Method Article

Charakterystyka przeciwdrobnoustrojowa zaawansowanych materiałów do zastosowań bioinżynieryjnych

DOI:

10.3791/57710

⸱

August 4th, 2018

 ,  , 
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół charakterystyki przeciwdrobnoustrojowej zaawansowanych materiałów. W tym przypadku aktywność przeciwdrobnoustrojowa na powierzchniach materiałów jest mierzona za pomocą dwóch metod, które wzajemnie się uzupełniają: jedna opiera się na teście dyfuzji krążka agarowego, a druga jest standardową procedurą opartą na normie ISO 22196:2007.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój nowych zaawansowanych materiałów o ulepszonych właściwościach staje się coraz ważniejszy w szerokim zakresie zastosowań bioinżynierii. W związku z tym wiele nowych biomateriałów jest projektowanych tak, aby naśladować określone środowiska wymagane w zastosowaniach biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa i kontrolowane dostarczanie leków. Opracowywanie materiałów o ulepszonych właściwościach do immobilizacji komórek lub enzymów jest również aktualnym tematem badawczym w inżynierii bioprocesowej. Jednak jedną z najbardziej pożądanych właściwości materiału w tych zastosowaniach jest zdolność przeciwdrobnoustrojowa do unikania niepożądanych infekcji. W tym celu przedstawiamy łatwe do naśladowania protokoły charakterystyki przeciwdrobnoustrojowej materiałów w oparciu o (i) test dyfuzji krążka agarowego (metoda dyfuzyjna) oraz (ii) normę ISO 22196:2007 do pomiaru aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa). Protokół ten musi być wykonywany przy użyciu bakterii i drożdży Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, aby objąć szeroki zakres mikroorganizmów. Na przykład 4 materiały o różnym nakładzie chemicznym są testowane zgodnie z tym protokołem przeciwko Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Wyniki tych testów wykazują aktywność nieprzeciwdrobnoustrojową dla pierwszego materiału i rosnącą aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych dla pozostałych 3 materiałów. Jednak żaden z 4 materiałów nie jest w stanie zahamować wzrostu Candida albicans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Awaria implantu jest często konsekwencją infekcji mikrobiologicznych, które występują pomimo profilaktyki przeciwbakteryjnej i aseptycznych warunków pracy. Ten problem powoduje bardzo wysokie koszty opieki zdrowotnej i jest niepokojący wśród pacjentów1. Ważne bakterie, takie jak Staphylococcus aureus, są obecnie uważane za bardzo niebezpieczne patogeny w zakażeniach szpitalnych związanych z cewnikami i innymi implantami medycznymi i są głównymi zanieczyszczeniami instrumentów medycznych2. W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowatorskich strategii przeciwdrobnoustrojowych zarówno do zastosowań codziennych, jak i medycznych.

Środki przeciwdrobnoustrojowe obejmują antybiotyki3, czwartorzędowe związki amoniowe4, jony/tlenki metali5, oraz peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs)6. Antybiotyki stopniowo stają się coraz mniej skuteczne ze względu na oporność bakterii7, która rośnie z powodu nadużywania antybiotyków8. Czwartorzędowe związki amoniowe są bardzo skuteczne tylko w krótkotrwałym stosowaniu ze względu na oporność mikrobiologiczną9. Jony/tlenki metali od dawna są wykorzystywane jako bardzo skuteczne środki przeciwdrobnoustrojowe i są stosowane w wielu popularnych produktach komercyjnych, w tym bandażach, filtrach do wody, farbach itp.10,11,12. Wykazano jednak, że tego typu związki mogą być toksyczne dla niektórych typów komórek ssaków13.

AMPs wykazują doskonałe właściwości przeciwbakteryjne i immunomodulujące14,15, a bakteriom wydaje się, że bardzo trudno jest rozwinąć odporność na nie16. Jednak proces produkcji czystych AMP jest kosztowny; W związku z tym produkcja na dużą skalę nie jest opłacalna. W związku z tym opracowano strategie przeciwdziałania problemom z wytwarzaniem AMP (np. małocząsteczkowe antybakteryjne peptoidy naśladują 17, peptoids18, α-peptides19 i β-peptides20). Polipeptydy i polipeptoidy zakończone metakrylanem zostały zsyntetyzowane do powłok przeciwbakteryjnych i przeciwporostowych21.

