Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57674

⸱

3 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, State University of New York at Binghamton

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Streszczenie

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów i fosforyluje około 8 - 13% proteomu; jednak liczba zidentyfikowanych celów dla Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest nadal niska. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ dostarczają one mechanistycznego wglądu w to, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla wiernej segregacji chromosomów, a defekty w tym skomplikowanym procesie prowadzą do aberracji chromosomowych i raka.

Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który służy do identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście oczyszczone białko jest fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny ludzki Cdk1 / cyklinę B. Pomyślna fosforylacja jest potwierdzana przez SDS-PAGE, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy oraz test wiązania do funkcjonalnej weryfikacji zidentyfikowanych miejsc fosforylacji, który bada interakcję między klasycznym sygnałem lokalizacji jądrowej (cNLS) a jego receptorem transportu jądrowego karioferyną α. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy przeglądu podejść do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 na podstawie sekwencji białek. Razem protokoły te stanowią bardzo skuteczne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki, zwłaszcza w połączeniu z badaniami funkcjonalnymi komórki.

Wprowadzenie

Kinazy to enzymy, które przenoszą grupy fosforanowe z ATP na substraty i regulują wiele procesów komórkowych. Ta fosforylacja jest odwracalna, szybka, dodaje dwa ładunki ujemne i magazynuje darmową energię i jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych stosowanych przez komórki. Cdk1, który jest również znany jako homolog białka 2 cyklu podziału komórki (CDC2) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów1,2,3,4,5, i fosforyluje około 8-13% proteomu6,7.

Podczas gdy ostatnie badania proteomiczne zidentyfikowały wiele miejsc fosforylacji w białkach, w większości przypadków kinaza odpowiedzialna za te modyfikacje jest nieznana. Liczba znanych celów Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest niska7. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ umożliwia badania mechanistyczne, które określają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego jest ważna dla wiernej segregacji chromosomów i podziału komórek, a niezliczone procesy komórkowe muszą zachodzić, aby wspierać tę ważną funkcję fizjologiczną. Obejmuje to zatrzymanie transkrypcji i translacji przed nadejściem mitozy, a także dramatyczną reorganizację struktury i organizacji komórkowej, taką jak demontaż otoczki jądrowej, kondensacja chromosomów i montaż wrzeciona mitotycznego. Deregulacja i błędy w tych procesach powodują raka, wady wrodzone lub mitotyczną śmierć komórki. Opracowano specyficzne inhibitory Cdk1, takie jak RO-3306 8, które dostarczają potężnych narzędzi do badań funkcjonalnych, a niektóre z tych inhibitorów są obecnie w badaniach klinicznych w leczeniu raka (zobacz9 w celu przeglądu).

Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który pozwala na identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście dostępny na rynku ludzki Cdk1 / cyklina B jest używany do fosforylacji oczyszczonego białka docelowego in vitro. Fosforylacja substratu zwiększa jego masę i dodaje dwa ładunki ujemne; dlatego udana fosforylacja jest potwierdzana przez przesunięcie w górę pasma żelu białkowego na SDS-PAGE. Miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1 są następnie identyfikowane za pomocą analizy spektrometrii mas fosforylowanego białka in vitro. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy również przeglądu narzędzi obliczeniowych i odniesień do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 z sekwencji białka. Ponadto opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy. Wreszcie, zidentyfikowane miejsca fosforylacji muszą zostać zweryfikowane za pomocą badań funkcjonalnych, a w tym celu opisano tutaj prosty test wiązania. W połączeniu jest to bardzo potężne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy7,10,11. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki. Zaleca się jednak funkcjonalną weryfikację uzyskanych miejsc fosforylacji in vitro, ponieważ komórki mają dodatkowe mechanizmy regulacyjne, takie jak modyfikacje potranslacyjne, partnerzy interakcji lub lokalizacja komórkowa, która może sprawić, że miejsca fosforylacji będą dostępne lub niedostępne do rozpoznania przez Cdk1.

Cdk1 rozpoznaje miejsce fosforylacji konsensusu, które składa się z (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), gdzie X to dowolna reszta, a seryna lub treonina to miejsce fosforylacji. Szczególnie ważna dla rozpoznania jest obecność proliny w pozycji +1. Ponadto reszty zasadowe są preferowane w pozycjach +2 lub +3, przy czym większość miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 zawiera Lys lub Arg na pozycji +36,12.

