Artykuł metodologiczny

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

DOI:

10.3791/57684

⸱

1 września 2018

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie ludzkich komórek zrębu endometrium (HESC) od wyglądu podobnego do fibroblastu do wydzielniczej decidua jest transformacją wymaganą do implantacji zarodka w błonie śluzowej macicy matki. Niewłaściwa decydualizacja została uznana za główną przyczynę niepowodzenia implantacji i późniejszego wczesnego poronienia zarodka. Dlatego zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw decydualizacji jest korzystne dla poprawy wskaźnika udanych porodów. Badania in vivo nad sztuczną decydualizacją są często ograniczone ze względu na dylematy etyczne związane z badaniami na ludziach, a także komplikacje translacyjne w modelach zwierzęcych. W rezultacie, testy in vitro poprzez pierwotną hodowlę komórkową są często wykorzystywane do badania modulacji decydualizacji za pomocą hormonów. Badanie to zapewnia szczegółowy protokół izolacji HESC i późniejszej sztucznej decydualizacji poprzez suplementację hormonów do pożywki hodowlanej. Co więcej, badanie to zapewnia dobrze zaprojektowaną metodę eliminacji dowolnego interesującego genu poprzez wykorzystanie transfekcji siRNA na bazie lipidów. Protokół ten pozwala na optymalizację czystości hodowli, a także wydajności produktu, maksymalizując w ten sposób możliwość wykorzystania tego modelu jako niezawodnej metody zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw decydualizacji i późniejszej kwantyfikacji wydzielanych czynników przez decydualizowane komórki zrębu endometrium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiędzy etapami menarche i menopauzy, kobiety w wieku rozrodczym przechodzą miesięczne cykle regulowanej hormonami proliferacji, różnicowania i późniejszego linienia endometrium w ramach przygotowań do ciąży w procesie znanym jako menstruacja1,2. Takie fizyczne modyfikacje ludzkiego endometrium są niezbędne do prawidłowego zagnieżdżenia się zarodka w ścianie macicy1. Zmiany w błonie śluzowej macicy, w tym adaptacje morfologiczne i biochemiczne, są zapośredniczone przez cały cykl menstruacyjny za pośrednictwem hormonów steroidowych jajników estrogenu i progesteronu (P4)3,4,5. W fazie proliferacyjnej (lub folikularnej) wzrasta poziom estrogenów przedowulacyjnych, inicjując pogrubienie endometrium. Po owulacji faza wydzielnicza (lub lutealna) sprzyja znacznemu wzrostowi stężeń P4, indukując morfologiczną transformację komórek zrębu endometrium (ESC) z wyglądu podobnego do fibroblastów do zaokrąglonych, nabłonkowych komórek dziesiętnych w procesie znanym jako decydualizacja4,6. Niewłaściwa decydualizacja została uznana za główną przyczynę niepowodzenia implantacji i późniejszego wczesnego poronienia zarodka4,7,8. Dlatego zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw decydualizacji jest korzystne w diagnostyce i leczeniu wczesnej utraty ciąży.

Obecnie wykorzystuje się kilka metodologii do badania podstawowych skutków decydualizacji na komórki zrębu endometrium. In vivo, macica myszy może być sztucznie wywołana do decydualizacji poprzez stymulację mechaniczną (tj. drapanie) lub wstrzyknięcie oleju do hormonalnie zaszczepionej macicy9. W odróżnieniu od ludzi, ta syntetyczna stymulacja sprzyja różnicowaniu światła macicy, zapewniając pojawienie się obecności blastocysty, co jest krokiem wymaganym do zainicjowania decydualizacji u gryzoni10,11. W związku z tym, ze względu na komplikacje translacyjne związane z modelami zwierzęcymi i dylematy etyczne związane z badaniami in vivo na ludziach, modele oparte na decydualizacji są najskuteczniej badane in vitro.

