Artykuł metodologiczny

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

DOI:

10.3791/57674

⸱

3 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, State University of New York at Binghamton

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów i fosforyluje około 8 - 13% proteomu; jednak liczba zidentyfikowanych celów dla Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest nadal niska. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ dostarczają one mechanistycznego wglądu w to, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla wiernej segregacji chromosomów, a defekty w tym skomplikowanym procesie prowadzą do aberracji chromosomowych i raka.

Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który służy do identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście oczyszczone białko jest fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny ludzki Cdk1 / cyklinę B. Pomyślna fosforylacja jest potwierdzana przez SDS-PAGE, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy oraz test wiązania do funkcjonalnej weryfikacji zidentyfikowanych miejsc fosforylacji, który bada interakcję między klasycznym sygnałem lokalizacji jądrowej (cNLS) a jego receptorem transportu jądrowego karioferyną α. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy przeglądu podejść do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 na podstawie sekwencji białek. Razem protokoły te stanowią bardzo skuteczne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki, zwłaszcza w połączeniu z badaniami funkcjonalnymi komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinazy to enzymy, które przenoszą grupy fosforanowe z ATP na substraty i regulują wiele procesów komórkowych. Ta fosforylacja jest odwracalna, szybka, dodaje dwa ładunki ujemne i magazynuje darmową energię i jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych stosowanych przez komórki. Cdk1, który jest również znany jako homolog białka 2 cyklu podziału komórki (CDC2) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów1,2,3,4,5, i fosforyluje około 8-13% proteomu6,7.

Podczas gdy ostatnie badania proteomiczne zidentyfikowały wiele miejsc fosforylacji w białkach, w większości przypadków kinaza odpowiedzialna za te modyfikacje jest nieznana. Liczba znanych celów Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest niska7. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ umożliwia badania mechanistyczne, które określają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego jest ważna dla wiernej segregacji chromosomów i podziału komórek, a niezliczone procesy komórkowe muszą zachodzić, aby wspierać tę ważną funkcję fizjologiczną. Obejmuje to zatrzymanie transkrypcji i translacji przed nadejściem mitozy, a także dramatyczną reorganizację struktury i organizacji komórkowej, taką jak demontaż otoczki jądrowej, kondensacja chromosomów i montaż wrzeciona mitotycznego. Deregulacja i błędy w tych procesach powodują raka, wady wrodzone lub mitotyczną śmierć komórki. Opracowano specyficzne inhibitory Cdk1, takie jak RO-3306 8, które dostarczają potężnych narzędzi do badań funkcjonalnych, a niektóre z tych inhibitorów są obecnie w badaniach klinicznych w leczeniu raka (zobacz9 w celu przeglądu).

Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który pozwala na identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście dostępny na rynku ludzki Cdk1 / cyklina B jest używany do fosforylacji oczyszczonego białka docelowego in vitro. Fosforylacja substratu zwiększa jego masę i dodaje dwa ładunki ujemne; dlatego udana fosforylacja jest potwierdzana przez przesunięcie w górę pasma żelu białkowego na SDS-PAGE. Miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1 są następnie identyfikowane za pomocą analizy spektrometrii mas fosforylowanego białka in vitro. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy również przeglądu narzędzi obliczeniowych i odniesień do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 z sekwencji białka. Ponadto opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy. Wreszcie, zidentyfikowane miejsca fosforylacji muszą zostać zweryfikowane za pomocą badań funkcjonalnych, a w tym celu opisano tutaj prosty test wiązania. W połączeniu jest to bardzo potężne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy7,10,11. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki. Zaleca się jednak funkcjonalną weryfikację uzyskanych miejsc fosforylacji in vitro, ponieważ komórki mają dodatkowe mechanizmy regulacyjne, takie jak modyfikacje potranslacyjne, partnerzy interakcji lub lokalizacja komórkowa, która może sprawić, że miejsca fosforylacji będą dostępne lub niedostępne do rozpoznania przez Cdk1.

Cdk1 rozpoznaje miejsce fosforylacji konsensusu, które składa się z (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), gdzie X to dowolna reszta, a seryna lub treonina to miejsce fosforylacji. Szczególnie ważna dla rozpoznania jest obecność proliny w pozycji +1. Ponadto reszty zasadowe są preferowane w pozycjach +2 lub +3, przy czym większość miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 zawiera Lys lub Arg na pozycji +36,12.

