Artykuł metodologiczny

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57701

⸱

2 czerwca 2018

 , 
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Department of Molecular Genetics, Institute of Life Science, Kurume University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Streszczenie

Komunikacja między narządami za pomocą sygnalizacji endokrynologicznej, na przykład z peryferii do mózgu, jest niezbędna do utrzymania homeostazy. Jako zwierzę modelowe do badań endokrynologicznych, Drosophila melanogaster, który dysponuje zaawansowanymi narzędziami genetycznymi i informacjami o genomie, jest coraz częściej wykorzystywany. W artykule opisano metodę obrazowania wapnia eksplantatów mózgu Drosophila. Metoda ta umożliwia wykrycie bezpośredniej sygnalizacji hormonu do mózgu. Powszechnie wiadomo, że wiele hormonów peptydowych działa poprzez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), których aktywacja powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężeniaCa2+. Aktywacja neuronalna podnosi również wewnątrzkomórkowy poziom Ca2 +, zarówno z napływu Ca2 +, jak i uwalniania Ca2 + przechowywanego w retikulum endoplazmatycznym (ER). Czujnik wapnia, GCaMP, może monitorować te zmianyCa2+. W tej metodzie GCaMP ulega ekspresji w neuronach będących przedmiotem zainteresowania, a mózg larwy wykazującej ekspresję GCaMP jest preparowany i hodowany ex vivo. Peptyd testowy jest następnie nakładany na eksplantat mózgu, a zmiany fluorescencyjne w GCaMP są wykrywane za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem wyposażonego w kamerę CCD. Za pomocą tej metody można przetestować dowolną cząsteczkę rozpuszczalną w wodzie, a różne zdarzenia komórkowe związane z aktywacją neuronalną można zobrazować za pomocą odpowiednich wskaźników fluorescencyjnych. Ponadto, modyfikując komorę obrazowania, metoda ta może być stosowana do obrazowania innych narządów Drosophila lub narządów innych zwierząt.

Wprowadzenie

Komunikacja między narządami jest ewolucyjnie zachowaną strategią utrzymania homeostazy w celu radzenia sobie ze zmianami środowiskowymi. U ludzi różne hormony sąuwalniane z gruczołów dokrewnych do krążenia. Wiele z tych hormonów celuje w podwzgórze mózgu, które reguluje procesy metaboliczne i podstawowe zachowania, takie jak karmienie1,2. Wiele hormonów odkryto przy użyciu modeli ssaków. Jednak mechanizmy ich działania, zwłaszcza sieci międzynarządowe, w których uczestniczą, pozostają w dużej mierze niejasne.