W tym badaniu, badani są rekrutowani poprzez umieszczanie ogłoszeń zarówno w lokalnych gazetach angielskich, jak i hiszpańskich. Osoby zidentyfikowane jako odpowiedni kandydaci do tego badania są zapraszane na spotkanie z koordynatorem badania, podczas którego omawiane jest pełne ujawnienie potencjalnych zagrożeń. Po potwierdzeniu, że w pełni rozumieją potencjalne związane z tym ryzyko, uzyskuje się zgodę uczestników zarówno w formie pisemnej, jak i ustnej. Zgoda uczestników obejmuje zgodę na (1) poddanie się flebotomii, (2) długotrwałe przechowywanie ich tkanek do przyszłych celów badawczych oraz (3) zgodę na tworzenie pierwotnych kultur z pobranych próbek tkanek. Po wyrażeniu zgody, uczestnicy otrzymują formularz do wypełnienia, w którym dozwolone jest samookreślenie rasy/pochodzenia etnicznego i/lub prawo do nieujawniania informacji. Kolejna wizyta jest zaplanowana w celu wykonania biopsji endometrium na podstawie cyklu menstruacyjnego pacjentki. Ochotnicy zrekrutowani do tego badania odzwierciedlają zarówno etniczną, jak i rasową demografię regionu metropolitalnego St. Louis, udokumentowaną przez Spis Ludności 2012 i nie obejmowały udziału żadnej wrażliwej populacji, w tym kobiet w ciąży, płodów, zarodków, dzieci poniżej 18 roku życia lub innych wrażliwych grup. Wymagania kwalifikacyjne do udziału w pobraniu próbki z biopsji obejmują: (1) bycie w wieku 18-45 lat, (2) regularne cykle miesiączkowe (25-32 dni), (3) brak aktualnej ciąży lub stosowanie hormonalnych/wewnątrzmacicznych środków antykoncepcyjnych przez 30 dni przed włączeniem, (4) brak infekcji pochwy lub chorób przenoszonych drogą płciową, (5) brak aktualnych antybiotyków, oraz (6) brak aktualnego nieprawidłowego rozmazu cytologicznego.

W tym badaniu, ludzkie komórki zrębu endometrium (HESC) są hodowane i sztucznie indukowane do poddania się decydualizacji in vitro poprzez suplementację hormonów (estradiolu (E2), octanu medroksyprogesteronu (MPA) i cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)) do podłoża. W tej metodzie stopień decydualizacji zmienia się na podstawie całkowitej liczby dni leczenia hormonalnego. W połączeniu z rearanżacją cytoszkieletu, suplementacja hormonalna indukuje adaptacje biochemiczne, w których komórki dziesiętne doświadczają cech podobnych do wydzielniczych2,4. Ekspresja charakterystycznych genów, takich jak prolaktyna (PRL) i białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGFBP1), może być wykorzystana do potwierdzenia i ilościowego określenia stopnia decydualizacji HESC 5,12,13,14. Co ważne, wykazano również zdolność tego protokołu do przeprowadzania knockdownu specyficznego dla genu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie biopsje ludzkiego endometrium pobrane do tego badania zostały pobrane z Washington University w St. Louis, Department of Obstetrics and Gynecology przy użyciu zatwierdzonego przez Institutional Review Board (IRB) pisemnego formularza zgody.

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj 500 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), dodając 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do pożywki zawierającej butelkę (dalej określaną jako pożywka HBSS+).
  2. Przygotuj 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium: mieszaniny składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) z czerwienią fenolową, L-glutaminą i 15 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), dodając 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (końcowe stężenie to 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml grzybozyny) do pożywki zawierającej butelkę (dalej określaną jako pożywka izolacyjna HESC).
  3. Przygotuj 500 ml DMEM/F12 z czerwienią fenolową, L-glutaminą i 15 mM HEPES, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x Na2HCO3 i 1% penicyliny (10 000 U / ml) i streptomycyny (10 000 μg / ml) (Pen Strep) do pożywki zawierającej butelkę (dalej określaną jako HESC Media).
  4. Przygotuj 500 ml zredukowanej pożywki surowicy z L-glutaminą, 2,4 g / l wodorowęglanem sodu i HEPES z 2% węglem drzewnym pozbawionej płodowej surowicy bydlęcej (csFBS) i 1% paciorkowca Pen do pożywki zawierającej (dalej określane jako pożywka decydualizacyjna).
  5. Przygotować 500 ml DMEM/F12 wolnego od czerwieni fenolowej, dodając 2% surowicy bydlęcej pozbawionej węgla drzewnego (csFBS) w pożywce zawierającej butelkę (dalej określaną jako pożywka zmieniająca).
  6. Przygotować 10 nM estradiolu (E2), 1 μM octanu medroksyprogesteronu (MPA) i 50 μM cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) w 15 ml polipropylenowej probówce stożkowej i dodać do 2 ml na studzienkę podwielokrotności wcześniej przygotowanych pożywek decydualizacyjnych do testu decydualizacji in vitro (dalej określane jako podłoża EPC).
  7. Przygotuj 50 ml środka do zamrażania z 90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml (dalej określanej jako środek do zamrażania).
  8. Odważyć 25 mg kolagenazy i 5 mg DNazy I w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20°C.

