Artykuł metodologiczny

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57687

⸱

3 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Streszczenie

Transdyferencjacja jednego typu komórek somatycznych w inny ma ogromny potencjał do modelowania i leczenia chorób ludzkich. Wcześniejsze badania wykazały, że fibroblasty embrionalne, skórne i sercowe myszy mogą być przeprogramowane w funkcjonalne indukowane komórki podobne do kardiomiocytów (iCM) poprzez nadekspresję kardiogennych czynników transkrypcyjnych, w tym GATA4, Hand2, Mef2c i Tbx5, zarówno in vitro, jak i in vivo. Jednak te wcześniejsze badania wykazały stosunkowo niską skuteczność. Aby przywrócić funkcję serca po urazie, należy wyjaśnić mechanizmy rządzące przeprogramowaniem serca w celu zwiększenia wydajności i dojrzewania iCM.

Wcześniej wykazaliśmy, że hamowanie sygnalizacji pro-fibrotycznej znacznie zwiększa efektywność przeprogramowywania. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metody osiągania wydajności przeprogramowania do 60%. Ponadto opisujemy kilka metod, w tym cytometrię przepływową, obrazowanie immunofluorescencyjne i obrazowanie wapnia w celu ilościowego określenia wydajności przeprogramowania i dojrzewania przeprogramowanych fibroblastów. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, można przeprowadzić badania mechanistyczne w celu określenia pozytywnych i negatywnych regulatorów przeprogramowania serca. Badania te mogą zidentyfikować szlaki sygnałowe, które mogą być ukierunkowane w celu promowania wydajności przeprogramowania i dojrzewania, co może prowadzić do nowych terapii komórkowych w leczeniu chorób serca u ludzi.

Wprowadzenie

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych1. Około 800 000 Amerykanów doświadcza pierwszego lub nawracającego zawału mięśnia sercowego (MI) rocznie1. Po zawale serca śmierć kardiomiocytów (CM) i zwłóknienie serca, odkładane przez aktywowane fibroblasty serca, upośledzają czynność serca2,3. Progresja niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego jest w dużej mierze nieodwracalna ze względu na słabą zdolność regeneracyjną dorosłych CMs4,5. Podczas gdy obecne terapie kliniczne spowalniają postęp choroby i zmniejszają ryzyko przyszłych zdarzeń sercowych6,7,8,9, żadne terapie nie cofają postępu choroby z powodu niezdolności do regeneracji CM po zawale10. Pojawiają się nowe terapie komórkowe w leczeniu pacjentów po zawale mięśnia sercowego. Rozczarowujące jest to, że dotychczasowe badania kliniczne nad dostarczaniem komórek macierzystych do serca po zawale mięśnia sercowego wykazały niejednoznaczny potencjał regeneracyjny11,12,13,14,15,16,17,18.

Generowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) z fibroblastów poprzez nadekspresję czterech czynników transkrypcyjnych, po raz pierwszy zademonstrowane przez Takahashi i Yamanakę, otworzyło drzwi do nowych przełomów w terapii komórkowej19. Komórki te mogą różnicować się we wszystkie trzy listki zarodkowe19, a kilka bardzo wydajnych metod generowania dużej liczby CM zostało wcześniej pokazanych20,21. CM pochodzące z HiPSC (hiPS-CMs) stanowią potężną platformę do badania kardiomiogenezy i mogą mieć ważne implikacje dla naprawy serca po urazie. Jednak hiPS-CM napotykają obecnie przeszkody translacyjne z powodu obaw o powstawanie potworniaków22, a ich niedojrzała natura może być proarytmogenna23. Przeprogramowanie fibroblastów w hiPSC wzbudziło zainteresowanie bezpośrednim przeprogramowaniem fibroblastów na inne typy komórek. Ieda i wsp. wykazali, że nadekspresja GATA4, Mef2c i Tbx5 (GMT) w fibroblastach powoduje bezpośrednie przeprogramowanie do linii serca, aczkolwiek przy niskiej wydajności24. Wydajność przeprogramowania została poprawiona dzięki dodaniu Hand2 (GHMT)25. Od czasu tych wczesnych badań wiele publikacji wykazało, że zmiana koktajlu czynników przeprogramowujących za pomocą dodatkowych czynników transkrypcyjnych26,27,28,29, modyfikatory chromatyny30,31, microRNAs32,33, lub małe cząsteczki34 prowadzi do poprawy efektywności przeprogramowania i/lub dojrzewania indukowanych komórek kardiomiocytów (iCM).