Drosophila melanogaster stała się użytecznym modelem do badania komunikacji między narządami. U owadów wiele procesów fizjologicznych jest kontrolowanych przez hormony. Wczesne badania skupiające się na wzroście i metamorfozie wykorzystywały duże owady. W tych badaniach usunięcie lub przeszczepienie określonych narządów przewidywało istnienie międzynarządowych cząsteczek sygnałowych; później hormon juweniliczny (JH), hormon protorakotropowy (PTTH) i ekdyzon zostały oczyszczone biochemicznie3,4,5. Uważa się, że duża rodzina międzykomórkowych peptydów sygnałowych bierze udział w różnych zdarzeniach fizjologicznych podczas cyklu życia owadów6,7. Większość z tych peptydów działa na receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), chociaż konkretne GPCR były początkowo trudne do zidentyfikowania przy użyciu konwencjonalnych metod. Publikacja sekwencji całego genomu Drosophila 8 była przełomem, który umożliwił identyfikację bioaktywnych peptydów Drosophila na podstawie ich homologii do tych występujących u innych owadów. Ponadto zidentyfikowano receptory dla kilku peptydów na podstawie GPCR przewidywanych w genomie za pomocą testów wiązania ligandów GPCR opartych na hodowli komórkowych. Następnie, analizy ekspresji pozwoliły przewidzieć szlaki między narządami wywoływane przez te peptydy i receptory. Warto zauważyć, że wiele z domniemanych receptorów peptydowych ulega ekspresji w mózgu, co sugeruje, że mózg jest głównym celem hormonów peptydowych9. Co więcej, zaawansowane narzędzia genetyczne u Drosophila przyczyniły się do identyfikacji fizjologicznych ról kombinacji peptyd-GPCR. Na przykład binarne systemy transkrypcyjne oparte na GAL4 i LexA umożliwiają knockdown lub nadekspresję genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo. GAL4, czynnik transkrypcyjny zidentyfikowany u drożdży, wiąże się ze specyficzną sekwencją cis-regulatorową zwaną sekwencją aktywacji upstream (UAS). W systemie GAL4/UAS linia sterująca zapewnia specyficzną tkankowo lub specyficzną dla etapu ekspresję GAL4, a linia odpowiadająca przenosi UAS przed genem będącym przedmiotem zainteresowania lub konstruktem w celu sterowania ekspresją shRNA. System LexA/LexAop opiera się na podobnym mechanizmie. Analizy fenotypowe zwierząt z peptydowym knockdownem specyficznym dla tkanek i GPCR-knockdown mogą ujawnić informacje na temat trybu i miejsca działania sygnalizacji peptyd-GPCR. Jednak wnioski, do których można dojść wyłącznie na podstawie danych genetycznych, są ograniczone. Z drugiej strony, gdy domniemany cel określonego hormonu peptydowego zostanie zawężony do typu tkanki lub komórki, obrazowanie wapnia ex vivo w eksplantatach narządów może być wykorzystane do wyjaśnienia komunikacji między narządami, w której pośredniczy sygnalizacja peptyd-GPCR. Po aktywacji GPCR sprzężonego z Gq, wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2 + jest zwiększone z powodu uwolnienia Ca2 + z klasy ER10. W mózgu aktywacja neuronalna podnosi również wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+. Takie wzrosty Ca2+ mogą być wykryte przez czujnik wapnia GCaMP, który ulega zmianom konformacyjnym w obecności Ca2+, co skutkuje emisją fluorescencji11.

W tym artykule opisana jest metoda obrazowania wapnia z wykorzystaniem eksplantatów mózgu Drosophila. Aby przetestować zdolność peptydu do aktywacji określonych neuronów, peptyd testowy nakłada się na eksplantat mózgu wyrażający GCaMP, a zmiany fluorescencji są monitorowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Udział GPCR jest następnie potwierdzany przez wykonanie tego samego testu przy użyciu zmutowanego mózgu pozbawionego GPCR. To połączenie obrazowania i genetyki dostarcza precyzyjnych informacji na temat komunikacji między narządami za pomocą peptydów-GPCR. Omówiono również możliwe modyfikacje i zastosowania tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie eksplantatów mózgu larw