Aktywacja Cdk1 jest ściśle regulowana i prowadzi do wystąpienia mitozy1,2,3,4,5. Aktywność kinaz zależnych od cyklin ogólnie zależy od ich związku z różnymi cyklinami (cyklina A, B, C, D i E u ludzi), które ulegają ekspresji na oscylacyjnych poziomach w całym cyklu komórkowym13. Ekspresja Cdk1 jest stała w całym cyklu komórkowym, a regulacja jej aktywności opiera się na jego powiązaniu z podjednostkami regulatorowymi cykliną A i cykliną B5,13,14,15, a także modyfikacje potranslacyjne. Do aktywacji kinazy wymagane jest wytworzenie kompleksu Cdk1/cyklina B5,14,15,16,17,18. W fazie G2 cyklina B ulega translacji w cytozolu i jest importowana do jądra, gdzie wiąże się z Cdk15,14,15,16,17,18; jednak Cdk1 / cyklina B jest utrzymywana w stanie inaktywowanym przez fosforylację na resztach Thr14 i Tyr15 przez ludzkie kinazy hamujące Cdk1 Myt1 (kinaza hamująca cdc2 specyficzna dla tyrozyny i treoniny specyficzna dla błony) i Wee1, odpowiednio19,20,21. W późnej fazie G2 defosforylacja Thr14 i Tyr15 przez fosfatazę 25 cyklu podziału komórki (cdc25) aktywuje aktywność kinazy kompleksu Cdk1/cyklina B i wyzwala inicjację mitozy12,14,18,20,22,23. Fosforylacja Thr161 jest również wymagana do aktywacji Cdk1 / cykliny B i odbywa się za pośrednictwem Cdk7, kinazy aktywującej Cdk (CAK)18. Degradacja cykliny B w anafazie dezaktywuje Cdk1, umożliwiając wyjście z mitozy24,25. Aktywacja Cdk1/cykliny B jest zatem skomplikowanym procesem. Prezentowany tutaj protokół jest wykonywany z użyciem dostępnego na rynku Cdk1/cykliny B. Podczas rekombinowanej ekspresji tego kompleksu w komórkach owadów jest on aktywowany in vivo przez endogenne kinazy14,20 i pozostaje aktywny w stanie oczyszczonym. Otrzymany w ten sposób aktywny, rekombinowany ludzki Cdk1/cyklina B nadaje się do testów kinazy in vitro.

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w ludzkim białku centromerowym F (CENP-F)10. CENP-F jest białkiem kinetochorowym, które znajduje się w jądrze podczas większości interfazy (faza G1 i S) i jest eksportowane do cytozolu w fazie G226,27,28 w sposób zależny od Cdk110,11. Lokalizacja jądrowa jest nadawana przez dwudzielną klasę cNLS26. cNLS są rozpoznawane przez czynnik transportu jądrowego karyoferyna α, który ułatwia, wraz z β karyoferyny i RanGDP, import ładunku cNLS do jądra29. Eksport jądrowy w fazie G2 jest ułatwiony przez nieznaną ścieżkę eksportu10. Gdy CENP-F znajdzie się w cytozolu, jest rekrutowany do otoczki jądrowej i z kolei rekrutuje kompleks białek motorycznych dynein30,31. Szlak ten jest ważny dla ułożenia jądra odpowiednio do centrosomu podczas początkowych etapów składania wrzeciona mitotycznego w sposób zależny od dyneiny, co jest ważne dla prawidłowego czasu wejścia mitotycznego i dla podstawowego procesu rozwoju mózgu30,31,32. Począwszy od fazy G2, CENP-F jest również montowany w kinetochorze, gdzie odgrywa ważną rolę w wiernej segregacji chromosomów27,28,33,34,35. Kluczowym krokiem regulacyjnym tych ścieżek jest eksport jądrowy CENP-F w fazie G2, który jest zależny od Cdk110,11. Opisujemy tutaj protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w cNLS CENP-F. Mutacje fosfomimetyczne tych miejsc spowalniają import jądrowy CENP-F, co sugeruje, że Cdk1 / cyklina B bezpośrednio reguluje komórkową lokalizację CENP-F poprzez fosforylację jego klasy cNLS10.

Ogólnie rzecz biorąc, ten test kinazy in vitro pozwala na identyfikację specyficznych substratów dla kinazy Cdk1. Oczyszczone białka docelowe są fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny kompleks Cdk1/cyklina B, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 wspiera badania mechanistyczne, które ujawniają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przewidywanie miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 na podstawie sekwencji białek