Coraz bardziej konieczne jest opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak zaawansowane materiały w czystej lub hybrydowej formie, zdolne do zapobiegania i leczenia infekcji wielolekoopornych. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano szeroką gamę nowych zaawansowanych materiałów dla wielu dziedzin bioinżynierii, takich jak inżynieria tkankowa i bioprocesowa, o ulepszonych właściwościach chemicznych i fizycznych dzięki kilku metodom: polimeryzacja plazmowa szczepienie na podłożu hydrofobowym22,23,24, dostosowanie gęstości sieciowania25,26, polimeryzacja w roztworze27,28,29,30, Porogen dissolution31,32, oraz poprzez włączenie nanomateriałów, takich jak tlenek grafenu (GO)33,34,35,36i nanowłókna węglowe (CNF)37.

Badanie zdolności przeciwdrobnoustrojowych tych nowych materiałów mogłoby wykładniczo zwiększyć ich potencjalną możliwość zastosowania w bioinżynierii i dlatego stało się niezbędne. Przedstawiamy łatwy do zastosowania protokół do ilościowego określenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej takich nowych zaawansowanych materiałów. Tutaj, po przygotowaniu próbki, stosuje się dwie uzupełniające się metody: pierwsza opiera się na teście dyfuzji krążka agarowego38 (metoda dyfuzji), a druga opiera się na normie ISO 22196:2007 39 w celu pomiaru aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Pociąć próbki materiału na krążki o średnicy 10 mm za pomocą cylindrycznego stempla o średnicy 10 mm.
    UWAGA: Kruche materiały można zmiękczyć w odpowiednich sterylnych rozpuszczalnikach przez 1 godzinę, a następnie pokroić na krążki. Na przykład materiały hydrofilowe, takie jak alginian, zostały przetestowane zgodnie z tym protokołem i zwilżono je w autoklawizowanej wodzie przed ich pocięciem, aby uniknąć pęknięcia próbki. Jednak inne materiały hydrofobowe, takie jak poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerianian) nie wymagają żadnego wcześniejszego pęcznienia, aby mogły być prawidłowo cięte.
  2. Suszyć krążki materiału próbki w temperaturze 60 °C w piecu próżniowym (<10-2 Torr) przez 24 godziny
    UWAGA: Niektóre materiały mogą wymagać wysokiej temperatury suszenia. Jednak ważne jest, aby nie osiągnąć temperatury, która mogłaby spowodować degradację termiczną materiału.
  3. Zmierz grubość folii materiału za pomocą suwmiarki cyfrowej.
    UWAGA: Protokół ten zaleca stosowanie folii materiałowych o stałej i podobnej grubości przy porównywaniu aktywności przeciwdrobnoustrojowej różnych materiałów.
  4. Sterylizuj każdą próbkę, zanurzając ją w etanolu 70% na 10 minut, a następnie promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 1 godzinę z każdej strony.
    UWAGA: Promieniowanie UV można przeprowadzić, umieszczając każdą próbkę na sterylnej szalce Petriego w okapie z przepływem laminarnym za pomocą 12,0 W lampy promieniowania UV-C.
    UWAGA: Badacze nie powinni narażać się na promieniowanie UV, ponieważ jest ono mutagenne.
  5. Wykonaj kroki 1.1, 1.2, 1.3 i 1.4. z dyskami materiału kontrolnego.
    UWAGA: Politereftalan etylenu (PET) lub alternatywne materiały nieprzeciwdrobnoustrojowe mogą być stosowane jako dyski kontrolne w metodzie dyfuzyjnej i kontaktowej. Ponadto, przy charakteryzowaniu nanokompozytów lub materiałów poddanych obróbce, materiał bazowy powinien być stosowany jako materiał kontrolny.

2. Zalecane mikroorganizmy

UWAGA: Zalecamy użycie 3 różnych mikroorganizmów do zbadania zdolności przeciwdrobnoustrojowej badanego materiału przeciwko szerokiej gamie mikroorganizmów.

  1. Użyj czystych kultur 3 mikroorganizmów: bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus, bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli i drożdży Candida albicans.
    UWAGA: Inne gatunki mikroorganizmów mogą być również testowane za pomocą tego protokołu, modyfikując w razie potrzeby warunki inkubacji.
    UWAGA: Wymagane pomiary bezpieczeństwa biologicznego muszą być przestrzegane w zależności od rodzaju mikroorganizmu zastosowanego w tym protokole.
  2. Pracuj z materiałem wstępnie sterylnym lub autoklawizowanym i używaj palnika Bunsena podczas całego procesu manipulacji mikrobiologicznej lub komory bezpieczeństwa biologicznego (jeśli to konieczne), aby zapewnić warunki aseptyki.
    UWAGA: Zalecane warunki autoklawu to 121 °C przez 15 minut dla pożywek hodowlanych i 121 °C przez 20 minut dla materiału roboczego i pozostałości biologicznych.