2. Pobranie biopsji endometrium u człowieka

  1. Pobrać próbki biopsji ludzkiej endometrium pobrane w fazie proliferacyjnej (dzień 9 - dzień 12) cyklu miesiączkowego z zatwierdzonej przez IRB kliniki w HBSS.
  2. Umyj próbki biopsji 1 ml podgrzanego podłoża HBSS+ o temperaturze 37 °C i delikatnie wstrząśnij, aby usunąć nadmiar krwi i śluzu.

3. Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium (HESC)

Uwaga: Ta procedura izolacji jest wykonywana w sterylnym środowisku pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przenieść biopsję za pomocą wysterylizowanych kleszczy do stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml świeżego HBSS.
  2. Odwirować biopsję w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 90 s.
    1. Jeśli osad komórkowy pęknie, należy ponownie odwirować biopsję przy 2,000 x g przez 90 s.
  3. Usunąć pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przemyć 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża izolacyjnego HESC o temperaturze 37 °C, a następnie odwirować przy 500 x g przez 90 s.
  4. Usunąć pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml i energicznie dodać 3 ml świeżej pożywki izolacyjnej HESC w celu usunięcia biopsji.
  5. Zdekantować biopsję na szalkę Petriego zawierającą 5 ml pożywki izolacyjnej HESC.
  6. Zmiel biopsję na jak najmniejsze kawałki za pomocą kleszczy #5 i cienkich nożyczek do ściegów prostych przez około 20 minut.
  7. Przygotować enzymy DNazy I i kolagenazy, dodając 10 ml pożywki izolacyjnej HESC do wstępnie zważonej DNazy I (0,5 mg / ml) i kolagenazy (2,5 mg / ml). Wymieszać pipetą.
  8. Pipetą należy wyciąć próbki tkanek za pomocą pipety o pojemności 1 ml do nowej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Przemyć 7 ml pożywki izolacyjnej HESC i dodać do probówki polipropylenowej w celu uzyskania pełnej próbki.
  9. Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej o sile 800 x g przez 2 minuty. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
  10. Przefiltrować roztwór DNazy I i kolagenazy przez filtr 0,2 μm przymocowany do strzykawki o pojemności 10 ml bezpośrednio na osad.
  11. Wiruj przez 10 s, aby ponownie zawiesić pellet.
  12. Wytrawić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny, dokładnie wirując przez 10 s co 10 minut, aż do wytrawienia tkanek.
  13. Przefiltrować próbkę przez sitko o wielkości 40 μm umieszczone na stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia komórek nabłonka i resztek tkanek.
    UWAGA: Komórki zrębu znajdują się w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  14. Odwirować stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml przy 800 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  15. Zawiesić osad w 10 ml pożywki izolacyjnej HESC.
  16. Wirować przy 800 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki HESC i pipetować do przodu i do tyłu, aby wymieszać.
  17. Powoli nakładaj 3 ml pożywki o gradiencie gęstości na zawieszone komórki, aby oddzielić pozostałe komórki krwi od komórek zrębu, uważając, aby nie wymieszać warstw.
  18. Odwirować probówkę polipropylenową o pojemności 15 ml o pojemności 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  19. Zebrać 5 ml supernatantu w nowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać dodatkowe 5 ml pożywki HESC w celu ponownego zawieszenia komórek.
  20. Wirować przy 800 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant i dodać 6 ml pożywki HESC. Wirować próbkę przez 10 s i mieszać pipetując do przodu i do tyłu 5 razy.
  21. Podwielokrotność 10 μl ponownie zawieszonych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu zliczenia komórek.
  22. Dodać 10 μl 0,4% barwnika błękitu trypanowego do podwielokrotności komórek i wymieszać z pipetą. Załadować 10 μl podwielokrotności i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  23. Umieść komórki w odpowiedniej kolbie w zależności od całkowitej liczby komórek w 15 ml pożywki HESC.
    1. Jeśli całkowita liczba komórek jest mniejsza niż 1 milion, umieść wszystkie komórki w kolbie o średnicy 25 cm z 6 ml pożywki HESC. Jeśli całkowita liczba komórek jest większa niż 1 milion, umieść wszystkie komórki w 75-centymetrowej kolbie z 15 ml pożywki HESC.
  24. Hodować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 6 godzin, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek i zmienić pożywkę na pożywkę HESC.
  25. Hodować wyizolowany HESC w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez okres 3-5 dni, aż komórki utworzą monowarstwę osiągającą 80-90% zbieżność w kolbie platerowanej.
  26. Zmieniaj nośnik HESC co dwa dni.
    1. Ciepłe media HESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-20 min.
    2. Odessać pożywkę z kolby i dodać do niej świeże pożywki HESC (objętość robocza: odpowiednio 8 ml lub 16 ml na kolbę 25 cm lub 75 cm).
    3. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia 80-90% zlewu.
  27. Gdy HESC stanie się zlewny w 80 - 90%, przenieś komórki z kolby 25 cm do 75 cm lub z jednej kolby 75 cm do trzech kolb 75 cm.
    UWAGA: HESC można w tej chwili zamrozić i przechowywać do późniejszego wykorzystania do przyszłych eksperymentów.