Aktywacja Cdk1 jest ściśle regulowana i prowadzi do wystąpienia mitozy1,2,3,4,5. Aktywność kinaz zależnych od cyklin ogólnie zależy od ich związku z różnymi cyklinami (cyklina A, B, C, D i E u ludzi), które ulegają ekspresji na oscylacyjnych poziomach w całym cyklu komórkowym13. Ekspresja Cdk1 jest stała w całym cyklu komórkowym, a regulacja jej aktywności opiera się na jego powiązaniu z podjednostkami regulatorowymi cykliną A i cykliną B5,13,14,15, a także modyfikacje potranslacyjne. Do aktywacji kinazy wymagane jest wytworzenie kompleksu Cdk1/cyklina B5,14,15,16,17,18. W fazie G2 cyklina B ulega translacji w cytozolu i jest importowana do jądra, gdzie wiąże się z Cdk15,14,15,16,17,18; jednak Cdk1 / cyklina B jest utrzymywana w stanie inaktywowanym przez fosforylację na resztach Thr14 i Tyr15 przez ludzkie kinazy hamujące Cdk1 Myt1 (kinaza hamująca cdc2 specyficzna dla tyrozyny i treoniny specyficzna dla błony) i Wee1, odpowiednio19,20,21. W późnej fazie G2 defosforylacja Thr14 i Tyr15 przez fosfatazę 25 cyklu podziału komórki (cdc25) aktywuje aktywność kinazy kompleksu Cdk1/cyklina B i wyzwala inicjację mitozy12,14,18,20,22,23. Fosforylacja Thr161 jest również wymagana do aktywacji Cdk1 / cykliny B i odbywa się za pośrednictwem Cdk7, kinazy aktywującej Cdk (CAK)18. Degradacja cykliny B w anafazie dezaktywuje Cdk1, umożliwiając wyjście z mitozy24,25. Aktywacja Cdk1/cykliny B jest zatem skomplikowanym procesem. Prezentowany tutaj protokół jest wykonywany z użyciem dostępnego na rynku Cdk1/cykliny B. Podczas rekombinowanej ekspresji tego kompleksu w komórkach owadów jest on aktywowany in vivo przez endogenne kinazy14,20 i pozostaje aktywny w stanie oczyszczonym. Otrzymany w ten sposób aktywny, rekombinowany ludzki Cdk1/cyklina B nadaje się do testów kinazy in vitro.

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w ludzkim białku centromerowym F (CENP-F)10. CENP-F jest białkiem kinetochorowym, które znajduje się w jądrze podczas większości interfazy (faza G1 i S) i jest eksportowane do cytozolu w fazie G226,27,28 w sposób zależny od Cdk110,11. Lokalizacja jądrowa jest nadawana przez dwudzielną klasę cNLS26. cNLS są rozpoznawane przez czynnik transportu jądrowego karyoferyna α, który ułatwia, wraz z β karyoferyny i RanGDP, import ładunku cNLS do jądra29. Eksport jądrowy w fazie G2 jest ułatwiony przez nieznaną ścieżkę eksportu10. Gdy CENP-F znajdzie się w cytozolu, jest rekrutowany do otoczki jądrowej i z kolei rekrutuje kompleks białek motorycznych dynein30,31. Szlak ten jest ważny dla ułożenia jądra odpowiednio do centrosomu podczas początkowych etapów składania wrzeciona mitotycznego w sposób zależny od dyneiny, co jest ważne dla prawidłowego czasu wejścia mitotycznego i dla podstawowego procesu rozwoju mózgu30,31,32. Począwszy od fazy G2, CENP-F jest również montowany w kinetochorze, gdzie odgrywa ważną rolę w wiernej segregacji chromosomów27,28,33,34,35. Kluczowym krokiem regulacyjnym tych ścieżek jest eksport jądrowy CENP-F w fazie G2, który jest zależny od Cdk110,11. Opisujemy tutaj protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w cNLS CENP-F. Mutacje fosfomimetyczne tych miejsc spowalniają import jądrowy CENP-F, co sugeruje, że Cdk1 / cyklina B bezpośrednio reguluje komórkową lokalizację CENP-F poprzez fosforylację jego klasy cNLS10.

Ogólnie rzecz biorąc, ten test kinazy in vitro pozwala na identyfikację specyficznych substratów dla kinazy Cdk1. Oczyszczone białka docelowe są fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny kompleks Cdk1/cyklina B, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 wspiera badania mechanistyczne, które ujawniają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przewidywanie miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 na podstawie sekwencji białkowej