  1. Zrób komorę obrazowania.
    UWAGA: Stabilny zapis wymaga, aby eksplantaty mózgu były na uwięzi. W tym przypadku w systemie obrazowania Ca2+ zastosowano tanią, ręcznie wykonaną komorę obrazowania.
    1. Za pomocą kleszczy podrap dolną środkową część plastikowej płytki hodowlanej (35 mm x 10 mm), aby zrobić wgniecenie w brzusznym zwoju mózgu larwy, ułatwiając montaż (krok 1.3, Rysunek 1).
    2. Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę superglue po obu stronach wgniecenia i przymocuj pręt wolframowy (średnica 0,125 mm, długość od 6 do 7 mm) do kleju.
    3. Używając małego kawałka kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę, wykonaj okrągłą ściankę (o średnicy 10 mm i wysokości 3 mm) otaczającą wgniecenie (Rysunek 1).
      UWAGA: Przestrzeń wewnątrz ściany zostanie później wypełniona solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 w 25 °C).
  2. Przygotowanie dla zwierząt
    UWAGA: W przypadku obrazowania wapnia wskaźnik wapnia, GCaMP6s, jest wyrażany w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania, co jest zwykle osiągane przy użyciu kombinacji specyficznych tkankowo GAL4 i UAS-GCaMP6s. Aby zapewnić, że sygnał jest przekazywany przez receptor kandydujący, GCaMP6s ulega również ekspresji w zmutowanym wadliwym receptorze.
    1. Gdy wymagane są porównania eksperymentalne dla różnych genotypów, takich jak dziki typ i mutanty, badaj larwy w teście wieku, aby uniknąć wahań poziomu ekspresji GCaMP6 i różnic fizjologicznych spowodowanych etapami rozwoju.
    2. Muchy rodzicielskie (po 30 much każdej płci) należy przechowywać w fiolce hodowlanej zawierającej standardowy pokarm dla much przez 8 godzin, aby umożliwić składanie jaj na powierzchni pokarmu. Hodowla larw w masie w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 60–70 %.
  3. Rozwarstwienie mózgu larwy
    1. Po 90-120 godzinach od złożenia jaj (AEL) należy zebrać larwy i umyć je co najmniej 3 razy wodą destylowaną, aby usunąć przylegające resztki jedzenia.
    2. Umieść larwę na kwadratowym 1,5-calowym szkiełku zegarkowym wypełnionym lodowatym PBS.
      UWAGA: Następne dwa kroki są wykonywane w tym szkiełku zegarkowym pod mikroskopem preparacyjnym.
    3. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić środkową część larwy. Użyj innych kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i delikatnie pociągnij haczyki do ust, aby oddzielić przednią część larwy zawierającej mózg od reszty ciała.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć nożyczek chirurgicznych.
    4. Przytrzymaj przedni koniec kleszczami i odwróć larwę na lewą stronę. Usuń obce tkanki przyczepione do mózgu, takie jak dyski wyobrażeniowe, ciała tłuszczowe i gruczoł pierścieniowy. Delikatnie oddziel mózg od aparatu gębowego.
    5. Nanieść 200 μl PBS na wnętrze pierścienia wykonanego z kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę w komorze obrazowania. Delikatnie zassać wypreparowany mózg za pomocą PBS do pipety Pasteura, a następnie przenieść go do komory obrazowania.
  4. Umieszczanie mózgu w komorze obrazowania
    1. Użyj kleszczy, aby chwycić włókna mięśniowe wystające z zwojów brzusznych. Delikatnie włóż mózg do wgłębienia pod drutem wolframowym.
    2. Używając innych kleszczy, pociągnij drut wolframowy lekko do góry, aby umieścić mózg w odpowiedniej pozycji do obrazowania (Rysunek 1).

2. Akwizycja obrazów fluorescencyjnych Ca2+

UWAGA: Eksplantaty mózgu zanurzone w PBS są obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (nie dotyczy = 0,5). PBS nie aktywuje komórek w mózgu. Jeśli potrzebne są obrazy w osi Z, soczewka obiektywu jest montowana za pomocą ruchomego obiektywu aktywowanego piezoelektrycznie. Głowica konfokalna z obracającym się dyskiem służy do zwiększenia rozdzielczości czasowej. W przypadku obrazowania przy słabym oświetleniu na mikroskopie zamontowana jest kamera ze sprzężeniem ładunku zwielokrotnionym elektronami. Obrazowanie fluorescencji GCaMP6s (wzbudzenie/emisja: 488/509 nm) wymaga lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia z dichroicznym rozdzielaczem wiązki i filtrem emisyjnym (np. filtr pasmowoprzepustowy 528 ± 38 nm).