  1. Przed rozpoczęciem testu kinazy należy przeanalizować sekwencję białka pod kątem przewidywanych miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 i przeszukać literaturę w poszukiwaniu eksperymentalnie ustalonych miejsc fosforylacji o nieznanej specyficzności kinazy. Użyj następujących narzędzi, baz danych i odwołań, które są podsumowywane.
    1. Użyj oprogramowania iGPS 3.036,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php), aby przewidzieć miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1 w docelowej sekwencji białka. Użyj linku tutaj, aby uzyskać kompleksową prognozę, która zawiera adnotacje dotyczące struktury drugorzędnej i dostępności powierzchni.
    2. W oprogramowaniu wprowadź sekwencję białka w formacie FASTA. Aby uzyskać swoistość kinazy, sprawdź kinazę seryny/treoniny, CMGC, CDK, CDC2, CDK1 i odznacz wszystkie inne specyficzności. Wybierz medium jako próg i kliknij przycisk Prześlij.
    3. Porównaj wynikowe przewidywane miejsca z miejscem fosforylacji konsensusu Cdk1 (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg).
    4. Co ważne, sprawdź przewidywane miejsce dla proliny obok fosforylowanej reszty (niektóre substraty Cdk1 są fosforylowane w minimalnym miejscu (Ser/Thr-Pro)6,12). Ponadto sprawdź, czy nie ma resztek zasadowych, które są preferowane w pozycjach +2 lub +3, przy czym większość miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 zawiera Lys lub Arg na pozycji +36,12.
  2. Sprawdź również, czy witryna jest dostępna do rozpoznania, ponieważ obecność pełnej witryny konsensusu nie jest wystarczająca do fosforylacji Cdk1.
    1. Sprawdź dostępność powierzchni i adnotację o przewidywaniu struktury drugorzędnej w danych wyjściowych iGPS, która określa, czy przewiduje się, że teren będzie dostępny; N- i C-końce białek są w wielu przypadkach elastyczne i dostępne do fosforylacji.
    2. Jeśli dostępna jest struktura rentgenowska białka docelowego, sprawdź dostępność przypuszczalnych miejsc fosforylacji, sprawdzając ich położenie w strukturze.
  3. Przeszukaj literaturę w poszukiwaniu eksperymentalnie ustalonych miejsc fosforylacji o nieznanej swoistości kinazy, korzystając z bazy danych UniProtKB/Swiss-Prot 38 (http://www.uniprot.org).
    1. Wpisz nazwę białka w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Szukaj. Wybierz prawidłowy wpis sekwencji. Miejsca fosforylacji są oznaczone i wymienione w sekcji modyfikacji aminokwasów.
    2. Wyszukaj badania proteomiczne ekstraktów mitotycznych ludzkich linii komórkowych7,39,40, które są szczególnie przydatne, ponieważ Cdk1 staje się aktywny w fazie G2 cyklu komórkowego.
  4. Zidentyfikuj dwuczęściowy cNLS za pomocą NLSmapper (opcjonalnie).
    UWAGA: W przypadku białek, które przemieszczają się między cytozolem a jądrem, powszechnym mechanizmem regulacji lokalizacji komórkowej jest fosforylacja dwuczęściowego cNLS w pozycji -1 głównego motywu przez Cdk1. Fosforylacja znosi lokalizację jądrową w fazie G210,41,42,43.
    1. W przypadku takich białek wahadłowych zidentyfikuj cNLS w sekwencji białka za pomocą NLSmapper43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi). Wklej sekwencję białka jako tekst w polu sekwencji, wybierz wynik odcięcia 5,0 i wybierz opcję wyszukiwania NLS w całym regionie. Kliknij przycisk Predict NLS (Przewiduj NLS).
    2. Porównaj wynikowy przewidywany cNLS z konsensusową sekwencją dwudzielnego cNLS, która składa się z motywu podrzędnego (Lys-Arg), łącznika co najmniej 10 reszt i motywu głównego (Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg), gdzie X jest dowolną resztą nienaładowaną ujemnie.
    3. Sprawdź, czy przewidywane miejsce fosforylacji Cdk1 (*) znajduje się w sąsiedztwie głównego motywu w pozycji -1 łącznika: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg.
      UWAGA: Fosforylacja dwudzielnego cNLS w pozycji -1 przez Cdk1 została ustalona jako mechanizm regulacyjny lokalizacji komórkowej dla kilku białek wahadłowych10,41,42,43.

