Wykorzystanie mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek grafenowych do badania trawienia nanokryształów in situ

Podsumowanie

Mikroskopia elektronowa z ciekłych komórek grafenowych może być używana do obserwacji dynamiki nanokryształów w środowisku ciekłym z większą rozdzielczością przestrzenną niż inne techniki mikroskopii elektronowej w ciekłych komórkach. Wytrawianie gotowych nanokryształów i śledzenie ich kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z ciekłymi ogniwami grafenowymi może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych na temat przemian nanocząstek.

Streszczenie

Mikroskopia elektronowa z ciekłymi komórkami grafenowymi daje możliwość obserwacji przemian chemicznych i dynamiki w nanoskali, ponieważ reakcje zachodzą w środowisku ciekłym. Niniejszy manuskrypt opisuje proces wytwarzania ogniw ciekłych grafenu na przykładzie eksperymentów z mikroskopią elektronową transmisyjną w ciekłych komórkach grafenowych (TEM) dotyczących trawienia nanokryształów złota. Protokół wytwarzania ogniw z cieczy grafenowej polega na pokryciu złotych, dziurawo-węglowych siatek TEM grafenem z chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie użyciu tych pokrytych grafenem siatek do hermetyzacji cieczy między dwiema powierzchniami grafenu. Te kieszenie cieczy, wraz z interesującym nas nanomateriałem, są obrazowane w mikroskopie elektronowym, aby zobaczyć dynamikę procesu w nanoskali, w tym przypadku oksydacyjnego trawienia nanoprętów złota. Kontrolując szybkość dawki wiązki elektronów, która moduluje formy trawiące w płynnej komórce, można lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw usuwania atomów z nanokryształów w celu utworzenia różnych faset i kształtów. Zaletą grafenowych płynnych ogniw TEM jest wysoka rozdzielczość przestrzenna, kompatybilność z tradycyjnymi uchwytami TEM oraz niskie koszty rozpoczęcia działalności dla grup badawczych. Obecne ograniczenia obejmują delikatne przygotowanie próbki, brak zdolności przepływu i zależność od produktów radiolizy generowanych wiązką elektronów w celu wywołania reakcji. Dzięki dalszemu rozwojowi i kontroli, ciekła komórka grafenowa może stać się wszechobecną techniką w nanomateriałach i biologii, a już teraz jest wykorzystywana do badania mechanizmów rządzących procesami wzrostu, trawienia i samoorganizacji nanomateriałów w cieczy na poziomie pojedynczych cząstek.

Wprowadzenie

Kontrolowane syntetyzowanie nanokryształów¹ i łączenie nanocząstek w większe struktury^2,3 wymaga zrozumienia podstawowych mechanizmów rządzących wzajemnymi oddziaływaniami i wiązaniem atomów i nanocząstek. Idealnie byłoby, gdyby badania tych procesów w nanoskali były prowadzone w ich naturalnym środowisku ciekłym z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną niezbędną do obserwacji zjawisk będących przedmiotem zainteresowania, ale wymagania te stanowią wyzwanie ze względu na nanometrową skalę, w której działają te systemy. Naukowcy od dawna chcieli wykorzystać rozdzielczość przestrzenną mikroskopii elektronowej do obrazowania tych procesów, ale wysoka próżnia kolumny mikroskopu elektronowego wymaga enkapsulacji ciekłego roztworu⁴. Niektóre wczesne eksperymenty z mikroskopem elektronowym z cieczą komórkową zamknęły ciecz między dwiema membranami z azotku krzemu^5,6,7,8, a metoda ta stała się obecnie komercyjnie dostępną techniką badania dynamicznych procesów w nanoskali.

Dostępne na rynku uchwyty TEM do płynnych ogniw z azotku krzemu dostarczyły niezbędną rozdzielczość, aby zobaczyć i zrozumieć wiele interesujących zjawisk w nanoskali9^{,10,11,12,13,14,15,16}. Niektóre komercyjne uchwyty TEM z płynnymi komórkami mają dodatkowe możliwości, takie jak ogrzewanie, przepływ i połączenia elektryczne, które jeszcze bardziej rozszerzają zakres procesów nanoskalowych, które mogą być badane. Jednak przy wszystkich tych możliwościach systemy komercyjne nie są zoptymalizowane pod kątem osiągnięcia najwyższej rozdzielczości przestrzennej. Dla badaczy, którzy potrzebują lepszej rozdzielczości przestrzennej, zmniejszenie grubości okna i zmniejszenie grubości cieczy to dwie potencjalne drogi do mniejszego rozpraszania wiązki elektronów i lepszej rozdzielczości¹⁷. Niektóre grupy, które używają ogniw ciekłych z azotku krzemu, wytwarzają własne okna, co zapewnia większą kontrolę nad oknem i grubością cieczy. ¹⁸ Zmniejszone rozproszenie tych domowych komórek płynnych umożliwiło badania mikroskopii elektronowej z większą rozdzielczością przestrzenną, w tym badania rozdzielczości atomowej^19,20,21.