  1. Przed rozpoczęciem testu kinazy należy przeanalizować sekwencję białka pod kątem przewidywanych miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 oraz przeszukać literaturę w poszukiwaniu eksperymentalnie ustalonych miejsc fosforylacji o nieznanej specyficzności kinazy. Należy wykorzystać podsumowane poniżej narzędzia, bazy danych i referencje.
    1. Użyj oprogramowania iGPS 3.036,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php), aby przewidzieć miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1 w sekwencji białka docelowego. Skorzystaj z zamieszczonego tutaj łącza, aby uzyskać kompleksową predykcję obejmującą adnotacje struktury drugorzędowej i dostępności powierzchniowej.
    2. W oprogramowaniu wprowadź sekwencję białka w formacie FASTA. W sekcji specyficzności kinazy zaznacz Serine/Threonine kinase, CMGC, CDK, CDC2, CDK1 oraz odznacz wszystkie pozostałe specyficzności. Wybierz próg „medium” i kliknij przycisk Submit.
    3. Porównaj wynikowe przewidywane miejsca z konsensusową sekwencją miejsca fosforylacji Cdk1 (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg).
    4. Co istotne, sprawdź w przewidywanym miejscu obecność proliny obok reszty fosforylowanej (niektóre substraty Cdk1 są fosforylowane w minimalnym miejscu (Ser/Thr-Pro)6,12). Dodatkowo sprawdź obecność reszt zasadowych, które są preferowane w pozycjach +2 lub +3, przy czym większość miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 zawiera Lys lub Arg w pozycji +36,12.
  2. Należy również sprawdzić, czy miejsce jest dostępne dla rozpoznania, ponieważ sama obecność pełnego miejsca konsensusowego nie jest wystarczająca do fosforylacji przez Cdk1.
    1. Przeanalizuj adnotacje dotyczące dostępności powierzchniowej i predykcji struktury drugorzędowej w wynikach iGPS, które określają, czy miejsce jest przewidywane jako dostępne; końce N- i C-białek są w wielu przypadkach elastyczne i dostępne dla fosforylacji.
    2. Jeśli dostępna jest struktura krystalograficzna białka docelowego, sprawdź dostępność domniemanych miejsc fosforylacji, analizując ich położenie w strukturze.
  3. Przeszukaj literaturę pod kątem eksperymentalnie ustalonych miejsc fosforylacji o nieznanej specyficzności kinazy, korzystając z bazy danych UniProtKB/Swiss-Prot38 (http://www.uniprot.org).
    1. Wpisz nazwę białka w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Search. Wybierz odpowiedni wpis sekwencji. Miejsca fosforylacji są adnotowane i opisane w sekcji amino acid modifications.
    2. Wyszukaj badania proteomiczne ekstraktów mitotycznych linii komórkowych człowieka7,39,40, które są szczególnie przydatne, ponieważ Cdk1 staje się aktywna w fazie G2 cyklu komórkowego.
  4. Zidentyfikuj dwudzielne cNLS za pomocą NLSmapper (opcjonalnie).
    UWAGA: Dla białek przemieszczających się między cytozolem a jądrem powszechnym mechanizmem regulacji lokalizacji komórkowej jest fosforylacja dwudzielnego cNLS w pozycji -1 głównego motywu przez Cdk1. Fosforylacja ta znosi lokalizację jądrową w fazie G210,41,42,43.
    1. W przypadku takich białek przemieszczających się, zidentyfikuj cNLS w sekwencji białka za pomocą NLSmapper43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi). Wklej sekwencję białka jako tekst w polu sekwencji, wybierz wartość odcięcia (cut-off score) 5.0 i zaznacz wyszukiwanie NLS w entire region. Kliknij przycisk Predict NLS.
    2. Porównaj wynikowy przewidywany cNLS z sekwencją konsensusową dwudzielnego cNLS, która składa się z motywu mniejszego (Lys-Arg), łącznika o długości co najmniej 10 reszt oraz motywu głównego (Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg), gdzie X to dowolna reszta niebędąca naładowana ujemnie.
    3. Sprawdź, czy przewidywane miejsce fosforylacji Cdk1 (*) znajduje się bezpośrednio obok motywu głównego w pozycji -1 łącznika: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg.
      UWAGA: Fosforylacja dwudzielnego cNLS w pozycji -1 przez Cdk1 została ustalona jako mechanizm regulacyjny lokalizacji komórkowej dla kilku białek przemieszczających się10,41,42,43.