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół generowania iCM z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z wysoką wydajnością. Wcześniej wykazaliśmy, że koktajl GHMT ulega znacznej poprawie po dodaniu miR-1 i miR-133 (GHMT2m) i jest dalej ulepszany, gdy pro-zwłóknieniowe szlaki sygnałowe, w tym szlaki sygnałowe transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) lub szlaki sygnałowe kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) są hamowane35. Korzystając z tego protokołu, pokazujemy, że około 60% komórek wyraża sercową troponinę T (cTnT), około 50% wyraża α-aktyninę, a dużą liczbę bijących komórek można zaobserwować już w 11 dniu po transdukcji czynników przeprogramowujących i leczeniu inhibitorem receptora TGF-β typu I A-83-01. Co więcej, te iCM wyrażają białka połączeń szczelinowych, w tym koneksynę 43, i wykazują spontaniczne skurcze i stany przejściowe wapnia. Ta wyraźna poprawa wydajności przeprogramowywania w porównaniu z wcześniejszymi badaniami pokazuje potencjał do regeneracji CM z endogennych populacji komórek, które pozostają w sercu po zawale serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Kampusie Medycznym UC Denver Anschutz.

1. Izolacja MEFów

  1. Kup ciężarne myszy C57BL/6 w E13. Wyślij z dnia na dzień.
  2. Poddać matkę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC (np. ~1,3 l/min CO2 do momentu, gdy zwierzę wydaje się martwe, a następnie zwichnięcie szyjki macicy)
  3. Spryskaj matkę 70% etanolem i otwórz jamę brzuszną. Usunąć róg macicy zawierający zarodki i umieścić w 10 cm naczyniu ze sterylnym PBS.
  4. Wykonaj nacięcie w woreczku zarodkowym, aby uwolnić zarodek. Przenieść zarodek do czystego 10 cm naczynia ze sterylnym PBS. Spłukać.
  5. Przetnij ciało poniżej wątroby i odrzuć głowę i górną część ciała. Usuń narządy wewnętrzne i wyrzuć. Przenieś pozostałą tkankę do czystego 10-centymetrowego naczynia ze sterylnym PBS i przenieś płytkę do szafki o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 lub 2. Połącz tkanki ze wszystkich zarodków w czystym, suchym naczyniu o średnicy 10 cm i zmiel na drobne kawałki.
  6. Dodaj 6 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA do rozdrobnionych zarodków. Rozetrzeć kilka razy pipetą, aby rozbić tkankę. Inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej (Tabela 1). Objętość pożywki jest dostosowywana w zależności od liczby pobranych zarodków. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować proporcje około 25 ml pożywki wzrostowej na 1,2 zarodka.
  8. Umieść 25 ml zawieszonych komórek w naczyniu o średnicy 15 cm. Po 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 25 ml świeżej pożywki do każdej płytki.
  9. Po 72 godzinach dodaj 2 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA do każdej 15 cm szalki. Gdy komórki odłączą się od naczynia hodowlanego, dezaktywuj trypsynę za pomocą 15 ml pożywki wzrostowej i zbierz komórki w stożkowych probówkach polistyrenowych o pojemności 50 ml. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 160 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce wzrostowej i przefiltrować przez sitko do komórek porowych o wielkości 70 μm.
  10. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zamroź MEF-y w 2 milionach komórek porcji w pożywce do zamrażania (10% DMSO, 25% FBS w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM)/Wysoki poziom glukozy Dulbecco) w temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieś komórki do ciekłego azotu i przechowuj do momentu użycia.
    UWAGA: Globalna ekspresja genów w MEF została sprofilowana przy użyciu tego protokołu przez sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) w celu zapewnienia uwierzytelnienia komórki. Dane sekwencyjne RNA z komórek ENCODE MEF zostały pobrane z NIH Gene Expression Omnibus (GEO) o numerze dostępu GSE93454. Dane dotyczące ekspresji genów RNA-seq dla używanych przez nas MEF zostały zdeponowane w NIH GEO o numerze akcesyjnym GSE71405. Te dwa zestawy danych zostały połączone zgodnie ze wspólnymi symbolami genów. Dane wyrażeń zostały następnie przekształcone logarytmicznie i wygenerowano wykres rozrzutu danych wyrażeń dla naszych MEF i ENCODE MEF, który pasował do linii regresji liniowej (Rysunek 1A). MEF-y wyizolowane przy użyciu tego protokołu są molekularnie podobne do tych wyizolowanych przez inne laboratoria.