4. Zamrażanie i rozmrażanie HESC

  1. Odessać pożywkę z kolby o średnicy 75 cm i dodać 2 ml trypsyny-EDTA.
  2. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C, aż komórki usuną się z kolby.
  3. Dodać 7 ml pożywki HESC i dobrze wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu.
  4. Wirować przy 800 x g przez 2,5 minuty i odsysać supernatant.
  5. Oznacz probówki do zamrażania linią komórkową, datą i numerem przejścia.
  6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki do zamrażania.
  7. Porcję 1 ml ponownie zawieszonego HESC do każdej probówki i przenieść probówki do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
  8. Przenieś probówki do ciekłego azotu w ciągu 24 godzin.
    UWAGA: Jeśli planujesz rozmrożenie komórek w najbliższej przyszłości, przechowuj zamrożone komórki w temperaturze -80 °C przez jeden miesiąc.
  9. W celu rozmrożenia HESC podgrzewaj media HESC przez 20 minut.
  10. Dodać 8 ml podgrzanej pożywki HESC do kolby o średnicy 25 cm.
  11. Wyjmij probówkę do zamrażania ze zbiornika ciekłego azotu lub -80 °C i zanurz probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty w celu rozmrożenia komórek.
  12. Przenieść rozmrożony HESC do 25-centymetrowej kolby z pożywką HESC i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc w temperaturze 37 °C.
  13. Następnego dnia zmień pożywkę HESC i odczekaj 2-3 dni, aż HESC zacznie się zlewać i przenieś komórki do kolby o średnicy 75 cm, jak opisano poniżej w Protokole 5.
    1. Ciepłe media HESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-20 min.
    2. Odessać pożywkę z kolby i dodać do niej świeże pożywki HESC (objętość robocza: odpowiednio 8 ml lub 16 ml na kolbę 25 cm lub 75 cm).
    3. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia 80-90% zlewu.