2. Ekspresja białek rekombinowanych w Escherichia Coli

  1. Wykorzystaj plazmidy ekspresyjne z kroków 2.1.1-2.1.2 do ekspresji białek rekombinowanych w E. coli.
    1. Aby stworzyć konstrukt ekspresyjny ludzkiego białka CENP-F (pozostałości 2,987 - 3,065), wygeneruj inserty poprzez amplifikację fragmentów DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z pełnowymiarowego konstruktu CENP-F (numer dostępu GenBank: U19769.1). Użyj następujących starterów: AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAGATTCCCG oraz AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGTGAATACCACTCATG.
      UWAGA: Pełnowymiarowy plazmid ludzkiego CENP-F został uprzejmie udostępniony przez dr. X. Zhu, Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Szanghaj, Chiny.
      1. Sklonuj insert do wektora pGEX6p1 z miejsc restrykcyjnymi BamHI i XhoI. Użyj tego plazmidu do ekspresji białek fuzyjnych CENP-F (pozostałości 2,987-3,065) z N-terminalną S-transferazą glutationową (GST).
        UWAGA: Znacznik GST można odciąć za pomocą proteazy PreScission (zwanej dalej proteazą PS).
    2. W przypadku ludzkiego konstruktu ekspresyjnego karyoferyny α, wygeneruj inserty poprzez amplifikację fragmentów DNA za pomocą PCR z matrycy cDNA pełnowymiarowej karyoferyny α2 (numer dostępu sekwencji NM_002264.3; startery: GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA oraz TCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC).
      UWAGA: Ze względu na podobieństwo izoform, ten konstrukt karyoferyny α2 jest w dalszej części tekstu określany jako karyoferyna α.
      1. Sklonuj insert do wektora pET28a-pres z miejscami restrykcyjnymi NdeI i XhoI.
        UWAGA: Jest to zmodyfikowany wektor pET28a, w którym sekwencja kodująca miejsce cięcia trombiny została zastąpiona sekwencją kodującą miejsce cięcia proteazy PS. Użyj tego plazmidu do ekspresji białka fuzyjnego karyoferyny α z N-terminalnym znacznikiem His6, gdzie znacznik His6 można odciąć za pomocą proteazy PS.
  2. Aby stworzyć mutacje punktowe białka docelowego, przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną za pomocą zestawu.
  3. Wyekspresuj białka rekombinowane w E. coli do późniejszej puryfikacji.
    1. Przygotuj następujące roztwory stokowe: kanamycyna 50 mg/mL (roztwór stokowy 1:1,000), chloramfenikol 35 mg/mL w 70% etanolu (1:1,000), ampicylina 100 mg/mL (1:1,000) oraz 1 M izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG; 1:5,000).
    2. Przefiltruj roztwory stokowe przez filtr sterylny i przechowuj w temperaturze -20 °C. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania IPTG.
    3. Przetransformuj 1 µL plazmidu ekspresyjnego do 50 µL kompetentnych komórek szczepu E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Wysiej kulturę na agar Luria-Bertani (LB) z chloramfenikolem (35 µg/mL LB) i ampicyliną (100 µg/mL LB) dla konstruktu CENP-F, lub z chloramfenikolem i kanamycyną (50 µg/mL kultury) dla konstruktu karyoferyny α. Inkubuj płytki przez 12-20 h w temperaturze 37 °C.
    5. Wyizoluj pojedynczą kolonię i zaszczep 50 mL LB uzupełnionego antybiotykami (patrz krok 2.3.4). Inkubuj prekulturę przy wytrząsaniu z prędkością 160-180 rpm przez 12-20 h w temperaturze 37 °C.
    6. Przygotuj 1 L medium LB w kolbie Fernbacha z przegrodami o pojemności 2,800 mL. Przygotuj dwie kolby dla każdej prekultury i wysterylizuj je w autoklawie. Aby zapewnić napowietrzanie, nie napełniaj kolb powyżej dwóch trzecich ich objętości. Można również użyć kolb Erlenmeyera.
    7. Dodaj antybiotyki (krok 2.3.4) oraz 10 mL sterylnie przefiltrowanego 40% (w/v) roztworu glukozy na 1 L schłodzonego LB. Dodaj 20 mL prekultury na 1 L medium LB.
      UWAGA: Absorbancja przy 600 nm rozcieńczenia prekultury 1:10 powinna wynosić od 0,15 do 0,2.
    8. Inkubuj kolby przy wytrząsaniu z prędkością 160-180 rpm w temperaturze 37 °C. Regularnie mierz absorbancję przy 600 nm kultury bakterii. Gdy absorbancja osiągnie 0,5-0,6, zindukuj ekspresję białka, dodając 0,2 mM IPTG (200 µL roztworu stokowego 1 M na 1 L medium LB).
      UWAGA: Ważne jest, aby indukcję komórek przeprowadzić przy odpowiedniej absorbancji. Zazwyczaj osiągnięcie tego etapu zajmuje 3-4 h.
    9. Inkubuj kolby przy wytrząsaniu przez 3 h w temperaturze 37 °C. Zbierz komórki przez wirowanie (15 min, 4,100 x g, 4 °C, rotor kątowy). Odlej nadsącz. Resuspender osad komórkowy w 20 mL buforu wiążącego GST (CENP-F) lub buforu wiążącego His6 (karyoferyna α) na 1 L kultury. Przechowuj komórki w temperaturze -80 °C.
      1. Przygotuj wcześniej bufor wiążący GST (10 mM Tris pH 8,0 przy 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM EDTA) oraz bufor wiążący His6 (10 mM Tris pH 8,0 przy 25 °C, 250 mM NaCl, 5 mM imidazol pH 8,0, 5 mM β-merkaptoetanol (BME)).