Ponieważ grubość materiału hermetyzującego jest jednym z aspektów, który negatywnie wpływa na rozdzielczość przestrzenną eksperymentów z komórkami cieczowymi, atomowo cienkie materiały o niskiej zawartości Z, takie jak grafen, byłyby idealnymi materiałami do kapsułkowania^22,23. Arkusze grafenu są nadal wystarczająco mocne, aby chronić kieszenie cieczy przed różnicą ciśnień kolumny. Ponadto te kieszenie komórek cieczy grafenowej zwykle zawierają cieńsze warstwy cieczy, co dodatkowo zwiększa osiągalną rozdzielczość przestrzenną. Zbadano wiele interesujących procesów w nanoskali za pomocą ogniw ciekłych grafenu, w tym badania podążające za trajektoriami fasetek nanocząstek i dynamiką nanocząstek z rozdzielczością atomową^{23,24,25,26,27}. Niezamierzoną zaletą techniki ciekłych ogniw grafenowych jest to, że tak wysoką rozdzielczość przestrzenną można osiągnąć bez konieczności zakupu innego uchwytu TEM lub specjalistycznej produkcji krzemu. Eksperymenty z użyciem ogniw z azotku krzemu, które osiągnęły wysoką rozdzielczość, również wymagały dużych nanocząstek złożonych z ciężkich atomów, podczas gdy rozdzielczość uzyskana przez ogniwo z cieczy grafenowej może zapewnić rozdzielczość atomową dla nanocząstek o długości fali poniżej 2 nm²⁵. Dodatkowo, ciekła komórka grafenowa otworzyła możliwości badania próbek biologicznych za pomocą mikroskopii elektronowej ze względu na elastyczną naturę grafenu do enkapsulacji^28,29 oraz zdolność grafenu do łagodzenia niektórych szkodliwych skutków wiązki elektronów³⁰. Ze względu na te zalety, grafenowa mikroskopia elektronowa z ciekłymi komórkami ma potencjał, aby stać się standardową techniką w społeczności nanonaukowej, gdy większa liczba badaczy lepiej zrozumie, czy technika ta może pomóc w ich badaniach i jak ją zastosować.

Badacze z dziedzin chemicznych, nanomateriałów, biologicznych i innych pragnący przestrzennej rozdzielczości transformacji in situ mogą skorzystać z zastosowania techniki mikroskopii elektronowej z ciekłymi komórkami grafenowymi. Ta metoda in situ jest szczególnie cenna w przypadku procesów nierównowagowych, które wymagają wizualizacji podczas transformacji. Jedną z istotnych wad technik TEM z komórek płynnych jest generowanie form radiolizy przez perturbacyjną wiązkę elektronów³¹, które mogą indukować niepożądane zmiany w delikatnych próbkach. Naukowcy opracowali modele, aby spróbować określić ilościowo chemię sterowaną wiązką^31,32, i opracowywane są strategie mające na celu złagodzenie tych efektów^30,32. Dodatkowym wyzwaniem jest to, że TEM z płynnych ogniw grafenowych jest delikatny i często trudny do wykonania, szczególnie dla naukowców początkujących w tej technice. Celem tego artykułu jest podzielenie się szczegółami na temat tego, w jaki sposób można przeprowadzać eksperymenty TEM z ciekłymi komórkami grafenowymi (Rysunek 1), na przykładzie eksperymentu obserwującego wytrawianie pojedynczych cząstek nanokryształów, i miejmy nadzieję, że pokazanie, że eksperymenty z ciekłymi komórkami grafenowymi są możliwe dla prawie każdej grupy z dostępem do mikroskopu elektronowego. Protokół obejmie powlekanie siatek grafenem, tworzenie komórek ciekłych, wykorzystanie TEM do eksperymentów z wytrawianiem ciekłych komórek grafenu oraz techniki analizy obrazu. Kluczowe etapy tworzenia płynnych komórek, takie jak wielkość kropli zamkniętej w kapsułkach, staranne rozważenie zawartości płynnego roztworu i użycie wyłącznie grafenu z bezpośrednim transferem, zostaną omówione z dodatkowymi poradami, jak uniknąć powtórzenia pułapek poprzednich badaczy. Grafenowe ogniwa ciekłe TEM to nowa technika badań w nanoskali, a ten artykuł umożliwi nowym uczestnikom rozpoczęcie stosowania tej techniki.