5. Hodowla ludzkich komórek zrębu endometrium (HESC)

Uwaga: Ta procedura hodowli jest przeprowadzana w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Podgrzej pożywkę HESC w temperaturze 37°C w łaźni wodnej przez 20-30 min.
  2. Odessać pożywkę z kolby i dodać 0,25% trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (1 ml dla kolby 25 cm lub 2 ml dla kolby 75 cm).
  3. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, aż komórki się usuną.
  4. Delikatnie postukaj w ścianki kolby, aby usunąć pozostałe komórki. Dodać 7 ml pożywki HESC i dobrze wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu.
  5. Odpipetować mieszaninę komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 800 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce HESC.
    1. Dodać 15 ml do kolby 25 cm lub 45 ml do kolby 75 cm (po 15 ml każda).
  7. Dodać 5 ml lub 15 ml zawiesiny komórek odpowiednio do każdej kolby o średnicy 25 cm lub 75 cm.
  8. Hodować wyizolowany HESC w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez okres 3-5 dni, aż komórki utworzą monowarstwę osiągającą 80-90% zbieżność w kolbie platerowanej.
  9. Zmieniaj nośnik HESC co dwa dni.
    1. Ciepłe media HESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-20 min.
    2. Odessać pożywkę z kolby i dodać do niej świeże pożywki HESC (objętość robocza: odpowiednio 8 ml lub 16 ml na kolbę 25 cm lub 75 cm).
    3. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia 80-90% zlewu.

6. Posiewanie ludzkich komórek zrębu endometrium (HESC) i transfekcja siRNA

Uwaga: Ta procedura transfekcji jest wykonywana w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Odessać pożywkę HESC z kolby o średnicy 75 cm i dodać 2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
  2. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, aż komórki się usuną.
  3. Po wyjęciu komórek z kolby dodać 7 ml pożywki HESC i delikatnie wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu 5 razy.
  4. Odpipetować mieszaninę komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 800 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml HESC Media.
    UWAGA: W przypadku posiewu komórek z więcej niż jednej kolby, po prostu zwiększ objętość pożywki HESC.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    1. Podaniec 10 μl ponownie zawieszonych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 10 μl 0,4% barwnika błękitu trypanowego do podwielokrotności komórek i mieszać, pipetując do przodu i do tyłu.
  6. Płytka 0,8 x 105 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych. Po dwóch dniach komórki powinny być zlewane w 60-70%, aby zapewnić optymalną transfekcję.
  7. Dla każdej próbki transfekcji siRNA należy przygotować kompleksy przy użyciu siRNA (60 nanomoli) do odczynnika do transfekcji.
  8. Rozcieńczyć 5 μl odczynnika do transfekcji w 150 μl zredukowanej pożywki wolnej od surowicy i inkubować przez 5 minut.
  9. Rozcieńczyć 60 nanomoli siRNA w 100 μl zredukowanej pożywki wolnej od surowicy i inkubować przez 5 minut.
  10. Po 5 minutach połączyć rozcieńczone siRNA z rozcieńczonym roztworem odczynnika do transfekcji i delikatnie wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu 5 razy.
    UWAGA: W przypadku transfekcji jednego lub więcej siRNA w wielu studzienkach, przygotuj mieszankę wzorcową w probówkach polistyrenowych o pojemności 10 ml.
  11. Inkubować kompleksy odczynników do transfekcji siRNA przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Podczas tej inkubacji dodaj 1 ml pożywki Change do każdego dołka.
  13. Po 5 minutach inkubacji odwirować probówki o masie 500 x g przez 2 minuty w celu zebrania roztworu i dodać 250 μl kompleksów odczynników do transfekcji siRNA do każdej studzienki zawierającej komórki i pożywkę.
  14. Wymieszać, delikatnie kołysząc i inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 5 godzin.
  15. Po 5 godzinach zmień nośnik na HESC Media.
  16. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 2 dni w celu przygotowania do testu decydualizacji in vitro.