3. Test dyfuzji krążka agarowego (metoda dyfuzji)

UWAGA: Gdy płynna dyfuzja związków przeciwdrobnoustrojowych może być głównym mechanizmem przeciwbakteryjnym zaawansowanych materiałów, metoda dyfuzji może dostarczyć bardzo użytecznych informacji na temat zdolności przeciwdrobnoustrojowej tych materiałów. Krążek materiału znajdujący się w środku płytki agarowej może tworzyć przezroczystą strefę pierścieniową (halo), w której po 24 godzinach hodowli następuje zahamowanie wzrostu mikroorganizmów (patrz rysunek 1).

  1. Procedura badania dyfuzji
    1. Przygotuj i autoklawuj tryptyczny agar sojowy (TSA) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wlać TSA do sterylnych szalek Petriego w warunkach aseptycznych, używając palnika Bunsena lub okapu z przepływem laminarnym.
      UWAGA: Płyty TSA muszą mieć grubość 4–6 mm.
    3. Hodowla różnych mikroorganizmów do badania tlenowego przez 18–24 godzin na szalkach Petriego z TSA w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    4. Przygotuj i autoklaw bulionu sojowego tryptycznego (TSB) zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Wlać TSB do 50 ml wstępnie wysterylizowanej probówki wirówkowej z wstępnie wysterylizowaną pipetą serologiczną w warunkach aseptycznych, używając palnika Bunsena lub okapu z przepływem laminarnym.
    6. Zawiesić kilka kolonii z kroku 3.1.3 w 25 ml TSB zawartego w sterylnej probówce wirówkowej za pomocą sterylnego wacika i wirować je przez 1 minutę, aby uzyskać równomierne wymieszanie.
    7. Dostosować absorbancję (przy 540 nm) kultury za pomocą spektrofotometru do odpowiedniej liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml: około 1,5 x 108 jtk/ml dla bakterii i od 1 x 106 do 5 x 106 jtk/ml dla drożdży><. UWAGA: Objętości kultur i kuwet do pomiaru absorbancji muszą być dobrane zgodnie z typem zastosowanego spektrofotometru.
    8. Wiruj bulion mikrobiologiczny przez 5 sekund, aby poprawić dyspersję mikroorganizmów i na krótko zanurz sterylny wacik w tej zawiesinie mikrobiologicznej. Usuń nadmiar płynu z wacika, dociskając go do ścianki probówki zawierającej kulturę.
    9. Równomiernie rozprowadź zawiesinę bulionu mikrobiologicznego sterylnym wacikiem na powierzchni płytek TSA w 3 płaszczyznach, aby pokryć całą ich powierzchnię mikroorganizmem i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut po zaszczepieniu.
      UWAGA: Aby usunąć wilgoć, płytki TSA muszą być otwarte w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C na 10–15 minut przed inokulacją.
    10. Wysterylizuj pęsetę, zanurzając ją w zlewce z etanolem 96%, a następnie paląc palnikiem Bunsena lub palnikiem alkoholowym.
    11. Umieść krążki z próbkami, które mają być badane, i dysk kontrolny na środku płytek TSA za pomocą sterylnej pęsety.
    12. Inkubować tlenowo płytki TSA w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
      UWAGA: Aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia, zaleca się inkubację płytek TSA w pozycji odwróconej. Jeśli jednak dysk próbki odczepi się od płytek TSA, nie należy wykonywać tego kroku w pozycji odwróconej. W takim przypadku zaleca się suszenie płytek w okapie z przepływem laminarnym. Ten test przeciwdrobnoustrojowy musi być wykonywany co najmniej w poczwórnym pierścieniu w różnych dniach, aby zapewnić odtwarzalność.
  2. Kontrola stężenia i czystości zawiesiny mikrobiologicznej
    UWAGA: Następujące kroki są niezbędne w celu sprawdzenia, czy stężenie drobnoustrojów określone za pomocą spektrofotometru w kroku 3.1.7 jest prawidłowe i upewnienia się, że nie doszło do mikrobiologicznego zanieczyszczenia środowiska. Mikrobiologiczne zanieczyszczenie środowiska można łatwo wykryć po pojawieniu się różnych typów kolonii drobnoustrojów po 24 godzinach hodowli. Ponadto za pomocą ujemnej płytki kontrolnej TSB nie należy zapewnić zanieczyszczenia mikrobiologicznego podłoża TSB podczas jego manipulacji w rozcieńczeniach dziesiętnych.
    1. Dozować sterylny TSB (przygotowany w kroku 3.1.4) do sterylnych probówek do mikrowirówek za pomocą mikropipety z odpowiednimi autoklawowanymi końcówkami w warunkach aseptycznych. Jeden z nich zostanie wykorzystany jako negatywna kontrola TSB.
    2. Wykonać dziesiętne rozcieńczenia seryjne za pomocą mikrobiologicznej zawiesiny bulionowej użytej w kroku 3.1.9 w sterylnych probówkach do mikrowirówek zawierających TSB.
    3. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach TSA za pomocą wstępnie wysterylizowanej szpatułki Drigalskiego lub alternatywnego narzędzia. Rozprowadzić również 100 μl pożywki TSB bez mikroorganizmów (przygotowanej w kroku 3.2.1) na płytce TSA jako ujemną płytkę kontrolną TSB.
    4. Inkubować tlenowo płytki TSA w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    5. Policz liczbę kolonii, aby sprawdzić, czy jtk/ml są podobne do określonych w kroku 3.1.7.
    6. Sprawdź, czy na płytkach TSA nie ma mikrobiologicznego zanieczyszczenia środowiska tylko jednym rodzajem kolonii.
    7. Sprawdzić, czy na płytce kontroli ujemnej TSB nie ma zanieczyszczeń mikrobiologicznych wskazujących na brak kolonii