3. Oczyszczanie białka rekombinowanego za pomocą chromatografii powinowactwa do glutationu oraz filtracji żelowej

  1. Przygotować następujące roztwory zapasowe: 1 M DTT (stężenie zapasowe 1:1000, przefiltrowane sterylnie przez membranę o rozmiarze porów 0,2 µM i odgazowane); 250 mM fluorek fenylometylosulfonylowy (PMSF; stężenie zapasowe 1:1000 w dimetylosulfoksydzie). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotować następujące bufory i schłodzić je do 4 °C.
    1. Przygotować bufor wiążący GST, stosując 10 mM Tris pH 8,0 przy 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA.
    2. Przygotować bufor eluujący GST, stosując 10 mM zredukowanego glutationu (0,15 g/50 mL) rozpuszczonego w buforze 50 mM Tris pH 8,0 przy 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. Potwierdzić, że pH końcowego buforu wynosi 8,0 i użyć go w dniu przygotowania.
    3. Przygotować bufor do filtracji żelowej, stosując 20 mM Tris pH 7,5 przy 25 °C, 60 mM NaCl, 2 mM DTT. Przefiltrować bufor sterylnie za pomocą filtra nakręcanego na butelkę (rozmiar porów 0,2 µM). Odgazować bufor, mieszając pod próżnią (-6 psi) przez 15 min.
    4. Dodać DTT do wszystkich powyższych buforów w dniu użycia.
  3. Rozmrozić komórki z Sekcji 2 zawierające konstrukt CENP-F. Dostosować objętość do 40 mL za pomocą buforu wiążącego GST. Dodać 1 mM DTT, 0,25 mM PMSF, 0,5 mM EDTA (roztwór zapasowy 0,5 M, pH 8,0), 7 mg chlorowodorku benzamidyny (1 mM) oraz 40 mg D/L metioniny.
    UWAGA: Aby ograniczyć degradację proteolityczną, wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze 4 °C, najlepiej w pomieszczeniu chłodniczym, chyba że zaznaczono inaczej. Komórki, lizaty i oczyszczone frakcje białek należy stale trzymać na lodzie i dodawać inhibitory proteaz. Aby zapobiec utlenianiu reszt cysteiny i metioniny, w dniu eksperymentu należy dodać reduktory, takie jak DTT i metionina. Aby ograniczyć degradację proteolityczną, należy szybko przechodzić przez poszczególne kroki.
  4. Liza komórek w sonikatorze przebiega następująco: napełnić zlew szklany lizatem i zanurzyć go w kąpieli wodno-lodowej. Sonikować kulturę (1 min 40 s, przy mocy/amplitudzie wyjściowej 100 W (50%), z impulsami 10 s i cyklami odpoczynku 10 s). Po sonikacji dodać 250 µM PMSF. Sprawdzić lizat komórkowy, który powinien być bardziej przejrzysty i przestać być lepki.
  5. Klarowanie lizatu poprzez wirowanie przy 12 000-40 000 x g przez 25 min w 4 °C. Należy użyć probówek wirówkowych z okrągłym dnem i rotora ze stałym kątem.
  6. Przeprowadzić równoważenie, dodając 2 mL zawiesiny agarozy z glutationem w stosunku 1:1 do jednorazowej kolumny chromatograficznej. Otrzymana kolumna będzie miała objętość 1 mL. Przemyć kolumnę 25 mL wody ultrapure oraz 25 mL buforu wiążącego GST.
  7. Przeprowadzić wiązanie w następujący sposób: pracując w pomieszczeniu chłodniczym lub w komorze chłodzącej, oddzielić lizat od osadu. Przefiltrować lizat (rozmiar porów 0,2 µm) i wlać go na zablokowaną kolumnę. Zamknąć kolumnę i inkubować, delikatnie nutując przez 30 min w 4 °C.
  8. Aby przemyć kolumnę, należy umieścić ją na statywie, pozwolić żywicy opaść i zebrać przelew. Przemyć kolumnę dwukrotnie 25 mL buforu wiążącego GST.
  9. Elucja poprzez cięcie proteolityczne:
    1. Zablokować kolumnę. Dodać 400 µL buforu wiążącego GST i 250 µL proteazy PS (roztwór zapasowy 2 mg/mL o aktywności 1000 U/mg, oczyszczonej w laboratorium lub zakupionej; patrz Tabela Materiałów).
    2. Zamknąć kolumnę i delikatnie zamieszać, aby resuspenderować żywicę w buforze. Inkubować kolumny przez 16-20 h w 4 °C. Następnie dodać 4 mL buforu wiążącego GST, aby eluować z kolumny proteolitycznie odcięty fragment CENP-F.
  10. Elucja glutationem:
    1. Zablokować kolumnę, dodać 4 mL buforu eluującego GST (4 objętości kolumny) i inkubować przez 10 min, aby eluować związany znacznik GST. Zebrać eluat. Zregenerować kolumny przed ponownym użyciem zgodnie z instrukcją producenta.
  11. Przeanalizować frakcję elucji proteazą PS oraz frakcję elucji glutationem za pomocą SDS-PAGE na żelach z 16% akryloamidu. Elektroforezę prowadzić przy 25 V/cm przez 45 min. Żele barwić błękitem Coomassie. Frakcja proteazy PS będzie zawierać oczyszczony fragment CENP-F, natomiast frakcja glutationowa będzie zawierać odcięty znacznik GST. Sprawdzić żel w celu oceny wydajności cięcia proteolitycznego.
  12. Skoncentrować eluat z proteazy PS do 0,5 mL, używając wirówkowych jednostek filtrujących z odcięciem masy cząsteczkowej 3 kDa (patrz Tabela Materiałów). Wlać eluat do górnej komory filtra i wirować w odstępach 10-15 min przy 4100 x g w 4 °C (rotor z koszyczkami odchylanymi), aby skoncentrować próbkę. Po każdym etapie wymieszać pipetując.
  13. Podłączyć odpowiednią kolumnę do filtracji żelowej (informacje o zakupie patrz w Tabeli Materiałów) do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i zrównoważyć ją jedną objętością kolumny buforu do filtracji żelowej.
  14. Odwirować skoncentrowany fragment CENP-F w mikrowirówce (20 min, 21 700 x g, 4 °C). Wstrzyknąć próbkę na kolumnę i eluować jedną objętością kolumny buforu do filtracji żelowej. Zbierać frakcje o objętości 0,6 mL.
    UWAGA: Bufor do filtracji żelowej jest zoptymalizowany pod kątem kompatybilności z następującym testem kinazy. Sprawdzić, czy białko docelowe jest stabilne w tym buforze. Jeśli nie jest stabilne, spróbować dodać więcej chlorku sodu.
  15. Przeanalizować frakcje szczytowe za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11). Połączyć frakcje szczytowe zawierające czyste fragmenty CENP-F. Skoncentrować oczyszczone fragmenty CENP-F do 3,3 mg/mL (krok 3.12). Przeanalizować oczyszczone fragmenty CENP-F za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11).
  16. Oznaczanie stężenia białka:
    1. Rozcieńczyć próbkę 1:100 w wodzie ultrapure i umieścić ją w kwarcowej mikrokwecie. Rejestrować widma w zakresie długości fal 220-300 nm w spektrofotometrze.
      UWAGA: Stężenie białka c (mg/mL) wyznacza się z następującego równania:
      Wzór na obliczanie absorbancji dla stężenia, c=(A228.5-A234)×rozcieńczenie/3.14, spektroskopia.
  17. Przygotować alikwoty 50 µL oczyszczonego białka w mikroprobówkach 0,5 mL i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. Przechowywać alikwoty w -80 °C.