2. Produkcja retrowirusa i transdukcja MEF-ów

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w tej sekcji muszą być wykonane w Szafie Bezpieczeństwa Biologicznego poziomu 2. Ponieważ protokół ten wykorzystuje transdukcję retrowirusową, należy upewnić się, że podjęto środki ostrożności, w tym traktowanie wszystkich odpadów zawierających pożywki wirusowe 10% wybielaczem przez co najmniej 20 minut. Zapoznaj się z Rysunek 1B, aby zapoznać się z harmonogramem przeprogramowania.

  1. Produkcja retrowirusa przy użyciu linii komórkowej Platinum E (PE)
    1. Utrzymuj komercyjnie dostępne komórki PE w pożywce PE (Tabela 1) zawierającej markery selekcyjne blasticydyny i puromycyny, aby zapewnić ekspresję genów gag-pol i env w celu wydajnej produkcji cząstek retrowirusowych36. Komórki pasażowe w stosunku 1:4 lub 1:5 co dwa dni. Należy uważać, aby zapobiec przepełnieniu komórek, ponieważ może to zmniejszyć wydajność produkcji retrowirusowej.
    2. W dniu -1 wysiewać około 5 x 106 komórek na 10 cm szalkę w pożywce wzrostowej (Tabela 1) 16-20 godzin przed transfekcją (patrz Tabela 2 w celu uzyskania gęstości posiewu dla innych standardowych rozmiarów szalek do hodowli komórkowych). Delikatnie roztrząśnij naczynia kilka razy w przód i w tył i ostrożnie umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby zapewnić równomierne rozprowadzenie posiewu (patrz Rysunek 1C dla optymalnej gęstości posiewu przed transfekcją).
      UWAGA: Należy uważać, aby przed transfekcją umieścić komórki PE w pożywce wolnej od markerów selekcyjnych, aby upewnić się, że pożywka zawierająca wytworzone cząstki retrowirusowe nie zabija MEF.
    3. W dniu 0 przygotuj DNA do transfekcji. W przypadku transfekcji na 10 cm należy dodać 2 μg każdego współczynnika przeprogramowania — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) — do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą 2, aby przeskalować ilość DNA potrzebną do transfekcji innych standardowych rozmiarów naczyń do hodowli komórkowych.
    4. Do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml dodać 360 μl zredukowanej pożywki surowicy. Następnie dodać 36 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie strzepnąć probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Aby uniknąć zmniejszenia wydajności transfekcji, ostrożnie dodaj odczynnik do transfekcji bezpośrednio do zredukowanej pożywki surowicy.
    5. Dodaj zredukowaną mieszaninę pożywki surowicy/odczynnika do transfekcji do koktajlu DNA GHMT2m. Delikatnie strzepnij probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nie wirować.
    6. Mieszaninę reakcyjną dodawać kroplami do komórek PE, delikatnie obracać pożywką przez 10-15 s i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Według producenta, komórki PE generują średnie miano od 106 do 107 jednostek zakaźnych/ml. Protokół ten generuje około 2 x 106 jednostek infekcji/ml przez 24 godziny i 6 x 106 jednostek infekcji/ml przez 48 godzin, co daje średni MOI wynoszący 4. Transfekcja GFP/DsRed może być również stosowana jako substytut skuteczności transfekcji/transdukcji, jeśli jest to pożądane; Oczekuje się, że wydajność transfekcji przekroczy 90% w ciągu 48 godzin (Rysunek 1C).
  2. Transformacja MEF
    1. W dniu 0 pokryć naczynia kolagenem i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 2 godziny.
    2. Usuń MEF z ciekłego azotu i rozmroź. Płytka 0,2 x 106 komórek na 60 mm szalka w pożywce. Delikatnie kołysz płytki, aby zapewnić równomierne rozłożenie posiewu i umieść je w inkubatorze (patrz Rysunek 1C dla optymalnej gęstości posiewu i Tabela 2 dla gęstości posiewu dla innych standardowych rozmiarów naczyń do hodowli komórkowych).
      UWAGA: Te gęstości poszycia zostały przetestowane na wielu partiach izolowanych MEF-ów; o ile MEF-y nie wykazują znacznie obniżonej żywotności, regulacja gęstości wysiewu komórek nie jest konieczna.
    3. W 1. dniu, 24 godziny po transfekcji, użyj strzykawki o pojemności 30 ml do pobrania pożywki retrowirusowej wytworzonej przez komórki PE. Przepuść pożywkę przez filtr o wielkości porów 0,45 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml. Dodać odczynnik do transfekcji bromku heksadimetryny do końcowego stężenia 6 μg/ml. Ostrożnie dodać 10 ml świeżej pożywki wzrostowej do komórek PE, pipetując pożywkę na ściankę naczynia hodowlanego, aby zapobiec przemieszczaniu się komórek.
    4. Odessać pożywkę z MEF i dodać 4 ml świeżo zebranej pożywki retrowirusowej do każdego naczynia. Zwróć MEF-y do inkubatora. Dodaj 10% wybielacza do wszystkich materiałów mających kontakt z pożywką wirusową, aby zneutralizować cząsteczki retrowirusowe.
    5. W dniu 2, 48 godzin po transfekcji, powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3. Komórki PE są odrzucane po 2. pobraniu pożywki retrowirusowej.
      UWAGA: Dodaj 10% wybielacza do wyrzuconych komórek PE przez co najmniej 20 minut, aby zneutralizować niechcianego retrowirusa.
    6. W dniu 3 odessać pożywkę z MEF i uzupełnić 4 ml pożywki iCM (Tabela 1) zawierającej 0,5 μM A-83-01, inhibitora receptora TGF-β typu I. Uzupełniaj pożywkę iCM zawierającą A-83-01 co 2 dni.
      UWAGA: W przypadku użycia GFP jako kontroli transdukcji, oczekuje się, że wyrażenie przekroczy 90% do tego punktu czasowego (Rysunek 1C).