4. Pomiar aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa)


UWAGA: Podczas gdy kontakt z powierzchnią może być głównym mechanizmem przeciwdrobnoustrojowym niektórych zaawansowanych materiałów, metoda kontaktowa może dostarczyć bardzo przydatnych informacji na temat zdolności przeciwdrobnoustrojowej tych materiałów. W tej metodzie mikroorganizmy są umieszczane bezpośrednio na powierzchni materiału, a zahamowanie ich wzrostu można określić po pewnym czasie.

  1. Procedura wstępna
    1. Przygotuj i autoklaw TSB zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wlać TSB do 50 ml wstępnie wysterylizowanej probówki wirówkowej z wstępnie wysterylizowaną pipetą serologiczną w warunkach aseptycznych, używając palnika Bunsena lub okapu z przepływem laminarnym.
    3. Hodować różne mikroorganizmy, które mają być badane tlenowo, przez noc w probówce z TSB w wytrząsarce orbitalnej (140 obr./min) w temperaturze 37 °C.
    4. Rozcieńczyć nocną hodowlę w 20 ml TSB w 50 ml wstępnie wysterylizowanej probówce wirówkowej do stężenia około 10,6 jtk/ml (oznaczonego spektrofotometrem przy 540 nm).
      UWAGA: Objętości kultur i kuwet do pomiaru absorbancji muszą być dobrane zgodnie z typem zastosowanego spektrofotometru.
    5. Wykonać dziesiętne seryjne rozcieńczenia tej kultury w sterylnych probówkach do mikrowirówek zawierających TSB. Rozprowadzić 100 μl kultury na płytkach TSA i inkubować ją w stanie tlenowym w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    6. Policz liczbę kolonii, aby zapewnić początkowe stężenie komórek około 1 x 106 jtk/ml
    7. Umieścić 4 krążki kontrolne do zliczania drobnoustrojów po 24 godzinach i 4 krążki z próbkami każdego rodzaju badanych materiałów do zliczania drobnoustrojów po 24 godzinach w oddzielnych studzienkach sterylnej płytki 48-dołkowej.
    8. Odpipetować 150 μl zawiesiny mikrobiologicznej na każdą powierzchnię dysku.
  2. Zliczanie mikrobiologiczne na materiałach kontrolnych i badanych (po 24 godzinach)
    1. Po wykonaniu czynności 4.1.6 przeprowadzić tlenową inkubację 4 krążków z próbkami pozostających na płytce 48-dołkowej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
      UWAGA: Ten 24-godzinny czas inkubacji może być modyfikowany w celu zbadania zahamowania wzrostu w krótszym lub dłuższym czasie.
    2. Po 24 godzinach inkubacji odpipetować 850 μl sterylnego PBS na powierzchnię 4 krążków z próbką i wymieszać ją ze 150 μl zawiesiny drobnoustrojów.
    3. Zebrać mieszaninę PBS/zawiesiny mikrobiologicznej i każdy krążek z płytki 48-dołkowej i przenieść je do wstępnie wysterylizowanej probówki o pojemności 10 ml.
    4. Wirować mieszaninę PBS/zawiesiny mikrobiologicznej i każdy krążek przez 1 minutę, sonikować ją przy 50 Hz przez 5 minut i ponownie wirować przez 1 minutę, aby upewnić się, że żadne żywe mikroorganizmy nie przylegają do powierzchni materiału.
    5. Przeprowadzić dziesiętne seryjne rozcieńczenia każdej kultury poddanej sonikacji w sterylnych probówkach do mikrowirówek zawierających TSB i rozprowadzić 100 μl kultury na płytkach TSA i inkubować ją tlenowo w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    6. Policz liczbę kolonii, czyli liczbę żywotnych mikroorganizmów na każdej próbce i powierzchni dysku kontrolnego. Wyraź tę liczbę żywotnych komórek w (CFU / ml).
    7. Należy sfotografować końcową hodowlę drobnoustrojów dla próbki i krążków kontrolnych.