  1. Umieść komorę obrazowania zawierającą eksplantat mózgu pod mikroskopem.
  2. Opuść soczewkę obiektywu, aż dotknie PBS. W świetle jasnego pola ustaw mózg i ustaw go w ostrości. Przełącz na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość na komórkach oznaczonych GCaMP6s.
    UWAGA: Podstawowa zielona fluorescencja GCaMP6s powinna być widoczna.
  3. Akwizycja rozpoczyna się z szybkością 250 ms/klatkę w rozdzielczości 512 × 512 pikseli w trybie chłodzonym wodą za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji (np. μManager). Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, ale nie mniejsze niż 1000 (dowolne jednostki), z obrazami 16-bitowymi (zakres dynamiczny 0-65 535).
    UWAGA: Należy użyć krótkiego czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie GCaMP6s. Czas ekspozycji powinien być zoptymalizowany w każdym eksperymencie, ponieważ zależy od poziomów ekspresji GCaMP6 i czułości systemu detekcji. W naszym eksperymencie z użyciem dilp2>GCaMP6s było to 100 ms. Gdy dla danej głębokości obrazowania wymagane są przekroje z, można uzyskać kilka obrazów przekroju z w zależności od czasu ekspozycji i interwałów klatek. Jeśli kamera ma wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, rozmiar binningu (liczba rejestrów na chipie, które zostaną połączone w jeden piksel cyfrowy) powinien zostać zwiększony, aby skrócić czas naświetlania.
  4. Po określeniu parametrów obrazowania należy wykonywać zdjęcia przez 1 minutę przed podaniem peptydu, aby wykryć wyjściowe natężenie sygnału (F0).
  5. Zastosować peptyd testowy; w tym celu rozpuścić 100 μl roztworu peptydu w PBS i pipetować go bezpośrednio do kąpieli larwalnej w celu uzyskania optymalnego stężenia.
    UWAGA: Roztwór peptydu należy wstrzykiwać powoli (np. z szybkością przepływu 20 μl/s) do roztworu kąpieli za pomocą pipety. Niepowiązany syntetyczny peptyd rozpuszczony w PBS stosuje się jako kontrolę ujemną.
  6. Rejestruj emisję GCaMP6s przez kilka minut.

3. Analiza danych

Uwaga: Dane obrazowania są analizowane w trybie offline za pomocą ImageJ. Podczas obrazowania poklatkowego pipetowanie powoduje ruch mózgu larwy. W związku z tym aberracje pozycyjne obrazów seryjnych powinny zostać skorygowane przed analizą. Korekcję można wykonać za pomocą wtyczki ImageJ, TurboReg w następujący sposób.

