Artykuł metodologiczny

Charakterystyka przeciwdrobnoustrojowa zaawansowanych materiałów do zastosowań bioinżynieryjnych

25.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57710

⸱

4 sierpnia 2018

 ,  , 
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół charakterystyki przeciwdrobnoustrojowej zaawansowanych materiałów. W tym przypadku aktywność przeciwdrobnoustrojowa na powierzchniach materiałów jest mierzona za pomocą dwóch metod, które wzajemnie się uzupełniają: jedna opiera się na teście dyfuzji krążka agarowego, a druga jest standardową procedurą opartą na normie ISO 22196:2007.

Streszczenie

Rozwój nowych zaawansowanych materiałów o ulepszonych właściwościach staje się coraz ważniejszy w szerokim zakresie zastosowań bioinżynierii. W związku z tym wiele nowych biomateriałów jest projektowanych tak, aby naśladować określone środowiska wymagane w zastosowaniach biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa i kontrolowane dostarczanie leków. Opracowywanie materiałów o ulepszonych właściwościach do immobilizacji komórek lub enzymów jest również aktualnym tematem badawczym w inżynierii bioprocesowej. Jednak jedną z najbardziej pożądanych właściwości materiału w tych zastosowaniach jest zdolność przeciwdrobnoustrojowa do unikania niepożądanych infekcji. W tym celu przedstawiamy łatwe do naśladowania protokoły charakterystyki przeciwdrobnoustrojowej materiałów w oparciu o (i) test dyfuzji krążka agarowego (metoda dyfuzyjna) oraz (ii) normę ISO 22196:2007 do pomiaru aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa). Protokół ten musi być wykonywany przy użyciu bakterii i drożdży Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, aby objąć szeroki zakres mikroorganizmów. Na przykład 4 materiały o różnym nakładzie chemicznym są testowane zgodnie z tym protokołem przeciwko Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Wyniki tych testów wykazują aktywność nieprzeciwdrobnoustrojową dla pierwszego materiału i rosnącą aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych dla pozostałych 3 materiałów. Jednak żaden z 4 materiałów nie jest w stanie zahamować wzrostu Candida albicans.

Wprowadzenie

Awaria implantu jest często konsekwencją infekcji mikrobiologicznych, które występują pomimo profilaktyki przeciwbakteryjnej i aseptycznych warunków pracy. Ten problem powoduje bardzo wysokie koszty opieki zdrowotnej i jest niepokojący wśród pacjentów1. Ważne bakterie, takie jak Staphylococcus aureus, są obecnie uważane za bardzo niebezpieczne patogeny w zakażeniach szpitalnych związanych z cewnikami i innymi implantami medycznymi i są głównymi zanieczyszczeniami instrumentów medycznych2. W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowatorskich strategii przeciwdrobnoustrojowych zarówno do zastosowań codziennych, jak i medycznych.

Środki przeciwdrobnoustrojowe obejmują antybiotyki3, czwartorzędowe związki amoniowe4, jony/tlenki metali5, oraz peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs)6. Antybiotyki stopniowo stają się coraz mniej skuteczne ze względu na oporność bakterii7, która rośnie z powodu nadużywania antybiotyków8. Czwartorzędowe związki amoniowe są bardzo skuteczne tylko w krótkotrwałym stosowaniu ze względu na oporność mikrobiologiczną9. Jony/tlenki metali od dawna są wykorzystywane jako bardzo skuteczne środki przeciwdrobnoustrojowe i są stosowane w wielu popularnych produktach komercyjnych, w tym bandażach, filtrach do wody, farbach itp.10,11,12. Wykazano jednak, że tego typu związki mogą być toksyczne dla niektórych typów komórek ssaków13.

AMPs wykazują doskonałe właściwości przeciwbakteryjne i immunomodulujące14,15, a bakteriom wydaje się, że bardzo trudno jest rozwinąć odporność na nie16. Jednak proces produkcji czystych AMP jest kosztowny; W związku z tym produkcja na dużą skalę nie jest opłacalna. W związku z tym opracowano strategie przeciwdziałania problemom z wytwarzaniem AMP (np. małocząsteczkowe antybakteryjne peptoidy naśladują 17, peptoids18, α-peptides19 i β-peptides20). Polipeptydy i polipeptoidy zakończone metakrylanem zostały zsyntetyzowane do powłok przeciwbakteryjnych i przeciwporostowych21.