7. Test decydualizacji in vitro

Uwaga: Ten test jest przeprowadzany w sterylnym środowisku pod koterią bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przygotować pożywkę EPC przed rozpoczęciem leczenia decydualizacyjnego in vitro, jak opisano w Camden i wsp.3 (Zobacz 1.6).
  2. Odessać pożywkę z transfekowanej linii HESC po 48 godzinach, inkubowanej od kroku 6.16.
  3. Dodaj 2 ml pożywki EPC do każdej studzienki.
    Uwaga: Jako kontrolę, pozostaw jeden zestaw komórek nietraktowany pożywką EPC. Zamiast tego dodaj 2 ml pożywki HESC do studzienek kontrolnych.
  4. Inkubować komórki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 dni.
    1. Zmieniaj nośnik EPC co 48 godzin.
      1. Podgrzej i przygotuj EPC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-20 min.
      2. Odessać pożywkę ze studni i dodać świeże podłoże EPC.
      3. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Po szóstym dniu przeanalizuj zakres decydualizacji komórek zrębu za pomocą ELISA i qRT-PCR (jak opisano poniżej).

8. Walidacja decydualizacji in vitro z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Uwaga: qRT-PCR został zakończony zgodnie z wcześniejszym opisem w Kommagani et al10.

  1. Wyizoluj całkowite RNA z HESC, korzystając z protokołu z dostępnego na rynku zestawu do izolacji RNA.
    1. Przeanalizuj ilość i czystość RNA (A260/A280) przy użyciu NanoDrop lub podobnej metodologii, jak opisano w Garcia-Elias et al15.
  2. Zsyntetyzuj cDNA z 1 μg całkowitego RNA za pomocą dostępnego na rynku protokołu zestawu do odwrotnej transkrypcji.
  3. Przeprowadź reakcję qRT-PCR zgodnie z opisem w dostępnym na rynku protokole zestawu qRT-PCR.
    1. Przeprowadź reakcję przy użyciu dostępnego na rynku Real-Time PCR Master Mix i sond specyficznych dla genów wraz z wewnętrznymi kontrolami systemu (18s, PRL i IGFBP1).

9. Walidacja decydualizacji in vitro za pomocą testu ELISA

  1. Określ ilościowo poziomy wydzielanej prolaktyny z pożywki do hodowli tkankowej, korzystając z dostępnego na rynku zestawu prolaktyny ELISA.

10. Walidacja decydualizacji in vitro z wykorzystaniem barwienia falloidyną.

  1. Włożyć sterylne szkiełka nakrywkowe do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
  2. Powtórz kroki 6.1 - 6.5.
  3. Płytka 0,8 x 105 komórek na dołek płytki 12-dołkowej.
  4. Inkubować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
  5. Zassać media.
  6. Powtórz kroki 7.3 - 7.4.
  7. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  8. Odessać roztwór utrwalający i przemyć 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut każdy.
  9. Dodaj 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego w PBS przez 5 minut do utrwalonych komórek, aby zwiększyć przepuszczalność.
  10. Umyj 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut każdy.
  11. Dodać 100 μl roztworu falloidyny na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
    1. Przygotować rozcieńczenie w PBS w stosunku 1:100 przy użyciu roztworu podstawowego falloidyny w 1 jednostce na 5 μl.
  12. Umyj 3 razy 1 ml PBS przez 5 minut każdy.
  13. Zamontuj szkiełka za pomocą podłoża montażowego zawierającego 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Obserwuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziesiętna w kulturze HESC