4. Oczyszczanie białka rekombinowanego za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA

  1. Przygotować następujące bufory i schłodzić do 4 °C.
    1. Przygotować bufor wiążący His6, stosując 10 mM Tris pH 8.0 w 25 °C, 250 mM NaCl, 5 mM imidazolu pH 8.0 oraz 5 mM BME. BME należy dodać do wszystkich buforów w dniu użycia.
    2. Przygotować bufor płuczący His6 w ten sam sposób co bufor wiążący His6, ale stosując 20 mM imidazolu.
    3. Przygotować bufor eluujący His6 w ten sam sposób co bufor wiążący, ale stosując 150 mM imidazolu.
  2. Odmrozić komórki z Sekcji 2 zawierające konstrukt karyoferyny α i dostosować objętość do 40 mL za pomocą buforu wiążącego His6-. Dodać 5 mM BME, 0,250 mM PMSF, 7 mg chlorku benzamidyny (1 mM) oraz 40 mg D/L metioniny.
    1. Postępować zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.8 z następującymi zmianami: we wszystkich etapach zamiast buforu wiążącego GST należy użyć buforu wiążącego His6. Zamiast agarozy z glutationem, do przygotowania kolumny należy użyć 4 mL żelu powinowactwa niklowego (patrz Tabela materiałów), co da objętość kolumny 2 mL.
      UWAGA: Kolumny powinowactwa niklowego są niekompatybilne z DTT i EDTA. Zamiast żelu powinowactwa niklowego można użyć agarozy z kwasem nitrylotrioctowym (NTA) Ni2+, jeśli stężenie imidazolu w buforze eluującym zostanie zwiększone do 250 mM (patrz Tabela materiałów).
  3. Przepłukać kolumny 8 mL buforu płuczącego His6.
  4. Eluować karyoferynę α za pomocą 12 mL buforu eluującego His6 i przeanalizować eluat metodą SDS-PAGE (krok 3.11).
  5. Dodać 250 µL proteazy PS (krok 3.9) do eluatu i inkubować przez 16-20 h w 4 °C. W międzyczasie przeprowadzić dwukrotną dializę eluatu przeciwko 1 L buforu wiążącego His6 przez 2-20 h, używając membrany dializacyjnej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 6-8 kDa.
  6. Zregenerować kolumnę z żelu powinowactwa niklowego zgodnie z instrukcją producenta. Równoważyć kolumnę 25 mL buforu wiążącego His6. Nanieść zdializowane białko na kolumnę i przeprowadzić etap wiązania zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  7. Zebrać frakcję przepływową, która zawiera oczyszczoną karyoferynę α (z odciętym znacznikiem His6), i eluować pozostałe białko dodatkowymi 4 mL buforu wiążącego His6. Połączyć te frakcje. Następnie eluować kolumny 12 mL buforu eluującego His6. Frakcja ta zawiera zanieczyszczenia.
  8. Przeanalizować nieodciętą i odciętą karyoferynę α z kroków 4.4-4.5 oraz dwie frakcje eluowane z tego etapu za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11), aby ocenić wydajność odcinania znacznika His6 oraz czystość białka.
  9. Skoncentrować karyoferynę α do 8 mg/mL i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie (kroki 3.15-3.17).

5. Analiza aktywności kinazy in vitro z użyciem Cdk1/cykliny B

  1. In vitro test kinazy
    UWAGA: Po otrzymaniu kinazy należy przygotować małe alikwoty, zamrozić je gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zużyć w ciągu 6 miesięcy. Podczas gdy masa cząsteczkowa wynosi 34 kDa dla Cdk1 i 48 kDa dla cykliny B, pozorna masa cząsteczkowa cykliny B w SDS-PAGE wynosi około 60 kDa.
    1. Przygotować 10-krotny bufor PK (dostarczony wraz z kinazą), stosując 0,5 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, 1 mM EDTA, 20 mM DTT, 0,1% Brij 35, pH 7,5 w 25 °C.
    2. Przygotować 10-krotny roztwór stokowy ATP: przygotować roztwór 4 mM ATP w 1-krotnym buforze PK i sprawdzić końcowe pH roztworu stokowego. Przechowywać w małych alikwotach w temperaturze -20 °C, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.
    3. W mikroprobówce o pojemności 0,5 mL wymieszać 40 µL fragmentu CENP-F (o stężeniu 3,3 mg/mL lub 400 µM), 6 µL 10-krotnego buforu PK, 3 µL wody ultrapure, 6 µL 10-krotnego roztworu stokowego ATP oraz 5 µL ludzkiej Cdk1/cykliny B (1 µg, 100 U).
      UWAGA: Fragment CENP-F ma masę molową 8,6 kDa i cztery specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji. W przypadku nowego substratu należy dostosować stężenie kinazy w teście do stężenia molowego białka oraz do liczby miejsc fosforylacji. Aktywność ludzkiej rekombinowanej Cdk1/cykliny B w roztworze stokowym wynosi 20 000 U/mL, a aktywność właściwa 1 000 000 U/mg. 1 U definiuje się jako ilość Cdk1/cykliny B wymaganą do skatalizowania przeniesienia 1 pmol fosforanu na peptydowy substrat Cdk1 PKTPKKAKKL-NH2 (50 µM) w ciągu 1 min w 30 °C (patrz Tabela materiałów).
    4. Przygotować reakcję kontrolną bez Cdk1/cykliny B. Inkubować reakcje w kąpieli wodnej przez 1–16 h w 30 °C.
  2. Przeanalizować 2,5 µL reakcji testu kinazy oraz 2,5 µL kontroli za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11), używając żelu z 16% akryloamidem. Aby zwiększyć rozdzielczość, należy wydłużyć czas prowadzenia elektroforezy.
  3. Do pozostałej części reakcji testu kinazy (oraz do kontroli) dodać równą objętość 6 M roztworu chlorku guanidyny. Końcowe stężenie chlorku guanidyny wyniesie 3 M. Próbki te należy przeanalizować za pomocą spektrometrii mas (Sekcja 6) w celu zidentyfikowania miejsc fosforylacji lub wysłać próbki do pracowni spektrometrii mas w celu analizy, a następnie przeprowadzić weryfikację funkcjonalną (Sekcja 7).
    UWAGA: Dla późniejszej analizy spektrometrią mas bardzo ważne jest, aby wydajność fosforylacji poszczególnych miejsc była jak najwyższa, najlepiej 100%, w przeciwnym razie nie będzie można zmapować miejsc fosforylacji. Aby znacznie zwiększyć wydajność fosforylacji, należy dodać większe ilości Cdk1/cykliny B i wydłużyć czas inkubacji do 16 h. Można również podwoić stężenie ATP.
  4. W celu rozwiązywania problemów należy przeprowadzić test kinazy in vitro dla CENP-F (pozostałości 2987-3065) jako kontrolę pozytywną. Należy używać świeżych partii Cdk1/cykliny B o wysokiej aktywności.

6. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 za pomocą spektrometrii mas

  1. W celu denaturacji i odsolenia próbek białek należy przeprowadzić mikrobore chromatografię cieczową w fazie odwróconej przy użyciu kolumny PLRP300.
  2. Aby określić liczbę miejsc fosforylacji w fragmencie CENP-F, należy przeanalizować nienaruszony, fosforylowany in vitro 84-mer CENP-F za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i jonizacją elektrosprayową (ESI-ITMS)44,45.
  3. W celu oceny lokalizacji miejsc fosfoaminokwasowych CENP-F należy przygotować hydrolizaty trypsynowe próbek białka CENP-F fosforylowanego in vitro. Hydrolizaty trypsynowe należy odsolić za pomocą końcówek do pipet do odsalania.
  4. Hydrolizaty trypsynowe CENP-F należy przeanalizować za pomocą spektrometrii mas z rezonansem cyklotronowym jonów z transformacją Fouriera i jonizacją elektrosprayową (ESI-FTICR MS). Analizę należy przeprowadzić na spektrometrze mas ESI-FTICR przy czasie akumulacji 169 µs.
    UWAGA: Dokładność mas wyznaczonych metodą ESI-FTICR MS mieści się w granicach 0,005 amu. Aby określić stosunek każdej fosforylowanej formy do całkowitej ilości białka, należy wyznaczyć wysokości pików na widmach mas.

7. Weryfikacja funkcjonalna: Badanie wpływu mutacji fosfomimetycznych na oddziaływania białko-białko za pomocą analitycznej chromatografii wykluczania cząsteczkowego

UWAGA: W celu weryfikacji funkcjonalnej zidentyfikowanych miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1, stworzono mutanty fosfomimetyczne fragmentów CENP-F poprzez zastąpienie zidentyfikowanych miejsc fosforylacji asparaginianami. Ujemny ładunek asparaginianu naśladuje efekty fosforylacji. Stworzono mutant S3048D fragmentu CENP-F (reszty 2,987-3,065).

  1. W celu weryfikacji funkcjonalnej porównać wiązanie fragmentów CENP-F typu dzikiego oraz fosfomimetycznych z karyoferyną α. Jako test wiązania zastosować analityczną filtrację żelową. Do analitycznej filtracji żelowej oczyścić fragmenty CENP-F za pomocą chromatografii powinowactwa do glutationu (kroki 3.1-3.12), pomijając etap filtracji żelowej.
  2. Skoncentrować białko do stężenia 5-6 mg/mL. Alikwoty białka zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie (kroki 3.15-3.17).
  3. Zmieszać oczyszczone fragmenty CENP-F (0,1 mg, albo typu dzikiego, albo wariantu S3048D) oraz oczyszczoną karyoferynę α (0,7 mg) w stosunku molowym 1:1. Objętość próbki doprowadzić do 200 µL za pomocą buforu do filtracji żelowej. Próbkę inkubować przez 30 min w lodzie, przefiltrować (porowatość 0,2 µm) i oczyścić poprzez wirowanie (25 min, 21 700 x g, 4 °C).
  4. Próbkę rozdzielić za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów (kroki 3.13-3.14). Zastosować bufor do filtracji żelowej składający się z 20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl oraz 2 mM DTT. Eksperymenty analitycznej filtracji żelowej przeprowadzić w identycznych warunkach dla wszystkich próbek.
  5. Zkalibrować kolumnę do analitycznej filtracji żelowej za pomocą standardów masy cząsteczkowej o znanej masie molowej, zgodnie z opisem producenta.
  6. Frakcje elucyjne analizować za pomocą 16% SDS-PAGE (krok 3.11).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niedawno wykorzystaliśmy test kinazy in vitro (Rycina 1), aby zidentyfikować specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji w fragmencie CENP-F zawierającym cNLS10. Sygnał ten warunkuje lokalizację jądrową CENP-F podczas większości interfazy. W fazie G2 CENP-F jest eksportowany z jądra do cytosolu w sposób zależny od Cdk1. Aby uzyskać wgląd w mechanizmy regulacji lokalizacji komórkowej CENP-F przez Cdk1, przeanalizowaliśmy sekwencj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz test kinazy in vitro jest bardzo skuteczną metodą identyfikacji celów molekularnych dla kinazy Cdk1, która jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego i reguluje wiele ważnych procesów komórkowych. Metoda określa, czy oczyszczone białko jest substratem dla Cdk1 i pozwala na identyfikację określonych miejsc fosforylacji. Ułatwia to badania mechanistyczne nad regulacją procesów komórkowych poprzez fosforylację przez Cdk1.