Protokół

1. Tworzenie siatek TEM pokrytych grafenem

1. Wytnij około 2 cm 2 kawałek gotowego grafenu na miedzi (patrz tabela materiałów), który pasuje do około 6 do 8 siatek TEM.
   UWAGA: Użycie grafenu 3-5-warstwowego zamiast grafenu jednowarstwowego zamyka kieszenie cieczy z wyższymi wskaźnikami sukcesu bez utraty rozdzielczości. Ponieważ grafen jest atomowo cienkim materiałem o niskiej zawartości Z, większość utraty rozdzielczości wynika z grubości cieczy w przypadku ogniw ciekłych grafenu.
2. Wyczyść grafen za pomocą mycia acetonem (Rysunek 2A).
   UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich pozostałości PMMA [poli(metakrylanu metylu)] pozostawionych na powierzchni grafenu podczas procesu osadzania. Jeśli użytkownik ma pewność, że jego grafen jest czysty, ten krok jest zbędny.
   1. Umieść grafen na miedzi w szklanej szalce Petriego i napełnij acetonem.
      UWAGA: Aceton jest używany, ponieważ PMMA rozpuszcza się w acetonie.
   2. Delikatnie podgrzewać roztwór acetonu (~50 °C) przez 5 minut, okresowo mieszając roztwór.
      UWAGA: Upewnij się, że obserwujesz aceton i temperaturę, aby uniknąć pożaru. Należy to zrobić w dygestorium.
   3. Usuń kawałek grafenu na miedzi z prania acetonem za pomocą pęsety i zastąp aceton nowym, czystym acetonem.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani w inny sposób nie uszkodzić powierzchni grafenu pęsetą.
   4. Powtórz proces prania w sumie 3 razy.
   5. Poczekaj, aż grafen na miedzi dokładnie wyschnie przed przejściem do następnego kroku.
3. Wygładź grafen na miedzi, aby usunąć wszelkie makroskopowe zmarszczki (Rysunek 2B).
   UWAGA: Ten proces wygładzania jest wykonywany w celu zapewnienia, że perforowane folie nośne - siatki TEM (patrz Tabela materiałów) są w stanie prawidłowo związać się z powierzchnią grafenu. Nierówności i zagniecenia w grafenie na miedzi utrudniają utrzymanie dobrego kontaktu.
   1. Weź dwa czyste szkiełka podstawowe i umieść złożoną chusteczkę (patrz Tabela materiałów) na dolnym szkiełku podstawowym. Na wierzchu chusteczki umieść kawałek grafenu na miedzi. Na koniec umieść drugie szklane szkiełko na górze.
      UWAGA: Umieść kawałek grafenu na miedzi grafenową stroną do góry (dotykając szkiełka podstawowego), aby zapobiec zarysowaniu przez chusteczkę. Sfałdowana tkanka służy do stopniowego wypychania zmarszczek i zapobiegania fałdowaniu się nowych fałd.
   2. Dociśnij górny suwak, stopniowo wygładzając wszelkie zmarszczki w elemencie grafenu na miedzi. Zmniejsz liczbę fałd w tkance i powtórz proces prasowania. Kontynuuj proces, aż do ostatecznego naciśnięcia między dwoma szklanymi szkiełkami bez wycierania chusteczek.
4. Ułóż siatki TEM na elemencie grafenu na miedzi (Rysunek 2C).
   1. Umieść dziurawe amorficzne siatki nośne z włókna węglowego i TEM (patrz tabela materiałów) na grafenie z amorficznym węglem stykającym się z grafenem.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zginać ani nie deformować siatek TEM podczas podnoszenia ich pęsetą. Wygięte siatki TEM nie wiążą się prawidłowo z grafenem. Podniesienie siatek za krawędź siatki zapobiega deformacji kratek. W tym przypadku stosuje się złote siatki TEM, aby uniknąć wytrawiania siatek podczas etapu, który usuwa miedź z grafenu na miedzi.
   2. Umieść kilka kropelek izopropanolu na rusztach.
      UWAGA: Jeśli jakiekolwiek kratki zachodzą na siebie, delikatnie przesuń je końcówką pęsety po nałożeniu izopropanolu na kratki. Uważaj, aby nie uszkodzić powierzchni grafenu.
   3. Pozostaw do wyschnięcia na 2+ godziny, aby upewnić się, że kratki są prawidłowo połączone. Ten proces suszenia sprawia, że dziurawy amorficzny węgiel ma lepszy kontakt z grafenem.
      UWAGA: Aby sprawdzić, czy siatki przylegają do grafenu, delikatnie podnieś kawałek grafenu na miedzi i odwróć go do góry nogami. Jeśli grawitacja nie usunie kratek, należy je odpowiednio złączyć.
5. Wytrawić miedź roztworem nadsiarczanu sodu ( Rysunek 2D).
   1. Przygotować roztwór z 1 g nadsiarczanu sodu w 10 ml wody dejonizowanej.
   2. Za pomocą pęsety ostrożnie umieść kawałek grafenu na miedzi na roztworze nadsiarczanu sodu miedzianą stroną do dołu. Niech kawałek unosi się na wierzchu roztworu nadsiarczanu sodu (Rysunek 2D).
   3. Utrzymuj roztwór z siatkami pokrytymi grafenem na noc. Zwróć uwagę, że roztwór zmieni kolor na niebieski w miarę wytrawiania miedzi, a po zakończeniu trawienia nie będzie widocznej miedzi za arkuszem grafenu (Rysunek 2E).
6. Umyj kratki, aby usunąć nadsiarczan sodu.
   1. Usuń pływające kratki z roztworu i umieść je na czystej, dejonizowanej wodzie (patrz Tabela materiałów dla filtra) na drugiej szalce Petriego.
      UWAGA: Najłatwiejsza metoda przenoszenia siatek polega na użyciu szklanego szkiełka do podniesienia kratek, a następnie umieszczeniu ich na drugiej szalce Petriego wypełnionej wodą. Niektóre siatki opadną na dno szalki Petriego podczas procesu przenoszenia. Jest to zwykle znak, że grafen na siatce jest pęknięty lub w inny sposób uszkodzony.
   2. Powtórz ten proces 3 razy, aby usunąć wszystkie pozostałości nadsiarczanu sodu z siatek pokrytych grafenem.
   3. Podnieś siatki pęsetą, umieść kratki grafenową stroną do góry na bibule filtracyjnej i pozwól im wyschnąć.
      UWAGA: To końcowe przeniesienie z myjki wodnej może być trudne, ponieważ siatki często przyklejają się do pęsety z powodu sił kapilarnych od resztek wody.