Coraz bardziej konieczne jest opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak zaawansowane materiały w czystej lub hybrydowej formie, zdolne do zapobiegania i leczenia infekcji wielolekoopornych. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano szeroką gamę nowych zaawansowanych materiałów dla wielu dziedzin bioinżynierii, takich jak inżynieria tkankowa i bioprocesowa, o ulepszonych właściwościach chemicznych i fizycznych dzięki kilku metodom: polimeryzacja plazmowa szczepienie na podłożu hydrofobowym22,23,24, dostosowanie gęstości sieciowania25,26, polimeryzacja w roztworze27,28,29,30, Porogen dissolution31,32, oraz poprzez włączenie nanomateriałów, takich jak tlenek grafenu (GO)33,34,35,36i nanowłókna węglowe (CNF)37.

Badanie zdolności przeciwdrobnoustrojowych tych nowych materiałów mogłoby wykładniczo zwiększyć ich potencjalną możliwość zastosowania w bioinżynierii i dlatego stało się niezbędne. Przedstawiamy łatwy do zastosowania protokół do ilościowego określenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej takich nowych zaawansowanych materiałów. Tutaj, po przygotowaniu próbki, stosuje się dwie uzupełniające się metody: pierwsza opiera się na teście dyfuzji krążka agarowego38 (metoda dyfuzji), a druga opiera się na normie ISO 22196:2007 39 w celu pomiaru aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa).

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Wytnij próbki materiału w postaci dysków o średnicy 10 mm za pomocą cylindricalnego dziurkacza o średnicy 10 mm.
    UWAGA: Materiały kruche można zmiękczyć w odpowiednich sterylnych rozpuszczalnikach przez 1 h, a następnie wyciąć w dyski. Na przykład materiały hydrofilowe, takie jak alginian cynku, badano zgodnie z tym protokołem, namaczając je w wodzie autoklawowanej przed wycinaniem, aby zapobiec łamaniu się próbek. Jednakże inne materiały hydrofobowe, takie jak poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerian), nie wymagają uprzedniego pęcznienia w celu prawidłowego wycięcia.
  2. Wysusz dyski z materiału próbnego w temperaturze 60 °C w piecu próżniowym (<10-2 Torr) przez 24 h.
    UWAGA: Niektóre materiały mogą wymagać wysokiej temperatury suszenia. Ważne jest jednak, aby nie osiągnąć temperatury, która mogłaby doprowadzić do termicznej degradacji materiału.
  3. Zmierz grubość folii materiałowej za pomocą cyfrowego suwmiarki.
    UWAGA: Niniejszy protokół zaleca stosowanie folii materiałowych o stałej i zbliżonej grubości podczas porównywania aktywności przeciwdrobnoustrojowej różnych materiałów.
  4. Sterylizuj każdy okaz poprzez zanurzenie w etanolu 70% na 10 min, a następnie poddaj działaniu promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 1 h na każdą stronę.
    UWAGA: Promieniowanie UV można przeprowadzić, umieszczając każdy okaz w sterylnej czarce Petriego wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza z lampą emitującą promieniowanie UV-C o mocy 12,0 W.
    OSTROŻE: Badacze nie powinni wystawiać się na działanie promieniowania UV, ponieważ jest ono mutagenne.
  5. Wykonaj kroki 1.1, 1.2, 1.3 i 1.4 dla dysków z materiału kontrolnego.
    UWAGA: Jako dyski kontrolne w metodzie dyfuzyjnej i kontaktowej można zastosować politereftalan etylenu (PET) lub alternatywne materiały pozbawione właściwości przeciwdrobnoustrojowych. Ponadto, podczas charakteryzacji nanokompozytów lub materiałów modyfikowanych, jako materiał kontrolny należy wykorzystać materiał bazowy.

2. Zalecane mikroorganizmy

UWAGA: Zalecamy użycie 3 różnych mikroorganizmów, aby zbadać zdolność przeciwdrobnoustrojową testowanego materiału przeciwko szerokiemu spektrum mikroorganizmów.

  1. Użyć czystych kultur 3 mikroorganizmów: bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus, bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli oraz drożdżaków Candida albicans.
    UWAGA: Za pomocą niniejszego protokołu można badać również inne gatunki mikroorganizmów, modyfikując w razie potrzeby warunki inkubacji.
    OSTRZEŻENIE: Należy przestrzegać wymaganych środków bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z rodzajem mikroorganizmów wykorzystanych w tym protokole.
  2. Pracować z materiałami sterylnymi lub autoklawowanymi; podczas całego procesu manipulacji mikrobiologicznych używać palnika Bunsena lub komory z laminarnym przepływem powietrza (jeśli jest to konieczne), aby zapewnić warunki aseptyczne.
    UWAGA: Zalecane warunki autoklawowania to 121 °C przez 15 min dla pośrodków hodowlanych oraz 121 °C przez 20 min dla materiałów roboczych i odpadów biologicznych.