Najbardziej krytycznym czynnikiem dla pomyślnej identyfikacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Davidowi Kingowi, Howard Hughes Medical Institute, University of California at Berkeley za analizę spektrometrii mas i pomocne komentarze. Dziękujemy dr Xuelian Zhu z Szanghaju, Instytutom Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny, za dostarczenie pełnowymiarowej konstrukcji CENP-F. Na koniec dziękujemy dr Susan Bane, dr Brianowi Callahanowi i dr Christofowi Grewerowi z Uniwersytetu Binghamton za dostęp do sprzętu. Badania te zostały sfinansowane przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku i Wydział Chemii Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Binghamton.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2800 ml przegrodowa kolba FernbachaCorning44232XL
ampicylinaGold BiotechnologyA-301-25
ATPFisher ScientfiicBP413-25
chlorowodorek benzamidynyMillipore SigmaB6506-25
Corning431161
rekombinant Cdk1/cyklina B, ludzki 20 000 U/mlNew England BiolabsP6020
Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)EMD Milipore14-450
Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)InvitrogenPV3292
Cdk1 / cyklina B + 10x bufor PKNew England BiolabsP6020
CENP-F (reszty 2987 i ndash; 3065) plazmid pGEX6P1Dostępne na życzenie.
wirówka: Heraeus Multifuge X3R, chłodzona, z rotorem wychylnym TX-1000Thermo Scientific10033-778
odśrodkowe jednostki filtracyjne: Odśrodkowe jednostki filtracyjne Amicon Ultra-15, odcięcie 3 kDa, membrany Ultracel-PLEMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L metioninaAgros Organics / Fisher
Końcówki do odsalania 125650010: Końcówki do zamków błyskawicznychMillipore SigmaZTC18S008
jednorazowe kolumny chromatograficzne, Econo-Pac 1,5 x 12 cmBiorad7321010
ditiotreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS szczepEMD Millipore71403
jonizacja elektrorozpylania Jon transformacyjny Fouriera
jonizacją elektrorozpylania pułapka jonowa spektrometrmasowy Bruker Amazonniestandardowy
wirnik o stałym kącie: Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
kta Pure FPLCGE Healthcare29032697
Żelowa kolumna filtracyjna: Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
glutation agarozaPierce16101
glutation, zredukowanyMillipore SigmaG4251-50g
wytrząsarka inkubacyjna: Multitron shakerInforsI10102
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydZłoto BiotechnologiaI2481C50
kanamycynaZłoto BiotechnologiaK-120-25
karyoferyna i plazmid pres alfa; pet-28aDostępne na życzenie.
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
mikrowirówka 5418R, chłodzonaEppendorf5401000013
mikroprobówki (0,5 ml)Eppendorf30121023
mikroprobówki (1,5 ml)Eppendorf30120086
Żel powinowactwa do niklu: His-Select Żel powinowactwa do nikluMillipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 plazmidMillipore SigmaGE28-9546-48
fluorek fenylometylosulfonyluZłoto BiotechnologiaP470-10
PS proteaza: Proteaza PreScissionGE Healthcare27084301
Akrylamid ze znacznikiem fosowymWako Pure Chem. Ind.304-93521
zredukowany gluthathionMillipore SigmaG4251-50g
probówki wirówkowe okrągłodenne (probówki Oakridge)Fisher Scientfiic055291D
zestaw do mutagenezy ukierunkowanej: QuikChange LightningAgilent210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: sonifier Branson S-250DBranson15 338 125
Membrana do dializy Spectra/Por 1RC (odcięcie 6-8 kDa)Spectrum Labs08 670B
Rotor wychylny TX-1000Thermo Scientific10033-778
Filtr butelkowy Spektrometr masowy rezonansu cyklotronowego Amazon Apex III spektrometr masowy z System FPLC: Ä

Bibliografia

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31(1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122(2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131(1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242(1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3(2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -J., Kim, H. -S., Seong, Y. -S., Hong, K. -M., Bae, C. -D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88(1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Identyfikacja miejsc fosforylacjioczyszczanie bia ekanaliza spektrometri masanaliza SDS PAGEtest wi zaniasygna lokalizacji j drowejoddzia ywanie z karyoferyn alfaregulacja cyklu kom rkowego
Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.