2. Tworzenie kieszeni na komórki płynów

1. Weź dwie siatki TEM pokryte grafenem i umieść je grafenową stroną do góry na szklanym szkiełku. Za pomocą małego ostrza skalpela chirurgicznego odetnij krawędź jednej z pokrytych grafenem siatek TEM, około 1/4 do 1/8 powierzchni siatki (Rysunek 3A).
   UWAGA: Przypuszcza się, że przecięcie jednej z siatek spowoduje zbliżenie grafenu na dwóch siatkach w celu zapewnienia lepszej interakcji grafen-grafen w celu utworzenia kieszeni.
2. Przygotuj roztwór do kapsułkowania.
   UWAGA: Roztwór jest specyficzny dla eksperymentu z wytrawianiem nanokryształów.
   1. Przygotować roztwór HCl buforu Tris z wodą dejonizowaną o stężeniu 10-100 mM.
      UWAGA: Odkryliśmy, że w przypadku przygotowania wodnych roztworów nanocząstek metalicznych, bufor Tris HCl prowadzi do wyższego wskaźnika sukcesu stabilnych kieszeni, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć, dlaczego bufor Tris HCl pomaga tworzyć stabilne kieszenie. Wydaje się, że korzystanie z bazy buforowej Tris lub bez bufora Tris ma w tym przypadku znacznie niższe wskaźniki sukcesu w tworzeniu kieszeni. Każdy rozpuszczalnik i próbka prawdopodobnie będą wymagały optymalizacji w celu znalezienia warunków, które tworzą stabilne kieszenie, nie zakłócając jednocześnie badanej chemii. Krótki przegląd literatury wskazuje na sukces orto-dichlorobenzenu/oleiloaminy (stosunek 9:1), ²³ 0,5x Tris-boran-EDTA (TBE) i 200 mM roztwór NaCl, ³³ i wodny roztwór 0,15 M NaCl³⁰, a także prezentowany tutaj wodny system buforowy Tris HCl.
   2. Przygotować 40 mM roztworu FeCl₃ w roztworze wody dejonizowanej z 1,8 μl HCl na ml wody.
      UWAGA: FeCl₃ jest wytrawiaczem do tego eksperymentu z trawieniem. Inne eksperymenty mogą dodawać różne rozwiązania w zależności od przeprowadzanego eksperymentu.
   3. Wykonaj złote nanopręty i zagęść próbkę nanopręta po oczyszczeniu^1,34.
   4. Wymieszaj 0,15 ml 0,01-0,1 mM buforu Tris HCl, 0,1 ml 40 mM FeCl₃ w HCl i 10 μl nanoprętów.
3. Umieść ~0,5 μl kropli roztworu do kapsułkowania na nieciętej siatce TEM pokrytej grafenem. Użyj pęsety, aby przytrzymać krawędź siatki TEM w dół podczas umieszczania kropli, tak aby siły kapilarne nie podniosły siatki TEM (Rysunek 3B).
   UWAGA: Uważaj, aby kropla była jak najmniejsza i umieść ją jak najbliżej środka siatki.
4. Szybko i ostrożnie umieść pokrytą grafenem siatkę TEM ściętym rogiem na wierzchu kropli; celem jest, aby druga siatka zatrzymała się na pierwszej siatce bez wyciskania cieczy (Rysunek 3C).
   UWAGA: Umieszczenie drugiej siatki w pęsetie samozamykającej się może przyspieszyć i ułatwić ten proces. Jest to prawdopodobnie najtrudniejszy etap procesu tworzenia komórek płynnych, z wieloma potencjalnymi awariami, które mogą wystąpić. Odłożenie górnej siatki podczas wyjmowania pęsety jest wyzwaniem, ponieważ pęseta może utknąć między dwiema kratkami. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej sprawdza się umieszczenie jednej krawędzi górnej siatki TEM w dół, a następnie stopniowe puszczanie siatki. Zwróć uwagę, że jeśli na szkiełku widać płyn, prawdopodobnie kieszenie nie uszczelniły się prawidłowo.
5. Odczekaj 5 minut, aby utworzyły się kieszenie komórek cieczy grafenowej.
   UWAGA: Podczas tworzenia się kieszeni może dojść do pewnego odparowania cieczy, ale po utworzeniu hermetycznego uszczelnienia nie jest prawdopodobne dodatkowe ubytek cieczy. Względne stężenia każdego gatunku w roztworze powinny pozostać stałe.
6. Przynieś próbkę do TEM w celu zobrazowania.
   UWAGA: Ilość czasu przeznaczonego na zapieczętowanie różni się w zależności od badacza. W przypadku eksperymentów z trawieniem pożądane jest skrócenie czasu przed doprowadzeniem płynnej komórki do TEM, aby uniknąć wstępnego trawienia.

3. Ładowanie i obrazowanie płynnej komórki grafenowej

Uwaga:Działanie transmisyjnego mikroskopu elektronowego przebiegało zgodnie ze standardowymi procedurami znajdującymi się w instrukcji obsługi. Każdy TEM będzie miał inne procedury dostosowawcze.