5. Analiza wyników leczenia przeciwdrobnoustrojowego

figure-protocol-1
Rysunek 1: Pomiary znormalizowanej szerokości "halo" środka przeciwdrobnoustrojowego. Panel ten pokazuje średnicę strefy inhibicji (diz) i średnicę dysku (d). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Analiza wyników metody dyfuzyjnej
    1. Zmierzyć średnicę strefy inhibicji (diz) i średnicę tarczy (d) (patrz rysunek 1) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
      UWAGA: Strefa inhibicji lub przeciwdrobnoustrojowa "halo" powstaje w wyniku zahamowania wzrostu drobnoustrojów wytwarzanego przez krążek z materiałem przeciwdrobnoustrojowym (patrz rysunek 1). Można zaobserwować, że w pobliżu próbki znajduje się przezroczysta strefa pierścieniowa w porównaniu z resztą płytki, w której mikroorganizmy rozwijały się prawidłowo (strefa nieprzezroczysta).
    2. Określ znormalizowaną szerokość przeciwdrobnoustrojowego "halo" (nw halo) każdego dysku, stosując równanie (1).
      (1) figure-protocol-2
    3. Określić średnią i odchylenie standardowe znormalizowanej szerokości przeciwdrobnoustrojowego "halo" za pomocą 4 określonych wartości halo nw każdej próbki.
    4. Zrób zdjęcie końcowej kultury drobnoustrojów za pomocą dysku materiałowego.
      Uwaga: Średnicę strefy inhibicji (diz) i średnicę dysku (d) można również zmierzyć na podstawie zdjęcia wykonanego w kroku 5.1.4 za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu.
  2. Analiza wyników metody kontaktowej
    1. Określić liczbę odzyskanych żywych mikroorganizmów zgodnie z równaniem (2).
      (2) figure-protocol-3
      UWAGA: Tutaj N oznacza liczbę żywych mikroorganizmów odzyskanych nacm2 na próbkę badaną; C oznacza liczbę tabliczek; D jest współczynnikiem rozcieńczenia; A jest polem powierzchni próbki do badań wcm2 określonym średnicą krążka próbki.
    2. Określić utratę żywotności (LV), aby odzwierciedlić zahamowanie wzrostu komórek, stosując równanie (3).
      (3) figure-protocol-4
      UWAGA: Tutaj C jest średnią liczbą żywotnych mikroorganizmów (N) w jtk/ml•cm2, odzyskanych z próbek kontrolnych po 24 godzinach; S jest liczbą żywotnych mikroorganizmów (N) w jtk/ml•cm2, odzyskanych z badanych próbek po 24 godzinach.
    3. Określić średnią i odchylenie standardowe utraty żywotności za pomocą 4 wyznaczonych wartości LV(%) dla każdej próbki.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został użyty, jako przykład, do przetestowania zdolności przeciwdrobnoustrojowej 4 materiałów o różnym naturze chemicznej przeciwko 3 zalecanym mikroorganizmom: Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Wyniki testów dyfuzji krążka agarowego (metoda dyfuzyjna) wykazały aktywność nieprzeciwdrobnoustrojową dla pierwszego materiału (M1), tak jak wystąpiła w dysku kontrolnym (C, obraz nie pokazano) i zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych dla pozostałych 3 materiałów M2, M3 i M4 (patrz Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Wyniki metody dyfuzji przeciwdrobnoustrojowej. Ten panel przedstawia metodę dyfuzji przeciwdrobnoustrojowej dla 4 dysków materiałowych (M1, M2, M3 i M4) (o średnicy 10 mm x grubości 1 mm) przeciwko S. aureus i E. coli po 24 godzinach inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 pokazuje różne znormalizowane szerokości przeciwdrobnoustrojowego "halo" (nw halo) dla różnych przykładowych materiałów M1, M2, M3 i M4 przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym obliczone za pomocą równania (1). Jednak żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdży Candida albicans (zdjęcia nie pokazane).