2. Ekspresja białek rekombinowanych w Escherichia coli

  1. Użyj ekspresji plazmidów z kroków 2.1.1-2.1.2 do ekspresji rekombinowanych białek w E. coli.
    1. Aby stworzyć ludzki konstrukt ekspresji CENP-F (reszty 2,987 - 3,065), wygeneruj inserty przez amplifikację fragmentów DNA przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z pełnowymiarowego konstruktu CENP-F (akces GenBank: U19769.1). Użyj następujących starterów: AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAAAGATTCCCG i AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGGGAATACCACTCATG.
      UWAGA: Pełnowymiarowy ludzki plazmid CENP-F został hojnie dostarczony przez dr X. Zhu z Instytutu Nauk Biologicznych Chińskiej Akademii Nauk w Szanghaju w Chinach.
      1. Sklonuj wstawkę do wektora pGEX6p1 z miejscami ograniczeń BamHI i XhoI. Użyj tego plazmidu do ekspresji N-końcowych białek fuzyjnych S-transferazy glutationowej (GST) CENP-F (reszty 2,987-3,065).
        UWAGA: Znacznik GST może zostać odcięty przez proteazę PreScission (zwaną dalej proteazą PS).
    2. W przypadku konstruktu ekspresji ludzkiej α karioferyny wygeneruj wstawki przez amplifikację fragmentów DNA metodą PCR z pełnowymiarowej matrycy cDNA karioferyny α2 (akcesja sekwencji NM_002264.3; startery: GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA i TCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC).
      UWAGA: Ze względu na podobieństwo izoform, ten konstrukt karioferyny α2 jest określany w następnym tekście jako karyoferyna α.
      1. Sklonuj wstawkę do wektora pET28a-pres z witrynami ograniczeń NdeI i XhoI.
        UWAGA: Jest to zmodyfikowany wektor pET28a, w którym sekwencja kodująca miejsce rozszczepienia trombiny została zastąpiona sekwencją kodującą miejsce rozszczepienia proteazy PS. Użyj tego plazmidu do ekspresji białka fuzyjnego α karioferyny z N-końcowymznacznikiem He 6, gdzie znacznik He6 może zostać odcięty przez proteazę PS.
  2. Aby utworzyć mutacje punktowe białka docelowego, należy przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą zestawu.
  3. Ekspresja rekombinowanych białek w E. coli w celu późniejszego oczyszczenia.
    1. Przygotuj następujące zapasy: 50 mg/ml kanamycyny (roztwór podstawowy 1:1,000), 35 mg/ml chloramfenikolu w 70% etanolu (1:1,000), 100 mg/ml ampicyliny (1:1,000) i 1 M izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG; 1:5,000).
    2. Sterylnie przefiltrować wywar i przechowywać w temperaturze -20 °C. W przypadku IPTG należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
    3. Przekształć 1 μl plazmidu ekspresyjnego w 50 μl kompetentnych komórek szczepu E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Umieść kulturę na agarze Luria-Bertani (LB) z chloramfenikolem (35 μg/ml LB) i ampicyliną (100 μg/ml LB) dla konstruktu CENP-F lub chloramfenikolem i kanamycyną (50 μg/ml kultury) dla konstruktu α karioferyny. Inkubować płytki przez 12-20 godzin w temperaturze 37 °C.
    5. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczepij 50 ml LB uzupełnionego antybiotykami (patrz krok 2.3.4). Inkubować kulturę wstępną, wytrząsając z prędkością 160–180 obr./min przez 12–20 godzin w temperaturze 37 °C.
    6. Przygotować 1 l pożywki LB w kolbie Fernbacha o pojemności 2 800 ml z przegrodą. Przygotuj dwie kolby dla każdej kultury wstępnej i sterylizuj je w autoklawie. Aby umożliwić napowietrzenie, nie napełniać kolb więcej niż dwiema trzecimi objętości kolby. Można również stosować kolby Erlenmeyera.
    7. Dodać antybiotyki (krok 2.3.4) i 10 ml sterylnie przefiltrowanego 40% (w/v) roztworu glukozy na 1 l schłodzonego LB. Dodać 20 ml prekultury na 1 l pożywki LB.
      UWAGA: Absorbancja przy 600 nm rozcieńczenia prekultury w stosunku 1:10 powinna wynosić od 0,15 do 0,2.
    8. Inkubować kolby, wytrząsając z prędkością 160-180 obr./min w temperaturze 37 °C. Regularnie mierzyć absorbancję kultury bakterii przy długości fali 600 nm. Jeśli absorbancja osiągnie 0,5-0,6, indukuj ekspresję białka, dodając 0,2 mM IPTG (200 μL 1 M zapasu na 1 l pożywki LB).
      UWAGA: Ważne jest, aby komórki były indukowane z odpowiednią absorbancją. Zwykle dotarcie do tego etapu zajmuje 3-4 godziny.
    9. Inkubować kolby, wytrząsając przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać komórki przez odwirowanie (15 min, 4 100 x g, 4 °C, odchylany rotor). Odrzucić supernatant. Zawiesić osady komórkowe w 20 ml buforu wiążącego GST (CENP-F) lub buforze wiążącym His6 (α karioferyny) na 1 l hodowli. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C.
      1. Przygotować wcześniej bufor wiążący GST (10 mM Tris pH 8,0 w 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM EDTA) i bufor wiążący His6 (10 mM Tris pH 8,0 w 25 °C, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazol pH 8,0, 5 mM β-merkaptoetanol (BME)) .