1. Umieść ogniwo cieczy grafenowej w tradycyjnym uchwycie TEM z pojedynczym przechyłem (Rysunek 4).
   UWAGA: Można również stosować inne standardowe uchwyty, takie jak uchwyty z podwójnym przechyleniem lub uchwyty grzewcze. Uchwyty, które używają mechanizmu śrubowego do zabezpieczenia siatki TEM, mogą wywierać siłę ścinającą, która niszczy ogniwo ciekłego grafenu.
2. Załaduj uchwyt TEM do kolumny TEM.
   UWAGA: Ponieważ ogniwo ciekłe grafenu zawiera tak małą objętość cieczy bez zbiornika i ma oddzielne kieszenie, nie ma potrzeby rygorystycznego sprawdzania szczelności, jak w przypadku eksperymentów z płynnymi ogniwami z azotku krzemu. Nawet jeśli kieszeń na ogniwo cieczy grafenowej pęknie, uwalniana jest tylko bardzo niewielka ilość cieczy, a tym samym nie spowoduje to awarii systemu próżniowego TEM.
3. Użyj nanocząstek i amorficznego węgla w próbce, aby prawidłowo wyrównać wiązkę TEM (nachylenie pistoletu, wyrównanie apertury kondensatora i stygmatyzacja kondensatora) oraz obraz (regulacja wysokości Z, stygmatyzacja obiektywu, wyrównanie środka obrotu i dostrojenie korekcji aberracji, jeśli dotyczy). Następnie zdejmij uchwyt ze ścieżki wiązki i skalibruj szybkość dawki wiązki elektronów.
   1. Włącz filament TEM co najmniej 20 minut przed kalibracją, aby umożliwić mu ustabilizowanie się w celu uzyskania powtarzalnych dawek; ten czas oczekiwania może się różnić w zależności od systemu TEM i typu pistoletu elektronowego.
      UWAGA: Mikroskopiści wyborczy często używają szybkości dawki, aby odnieść się do liczby elektronów dostarczonych na jednostkę powierzchni w jednostce czasu (e^-/Ųs). W społeczności chemii radiacyjnej jest to znane jako gęstość strumienia, a szybkość dawki jest definiowana jako ilość energii pochłoniętej na jednostkę powierzchni w jednostce czasu. Ponieważ obliczenie ilości energii pochłoniętej przez próbkę jest trudne w przypadku złożonych geometrii występujących w ogniwach ciekłych, a także w celu zachowania spójności ze społecznością TEM, zdecydowaliśmy się użyć szybkości dawki w odniesieniu do elektronów na jednostkę powierzchni w jednostce czasu.
   2. Zagęścić wiązkę do najbardziej skondensowanej ilości, najwyższej dawki potrzebnej do eksperymentu, korzystając z ekranu podglądu (Rysunek 5A). Odczyt i zapisz prąd soczewki dla wiązki skondensowanej.
      UWAGA: Dla kroków od 3.3.2 do 3.3.5 został napisany niestandardowy skrypt mikrografu cyfrowego, który przejmuje kontrolę nad układem kondensatora TEM w celu skalibrowania prądu soczewki drugiego kondensatora (C2) z dostarczoną szybkością dawki elektronów. Dzięki temu badacz może w sposób powtarzalny ustawić szybkość dawki elektronów na dowolne wartości podczas eksperymentu.
   3. Rozłóż wiązkę do największej ilości rozrzutu, najniższej dawki potrzebnej do eksperymentu, korzystając z ekranu podglądu (Rysunek 5B). Odczytaj i zapisz prąd soczewki dla wiązki rozproszonej.
   4. Podziel zakres prądów soczewki kondensatora na 10 równomiernie rozmieszczonych wartości i zbierz obrazy dla każdej wartości soczewki kondensatora za pomocą kamery CCD.
   5. Przelicz liczbę CCD na moc dawki, używając czułości CCD i kalibracji powiększenia dla każdego prądu obiektywu.
   6. Użyj danych strumienia elektronów przy różnych prądach soczewki, aby wykonać krzywą kalibracyjną. Użyj tej krzywej kalibracyjnej do końca eksperymentu, aby kontrolować wiązkę elektronów do pożądanego strumienia.
   7. Ponownie włóż próbkę do ścieżki wiązki.
4. Rozpocznij poszukiwanie nanocząstek w kieszeniach cieczy, utrzymując niską dawkę (zwykle około 20 e^-/²s).
   UWAGA: Utrzymywanie niskiej dawki zapobiega wytrawianiu nanocząstek podczas poszukiwania nanocząstek.
5. Gdy nanocząstka zostanie znaleziona w kieszeni cieczy, należy precyzyjnie dostroić ostrość na nanocząstce, utrzymując niską dawkę.
   UWAGA: Ustalenie, czy nanocząstka znajduje się w kieszeni cieczy, może być trudne, ale obecność pęcherzyków lub ruch cząstek jest często dobrym znakiem stabilnej kieszeni cieczy. Czasami, zamiast płynu, kieszenie przypominają bardzo gęsty żel z bąbelkami poruszającymi się niezwykle wolno. Sytuacje te są spowodowane parowaniem cieczy, potencjalnie z powodu nieuszczelnionych kieszeni lub pęknięć w grafenie. Dość łatwo jest odróżnić żele bez ruchu od środowisk płynnych z szybko poruszającymi się i zmieniającymi kształt bąbelkami. Podczas tworzenia dobrych kieszeni komórek cieczy może dojść do pewnego parowania, ale względne stężenia między reagentami pozostają stałe.
6. Użyj krzywej kalibracyjnej (patrz krok 3.3), aby ustawić prąd soczewki kondensatora dla żądanej szybkości dawki ( Rysunek 5D).
   UWAGA: Wewnętrzny skrypt służy do ustawiania prądu soczewki kondensora i parametrów akwizycji obrazu
7. Rozpocznij zbieranie serii czasowych obrazów TEM z metadanymi dawki i znacznikami czasu osadzonymi w pliku obrazu.
8. Po zakończeniu trawienia cząstki rozprowadź wiązkę i zacznij szukać innych nanocząstek w kieszeniach cieczy.
9. Po zebraniu wystarczającej ilości nagrań wideo z wytrawiania nanocząstek, wyjmij uchwyt TEM z TEM zgodnie ze standardowymi procedurami TEM. Wyjmij ogniwo cieczy grafenowej z uchwytu TEM.
   UWAGA: Typowa sesja obrazowania trwa około 2-3 godzin i obejmuje około 30 filmów. Liczba filmów z użytecznymi danymi zależy od jakości kieszeni i rodzaju eksperymentu z akwafortą.

4. Analiza obrazu filmów TEM za pomocą oprogramowania obliczeniowego

Uwaga: Ponieważ filmy TEM są dwuwymiarowymi projekcjami trójwymiarowych kształtów, należy przeprowadzić staranną analizę obrazu, aby wyodrębnić tempo trawienia lub zmiany kształtu.

1. Konwertuj natywne pliki wideo DM3 do formatu avi za pomocą ImageJ i zaimportuj filmy avi do oprogramowania obliczeniowego (patrz Spis materiałów).
2. Przeanalizuj każdy nanopręt w każdej klatce filmu.
   1. Określ kontur nanopręta, progując obraz (Rysunek 7A).
      UWAGA: Wysoki kontrast nanocząstek metalicznych ułatwia analizę obrazu. Do badania systemów o niższym kontraście mogą być potrzebne dodatkowe filtry przed progowaniem.
   2. Na podstawie konturu nanopręta wyznacz główną i pomocniczą oś najbliższej dopasowanej elipsy (Rysunek 7B).
      UWAGA: Wbudowane oprogramowanie do analizy obrazu w celu wyznaczenia osi głównej i pomocniczej zakłada, że kształt jest elipsą. W przypadku nanopręta, który nie jest elipsą, wartości te nie powinny być stosowane przy wymiarowaniu nanocząstek.
   3. Użyj osi głównej, aby przeciąć kontur nanopręta na dwie połowy (Rysunek 7C).
   4. Dla każdej z tych połówek określ objętość i powierzchnię objętego kształtu, obracając ten kontur wokół osi głównej.
      UWAGA: Ta metoda rachunku różniczkowego jest czasami określana jako metoda pierścieni. Ta metoda analizy działa tylko wtedy, gdy nanopręt jest symetryczny wokół osi głównej. Posiadanie dwóch połówek do porównywania objętości i powierzchni daje pewną pewność, że nanopręt jest naprawdę symetryczny rotacyjnie.
3. Po wyodrębnieniu objętości i powierzchni nanopręta dla każdej klatki wideo, skompiluj i zinterpretuj dane.
   UWAGA: Ta metoda obrysowywania pozwala również na analizę fasetek nanokryształów o zdefiniowanych kształtach.