3. Cytometria przepływowa dla markerów sercowych

  1. Odessać pożywkę z przeprogramowanych MEF dnia 9 i przemyć (1x) 1x PBS, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia.
  2. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić komórki za pomocą mikroskopu świetlnego i wstrząsnąć naczyniem; jeśli komórki pozostają połączone, inkubować jeszcze 5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą.
  3. Umyj komórki w 1x PBS zawierającym 5% FBS i przefiltruj przez sitko do komórek porowych 70 μm.
  4. Wirować przy 160 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odsysać ciecz z granulki.
    UWAGA: Aby zwiększyć wydajność komórek, pozostaw około 50 μl płynu nad osadem komórkowym.
  5. Przemyć komórki 500 μl 1x PBS zawierającym 1% BSA.
  6. Napraw komórki roztworem utrwalającym 0,2 ml/1 milion komórek przez 20 minut na lodzie.
  7. Dodaj 1 ml 1x lodowatej trwałej ondulacji/buforu do mycia.
    UWAGA: Rozwiązanie producenta to 10x.
  8. Odwirować komórki przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i aspirować supernatant.
  9. Powtórz kroki 3.7 i 3.8 jeszcze jeden raz. Po 2. praniu przejdź bezpośrednio do następnego kroku lub utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C przez noc.
  10. Blok ze 100 μl 5% surowicy koziej i osła w 1x bufor do trwałej ondulacji/prania przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego.
    UWAGA: W tym protokole komórki znakowano mysią troponiną T (1:200) i myszą α-aktyniną (1:200) w celu ilościowego określenia odsetka komórek dodatnich dla kluczowych składników sarkomeru sercowego. Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Odwirować komórki przy 160 x g przez 5 m w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i przemyć 2x lodowatym buforem do trwałej ondulacji/przemycia.
  13. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego.
    UWAGA: W tym protokole komórki znakowano przeciwciałem drugorzędowym anty-myszy 647 nm (1:200). Inkubować przeciwciała drugorzędowe przez 45 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym typu end-of-end. Chroń komórki przed światłem, owijając probówki folią.
  14. Odwirować komórki przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i przemyć 2x lodowatym buforem do trwałej ondulacji/przemłukiwania.
  15. Dodać 1 ml 1% BSA do PBS i natychmiast wykonać FACS.
    UWAGA: Wygeneruj wykres punktowy do przodu i z boku, aby najpierw bramkować żywe komórki podczas wykonywania FACS. Alternatywnie, użyj dostępnego w handlu barwnika żywych/martwych komórek przed utrwaleniem komórek, aby zidentyfikować żywe i martwe populacje komórek.