3. Test dyfuzyjny na dyskach agarowych (metoda dyfuzyjna)

UWAGA: W przypadku, gdy głównym mechanizmem przeciwdrobnoustrojowym zaawansowanych materiałów może być dyfuzja ciekła związków przeciwdrobnoustrojowych, metoda dyfuzyjna może dostarczyć bardzo użytecznych informacji na temat zdolności przeciwdrobnoustrojowej tych materiałów. Dysk z materiału umieszczony w centrum płytki z agarem może utworzyć przezroczystą strefę pierścienia (halo), w której dochodzi do zahamowania wzrostu mikroorganizmów po 24 h inkubacji (patrz Rysunek 1).

  1. Procedura testu dyfuzyjnego
    1. Przygotować i wysterylizować w autoklawie agar sojowy z tryptoną (TSA) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wlej agar TSA do sterylnych szalek Petriego w warunkach aseptycznych, używając palnika Bunsena lub komory z laminarnym przepływem powietrza.
      UWAGA: Płytki TSA muszą mieć grubość 4–6 mm.
    3. Hodować poszczególne mikroorganizmy do testów tlenowo przez 18–24 h w szalkach Petriego z podłożem TSA w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    4. Przygotować i autoklawować pożywkę sojową z tryptonem (TSB) zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Przenieś TSB do uprzednio wysterylizowanej probówki do wirowania o pojemności 50 mL za pomocą uprzednio wysterylizowanej pipety serologicznej, zachowując warunki aseptyczne przy użyciu palnika Bunsena lub komory z laminarnym przepływem powietrza.
    6. Resuspend kilka kolonii z kroku 3.1.3 w 25 ml pożywki TSB znajdującej się w sterylnej probówce do wirowania, używając sterylnego patyczka bawełnianego, a następnie mieszaj na wortexie przez 1 min, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
    7. Dostosuj absorbancję (przy 540 nm) hodowli za pomocą spektrofotometru do odpowiedniej liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml: około 1,5 x 108 CFU/ml dla bakterii i od 1 x 106 do 5 x 106 CFU/ml dla drożdży.
      UWAGA: Objętość hodowli i kuwety do pomiaru absorbancji należy dobrać zgodnie z typem zastosowanego spektrofotometru.
    8. Wymieszaj pożywkę mikrobiologiczną na wstrząsacu wirówkowy (vortex) przez 5 sekund, aby poprawić dyspersję mikroorganizmów, a następnie krótko zanurz w tej zawiesinie mikrobiologicznej sterylną patyczkową wymazówkę. Usuń nadmiar cieczy z wymazówki, dociskając ją do ścianki probówki z kulturą.
    9. Równomiernie rozprowadzić zawiesinę drobnoustrojową z bulionu za pomocą sterylnego wełnianego tamponu na powierzchni płytek TSA w trzech płaszczyznach, aby pokryć całą ich powierzchnię mikroorganizmem, a następnie pozostawić do wyschnięcia przez 5 min po szczepieniu.
      UWAGA: Aby usunąć wilgoć, płytki TSA należy pozostawić otwarte w pozycji odwróconej przez 37 °C przez 10–15 min przed inokulacją.
    10. Zdezynfekuj pęsetę, zanurzając ją w zlewce z 96% etanolem, a następnie opalając palnikiem Bunsena lub palnikiem spirytusowym.
    11. Za pomocą sterylnej pęsety umieść badane krążki z próbkami oraz krążek kontrolny w centrum płyt z agarosem TSA.
    12. Inkubować płytki TSA tlenowo w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C przez 24 h.
      UWAGA: Aby uniknąć ryzyka kontaminacji, zaleca się inkubację płytek TSA w pozycji odwróconej. Jeśli jednak krążek z próbką odłączy się od płytek TSA, nie należy wykonywać tego etapu w pozycji odwróconej. W takim przypadku zaleca się wysuszenie płytek w laminarnym dyfuzorze powietrza. Ten test przeciwmikrobowy musi zostać przeprowadzony co najmniej w czterech powtórzeniach w różne dni, aby zapewnić powtarzalność.
  2. Kontrola stężenia i czystości zawiesiny drobnoustrojów
    UWAGA: Następujące kroki są niezbędne, aby sprawdzić, czy stężenie drobnoustrojów określone za pomocą spektrofotometru w kroku 3.1.7 jest prawidłowe oraz upewnić się, że nie doszło do środowiskowej kontaminacji mikrobiologicznej. Kontaminację środowiskową można łatwo wykryć po pojawieniu się różnych typów kolonii drobnoustrojów po 24 godzinach inkubacji. Ponadto, za pomocą ujemnej płytki kontrolnej z pożywką TSB należy upewnić się, że nie doszło do kontaminacji mikrobiologicznej pożywki TSB podczas jej manipulacji w trakcie wykonywania dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych.
    1. Przenieś sterylną pożywkę TSB (przygotowaną w kroku 3.1.4) do sterylnych probówek do mikrowirówki, używając mikropipety z odpowiednimi autoklawowanymi końcówkami w warunkach aseptycznych. Jedna z probówek posłuży jako ujemna kontrola TSB.
    2. Przeprowadź dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne zawiesiny mikroorganizmów w bulionie wykorzystanej w kroku 3.1.9, używając sterylnych probówek do mikrowirówki zawierających TSB.
    3. Rozprzestrzenianie 100 µL każdego rozcieńczenia na płytkach TSA, używając uprzednio wysterylizowanej pęsety Drigalskiego lub innego odpowiedniego narzędzia. Następnie rozprowadzić 100 μL pożywki TSB bez mikroorganizmów (przygotowanej w kroku 3.2.1) na płytce TSA jako ujemną płytkę kontrolną TSB.
    4. Inkubować płytki TSA w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 h.
    5. Policz liczbę kolonii, aby sprawdzić, czy wartość CFU/ml jest zbliżona do wartości wyznaczonej w kroku 3.1.7.
    6. Upewnij się, że na płytkach TSA nie występuje mikrobiologiczne zanieczyszczenie środowiskowe, obserwując obecność tylko jednego typu kolonii.
    7. Sprawdzić, czy na płytce kontrolnej ujemnej TSB nie występuje zanieczyszczenie mikrobiologiczne, co potwierdza brak kolonii