Wyniki

Klatki z reprezentatywnego filmu przedstawiającego wytrawianie nanoprętem pod prędkością dawki wiązki elektronów wynoszącą 800 e^-/Ųs są pokazane w Rysunek 6. Roztwór wymaga około 20 s oświetlenia wiązką, zanim nanopręt zacznie ulegać trawieniu oksydacyjnemu. Po tym, jak nanopręt zacznie wytrawiać, szybkość usuwania atomów pozostaje stała, podczas gdy nanopręt również utrzymuje stały współczynnik proporcji. Nanopręty zazwyczaj nie mają znaczącego ruchu podczas filmów, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami TEM w płynnych komórkach przy użyciu nanocząstek o tym rozmiarze²⁴. Ponieważ nanocząstki nie poruszają się zbytnio, generowanie pęcherzyków i ruch pęcherzyków są zwykle najlepszymi sposobami określenia, czy nanocząstka znajduje się w kieszeni cieczy. Gdy nanopręt staje się mały, nanopręt zaczyna się obracać i poruszać w płaszczyźnie ogniskowej, potwierdzając, że nanopręt znajduje się w środowisku ciekłym.

Najczęstszą awarią komórek cieczy grafenowej jest niezdolność do hermetyzacji stabilnych kieszeni cieczy. Czasami może to prowadzić do całkowicie suchych kieszeni charakteryzujących się brakiem pęcherzyków i brakiem ruchu nanocząstek lub zmiany rozmiaru. Dodatkowo kieszeń może zaczynać się od cieczy i pęcherzyków, ale później wyschnąć, zanim nanocząstka całkowicie się wytrawi. Zwykle, aby uzyskać dobrą płynną komórkę, każda kieszeń jest stabilna przez około 2-3 minuty przy dawce trawienia, a suszenie kieszeni staje się problemem tylko w przypadku dużych nanocząstek lub powolnych procesów trawienia. Czasami ciecz może wyparować z kieszeni i pozostawić żelowy roztwór o bardzo wysokim stężeniu soli. Żele te są zwykle łatwo widoczne podczas obrazowania ze względu na wysoki kontrast roztworu i wyjątkowo powolny ruch pęcherzyków i cząstek. Nie można ufać danym zebranym w tych żelowych roztworach.

Po zebraniu danych TEM z komórek płynnych, analizowane są filmy z trawieniem nanocząstek. Objętości, powierzchnie i fasety (jeśli dotyczy) mogą być wyodrębniane i dalej oceniane (Rysunek 7). Jedną z oznak wysychania kieszeni jest znaczne spowolnienie tempa trawienia w czasie, więc wykreślenie objętości w czasie może być skuteczną metodą sprawdzania stabilności kieszeni i wiarygodności danych. Inne nieoptymalne wyniki obejmują niesymetryczne trawienie wskazujące na niejednorodną zawartość kieszeni i niepożądane wytrącanie się wodorotlenku żelaza z wytrawiacza chlorku żelaza. Ogólnie rzecz biorąc, najważniejszym kluczem do udanych ogniw z cieczy grafenowej jest stabilne środowisko ciekłe, które prowadzi do powtarzalnej dynamiki nanokryształów w wielu nanocząstkach i kieszeniach cieczy.

Rysunek 1. Schemat techniki TEM z ciekłą komórką grafenową. (A) Aby zmontować ogniwo z cieczy grafenowej, kroplę roztworu umieszcza się na pokrytej grafenem dziurawej siatce węglowej TEM. Druga siatka pokryta grafenem jest umieszczana na wierzchu kropli, aby utworzyć kieszeń. Zwróć uwagę, że ten obraz nie jest w skali, a kropla cieczy jest o około 33% za duża. (B) Powiększony schemat kieszeni cieczy podczas obrazowania TEM nanoprętów złota. Ta kreskówka też nie jest do skalowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Proces wytwarzania siatek TEM pokrytych grafenem (A) Mycie kawałka grafenu na miedzi w ciepłym acetonie (B) Usuwanie makroskopowych zmarszczek poprzez spłaszczanie grafenu na miedzi między dwoma szkiełkami. Tkankę umieszcza się pod kawałkiem grafenu na miedzi, aby nie fałdować się w nowych zmarszczkach. (C) Umieszczanie amorficznych, dziurawych węglowych siatek TEM na grafenie na miedzi z amorficzną stroną węglową siatek TEM stykającą się z grafenem. (D) Pływające siatki miedziane/grafenowe/TEM na wytrawiaczu nadsiarczanu sodu. Spowoduje to usunięcie miedzi z siatek. (E) Siatki TEM pokryte grafenem po wytrawieniu miedzi. Roztwór jest niebieski i na siatkach pokrytych grafenem nie ma już miedzi. Średnica szklanej szalki Petriego wynosi około 6 cm, a szkiełka ma wymiary 7,5 cm na 2,5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Proces wytwarzania ciekłych komórek grafenowych (A) Dwie siatki TEM pokryte grafenem przygotowane na szkiełku podstawowym z krawędzią odciętą od jednej z nich. Skalpel chirurgiczny używany do cięcia siatki znajduje się w prawym górnym rogu obrazu. (B) Kropla roztworu kapsułkującego na siatce pokrytej grafenem. Kropla na górnej siatce ma odpowiedni rozmiar i utworzyła ładny koralik na grafenie. Kropla na dolnej siatce przedostała się przez grafen, prawdopodobnie z powodu pęknięcia grafenu. (C) Druga siatka pokryta grafenem umieszczona na pierwszej siatce z kroplą roztworu. Ta ciekła komórka grafenowa jest teraz gotowa do załadowania do TEM. Dla porównania, szklane szkiełko ma wymiary 7,5 cm na 2,5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Ładowanie ciekłej komórki grafenowej do standardowego uchwytu TEM z pojedynczym przechyleniem. Ciekła kuweta grafenowa mieści się w standardowym uchwycie TEM z pojedynczym przechyleniem w taki sam sposób, jak normalna siatka TEM mieści się w uchwycie. Dla porównania, siatka TEM ma średnicę 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Sterowanie wiązką TEM. (A) Skondensowana wiązka elektronów do kalibracji dawki oglądana za pomocą ekranu fluorescencyjnego. (B) Rozszerzona wiązka elektronów do kalibracji dawki oglądana za pomocą ekranu fluorescencyjnego. Intensywność zmniejsza się wraz ze spadkiem liczby elektronów na obszar w czasie, dlatego wiązka elektronów jest bardzo słaba. (C) Krzywa kalibracyjna odnosząca natężenie dawki wiązki elektronów do prądu soczewki kondensatora. Ta krzywa kalibracyjna służy do kontrolowania szybkości dawki wiązki podczas obrazowania. (D) Parametry stosowane podczas zbierania filmów TEM nanocząstek w ogniwach ciekłych grafenu. Konkretne wartości używane dla każdego parametru mogą się zmieniać w zależności od obrazowanego materiału i wymaganej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Wytrawianie złotego nanopręta w kieszeni na ciekłą komórkę grafenową. Klatki reprezentatywnego filmu TEM przedstawiającego trawienie złotym nanoprętem przy dawce 800 e^-/^{A 2}s. Po początkowym okresie braku trawienia nanopręt wytrawia się ze stałą szybkością. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Metoda analizy klatek wideo (A) Wyznaczanie krawędzi nanopręta za pomocą progowania w oprogramowaniu do analizy obrazu. (patrz tabela materiałów) W ten sposób nanocząstka oddziela się od tła i nadaje kształt do analizy ilościowej. (B) Wyznaczanie głównych i drugorzędnych osi nanopręta. (C) Wyodrębnienie każdej połowy obrysu 2D przeciętego wzdłuż osi głównej. Korzystając z tych konturów, zrekonstruuj kształt 3-W, obracając kontur wokół osi x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Mikroskopia elektronowa ciekłych komórek grafenowych może dostarczyć mechanistycznych informacji na temat wzrostu i trawienia nanokryształów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale ponieważ wytwarzanie ogniw ciekłych grafenu może być trudne i delikatne, technika ta wymaga dbałości o szczegóły w celu wydobycia użytecznych danych. Nawet po intensywnej praktyce wytwarzania płynnych ogniw grafenowych, tylko około połowa do jednej czwartej wytworzonych komórek płynnych z powodzeniem zamyka płynny roztwór. Krytycznym krokiem w tworzeniu komórek płynnych jest umieszczenie drugiej siatki na kropli cieczy. Typowe błędy obejmują utknięcie pęsety między dwiema siatkami, upuszczenie drugiej siatki zbyt daleko poza środek i rozpoczęcie od zbyt dużej kropli. Ponieważ montaż ogniw cieczy grafenowej jest delikatny i wymaga umiejętności motorycznych, zwykle potrzeba praktyki, aby skutecznie wykonać kieszenie cieczy. Ze względu na koszt siatek TEM pokrytych grafenem, zdecydowanie zaleca się, aby nowi użytkownicy ciekłych ogniw grafenowych najpierw przećwiczyli proces wytwarzania płynnych ogniw na tradycyjnych miedzianych, amorficznych siatkach TEM z węgla amorficznego, aby zaoszczędzić pieniądze.

