Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57712

⸱

27 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Streszczenie

Niedawny wzrost liczby wirusopodobnych cząsteczek (VLP) w badaniach biomedycznych i materiałowych można przypisać ich łatwości biosyntezy, dyskretnemu rozmiarowi, programowalności genetycznej i biodegradowalności. Chociaż są one bardzo podatne na reakcje biokoniugacji w celu dodania syntetycznych ligandów do ich powierzchni, zakres metodologii biokoniugacji na tych wodnych kapsydach jest stosunkowo ograniczony. Aby ułatwić kierunek badań nad biomateriałami funkcjonalnymi, należy rozważyć nietradycyjne reakcje biokoniugacji. Reakcja opisana w tym protokole wykorzystuje dibromomaleimidy do wprowadzenia nowej funkcjonalności w wiązaniach dwusiarczkowych wystawionych na działanie rozpuszczalnika VLP na bazie bakteriofaga Qβ. Co więcej, produkt końcowy jest fluorescencyjny, co ma dodatkową zaletę w postaci generowania sondy in vitro do śledzenia przy użyciu dostępnego na rynku zestawu filtrów.

Wprowadzenie

Wykorzystanie nano-rozmiarowych kapsydów wirusowych stało się ekscytującą dziedziną, która ma na celu poszerzenie zakresu zastosowań w badaniach biomedycznych1,2,3. Rekombinowane cząstki wirusopodobne (VLP) są strukturalnie wywodzące się z wirusów, ale brakuje im oryginalnego materiału genetycznego wirusa, co czyni je niezakaźnymi nanocząstkami białkowymi. Ponieważ cechy powierzchni są programowane genetycznie, a każdy kapsyd ulega ekspresji identycznie jak te przed i po nim, możliwe jest poznanie lokalizacji i liczby reaktywnych łańcuchów bocznych aminokwasów z atomistyczną precyzją. W wielu przypadkach zarówno powierzchnia zewnętrzna, jak i wewnętrzna zawierają wiele rodzajów reszt aminokwasowych wystawionych na działanie rozpuszczalników, które można funkcjonalizować poprzez reakcje biokoniugacji - reakcje, które tworzą wiązania kowalencyjne między biomolekułą a cząsteczką syntetyczną4,5.