4. Barwienie immunologiczne przeprogramowanych MEFów

  1. Odessać pożywkę z dnia 14 przeprogramowane MEF i przemyć (1x) 1 ml 1x lodowaty PBS.
    UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego przeprogramowano je na płytkach 12-dołkowych, aby zminimalizować objętość roztworu przeciwciała. Można również stosować płytki 24-dołkowe; po prostu połowa wszystkich następnych tomów.
  2. Odsysać i utrwalać komórki za pomocą 500 μl 2% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać i umyć komórki 3 razy 1 ml 1x PBS (5 minut na pranie w temperaturze pokojowej).
  4. Przepuszczalność komórek za pomocą 500 μl 0,2% odczynnika do przepuszczalności w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać i zablokować w 500 μl 10% surowicy końskiej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odsysać i inkubować z 500 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym protokole komórki znakowano mysią troponiną T lub α-aktyniną (każdy 1:400) i jednocześnie znakowano Connexin 43 (1:400) lub troponiną I (1:400
    7. ).
  7. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć trzykrotnie 1 ml 1x PBS (5 minut na pranie w temperaturze pokojowej).
  8. Aspirować i inkubować z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym w 500 μl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym protokole komórki znakowano przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim 555 nm (1:800) w celu rozpoznania troponiny T lub α-aktyniny oraz przeciwciałem drugorzędowym anty-królika 488 nm (1:800) w celu rozpoznania Connexin 43 lub Troponiny I. Dodatkowo jądra wybarwiono Hoechstem (1:10 000). Chroń komórki przed światłem, inkubując w ciemności.
  9. Odessać przeciwciało drugorzędowe i przemyć trzykrotnie 1 ml 1x PBS (5 minut na przemycie w temperaturze pokojowej). Owinąć płytkę w folię w celu ochrony komórek przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  10. Obraz za pomocą trójkanałowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

5. Obrazowanie wapnia

UWAGA: Jeśli obrazujesz przy 10-krotnym powiększeniu, standardowe szalki i płytki do hodowli komórkowych są odpowiednie do obrazowania wapnia. Obrazowanie w większym powiększeniu wymaga, aby komórki były powlekane na szklanych szkiełkach nakrywkowych lub naczyniach ze szklanym dnem.