  1. Otwórz oprogramowanie analityczne i użyj pierwszej klatki (przed nałożeniem peptydu) jako obrazu referencyjnego.
  2. Wybierz Wtyczki | Rejestracja | TurboReg.
  3. Wybierz plik obrazu szeregowego jako źródło i obraz referencyjny jako element docelowy.
  4. Sprawdź opcję Sztywny korpus (równoległe przemieszczenie i obrót obrazów) i Dokładny ("Szybki" to zgrubna, ale szybka analiza) odpowiednio dla metody przetwarzania i jakości.
  5. Kliknij przycisk Partia, aby rozpocząć przetwarzanie obrazu.
  6. Wybieranie wielu regionów zainteresowania (ROI) przy użyciu opcji Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji w ImageJ.
  7. Zmierz intensywność pikseli, klikając Więcej | Wiele środków | OK w oknie Menedżer ROI.
  8. Obliczyć ΔF/F0 = (F - F0)/F0, gdzie F to intensywność ROI w momencie bodźca, a F0 to intensywność w oknie czasowym bezpośrednio przed określonym zdarzeniem eksperymentalnym (np. 30 klatek poprzedzających początek bodźca).
  9. Powtórz eksperyment, używając wielu próbek mózgu, przeprowadzając przetwarzanie statystyczne w celu uzyskania średniej i błędu standardowego średniej (SEM) w każdym punkcie czasowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowano ten protokół, aby zbadać aktywację produkujących insulinę komórek (IPC) mózgu przez hormon peptydowy CCHa2. Komórki IPC w mózgach typu dzikiego oznakowano GCaMP6s, wykorzystując kombinację dilp2-GAL412 (dar od dr. Rulifsona) oraz UAS-GCaMP6s13 (dar od dr. Kim). Eksplanty mózgów larwalnych poddano działaniu syntetycznego peptydu CCHa2, a fluorescencję GCaMP6s rejestrowano w czasie rzeczywistym. W tym doświadczeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda obrazowaniaCa2+ jest użytecznym systemem do badania funkcji hormonów w mózgu. In vivo mózg otrzymuje hormony z różnych narządów dokrewnych. Ponadto mózg stale odbiera wznoszące się informacje sensoryczne, co powoduje spontaniczną aktywację neuronów. Ten system ex vivo eliminuje takie szumy i zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu niż obrazowanie in vivo . W tym systemie cząsteczki mogą być testowane pojedynczo lub w połączeniu. Oprócz hormonów peptydowych, do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (15K07147, 17K07419) od JSPS (dla Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), Inamori Foundation Research Grant (dla HI) oraz Program of the Joint Usage/Research Center for Developmental Medicine, w Instytucie Embriologii Molekularnej i Genetyki, Kumamoto University (do HS). Dziękujemy dr Azusa Kamikouchi i panu Daichi Yamada za pomoc w korzystaniu z systemu obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pręt wolframowyA-M systems, Sequim, WA, USA717000
Blu TackBostik, Paryż, Francja3049100Kleje wielokrotnego użytku podobne do szpachli
Szkiełko zegarka, kwadrat, 1 5/8 wCarolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA742300
PBSTAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, JaponiaT900Fosforanowane sole buforowe
CCHa2SCRUM Inc., Tokio, JaponiaPeptyd syntetyzowany w kusku
GhrerinPeptide institute Inc., Osaka, Japonia4372-s
NociceptinPeptide institute Inc., Osaka, Japonia4313-v
Axio Imager A2Carl Zeiss, Oberkochen, NiemcyMikroskop fluorescencyjnyAxio Imager A2
Obiektyw W N-Achroplan 20x/0,5 M27Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy420957-9900-000obiektywowa zanurzająca w wodzie
P-725 Skaner obiektywowy PIFOC o dużym zasięgu przesuwuPhysik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, NiemcyNie dotyczyaktywowany piezoelektrycznie
Skaner konfokalny CSU-W1Yokogawa Electric Corporation, Tokio, JaponiaCSU-W1głowica konfokalna z wirującym
dyskiem ImagEM C9100-13Hamamatsu Photonics, Sizuoka, JaponiaKamera C9100-13EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mWKoherent, Santa Clara, CA, USA1178770Laser 488 nm
488/568/647 nm Rozdzielacz wiązki YokogawaSemrock, Rochester, NY, USADi01-T405/488/568/647-13x15x0,5dichroiczny rozdzielacz wiązki
528/38 nm Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLineSemrock, Rochester, NY, USAFF01-528/ Filtr emisji 38-25
i mikro; KierownikOpen Imaging, Inc.Niedotyczy https://micro-manager.org
ImageJU. S. National Institutes of HealthNie dotyczyhttps://imagej.nih.gov/ij/
TurboRegPhilippe Thé venaz, Grupa Obrazowania Biomedycznego, Szwajcarski Federalny Instytut Technologii LozannaN/Ahttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
soczewka Skaner konfokalny

Bibliografia

  1. Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
  2. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
  3. Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
  4. Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
  5. Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
  6. Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
  7. Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
  8. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  9. Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896(2008).
  10. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
  11. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  12. Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252(2013).
  15. Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209(2015).
  16. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744(2016).
  17. Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).
  18. Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).
  19. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  20. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
  21. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  22. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

m zg Drosophilaobrazowanie ex vivosensor GCaMPmikroskopia konfokalnahormon peptydowysygnalizacja GPCRaktywacja neuronalnaeksplant m zgu

Powiązane artykuły