3. Oczyszczanie białka rekombinowanego metodą chromatografii powinowactwa do glutationu i filtracji żelowej

  1. Wykonaj następujące zapasy: 1 M DTT (1:1,000 zapasów, sterylnie przefiltrowane z rozmiarem porów 0,2 μM i odgazowane); 250 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF; 1:1,000 zapas dimetylosulfotlenku). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotować następujące i schłodzić je do temperatury 4 °C.
    1. Przygotować bufor wiążący GST, używając 10 mM Tris pH 8,0 w temperaturze 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA.
    2. Przygotować bufor elucyjny GST, używając 10 mM zredukowanego glutationu (0,15 g/50 ml) rozpuszczonego w buforze 50 mM Tris pH 8,0 w temperaturze 25 °C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. Upewnij się, że pH końcowego buforu wynosi 8,0 i zużyć w tym samym dniu, w którym został wyprodukowany.
    3. Przygotować żelowy bufor filtracyjny przy użyciu 20 mM Tris pH 7,5 w temperaturze 25 °C, 60 mM NaCl, 2 mM DTT. Sterylny przefiltruj bufor za pomocą filtra butelkowego (wielkość porów 0,2 μM). Odgazować bufor, mieszając w próżni (-6 psi) przez 15 minut.
    4. Dodaj DTT do wszystkich powyższych w dniu użycia.
  3. Rozmrozić komórki z sekcji 2, które zawierają konstrukt CENP-F. Dostosuj objętość do 40 ml za pomocą bufora wiążącego GST. Dodać 1 mM DTT, 0,25 mM PMSF, 0,5 mM EDTA (0,5 M roztwór podstawowy, pH 8,0), 7 mg chlorowodorku benzamidyny (1 mM) i 40 mg D/L metioniny.
    UWAGA: Aby zmniejszyć degradację proteolityczną, wszystkie kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C, najlepiej w chłodnym pomieszczeniu, chyba że zaznaczono inaczej. Utrzymuj komórki, lizaty i oczyszczone frakcje białkowe na lodzie przez cały czas i dodawaj inhibitory proteazy. Aby zapobiec utlenianiu reszt cysteiny i metioniny, dodaj reduktory, takie jak DTT i metionina w dniu eksperymentu. Aby zmniejszyć degradację proteolityczną, szybko wykonaj te kroki.
  4. Lizować komórki w sonikatorze w następujący sposób. Napełnij szklaną zlewkę lizatem i zanurz ją w lodowatej kąpieli wodnej. Sonikuj kulturę (1 min 40 s, przy 100 W (50%) mocy wyjściowej/amplitudzie, z 10 s impulsami i 10 s cyklami spoczynku). Dodać 250 μM PMSF po sonikacji. Sprawdź lizat komórkowy, który powinien wyglądać na bardziej przezroczysty i nie być już lepki.
  5. Oczyścić lizat przez odwirowanie w temperaturze 12 000-40 000 x g, 25 min, 4 °C. Użyć okrągłodennych probówek wirówkowych i wirnika o stałym kącie.
  6. Przeprowadzić równoważenie, dodając 2 ml zawiesiny agarozy glutationowej w stosunku 1:1 do jednorazowej kolumny chromatograficznej. Powstała kolumna będzie miała objętość 1 ml. Przemyć kolumnę 25 ml ultraczystej wody i 25 ml buforu wiążącego GST.
  7. Wykonaj wiązanie w następujący sposób. Pracując w chłodni lub komorze chłodniczej, zdekantować lizat z granulek. Przefiltruj lizat (wielkość porów 0,2 μm) i wlej go do zatkanej kolumny. Zakryć kolumnę i inkubować ją, delikatnie nutując przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Aby umyć kolumnę, umieść ją na stojaku, pozwól żywicy osiąść i zbierz przepływ. Przemyć kolumnę dwukrotnie 25 ml buforu wiążącego GST.
  9. Elute przez rozszczepienie proteolityczne.
    1. Podłącz kolumnę. Dodać 400 μl buforu wiążącego GST i 250 μl proteazy PS (2 mg/ml zapasu o aktywności 1000 U/mg, oczyszczonego w laboratorium lub zakupionego; patrz Tabela materiałów).
    2. Zakryj kolumnę i delikatnie zamieszaj, aby ponownie zawiesić żywicę w buforze. Inkubować kolumny przez 16-20 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 4 ml buforu wiążącego GST, aby wymyć proteolitycznie odcięty fragment CENP-F z kolumny.
  10. Elucja glutationu
    1. Zatkać kolumnę, dodać 4 ml buforu elucyjnego GST (4 objętości kolumny) i inkubować przez 10 minut, aby wymyć związany znacznik GST. Zebrać eluat. Zregeneruj kolumny przed ponownym użyciem zgodnie z opisem producenta.
  11. Analizuj frakcję elucji proteazy PS i frakcję elucji glutationu za pomocą SDS-PAGE na 16% żelach akrylowo-amidowych. Wykonać elektroforezę przy napięciu 25 V/cm przez 45 min. Plamić żele marki Coomassie Blue. Frakcja proteazy PS będzie zawierała oczyszczony fragment CENP-F, podczas gdy frakcja glutationu będzie zawierać rozszczepiony znacznik GST. Sprawdź żel, aby ocenić skuteczność rozszczepienia proteolitycznego.
  12. Zagęścić eluat proteazy PS do 0,5 ml za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących z granicą masy cząsteczkowej 3 kDa (patrz Tabela materiałów). Dodać eluat do górnej komory filtra i odwirować go w odstępach 10-15 minutowych przy 4 100 x g, 4 °C (odchylany wirnik) w celu zagęszczenia próbki. Mieszać pipetując po każdym zwiększeniu.
  13. Podłączyć odpowiednią żelową kolumnę filtracyjną (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o zakupie) do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i zrównoważyć ją z objętością 1 kolumny żelowego buforu filtracyjnego.
  14. Odwirować zagęszczony fragment CENP-F w mikrowirówce (20 min, 21 700 x g, 4 °C). Wstrzyknąć próbkę do kolumny i wymyć ją za pomocą 1 objętości kolumny żelowego buforu filtracyjnego. Zbierz 0,6 ml frakcji.
    UWAGA: Bufor do filtracji żelu jest zoptymalizowany pod kątem kompatybilności z kolejnym testem kinazy. Sprawdzić, czy białko docelowe jest stabilne w tym buforze. Jeśli nie jest stabilny, spróbuj dodać więcej chlorku sodu.
  15. Przeanalizuj frakcje pików za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11). Połącz frakcje pików, które zawierają czyste fragmenty CENP-F. Zagęścić oczyszczone fragmenty CENP-F do 3,3 mg/ml (etap 3.12). Przeanalizuj oczyszczone fragmenty CENP-F za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11).
  16. Oznaczanie stężenia białka
    1. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:100 w ultraczystej wodzie i umieścić ją w mikrokuwecie kwarcowej. Rejestruj widma w zakresie długości fal 220-300 nm w spektrofotometrze.
      UWAGA: Stężenie białka c (mg / ml) wynika z następującego równania:
      figure-protocol-1
  17. Przygotować 50 μl podwielokrotności oczyszczonego białka w mikroprobówkach o pojemności 0,5 ml i błyskawicznie zamrozić je w ciekłym azocie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