4. Pomiar aktywności przeciwdrobnoustrojowej na powierzchniach materiałów (metoda kontaktowa)


UWAGA: W przypadku, gdy kontakt z powierzchnią może być głównym mechanizmem przeciwdrobnoustrojowym niektórych materiałów zaawansowanych, metoda kontaktu może dostarczyć bardzo cennych informacji o zdolności przeciwdrobnoustrojowej tych materiałów. W tej metodzie mikroorganizmy umieszcza się bezpośrednio na powierzchni materiału, a stopień zahamowania ich wzrostu określa się po upływie określonego czasu.

  1. Procedura wstępna
    1. Przygotować i wysterylizować w autoklawie pożywkę TSB zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przenieść pożywkę TSB do wstępnie wysterylizowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL za pomocą wstępnie wysterylizowanej pipety serologicznej, zachowując warunki aseptyczne przy użyciu palnika Bunsena lub komory z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Hodować badane mikroorganizmy tlenowo przez noc w probówce z TSB w inkubatorze orbitalnym (140 rpm) w temperaturze 37 °C.
    4. Rozcieńczyć nocną hodowlę w 20 mL TSB w wstępnie wysterylizowanej probówce wirówkowej o pojemności 50 mL do stężenia około 106 CFU/mL (wyznaczonego za pomocą spektrofotometru przy 540 nm).
      UWAGA: Objętość hodowli i kuwety do pomiaru absorbancji należy dobrać zgodnie z typem zastosowanego spektrofotometru.
    5. Wykonać dziesiętne rozcieńczenia seryjne tej hodowli w sterylnych probówkach mikrocentryfugowych zawierających TSB. Wysiać 10 µL hodowli na płytki TSA i inkubować tlenowo w 37 °C przez 24 h.
    6. Policzyć liczbę kolonii, aby upewnić się, że początkowe stężenie komórek wynosi około 1 x 106 CFU/mL.
    7. Umieścić 4 krążki kontrolne do liczenia drobnoustrojów po 24 h oraz 4 krążki z próbek każdego z badanych materiałów do liczenia drobnoustrojów po 24 h w oddzielnych studzienkach sterylnej płytki 48-dołkowej.
    8. Nanieść pipetą 150 µL zawiesiny drobnoustrojów na powierzchnię każdego krążka.
  2. Liczenie drobnoustrojów na materiałach kontrolnych i badanych (po 24 h)
    1. Po kroku 4.1.6 inkubować tlenowo 4 pozostałe krążki z próbkami w płytce 48-dołkowej w 37 °C przez 24 h.
      UWAGA: Ten 24-godzinny czas inkubacji może zostać zmodyfikowany w celu zbadania hamowania wzrostu w krótszych lub dłuższych odstępach czasu.
    2. Po 24 h inkubacji nanieść pipetą 850 µL sterylnego PBS na powierzchnię 4 krążków z próbkami i wymieszać go z 150 µL zawiesiny drobnoustrojów.
    3. Zebrać mieszaninę PBS/zawiesiny drobnoustrojów oraz każdy krążek z płytki 48-dołkowej i przenieść je do wstępnie wysterylizowanej probówki o pojemności 10 mL.
    4. Mieszaninę PBS/zawiesinę drobnoustrojów oraz każdy krążek poddać wytrząsaniu wortexie przez 1 min, sonikować przy 50 Hz przez 5 min i ponownie poddać wytrząsaniu wortexie przez 1 min, aby upewnić się, że żadne żywe mikroorganizmy nie pozostały przytwierdzone do powierzchni materiału.
    5. Wykonać dziesiętne rozcieńczenia seryjne każdej sonikowanej hodowli w sterylnych probówkach mikrocentryfugowych zawierających TSB, wysiać 10 µL hodowli na płytki TSA i inkubować tlenowo w 37 °C przez 24 h.
    6. Policzyć liczbę kolonii, która odpowiada liczbie żywych mikroorganizmów na powierzchni każdego krążka z próbką i krążka kontrolnego. Wyrazić tę liczbę żywych komórek w (CFU/mL).
    7. Wykonać zdjęcie końcowej hodowli drobnoustrojów dla krążków z próbkami i krążków kontrolnych.