Po izolacji, ludzkie komórki zrębu endometrium zostały wyhodowane do jednowarstwowej formacji z 80-90% konfluencją i wywołane do decydualizacji in vitro poprzez traktowanie 10 nM E2, 1 μM MPA i 50 μM cAMP (EPC). Przesunięcia morfologiczne związane z decydualizacją in vitro zostały zwizualizowane w Rysunek 1A. Po decydualizacji HESC ulegają rearanża...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żeński reprodukcyjny cykl menstruacyjny charakteryzuje się wzrostem poziomu progesteronu w całej fazie lutealnej, indukując w ten sposób decydualizację ESC do okrągłych, podobnych do nabłonka komórek wydzielniczych 3,8. Inicjacja decydualizacji jest zależna od gatunku. U ludzi decydualizacja następuje spontanicznie po wzroście stężenia progesteronu, podczas gdy myszy wymagają obecności blastocysty10,11. T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta jest wspierana przez fundusze z grantu National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R00 HD080742) oraz funduszy początkowych Washington University School of Medicine dla R.K. Chcielibyśmy podziękować Klinice Niepłodności Uniwersytetu Waszyngtońskiego za dostarczenie próbek biopsji endometrium.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Opti-MEM I (1X) Zredukowane podłoże surowicyGibco31985-070Do pożywki decydualizacyjnej
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypanowa niebieska plama (0,4%)Gibco15250-061Do liczby komórek
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018ADo izolacji/oczyszczania RNA
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems4374967
Eukariotyczna kontrola 18S rRNA Endogennetechnologie życia4319413EDo kontroli wewnętrznej qPCR
Test ekspresji genów TaqMan Sonda prolaktynyApplied Biosystems4331182do kontroli wewnętrznej qPCR
Ekspresja genu TaqMan Test IGFBP1 SondaApplied Biosystems4331182do kontroli wewnętrznej qPCR
Odczynnik Phalloidin-iFluor 488 - CytoPainterAbcamab176753
Zestaw ELISA dla ludzkiej prolaktynyInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldehydAlfa Aesar30525-89-4Utrwalacz
Lipofectamina RNAiMAXInvitrogen13778150Odczynnik do transfekcji
ProLong Gold przeciw blaknięciu z DAPIInvitrogenP36935Do montażu
0,25% Trypsyny-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122
Węgiel drzewny Pozbawiona płodu surowica bydlęcaSigmaF6765-500ML
Wodorowęglan sodu (7,5%)Gibco25080-094
Odczynnik Ficoll-Paque PLUSFisher Scientific45001749
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydłaSigmaDN25-100MG
17-octan medroksyprogesteronuSigmaM1629-1Gdo podłoża EPC
EstradiolSigmaE1024-1GDla EPC Media
cAMPSigmaA6885-100MGDla EPC Media
Nożyczki do cienkiego ściegu prostegoFine Science Tools15396-00
Test ekspresji genów TaqMan Sonda NCOA2Zastosowane biosystemy4351372
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznieGibco10-082-147
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczyThermo Naukowy15240062
Hank' s Zrównoważony roztwór soli Corning21-021-cv
50 ml stożkowa rurka polipropylenowa FalconCorning352098
Dumont #5/45 KleszczeFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Szklana szalka PetriegoVWR75845-546
Sitko komórkowe 40 mikronówMidsci229481
Isotemp 215 Łaźnia wodnaFisher ScientificFS-215
Wirówka LSE Corning6755
Ludzkie NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Sonda qPCR specyficzna dla genu
Inkubator CO2 i160 w cyklu sterycznym Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000do oznaczania ilościowego RNA
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Fisher Scientific 50146771
75 cm kolba do hodowli komórkowych z przechyloną szyjkąCorning430641U
6-ciodzielna niepirogenna płytka do hodowli komórkowychKontroler pipet Corning3506
UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm kolba do hodowli komórkowych z pochyloną szyjkąCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 ml stożkowa polipropylenowa probówka FalconCorning352099
10 ml
1300 Series A2Thermo Scientific1377
accuspin Micro17Fisher Scientific13100675
7500 Fast system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems3052632
Mikroskop immunofluorescencyjny EVOS FLLife Technologies01414-155G-291
Mikroskop Leica ze światłem odwróconym LeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Arkusze kalkulacyjne Excel Microsoft2016
Deckglaser 18 mmNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-merkaptoetanolFisher BioodczynnikiBP176-100Do buforu do lizy RNA
1,2 ml Polipropylenowa fiolka kriogeniczna z gwintem zewnętrznymCorning430658Do zamrażania komórek HESC 
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650-100mLDo zamrażania
Okap bezpieczeństwa biologicznego BD 302995

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937(2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900(2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436(2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725(2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek zr butransfekcja siRNAwyciszanie gen wsuplementacja hormonamigradient g sto citrawienie kolagenazekspresja prolaktynyreorganizacja cytoszkieletu

Powiązane artykuły