4. Oczyszczanie białka rekombinowanego metodą chromatografii powinowactwa Ni-NTA

  1. Przygotować następujące i schłodzić do temperatury 4 °C.
    1. Przygotować bufor wiążący He6 przy użyciu 10 mM Tris pH 8,0 w temperaturze 25 °C, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazol pH 8,0, 5 mM BME. Dodaj BME do wszystkich w dniu użycia.
    2. Przygotować bufor His6-wash w taki sam sposób, jak bufor wiążący His6, ale używając 20 mM imidazolu.
    3. Przygotować bufor 6-elucyjny He w taki sam sposób jak bufor wiążący, ale przy użyciu 150 mM imidazolu.
  2. Rozmrozić komórki z sekcji 2, które zawierają α karioferyny, skonstruować i dostosować objętość do 40 ml za pomocą buforu wiążącego His6. Dodać 5 mM BME, 0,250 mM PMSF, 7 mg chlorowodorku benzamidyny (1 mM) i 40 mg D/L metioniny.
    1. Postępuj zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.8 z następującymi wariantami: Użyj bufora z6 wiązaniami zamiast bufora z wiązaniem GST dla wszystkich kroków. Zamiast agarozy glutationowej użyj 4 ml żelu o powinowactwie do niklu (patrz Tabela materiałów) do wykonania kolumny, która będzie miała objętość kolumny 2 ml.
      UWAGA: Kolumny powinowactwa do niklu są niekompatybilne z DTT i EDTA. Zamiast żelu o powinowactwie do niklu można zastosować agarozę kwasuNi-2+-nitrylotrioctowego (NTA), jeśli stężenie imidazolu w buforze elucyjnym wzrośnie do 250 mM (patrz tabela materiałów).
  3. Przemyć kolumny 8 ml buforu do przemywania6 płuczek.
  4. Eluować α karioferyny za pomocą 12 ml buforu 6-elucyjnego His i analizować eluat za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11).
  5. Dodać 250 μl proteazy PS (etap 3.9) do eluatu i inkubować przez 16-20 godzin w temperaturze 4 °C. W międzyczasie należy dwukrotnie dializować eluat w stosunku do 1 litra buforu wiążącego His6 przez 2-20 godzin, używając membrany dializacyjnej z odcięciem masy cząsteczkowej 6-8 kDa.
  6. Zregeneruj kolumnę żelu o powinowactwie do niklu zgodnie z opisem producenta. Zrównoważyć kolumnę z 25 ml buforu wiążącego His6. Dodać dializowane białko do kolumny i wykonać etap wiązania zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  7. Zebrać przepływ, który zawiera oczyszczoną α kariosferyny (z odciętym znacznikiem His6) i wymyć pozostałe białko dodatkowymi 4 ml buforu wiążącego His6. Połącz te ułamki. Następnie eluuj kolumny 12ml buforu 6-elucyjnego His. Ta frakcja zawiera zanieczyszczenia.
  8. Przeanalizuj rozszczepioną i rozszczepioną α karioferyny z kroków 4.4-4.5 oraz dwie frakcje elucji z tego kroku za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11), aby ocenić skuteczność Jego 6-znacznikowego rozszczepienia i czystości.
  9. Zagęścić karioferynę α do 8 mg/ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie (etapy 3.15-3.17).

5. Test kinazy in vitro z Cdk1/cykliną B

  1. Test kinazy in vitro
    UWAGA: Po przybyciu kinazy należy przygotować małe porcje, zamrozić je błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zużyć w ciągu 6 miesięcy. Podczas gdy masa cząsteczkowa wynosi 34 kDa dla Cdk1 i 48 kDa dla cykliny B, pozorna masa cząsteczkowa cykliny B na SDS-PAGE wynosi około 60 kDa.
    1. Przygotować 10x bufor PK (dostarczany z kinazą) za pomocą 0,5 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, 1 mM EDTA, 20 mM DTT, 0,1% Brij 35, pH 7,5 w 25 °C.
    2. Przygotuj 10x ATP: Przygotuj roztwór 4 mM ATP w 1x buforze PK i sprawdź końcowe pH podstawy. Przechowywać w małych porcjach w temperaturze -20 °C i unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
    3. Wymieszaj 40 μl fragmentu CENP-F (w stężeniu 3,3 mg/ml lub 400 μM), 6 μl 10x bufor PK, 3 μl ultraczystej wody, 6 μl ATP 10x bulion i 5 μl ludzkiego Cdk1/cykliny B (1 μg, 100 U) w mikroprobówce 0,5 ml.
      UWAGA: Fragment CENP-F ma masę molową 8,6 kDa i cztery miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1. W przypadku nowego substratu należy dostosować stężenie kinazy w teście zgodnie ze stężeniem molowym białka i liczbą miejsc fosforylacji. Aktywność ludzkiego rekombinowanego zapasu Cdk1 / cykliny B wynosi 20 000 U / ml, a aktywność właściwa wynosi 1 000 000 U / mg. 1 U definiuje się jako ilość Cdk1 / cykliny B wymaganą do katalizowania transferu 1 pmol fosforanu do substratu peptydu Cdk1 PKTPKKAKKL-NH2 (50 μM) w ciągu 1 minuty w temperaturze 30 °C (patrz tabela materiałów).
    4. Przygotować reakcję kontrolną bez Cdk1/cykliny B. Reakcje inkubować w łaźni wodnej przez 1-16 godzin w temperaturze 30 °C.
  2. Przeanalizować 2,5 μl reakcji oznaczania kinazy i 2,5 μl kontroli za pomocą SDS-PAGE (krok 3.11), używając żelu z 16% akrylamidem. Aby zwiększyć rozdzielczość, wydłuż czas działania.
  3. Dodać równą objętość 6 M roztworu chlorowodorku guanidyny do pozostałej reakcji oznaczania kinazy (i do próby). Końcowe stężenie chlorowodorku guanidyny wynosi 3 M. Próbki te należy przeanalizować za pomocą spektrometrii mas (sekcja 6) w celu zidentyfikowania miejsc fosforylacji lub wysłać próbki do urządzenia do spektrometrii mas w celu analizy, a następnie przeprowadzić weryfikację działania (sekcja 7).
    UWAGA: Dla późniejszej analizy spektrometrii mas bardzo ważne jest, aby skuteczność fosforylacji poszczególnych miejsc była jak najwyższa, najlepiej 100%, ponieważ w przeciwnym razie nie można zmapować miejsc fosforylacji. Aby znacznie zwiększyć wydajność fosforylacji, dodaj większe ilości Cdk1/cykliny B i wydłuż czas inkubacji do 16 godzin. Stężenie ATP można również podwoić.
  4. W celu rozwiązania problemów należy wykonać test kinazy in vitro CENP-F (reszty 2,987-3,065) jako kontrolę pozytywną. Stosować świeże partie Cdk1/cykliny B o wysokiej aktywności.

6. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 za pomocą spektrometrii mas

  1. Aby dokonać denaturacji i odsolenia próbek białek, należy przeprowadzić chromatografię cieczową z odwróconymi fazami mikrootworowymi z kolumną PLRP300.
  2. Aby uzyskać liczbę miejsc fosforylacji we fragmencie CENP-F, należy przeanalizować nienaruszony 84-mer CENP-F fosforylowany in vitro za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową z jonizacją elektrorozpylania (ESI-ITMS)44,45.
  3. Aby ocenić lokalizację CENP-F w miejscu fosfoaminokwasów, należy przygotować trawienia trypsyny z próbek fosforylowanych białek CENP-F in vitro. Odsalić trawienie trypsyny za pomocą końcówek pipet odsalających.
  4. Analizować tryptyczne trawienie CENP-F za pomocą spektrometrii mas rezonansu cyklotronowego rezonansu jonów z transformacją Fouriera metodą elektrorozpylania (ESI-FTICR MS). Przeprowadzić analizę na spektrometrze mas ESI-FTICR o czasie akumulacji 169 μs.
    UWAGA: Dokładność mas wyznaczona przez ESI-FTICR MS mieści się w granicach 0,005 amu. Aby określić ilościowo stosunek każdego fosforylowanego gatunku do całkowitej ilości białka, należy określić wysokości pików widm masowych.

7. Weryfikacja funkcjonalna: Testowanie wpływu mutacji fosfomimetycznych na interakcje białko-białko za pomocą analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość

UWAGA: W celu funkcjonalnej weryfikacji zidentyfikowanych miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1, stworzono fosfomimetyczne mutanty fragmentów CENP-F poprzez zastąpienie zidentyfikowanych miejsc fosforylacji asparaginianami. Ujemny ładunek asparaginianu naśladuje efekty fosforylacji. Stworzono mutanta S3048D fragmentu CENP-F (reszty 2,987-3,065).

  1. W celu weryfikacji funkcjonalnej porównaj wiązanie fragmentów CENP-F typu dzikiego i fosfomimetycznego z α karioferyny. Jako test wiązania należy użyć analitycznej filtracji żelowej. W celu analitycznej filtracji żelowej należy oczyścić fragmenty CENP-F za pomocą chromatografii powinowactwa glutationu (kroki 3.1-3.12) i pominąć etap filtracji żelu.
  2. Skoncentrować białko do 5-6 mg/ml. Błyskawiczne zamrażanie podwielokrotności białek w ciekłym azocie (etapy 3.15-3.17).
  3. Wymieszać oczyszczone fragmenty CENP-F (0,1 mg, typ dziki lub wariant S3048D) i oczyszczoną α karioferyny (0,7 mg) w stosunku molowym 1:1. Dostosować objętość próbki do 200 μl za pomocą żelowego buforu filtracyjnego. Inkubować próbkę przez 30 minut na lodzie, przefiltrować próbkę (porów o wielkości 0,2 μm) i oczyścić próbkę przez odwirowanie (25 min, 21 700 x g, 4 °C)
  4. Oddzielić próbkę metodą chromatografii wykluczającej pod względem wielkości (etapy 3.13-3.14). Użyj żelowego buforu filtracyjnego składającego się z 20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl i 2 mM DTT. Przeprowadzić eksperymenty analitycznej filtracji żelowej w identycznych warunkach dla wszystkich próbek.
  5. Skalibrować analityczną kolumnę filtracyjną w żelu za pomocą wzorców masy cząsteczkowej o znanej masie molowej, zgodnie z opisem producenta.
  6. Przeanalizuj frakcje elucyjne przez 16% SDS-PAGE (krok 3.11).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio użyliśmy testu kinazy in vitro (Rysunek 1) do identyfikacji specyficznych dla Cdk1 miejsc fosforylacji we fragmencie CENP-F, który zawierał cNLS10. Sygnał ten nadaje lokalizację jądrową CENP-F podczas większości interfazy. W fazie G2 CENP-F jest eksportowany z jądra do cytozolu w sposób zależny od Cdk1. Aby uzyskać mechanistyczny wgląd w to, jak Cdk1 reguluje lokalizację komórkową CENP-F, przeanalizowaliśmy sekwencję CENP-F w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz test kinazy in vitro jest bardzo skuteczną metodą identyfikacji celów molekularnych dla kinazy Cdk1, która jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego i reguluje wiele ważnych procesów komórkowych. Metoda określa, czy oczyszczone białko jest substratem dla Cdk1 i pozwala na identyfikację określonych miejsc fosforylacji. Ułatwia to badania mechanistyczne nad regulacją procesów komórkowych poprzez fosforylację przez Cdk1.