figure-results-2
Rysunek 3: Wyniki "halo" dyfuzji środków przeciwdrobnoustrojowych. Ten panel pokazuje znormalizowane "halo" (nwhalo) dla każdego materiału (M1, M2, M3 i M4) dysku (10 mm średnicy x 1 mm grubości) przeciwko S. aureus i E. coli po 24 godzinach inkubacji. Różnice są istotne statystycznie (p <0,01). Jednak próbka M1 nie wykazywała aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki metody kontaktowej wykazały również aktywność nieprzeciwbakteryjną dla pierwszego materiału (M1), tak jak miało to miejsce w dysku kontrolnym (C) i zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną przeciwko bakteriom Gramdodatnim i Gram-ujemnym dla pozostałych 3 materiałów (patrz Rysunek 4).

figure-results-3
Rysunek 4: Wyniki metody kontaktu przeciwdrobnoustrojowego. Panel ten przedstawia odpowiednie płytki o średnicy 90 mm w teście aktywności przeciwdrobnoustrojowej powierzchni 4 materiałów (M1, M2, M3 i M4) zgodnie z ISO 22196:2007 po 24 godzinach inkubacji na obecność S. aureus i E. coli (współczynnik rozcieńczenia 10-4). C to żywe bakterie odzyskane z dysku kontrolnego po 24 godzinach inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Utrata rentowności (%) została określona przez równanie (2) i (3), jak wskazano w tym protokole (patrz Rysunek 5).

figure-results-4
Rysunek 5: Utrata żywotności metodą kontaktową. Ten panel pokazuje utratę żywotności (%) dla M1, M2, M3 i M4 przeciwko S. aureus i E. coli na powierzchniach materiałów. Próbka M1 nie wykazywała aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jednak żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdży Candida albicans metodą kontaktową (zdjęcia nie pokazane). W związku z tym 3 z tych 4 zaawansowanych materiałów wykazały pozytywne wyniki przeciwdrobnoustrojowe przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym, a zatem mogą być bardzo przydatne w wielu zastosowaniach bioinżynieryjnych o wysokich wymaganiach dotyczących aktywności przeciwbakteryjnej. Jednak żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdży.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność przeciwdrobnoustrojową nowych zaawansowanych materiałów można analizować za pomocą tego łatwego do naśladowania protokołu składającego się z 2 uzupełniających się procedur opartych na 2 istniejących metodach: teście dyfuzji krążka agarowego38 oraz aktywności przeciwdrobnoustrojowej mierzonej na powierzchniach materiałów zgodnie z normą ISO 22196:200739.

W tej dziedzinie badań wiele testów przeciwdrobnoustrojowych opisywanych w literaturze jest w dużym stopniu zależnych od testów. Dlatego bardzo ważne jest, aby we wszystkich laboratoriach obowiązywały szczegółowe i spójne protokoły. Ten artykuł jest krokiem w tym kierunku. Co więcej, może to być bardzo pomocne dla wielu badaczy, którzy są mniej doświadczeni w tej dziedzinie i wymagają dogłębnych procedur krok po kroku, których należy przestrzegać, aby uzyskać dokładne wyniki.