Określenie przyczyn awarii komórek płynnych może być trudne, ponieważ badacz może nie wiedzieć, czy każdy krok zakończył się sukcesem, dopóki nie zobrazuje próbki na końcu, a błędy, takie jak zarysowanie grafenu, mogą pozostać niezauważone. Najłatwiejszym do zidentyfikowania błędem jest nieprawidłowy montaż, ponieważ badacz natychmiast zobaczy ciecz wyciekającą z ogniwa cieczy grafenowej. Problemy z wytwarzaniem grafenu na miedzianych siatkach, takie jak pękanie grafenu, mogą być trudniejsze do zidentyfikowania. Jakość grafenu można sprawdzić zarówno przed, jak i po pokryciu siatek TEM za pomocą spektroskopii Ramana, ale grafen zwykle nie nadaje się do użytku po tym badaniu. Dodatkowo ważne jest, aby używać grafenu z bezpośrednim transferem, ponieważ dwie strony grafenu, które są ze sobą łączone, muszą być czyste, aby prawidłowo utworzyć uszczelnienie za pomocą sił Van der Waalsa. Wytwarzanie siatek pokrytych grafenem za pomocą metod transferu polimeru może pozostawić pozostałości polimeru po stronie grafenu, które mają się ze sobą wiązać. Jeśli postępuje się zgodnie z właściwą procedurą przy użyciu odpowiednich siatek TEM, brak sukcesu z ogniwem ciekłym grafenu jest zwykle spowodowany niewłaściwym obchodzeniem się z grafenem i kratkami podczas montażu i produkcji.

Grafenowe TEM z płynnymi komórkami rozwijają istniejące techniki TEM z płynnymi komórkami, wykorzystując znacznie cieńszy materiał do enkapsulacji, który można stosować w dowolnym tradycyjnym uchwycie TEM, co znacznie ułatwia eksperymenty ze śledzeniem trajektorii o wysokiej rozdzielczości i fasetach. Dzięki rozdzielczości komercyjnych ciekłych ogniw z membraną z azotku krzemu, wiele informacji aspektowych i kinetycznych, które można uzyskać przez wytrawianie nanokryształów w ciekłym ogniwie grafenowym, zostałoby utraconych. Eksperymenty TEM z ciekłymi komórkami grafenowymi można również przeprowadzać na istniejących uchwytach TEM z pojedynczym pochyleniem, eliminując potrzebę stosowania nowych, drogich specjalistycznych uchwytów. Co więcej, ciekła komórka grafenowa może być umieszczona w dowolnym uchwycie, który akceptuje standardowe próbki siatki TEM, co pozwala na przeprowadzanie eksperymentów z ogniwami płynnymi w zaawansowanych uchwytach (ogrzewanie, podwójne pochylenie, chłodzenie, kriometria, katodoluminescencja), w których nie zaprojektowano ogniw płynnych z azotku krzemu. Ponadto ogniwa ciekłe grafenu nie stwarzają ryzyka załamania próżni kolumny TEM, jeśli kieszenie pękną, jak w przypadku innych technik TEM z płynnymi ogniwami. Chociaż ciekłe ogniwo grafenowe nie jest jeszcze wszechobecną techniką w dziedzinie nanokryształów, jego łatwość użycia i rozdzielczość przestrzenna sprawią, że w przyszłości będzie ono znacznie szerzej stosowane.