  1. Odessać pożywkę i dodać 2 ml (na płytkę 6-dołkową) zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 0,1% BSA i 1% pirogronianu, pH 7,4) zawierającego 5 μM Fura-2 AM i 0,1% Pluronic F-127 do pokonania (D14 do D20) iCM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Chroń ogniwa przed światłem, aby zapobiec wygaszaniu wskaźnika fluorescencyjnego.
  2. Myj komórki w 2 ml roztworu Tyrode'a przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić deestryfikację Fura-2 AM.
  3. Obraz z mikroskopią konfokalną z wirującym dyskiem przy 340 nm i 380 nm przy użyciu oprogramowania do obrazowania Slidebook 5.5 Ca2+. Wykonaj obrazowanie w temperaturze pokojowej.
  4. Przejściowe stany nieustalone wapnia oblicza się przy użyciu stosunku intensywności fluorescencji przy 340 nm do intensywności fluorescencji przy 380 nm.
  5. W razie potrzeby należy potraktować iCM 1 lub 2 μM izoproterenolem lub 10 μM nifedypiną, aby manipulować obchodzeniem się z wapniem po obrazowaniu wyjściowych stanów przejściowych wapnia. Dodaj związki lokalnie do komórek i obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując strategię przeprogramowania opisaną powyżej oraz na Ryc. 1B, wygenerowano iCM, w których około 70% komórek wykazuje ekspresję troponiny T serca, a około 5% komórek wykazuje ekspresję α-aktyniny serca, co określono za pomocą cytometrii przepływowej w 9. dniu po transdukcji GHMT2m (Ryc. 2A i B). Dodatkowo, w 14. dniu po transdukcji większość komórek wykazuje ekspresję troponiny T serca, troponiny I i α-akt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia wysoce efektywną strategię bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w funkcjonalne iCM poprzez dostarczanie czynników przeprogramowujących GHMT2m w połączeniu z supresją pro-fibrotycznych szlaków sygnałowych. Korzystając z cytometrii przepływowej, obrazowania immunofluorescencyjnego, obrazowania wapnia i bicia liczby komórek, pokazujemy, że większość komórek w tym protokole przechodzi udane przeprogramowanie i przyjmuje los linii CM. Wcześniej wykazaliśmy, że dodanie związków przeciwzwł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez fundusze z Programu Badań Biomedycznych Webb-Waring Fundacji Boettchera, Grantu Rozwoju Naukowca Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (13SDG17400031), Programu Wybitnego Stypendysty Na Wczesnym Etapie Kariery Wydziału Medycyny Uniwersytetu Kolorado, Fundacji Barlowa Nyle'a Uniwersytetu Kolorado oraz NIH R01HL133230 (do K.S.). ASR był wspierany przez NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1TR001081 oraz stypendium przeddoktoranckie od University of Colorado Consortium for Fibrosis Research & Translation (CFReT). Badania te były również wspierane przez Cancer Center Support Grant (P30CA046934), Skin Diseases Research Cores Grant (P30AR057212) oraz Flow Cytometry Core na University of Colorado Anschutz Medical Campus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/6 MyszyCharles River's Laboratory027Do izolacji MEF
Komórki Platinum E (PE) CellBiolabs, INCRV-101Do produkcji retrowirusów
DMEM High GlucoseGibcoSH30022. FSSkładnik iCM, PE i pożywki wzrostowej
199Life Technologies11150-059Składnik pożywki iCM
Płodowa surowica bydlęcaGemini100106Składnik iCM, PE i pożywki wzrostowej
Surowica konia dawcyGemini100508 500Składnik pożywki iCM
MEM Niezbędne aminokwasy, 50XLife Technologies11130051Składnik iCM media
Roztwór pirogronianu sodu, 100XLife Technologies11360070Składnik pożywki iCM i do obrazowania wapnia
MEM Aminokwasy endogenne, 100XLife Technologies11140050Składnik pożywki iCM
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Składnik pożywki iCM
Insulina-Transferyna-SelenGibco41400045Składnik pożywki iCM
B27Gibco17504-044Składnik pożywki iCM
Penicilin-StreptomycynaGibco15140-122Składnik iCM, PE i pożywki wzrostowej
GlutaMAX (suplement L-glutaminy)Gibco35050-061Składnik iCM, PE i pożywki wzrostowej
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Składnik pożywki PE
Dichlorowodorek puromycynyLife TechnologiesA11138-03Składnik pożywki PE
0,25% Trypsyna/EDTAGibco25200-056Do oddzielania komórek od naczyń hodowlanych