Protokół ten może być stosowany w przypadku wielu rodzajów materiałów pociętych na dyski o średnicy 10 mm. Kruche materiały można pęcznieć w odpowiednim rozpuszczalniku przez 1 godzinę, aby ułatwić proces cięcia. W ten sposób materiały hydrofilowe, takie jak alginiany, można uwodnić w autoklawowanej wodzie destylowanej. Inne rozpuszczalniki, takie jak etanol, keton i dichlorometan, można zastosować do pęcznienia materiałów hydrofobowych przez 1 godzinę przed ich pocięciem. Jednak niektóre materiały, takie jak poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerianian) nie muszą być spęczniane i można je ciąć bezpośrednio. Następnie bardzo ważne jest, aby wysuszyć krążki z materiałem próbki w piecu próżniowym i sterylizować każdą próbkę etanolem i promieniowaniem UV przez 1 godzinę, aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia.

Protokół ten zaleca TSA i TSB jako pożywki hodowlane oraz stosowanie czystych kultur 3 mikroorganizmów w celu dotarcia do szerokiej gamy mikroorganizmów: bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus, bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli i drożdży Candida albicans. Jednak w ramach tego protokołu można również stosować alternatywne podłoża hodowlane i inne mikroorganizmy wymagające różnych warunków inkubacji. Czasami testowany jest tylko 1 mikroorganizm, aby mieć wstępne wyobrażenie o aktywności przeciwdrobnoustrojowej nowego materiału.

Materiały wykazujące silną aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec zalecanych 3 różnych typów mikroorganizmów powinny być również testowane pod kątem patogenów opornych na antybiotyki, takich jak oporny na metycylinę Staphylococcus epidermidis (MRSE), które zostały z powodzeniem wykorzystane w tym protokole. Inne ważne mikroorganizmy lekooporne, które budzą duże zaniepokojenie, to Gram-dodatni gronkowcowy gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (MRSA) i enterokoki oporne na wankomycynę (VRE) oraz Gram-ujemne Pseudomonas aeruginosa40,41.

Za pomocą tego protokołu nie można badać hamowania biofilmu i aktywności przeciwdrobnoustrojowej materiałów wobec innych rodzajów mikroorganizmów, takich jak wirusy i pasożyty. Protokół ten stanowi jednak bardzo przydatny punkt wyjścia do badania przeciwdrobnoustrojowego nowego zaawansowanego materiału.

W antybakteryjnym teście dyfuzji krążka agarowego krytyczny etap zachodzi, gdy krążek próbki musi zostać umieszczony na środku płytki, ponieważ niektóre materiały składają się, gdy tylko wejdą w kontakt z podłożem agarowym. W takim przypadku zaleca się użycie sterylnej pęsety w celu ostrożnego rozłożenia próbki. Z drugiej strony, w metodzie kontaktowej, bardzo ważne jest, aby bardzo dobrze umyć krążki kontrolne i próbki za pomocą PBS poprzez ich czterokrotne pipetowanie, a następnie energiczne wirowanie i sonikację, aby upewnić się, że żadne żywe mikroorganizmy nie pozostaną przyklejone do powierzchni materiału.

Ten protokół wideo może być wykorzystywany w wielu zastosowaniach bioinżynieryjnych, takich jak inżynieria bioprocesowa, inżynieria tkankowa, kontrolowane dostarczanie leków, materiały opakowaniowe, oczyszczanie ścieków i rolnictwo, które wykorzystują biomateriały o wysoce pożądanej zdolności przeciwdrobnoustrojowej.

Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu są jakościowe (obrazy) i ilościowe (znormalizowana szerokość przeciwbakteryjnej "aureoli" i utrata żywotności) z dobrą analizą jej odtwarzalności (średnia ± odchylenie standardowe). Porównując różne materiały, te średnie wartości uzyskane za pomocą analizy wyników metody dyfuzji i kontaktu muszą być przeanalizowane za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie analizy post hoc w Turcji, w celu zbadania, czy statystycznie różnią się one istotnie (p <0,01).