Nawet przy wielu zaletach, grafenowe ogniwa płynne TEM mają ograniczenia co do rodzajów eksperymentów, które można przeprowadzić. Część cieczy paruje, gdy tworzą się kieszenie, więc trudno jest dokładnie określić stężenie gatunków w roztworze, nawet bez uwzględnienia efektów wiązki elektronów. Ogniwa ciekłe grafenu mają również losowe rozmiary, wysokości i rozkłady małych kieszeni, więc ogniwa przepływowe z azotku krzemu mają tę zaletę, że charakteryzują się bardziej wymiernymi stężeniami wiązki wstępnej i dużymi, jednolitymi warstwami cieczy. Jak opisano w tej pracy, tylko wstępnie załadowane próbki mogą być oglądane za pomocą ciekłej komórki grafenowej w TEM, więc nie jest możliwe przepływanie w innych roztworach w celu wywołania reakcji chemicznych. Formy radiolizy powstające w wyniku oddziaływania wiązki elektronów z ciekłym roztworem są jedynym wyzwalaczem, który można wykorzystać do rozpoczęcia reakcji. Chociaż nie zostało to jeszcze zademonstrowane, procesy inicjowane termicznie mogą być uruchamiane w ogniwach ciekłych grafenu za pomocą standardowych uchwytów grzewczych. Efekty radiolizy wywołanej wiązką elektronów nadal nie są w pełni poznane i mogą być trudne do kontrolowania. Naukowcy opracowali modele kinetyczne do określenia zawartości kieszeni komórek ciekłych po interakcji wiązki ^31,32, ale ich dokładność jest ograniczona liczbą reakcji zawartych w modelu i wszelkimi nieznanymi zmianami stężeń spowodowanymi suszeniem. Złożona początkowa zawartość kieszeni z wieloma reagującymi gatunkami, takimi jak FeCl₃, Tris Buffer, a nawet grafen³⁰, może być trudna do pełnego zrozumienia przy użyciu modelu kinetycznego. Kolejną wadą mikroskopii elektronowej w komórkach ciekłych jest to, że trudno jest scharakteryzować skład kryształów powstających podczas procesów dynamicznych. Na przykład w eksperymentach wzrostu układów wieloskładnikowych może być niemożliwe rozróżnienie, jakie fazy lub gatunki rosną, jeśli nowe nanokryształy są amorficzne, czy nie znajdują się na osi strefy. Jest to kolejny powód, dla którego pożądane jest wytrawianie wstępnie uformowanych nanokryształów o znanym składzie znajdujących się na znanej osi strefy. Wreszcie, nadal istnieją pewne argumenty, że reakcje wywołane wiązką w ciekłym ogniwie grafenowym nie reprezentują warunków reakcji ex situ w kolbie.

Przyszłe eksperymenty z ciekłymi ogniwami grafenowymi pomogą złagodzić niektóre z tych problemów, a jednocześnie wykorzystają nowe postępy w zakresie TEM do dalszego badania tajemnic leżących u podstaw nanokryształów. Korelacyjne eksperymenty z syntezą i trawieniem nanokryształów ex situ będą miały kluczowe znaczenie dla potwierdzenia mechanizmów obserwowanych w eksperymentach TEM z użyciem ciekłych komórek. Naukowcy rozpoczęli również prace nad dodaniem możliwości przepływu do ciekłych ogniw grafenowych TEM³⁵ i tworzeniem bardziej kontrolowanych kieszeni³⁶ , w tym układów ogniw z płynu grafenowego przy użyciu litograficznie przygotowanych otworów³⁷. Postępy w zakresie mikroskopii elektronowej, rozdzielczości i szybkości kamery sprawią, że ciekłe ogniwo grafenowe będzie w stanie dalej badać dynamikę atomową podczas przemian nanokryształów. Owijanie małych kieszeni cieczy w atomowo cienki materiał, taki jak grafen, do wykorzystania w mikroskopii elektronowej ma wiele potencjalnych zastosowań i bez wątpienia stanie się podstawą badań nanobiologicznych w przyszłości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-propanol (izopropanol)	Sigma Aldrich	190764-4L
Aceton	Fisher Chemical	A949-4 HPLC Grade
FeCl3	Sigma Aldrich	44944-250g
Złoto Quantifoil, amorficzne węglowe siatki TEM	SPI dostarcza	4230G-XA	300 Mesh Gold, R1.2 / 1.3- Często szeroko na zamówienie
Graphene	ACS Materials	GnVCu3 ~ 5L-4x2in	Specjalnie zamawiamy to, aby uzyskać grafen tylko z jednej strony. Dwustronny numer produktu to CVCU3022. Zwykle używamy 3-5 warstwowego grafenu do produkcji płynnych ogniw grafenowych. Jeśli naukowcy potrzebują jednowarstwowego grafenu do swoich płynnych komórek, ostatnio używamy Grolltex
Płyta grzejna	IKA	C-MAG HS 7 Cyfrowy
kwas chlorowodorowy	Fisher Chemical	7647-01-0
Chusteczki Kimwipe	Kimberly-Clark	34120
Matlab	Mathworks
Millipore Filtr do wody	Millipore
Nadsiarczan sodu	Sigma Aldrich	71890-500g
Chirurgiczne ostrze skalpela	Swann-Morton	No. 6
TEM	FEI	Tecnai T20 S-Twin	TEM musi być połączone z oprogramowaniem do akwizycji kamery, aby umożliwić procedury kalibracji dawki.
TEM Cameara do zbierania danych in situ	Gatan	Orius SC200	Niestandardowe cyfrowe skrypty mikrograficzne (napisane wewnętrznie) do kalibracji wartości soczewki C2 do dawki i zbierania zestawów danych in situ
Uchwyt na próbkę TEM z pojedynczym pochyleniem	FEI
Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris Buffer HCl)	Pęseta Fisher Biotech	1185-53-1
	Excelta	7-SA