5. Analiza wyników przeciwdrobnoustrojowych

Szalka z kulturą drobnoustrojów z halo antymikrobowym, metoda dyfuzji dyskowej, hamowanie wzrostu drobnoustrojów.
Rysunek 1: Pomiary znormalizowanej szerokości strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów. Ten panel przedstawia średnicę strefy zahamowania (diz) oraz średnica krążka (To jest pusta wiadomość lub pojedyncza litera. Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

  1. Analiza wyników metody dyfuzyjnej
    1. Zmierz średnicę strefy zahamowania (diz) oraz średnica krążka (d) (patrz Rycina 1) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
      UWAGA: Strefa zahamowania lub przeciwdrobnoustrojowa „halo” powstaje w wyniku zahamowania wzrostu mikroorganizmów wywołanego przez krążek z materiałem przeciwdrobnoustrojowym (patrz Rycina 1). Można zauważyć obecność przezroczystej strefy pierścieniowej w pobliżu próbki w porównaniu z pozostałą częścią płytki, na której mikroorganizmy rozwinęły się prawidłowo (strefa mętna).
    2. Wyznacz znormalizowaną szerokość antybakteryjnego „halo” (nwcześć) każdego dysku, stosując równanie (1).
      (1)     Równanie równowagi statycznej; formuła obliczania szerokości halo; n_hw= (d_iz-d)/(2/d).
    3. Wyznacz średnią i odchylenie standardowe znormalizowanej szerokości „halo” przeciwmikrobowego dla 4 wyznaczonych wartości nwcześć wartości dla każdej próbki.
    4. Wykonaj zdjęcie końcowej hodowli mikrobiologicznej z dyskiem z materiałem.
      Uwaga: Średnica strefy zahamowania (diz) oraz średnicy krążka (d) można również zmierzyć na podstawie fotografii wykonanej w kroku 5.1.4, wykorzystując odpowiednie oprogramowanie do przetwarzania obrazów.
  2. Analiza wyników metody kontaktowej
    1. Wyznaczyć liczbę odzyskanych żywych drobnoustrojów zgodnie z równaniem (2).
      (2)     Równanie równowagi N=C·D/A; obliczenia według wzoru; zastosowanie edukacyjne; pojęcie równowagi statycznej.
      UWAGA: Tutaj, N liczba odzyskanych żywych mikroorganizmów na cm2 na próbkę badawczą; C jest to liczba kolonii na płytce; D jest współczynnikiem rozcieńczenia; A czy powierzchnia próbki testowej jest podana w cm2 wyznaczono na podstawie średnicy dysku z próbką.
    2. Określ utratę żywotności (LV) w celu odzwierciedlenia zahamowania wzrostu komórek poprzez zastosowanie równania (3).
      (3)     Wzór na ubytek objętości soczewki, LV(%)=(C−S)/C×100, schemat równania matematycznego.
      UWAGA: W tym przypadku C oznacza średnią liczbę żywych mikroorganizmów (N) w JCF/ml•cm2, odzyskane z próbek kontrolnych po 24 h; S to liczba żywych mikroorganizmów (N) w CFU/ml•cm2, odzyskane z próbek testowych po 24 h.
    3. Wyznacz średnią i odchylenie standardowe utraty żywotności dla 4 wyznaczonych wartości LV(%) wartości dla każdej próbki.