Najbardziej krytycznym czynnikiem dla pomyślnej identyfikacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Davidowi Kingowi, Howard Hughes Medical Institute, University of California at Berkeley za analizę spektrometrii mas i pomocne komentarze. Dziękujemy dr Xuelian Zhu z Szanghaju, Instytutom Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny, za dostarczenie pełnowymiarowej konstrukcji CENP-F. Na koniec dziękujemy dr Susan Bane, dr Brianowi Callahanowi i dr Christofowi Grewerowi z Uniwersytetu Binghamton za dostęp do sprzętu. Badania te zostały sfinansowane przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku i Wydział Chemii Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Binghamton.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2800 ml przegrodowa kolba FernbachaCorning44232XL
ampicylinaGold BiotechnologyA-301-25
ATPFisher ScientfiicBP413-25
chlorowodorek benzamidynyMillipore SigmaB6506-25
Corning431161
rekombinant Cdk1/cyklina B, ludzki 20 000 U/mlNew England BiolabsP6020
Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)EMD Milipore14-450
Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)InvitrogenPV3292
Cdk1 / cyklina B + 10x bufor PKNew England BiolabsP6020
CENP-F (reszty 2987 i ndash; 3065) plazmid pGEX6P1Dostępne na życzenie.
wirówka: Heraeus Multifuge X3R, chłodzona, z rotorem wychylnym TX-1000Thermo Scientific10033-778
odśrodkowe jednostki filtracyjne: Odśrodkowe jednostki filtracyjne Amicon Ultra-15, odcięcie 3 kDa, membrany Ultracel-PLEMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L metioninaAgros Organics / Fisher
Końcówki do odsalania 125650010: Końcówki do zamków błyskawicznychMillipore SigmaZTC18S008
jednorazowe kolumny chromatograficzne, Econo-Pac 1,5 x 12 cmBiorad7321010
ditiotreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS szczepEMD Millipore71403
jonizacja elektrorozpylania Jon transformacyjny Fouriera
jonizacją elektrorozpylania pułapka jonowa spektrometrmasowy Bruker Amazonniestandardowy
wirnik o stałym kącie: Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
kta Pure FPLCGE Healthcare29032697
Żelowa kolumna filtracyjna: Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
glutation agarozaPierce16101
glutation, zredukowanyMillipore SigmaG4251-50g
wytrząsarka inkubacyjna: Multitron shakerInforsI10102
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydZłoto BiotechnologiaI2481C50
kanamycynaZłoto BiotechnologiaK-120-25
karyoferyna i plazmid pres alfa; pet-28aDostępne na życzenie.
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
mikrowirówka 5418R, chłodzonaEppendorf5401000013
mikroprobówki (0,5 ml)Eppendorf30121023
mikroprobówki (1,5 ml)Eppendorf30120086
Żel powinowactwa do niklu: His-Select Żel powinowactwa do nikluMillipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 plazmidMillipore SigmaGE28-9546-48
fluorek fenylometylosulfonyluZłoto BiotechnologiaP470-10
PS proteaza: Proteaza PreScissionGE Healthcare27084301
Akrylamid ze znacznikiem fosowymWako Pure Chem. Ind.304-93521
zredukowany gluthathionMillipore SigmaG4251-50g
probówki wirówkowe okrągłodenne (probówki Oakridge)Fisher Scientfiic055291D
zestaw do mutagenezy ukierunkowanej: QuikChange LightningAgilent210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: sonifier Branson S-250DBranson15 338 125
Membrana do dializy Spectra/Por 1RC (odcięcie 6-8 kDa)Spectrum Labs08 670B
Rotor wychylny TX-1000Thermo Scientific10033-778
Filtr butelkowy Spektrometr masowy rezonansu cyklotronowego Amazon Apex III spektrometr masowy z System FPLC: Ä

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31(1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122(2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131(1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242(1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3(2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -J., Kim, H. -S., Seong, Y. -S., Hong, K. -M., Bae, C. -D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88(1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Phosphorylation Site IdentificationProtein PurificationMass Spectrometry AnalysisSDS PAGE AnalysisBinding AssayNuclear Localization SignalKaryopherin Alpha InteractionCell Cycle Regulation

Powiązane artykuły