A-83-01R& Systemy D - Tocris2939/10Leczenie komórek w celu zahamowania sygnalizacji TGF-&beta - sprzyja przeprogramowaniu o wysokiej skuteczności. Stosować przy 0,5 i mikro; M
DMSOThermo Scientific85190Do rozcieńczania i przechowywania A-83-01 i składnika pożywki zamrażającej
SureCoatCellutronSC-9035Do powlekania naczyń na talerzu MEF
Odczynnik do transfekcji FuGENE 6PromegaE2692Odczynnik do transfekcji
Opti-MEM Zredukowane podłoże w surowicyGibco11058-021Odczynnik
do transfekcjipBabe-X Myc-GATA4Plazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X Myc-Hand2Plazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X Myc-Mef2cPlazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X Myc-Tbx5Plazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X miR-1Plazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X miR-133Plazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
pBabe-X GFPPlazmid zawierający czynnik przeprogramowujący
Polybrene (bromek heksadimetryny)SigmaH9268-5GDo indukcji wirusa. Stosować w stężeniu 6 &mikro; g / ml
Filtr próżniowy + butelki (0,22 i mikro; m pores)Nalgene  569-0020 Do mediów filtracyjnych
StrzykawkiBd Vacutainer Sprzęt laboratoryjny 309654Do filtracji wirusów
0,45 i mikro; m FiltryCelltreat229749Do filtracji wirusów
70 & mikro; m sitka komórkoweFalcon 352350Do izolacji MEF i cytometrii przepływowej
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722Do utrwalania i przepuszczalności komórek do cytometrii przepływowej
trwała ondulacja/bufor do płukania BD554723Do mycia komórek do cytometrii przepływowej
DPBS 1XGibco14190-250Do mycia komórek
Albumina surowicy bydlęcejVWR0332-100gDo cytometrii przepływowej i obrazowania wapnia
Surowica koziaSigma G9023Do blokowania komórek do cytometrii przepływowej
Surowica osłaSigmaD9663-10mgDo blokowania komórek do cytometrii przepływowej
myszy Troponina TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Cytometria przepływowa
Mysz &alfa;-aktyninaSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Cytometria przepływowa
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Troponina królika IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, królikLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, myszLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, myszLife TechnologiesA-31571Cytometria przepływowa 1:200
27-kolorowy cytometr przepływowy ZE5 Bio-RADDla FACS
ParaformaldehydsigmaP6148-500mgDo mocowania komórek do IF
Triton X-100PromegaH5142Do przenikania komórek do IF
EVOS™ System obrazowania kolorowego FLThermo ScientificAMEFC4300Do IF
NaClRPIS23020-5000Do obrazowania wapnia
KClVWR395Do obrazowania wapnia
CaCl2FisherC614-500Do obrazowania wapnia
MgCl2VWR97061-352Do obrazowania
glukozasigmaG7528-250gDo obrazowania wapnia
HEPESsigmaH4034-500gDo obrazowania wapnia
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221Do obrazowania wapnia
Fluronic F-127SigmaP2443-250gDo obrazowania wapnia
NifedypinaSigmaN7634-1GDo zaburzeń stanów przejściowych wapnia w iCM - stosować przy 10 & Mikro; M
IsoproterenolsigmaI6504-1gDla zwiększenia liczby stanów przejściowych wapnia w iCM - stosować w 1-2 &mikro; M
Marianas Spinning Disk Mikroskop konfokalny3iDo obrazowania etanolu wapniowego
Decon Laboratories2801
wybielaczClorox
50 ml probówki stożkoweGREINER BIO-ONE
15 ml probówki stożkoweGREINER BIO-ONE
15 cm naczynia do hodowli komórkowychSokół
Szalki do hodowli komórkowych 10 cmFalcon353003
60 mm Szalki do hodowli komórkowychGREINER BIO-ONE628160
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGREINER BIO-ONE657160 
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGREINER BIO-ONE665180 
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGREINER BIO-ONE662160 
wapnia 227261 188271 353025

Bibliografia

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678(2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577(2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeprogramowanie kardiologicznecytometria przep ywowaobrazowanie immunofluorescencyjneobrazowanie wapniowetransdukcja retrowirusowahamowanie TGF betakoktajl GHMT2Mtworzenie z czy szczelinowych

Powiązane artykuły