Wyniki

Niniejszy protokół został zastosowany, w ramach przykładu, do przetestowania zdolności przeciwdrobniczej 4 materiałów o różnej naturze chemicznej przeciwko 3 zalecanym mikroorganizmom: Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz Candida albicans. Wyniki testów dyfuzyjnych na dyskach agarowych (metoda dyfuzyjna) wykazały brak aktywności przeciwdrobniczej w przypadku pierwszego materiału (M1), podobnie jak w przypadku dysku kontrolnego (C, obraz nie pokazano), oraz wzrost aktywności przeciwbakteryjnej przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym dla pozostałych 3 materiałów M2, M3 i M4 (patrz Rysunek 2).

Test wrażliwości na antybiotyki, szalki Petriego z S. aureus, E. coli, strefy zahamowania wzrostu.
Rysunek 2: Wyniki metody dyfuzyjnej przeciwdrobnoustrojowej. Ten panel przedstawia metodę dyfuzyjną do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej dla 4 dysków z materiałów (M1, M2, M3 i M4) (średnica 10 mm x grubość 1 mm) przeciwko S. aureus i E. coli po 24 h inkubacji. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 3 przedstawia różne znormalizowane szerokości przeciwbakteryjnego „halo” (nwhalo) dla różnych materiałów przykładniczych M1, M2, M3 i M4 przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym, obliczone zgodnie z równaniem (1). Jednak żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdżaków Candida albicans (zdjęcia nie zostały przedstawione).

Wykres aktywności przeciwdrobnoustrojowej, S. aureus vs E. coli, przedstawiający strefy zahamowania wzrostu, porównanie na wykresie słupkowym.
Rysunek 3: Wyniki dyfuzyjnego testu podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe („halo”). Ten panel przedstawia znormalizowany „halo” (nwcześć) dla każdego materiału (M1, M2, M3 i M4) krążka (średnica 10 mm x grubość 1 mm) przeciwko S. aureus i E. coli po 24 h inkubacji. Różnice są statystycznie istotne (p <0,01). Jednakże próbka M1 nie wykazała aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki metody kontaktowej również wykazały brak aktywności przeciwdrobnoustrojowej dla pierwszego materiału (M1), podobnie jak w przypadku krążka kontrolnego (C), oraz zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych dla pozostałych 3 materiałów (patrz Rysunek 4).

Wzrost bakteryjny na płytkach agarowych S. aureus, E. coli; porównanie formowania kolonii, wyniki eksperymentu.
Rysunek 4: Wyniki metody kontaktowej oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Ten panel przedstawia odpowiednie płytki o średnicy 90 mm z badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej powierzchni 4 materiałów (M1, M2, M3 i M4) zgodnie z normą ISO 22196:207 po 24 h inkubacji dla S. aureus i E. coli (czynnik rozcieńczenia wynoszący 10-4). C jest liczba żywych bakterii odzyskanych z krążka kontrolnego po 24 h inkubacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego schematu.

Utratę żywotności (%) określono za pomocą równań (2) i (3), zgodnie z opisem w niniejszym protokole (patrz Rysunek 5).

Wykres słupkowy utraty żywotności bakterii dla S. aureus, E. coli; porównanie efektu przeciwdrobnoustrojowego.
Rysunek 5: Utrata żywotności metodą kontaktową. Panel ten przedstawia utratę żywotności (%) dla M1, M2, M3 i M4 w stosunku do S. aureus i E. coli na powierzchniach materiałów. Próbka M1 nie wykazała aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Jednakże żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdżaków Candida albicans metodą kontaktową (zdjęcia nie zostały przedstawione). Zatem 3 z tych 4 zaawansowanych materiałów wykazały pozytywne wyniki przeciwdrobnoustrojowe wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, a tym samym mogą być bardzo użyteczne w wielu zastosowaniach bioinżynieryjnych wymagających wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej. Niemniej jednak żaden z 4 materiałów nie był w stanie zahamować wzrostu drożdżaków.

Dyskusja

Aktywność przeciwdrobnoustrojową nowych zaawansowanych materiałów można analizować za pomocą tego łatwego do naśladowania protokołu składającego się z 2 uzupełniających się procedur opartych na 2 istniejących metodach: teście dyfuzji krążka agarowego38 oraz aktywności przeciwdrobnoustrojowej mierzonej na powierzchniach materiałów zgodnie z normą ISO 22196:200739.