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir za wsparcie finansowe dla tej pracy poprzez granty 2017-231-001UCV i 2018-231-001UCV.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stempel cylindryczny Szalki Petriego o średnicy 10 mm
soria genlabP101Średnica 90 mm, sterylne
Tryptyczny agar sojowy (TSA)Liofilchem610052Odwodnione podłoże 500 g (proszek)
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Liofilchem610053Odwodnione podłoże 500 g (proszek)
Sterylny wacik bawełnianyWirówka EUTOTUBO300200
probówki VIDRA FOC, SA42990050 mL, sterylne
EtanolVWR83813360Absolutny etanol
Sterylna 48-dołkowa płytkaCOSTAR3548Płaskie dno z pokrywką, poddana działaniu kultur tkankowych, niepirogenna, polistyren
Para pęsetBRAUN24612036Bezzębny
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).VWRE404-100TAPBS Piec próżniowy
z podłączoną pompą próżniowąJP Selecta, SA5900620
Okap laminarnyTELSTAR Technologies, SL TELSTARAH-100Lampa 12,0 W promieniowania UV-C
Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznegoInkubator LABOGENEMARS 1200
ASTEC CO, LTDSCA-165DR
Mieszalnik wirowyBiosanV-1 Plus
Macherey-Nagel, NiemcyNanocolor UV/VIS II
Palnik BunsenaJP Selecta, SA7001539
Palnik alkoholowyVIDRA FOC, SA1658/20W przypadku, gdy konieczna jest sterylizacja, należy przeprowadzić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II
Wytrząsarka orbitalnasartorius stedim8864845
SonicatorSELECTA 300061750/60 Hz
Suwmiarka cyfrowaACHA17-2600-150 mm
Pipeta serologicznaFisherbrand13-678-1125 mL, sterylna
Pipeta serologicznaVWR612-49505 mL, sterylna
Pipeta serologicznaVWR612-554110 mL, sterylna
MikropipetaGILSONFA10005PPipetman L P200L, plastikowa 20-200 i mikro; L
MikropipetaGILSONF123602Pipetman P1000, 200-1000 & mikro; L
Mikropipeta GILSONFA10016Pipetman L P12X300L, 20-300 & mikro; L
Końcówki do mikropipetLABBOXTIBP-200-9602-200 µ L
Końcówki do mikropipetLABBOXTIBP-1K0-480100-1000 µ L
Wstępnie wysterylizowana tuba INSULAB30140210 ml 
Aparat fotograficznyCanon EOS 5DMożna również wykorzystać dowolny aparat o wysokiej rozdzielczości
Bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus  szczep V329Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888– 2896 (2001)
Bakterie Gram-ujemne Escherichia coliColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECTCECT 101
Drożdże Candida albicansColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECTCECT 1394
Probówki do mikrowirówek DASLAB1755081,5 mL
AutoklawJP Selecta, SA4002136
Spektrofotometr-kuwetyUVAT Bio CBF-0902-024,5 mL
Szpatułka DrigalskiegoLABBOXSPRP-L05-1K0Sterylne, jednorazowe 
szklane (średnica 2 mm)Hecht Karl1401/2Autoklawowalne, alternatywne urządzenie dla szpatułki Drigalskiego
Worki autoklawoweDELTALAB200318Do sterylizacji pozostałości mikrobiologicznych lub skażonego materiału
Elektroniczne urządzenie do napełniania pipetJetPipJET BIOFIL
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-100-010100 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-250-010250 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-500-010500 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-1K0-0101000 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Rękawiczki lateksoweDENIA2278000000
Taśma wskaźnikowa do sterylizacjiLABBOXSTAP-A55-001Taśma samoprzylepna z impregnowanym papierem zmienia kolor pod wpływem procesu sterylizacji.
Uniwersalny stojak na probówkiLABBOXMTSP-001-001Do przechowywania probówek wirówkowych
Stojak na probówki do mikrowirówekVWR211-0210Do przechowywania probówek do mikrowirówek
Sterylnapętla ACEFE S.A.10014005510 & mikro; L zdolności do hodowli drobnoustrojów 
Materiał M1Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 1 
Materiał: M2Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 2 
Materiał M3Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału3
Materiał M4Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 4 
Materiał: C: Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Materiałkontrolny
Spektrofotometr kulki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).">Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668(2016).">Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668(2016).
  3. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104(2011).">Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104(2011).
  4. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).">Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).">Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).">Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).">Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).">Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).">Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).">Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).">Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).">Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).">Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).">Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).">McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).">Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).">Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).">Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).">Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565(2000).">Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565(2000).
  21. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).">Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).">Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).">Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).">Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).">Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).">Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).">Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684(2017).">Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684(2017).
  34. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235(2017).">Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235(2017).
  35. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).">Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).">Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405(2018).">Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405(2018).
  38. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).">Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584(2007).">ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584(2007).
  40. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).">Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).">Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antimicrobial CharacterizationAdvanced MaterialsBioengineering ApplicationsAgar Disk DiffusionISO 22196 Contact MethodStaphylococcus aureusEscherichia coliCandida albicansTryptic Soy BrothColony Forming Units

Related Articles