W tej dziedzinie badań wiele testów przeciwdrobnoustrojowych opisywanych w literaturze jest w dużym stopniu zależnych od testów. Dlatego bardzo ważne jest, aby we wszystkich laboratoriach obowiązywały szczegółowe i spójne protokoły. Ten artykuł jest krokiem w tym kierunku. Co więcej, może to być bardzo pomocne dla wielu badaczy, którzy są mniej doświadczeni w tej dziedzinie i wymagają dogłębnych procedur krok po kroku, których należy przestrzegać, aby uzyskać dokładne wyniki.

Protokół ten może być stosowany w przypadku wielu rodzajów materiałów pociętych na dyski o średnicy 10 mm. Kruche materiały można pęcznieć w odpowiednim rozpuszczalniku przez 1 godzinę, aby ułatwić proces cięcia. W ten sposób materiały hydrofilowe, takie jak alginiany, można uwodnić w autoklawowanej wodzie destylowanej. Inne rozpuszczalniki, takie jak etanol, keton i dichlorometan, można zastosować do pęcznienia materiałów hydrofobowych przez 1 godzinę przed ich pocięciem. Jednak niektóre materiały, takie jak poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerianian) nie muszą być spęczniane i można je ciąć bezpośrednio. Następnie bardzo ważne jest, aby wysuszyć krążki z materiałem próbki w piecu próżniowym i sterylizować każdą próbkę etanolem i promieniowaniem UV przez 1 godzinę, aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia.

Protokół ten zaleca TSA i TSB jako pożywki hodowlane oraz stosowanie czystych kultur 3 mikroorganizmów w celu dotarcia do szerokiej gamy mikroorganizmów: bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus, bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli i drożdży Candida albicans. Jednak w ramach tego protokołu można również stosować alternatywne podłoża hodowlane i inne mikroorganizmy wymagające różnych warunków inkubacji. Czasami testowany jest tylko 1 mikroorganizm, aby mieć wstępne wyobrażenie o aktywności przeciwdrobnoustrojowej nowego materiału.

Materiały wykazujące silną aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec zalecanych 3 różnych typów mikroorganizmów powinny być również testowane pod kątem patogenów opornych na antybiotyki, takich jak oporny na metycylinę Staphylococcus epidermidis (MRSE), które zostały z powodzeniem wykorzystane w tym protokole. Inne ważne mikroorganizmy lekooporne, które budzą duże zaniepokojenie, to Gram-dodatni gronkowcowy gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (MRSA) i enterokoki oporne na wankomycynę (VRE) oraz Gram-ujemne Pseudomonas aeruginosa40,41.

Za pomocą tego protokołu nie można badać hamowania biofilmu i aktywności przeciwdrobnoustrojowej materiałów wobec innych rodzajów mikroorganizmów, takich jak wirusy i pasożyty. Protokół ten stanowi jednak bardzo przydatny punkt wyjścia do badania przeciwdrobnoustrojowego nowego zaawansowanego materiału.

W antybakteryjnym teście dyfuzji krążka agarowego krytyczny etap zachodzi, gdy krążek próbki musi zostać umieszczony na środku płytki, ponieważ niektóre materiały składają się, gdy tylko wejdą w kontakt z podłożem agarowym. W takim przypadku zaleca się użycie sterylnej pęsety w celu ostrożnego rozłożenia próbki. Z drugiej strony, w metodzie kontaktowej, bardzo ważne jest, aby bardzo dobrze umyć krążki kontrolne i próbki za pomocą PBS poprzez ich czterokrotne pipetowanie, a następnie energiczne wirowanie i sonikację, aby upewnić się, że żadne żywe mikroorganizmy nie pozostaną przyklejone do powierzchni materiału.

Ten protokół wideo może być wykorzystywany w wielu zastosowaniach bioinżynieryjnych, takich jak inżynieria bioprocesowa, inżynieria tkankowa, kontrolowane dostarczanie leków, materiały opakowaniowe, oczyszczanie ścieków i rolnictwo, które wykorzystują biomateriały o wysoce pożądanej zdolności przeciwdrobnoustrojowej.

Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu są jakościowe (obrazy) i ilościowe (znormalizowana szerokość przeciwbakteryjnej "aureoli" i utrata żywotności) z dobrą analizą jej odtwarzalności (średnia ± odchylenie standardowe). Porównując różne materiały, te średnie wartości uzyskane za pomocą analizy wyników metody dyfuzji i kontaktu muszą być przeanalizowane za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie analizy post hoc w Turcji, w celu zbadania, czy statystycznie różnią się one istotnie (p <0,01).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir za wsparcie finansowe dla tej pracy poprzez granty 2017-231-001UCV i 2018-231-001UCV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stempel cylindryczny Szalki Petriego o średnicy 10 mm
soria genlabP101Średnica 90 mm, sterylne
Tryptyczny agar sojowy (TSA)Liofilchem610052Odwodnione podłoże 500 g (proszek)
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Liofilchem610053Odwodnione podłoże 500 g (proszek)
Sterylny wacik bawełnianyWirówka EUTOTUBO300200
probówki VIDRA FOC, SA42990050 mL, sterylne
EtanolVWR83813360Absolutny etanol
Sterylna 48-dołkowa płytkaCOSTAR3548Płaskie dno z pokrywką, poddana działaniu kultur tkankowych, niepirogenna, polistyren
Para pęsetBRAUN24612036Bezzębny
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).VWRE404-100TAPBS Piec próżniowy
z podłączoną pompą próżniowąJP Selecta, SA5900620
Okap laminarnyTELSTAR Technologies, SL TELSTARAH-100Lampa 12,0 W promieniowania UV-C
Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznegoInkubator LABOGENEMARS 1200
ASTEC CO, LTDSCA-165DR
Mieszalnik wirowyBiosanV-1 Plus
Macherey-Nagel, NiemcyNanocolor UV/VIS II
Palnik BunsenaJP Selecta, SA7001539
Palnik alkoholowyVIDRA FOC, SA1658/20W przypadku, gdy konieczna jest sterylizacja, należy przeprowadzić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II
Wytrząsarka orbitalnasartorius stedim8864845
SonicatorSELECTA 300061750/60 Hz
Suwmiarka cyfrowaACHA17-2600-150 mm
Pipeta serologicznaFisherbrand13-678-1125 mL, sterylna
Pipeta serologicznaVWR612-49505 mL, sterylna
Pipeta serologicznaVWR612-554110 mL, sterylna
MikropipetaGILSONFA10005PPipetman L P200L, plastikowa 20-200 i mikro; L
MikropipetaGILSONF123602Pipetman P1000, 200-1000 & mikro; L
Mikropipeta GILSONFA10016Pipetman L P12X300L, 20-300 & mikro; L
Końcówki do mikropipetLABBOXTIBP-200-9602-200 µ L
Końcówki do mikropipetLABBOXTIBP-1K0-480100-1000 µ L
Wstępnie wysterylizowana tuba INSULAB30140210 ml 
Aparat fotograficznyCanon EOS 5DMożna również wykorzystać dowolny aparat o wysokiej rozdzielczości
Bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus  szczep V329Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888– 2896 (2001)
Bakterie Gram-ujemne Escherichia coliColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECTCECT 101
Drożdże Candida albicansColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECTCECT 1394
Probówki do mikrowirówek DASLAB1755081,5 mL
AutoklawJP Selecta, SA4002136
Spektrofotometr-kuwetyUVAT Bio CBF-0902-024,5 mL
Szpatułka DrigalskiegoLABBOXSPRP-L05-1K0Sterylne, jednorazowe 
szklane (średnica 2 mm)Hecht Karl1401/2Autoklawowalne, alternatywne urządzenie dla szpatułki Drigalskiego
Worki autoklawoweDELTALAB200318Do sterylizacji pozostałości mikrobiologicznych lub skażonego materiału
Elektroniczne urządzenie do napełniania pipetJetPipJET BIOFIL
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-100-010100 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-250-010250 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-500-010500 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Butelka laboratoryjna z gwintem ISO, z podziałką, borokrzemian 3.3LABBOXSBG3-1K0-0101000 mL, do autoklawowania pożywek hodowlanych
Rękawiczki lateksoweDENIA2278000000
Taśma wskaźnikowa do sterylizacjiLABBOXSTAP-A55-001Taśma samoprzylepna z impregnowanym papierem zmienia kolor pod wpływem procesu sterylizacji.
Uniwersalny stojak na probówkiLABBOXMTSP-001-001Do przechowywania probówek wirówkowych
Stojak na probówki do mikrowirówekVWR211-0210Do przechowywania probówek do mikrowirówek
Sterylnapętla ACEFE S.A.10014005510 & mikro; L zdolności do hodowli drobnoustrojów 
Materiał M1Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 1 
Materiał: M2Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 2 
Materiał M3Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału3
Materiał M4Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Rodzaj materiału 4 
Materiał: C: Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Materiałkontrolny
Spektrofotometr kulki

Bibliografia

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668(2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104(2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565(2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684(2017).
  34. Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235(2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405(2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584(2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda dyfuzyjna z kr kami agarowymimetoda kontaktu wg normy ISO 22196Staphylococcus aureusEscherichia coliCandida albicansbulion sojowy tryptycznyjednostki tworz ce kolonie
Charakterystyka przeciwdrobnoustrojowa zaawansowanych materiałów do zastosowań bioinżynieryjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.