Reakcje biokoniugacji pomagają interesującym biomolekułom uzyskać bardziej zróżnicowane funkcje w stosunkowo prosty sposób. Cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, takie jak leki terapeutyczne6, znaczniki fluorescencyjne7 i polimery8,9 mogą być wstępnie zsyntetyzowane i scharakteryzowane, zanim zostaną przyłączone do powierzchni VLP. Szczególnie powszechnym VLP w badaniach biomedycznych i biomateriałowych jest VLP oparty na bakteriofagu Qβ, który, w rekombinacji wyrażony, jest dwudziestościennym kapsydem wirusowym o długości fali 28 nm10. Najczęstszymi miejscami reakcji na Qβ są lizyny z dużym marginesem, chociaż niedawno poinformowaliśmy o udanej koniugacji związków dibromomaleimidu 11 ze zredukowanymi dwusiarczkami, które wyściełają pory Qβ w reakcji Haddletona-Bakera. Reakcja przebiega z dobrą wydajnością i, co równie ważne, bez utraty stabilności termicznej cząstek. Jednocześnie reakcja ta generuje fluorescencję indukowaną koniugacją, która może być wykorzystana do śledzenia wchłaniania tych cząstek do komórek. W tej pracy demonstrujemy koniugację glikolu polietylenowego (PEG) na powierzchni Qβ w wyniku reakcji Haddletona-Bakera, w wyniku której powstaje jasnożółty fluorofor. Cząstki te mogą być następnie śledzone, gdy są pobierane przez komórki. Niniejszy protokół pomoże naukowcom w generowaniu nowych fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek białkowych opartych na Qβ, chociaż jego zasady mają zastosowanie do jednego z wielu innych VLP zawierających dwusiarczki narażone na działanie rozpuszczalników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj agar z bulionu lizogennego (LB) i wlej talerze12.
  2. Przekształć BL21(DE3) za pomocą plazmidu pET28 zawierającego sekwencję białka płaszcza wtQβ.
    1. Rozmrozić kompetentne komórki E. coli BL21(DE3) w łaźni lodowej. Umieść 50 μl komórek w probówce do mikrowirówki.
    2. Dodaj 2 μl plazmidu do jednej probówki i delikatnie przesuń probówkę. Następnie inkubować na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny komórek przez 45 s w łaźni wodnej o temperaturze dokładnie 42 °C. Natychmiast po szoku cieplnym umieścić probówkę z powrotem w łaźni lodowej i inkubować przez 5 minut.
    4. Dodać 950 μl pożywki LB, która nie zawiera żadnego antybiotyku.
    5. Potrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Umieścić 100 μl kultury na płytkach agarowych LB (z kanamycyną) i inkubować szalkę przez noc w temperaturze 37 °C. W razie potrzeby wybrać białe kolonie.
  3. Przygotuj pożywkę Super Optimal Bulion (SOB).
    1. Dwie 2-litrowe kolby Erlenmeyera z przegrodami w autoklawie w cyklu superdry.
    2. W aseptycznym środowisku odważyć i dodać do każdej kolby 20,0 g tryptonu, 5,0 g ekstraktu drożdżowego, 2,469 g bezwodnego siarczanu magnezu, 0,584 g chlorku sodu i 0,186 g chlorku potasu.
    3. Doprowadzić objętość do 1 l ultraczystą wodą w każdej kolbie i autoklawie w cyklu cieczowym.
    4. Gdy pożywka SOB osiągnie temperaturę pokojową po autoklawowaniu, dodać 1 ml kanamycyny (100 mg/ml) do każdego litra pożywki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 0,1 M bufor fosforanu potasu (pH 7,00).
    1. Przygotować 1 M jednozasadowy roztwór potasu, rozpuszczając 68,045 g jednozasadowego potasu w 500 ml ultraczystej wody.
    2. Przygotować 1 M roztwór dwuzasadowy potasu, rozpuszczając 87,09 g dwuzasadowego potasu w 500 ml ultraczystej wody.
    3. Do butelki o pojemności 1 l dodać 38,5 ml jednozasadowego roztworu potasu i 61,5 ml dwuzasadowego potasu.
    4. W razie potrzeby dostosuj pH do 7,00 i doprowadź do objętości 1 l.
  5. Wykonać 5–40% gradientów sacharozy w 0,1 M buforze fosforanu potasu (pH 7,00).
    1. W probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml przygotować roztwory zawierające 5–40% (zwiększając się w krokach co 5%) sacharozę rozpuszczoną w 0,1 M buforze fosforanu potasu (pH 7,00).
    2. Umieść 3,3 ml 5% roztworu sacharozy na dnie 38 ml okrągłodennej probówki z poliwęglanu za pomocą długiej strzykawki igłowej i powtórz to dla pięciu innych probówek.
    3. Ostrożnie umieść 3,3 ml 10% roztworu sacharozy na dnie probówki i ostrożnie wyjmij igłę, aby nie zakłócić gradientu. Powtórz dla pozostałych pięciu probówek.
       
  6. Kontynuuj osadzanie 3,3 ml warstw roztworów sacharozy, zwiększając od 15% do 40% w każdej probówce, zachowując ostrożność, aby nie zakłócić gradientu.
  7. Po zakończeniu przykryć wierzchołki gradientów folią i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Wyrażenie Qβ

  1. Przetrzyj powierzchnię stołu wybielaczem/etanolem w stosunku 1:1.
  2. Wykonaj dwie kultury starterowe o pojemności 3 ml w środowisku aseptycznym poprzez dodanie pojedynczych kolonii E. coli BL21(DE3) do 3 ml pożywki SOB w środowisku aseptycznym .
  3. Uprawiaj na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0% (rH) przez noc.
  4. Zaszczepić kulturę starterową w pożywce SOB:
    1. Wyjąć z wytrząsarki obie kultury starterowe o pojemności 3 ml i w aseptycznym środowisku wlać każdą kulturę starterową do jednej z dwóch 2-litrowych kolb Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 1 litr świeżej pożywki SOB.
    2. Umieścić zaszczepioną pożywkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0%.
  5. Hoduj bakterie na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0%, aż OD600 osiągnie 0,9–1,0.
  6. Dodać 1 ml 1 M tiogalaktopiranozydu izopropylu β-D-1 (IPTG) za pomocą pipety P1000 w celu wywołania ekspresji białka.
  7. Pozostaw media na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0% na noc.
  8. Następnego ranka wyjąć pożywkę z wytrząsarki i odwirować ją przy użyciu butelek o pojemności 1000 ml o stężeniu 20,621 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek.
  9. Odrzucić supernatant i zebrać osad komórkowy.
    1. Wlej supernatant do kolby z około 5 ml wybielacza, aby zabić bakterie. To jest marnotrawstwo.
    2. Za pomocą szpatułki zeskrob osad komórkowy z dna butelki wirówki i włóż osad do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

3. Oczyszczanie Qβ

  1. Zawiesić osad komórkowy za pomocą ~20–30 ml 0,1 M buforu fosforanu potasu (pH 7,00).
  2. Upewnij się, że resuspension nie ma kawałków i poddać komórki lizie za pomocą procesora mikrofluidyzatora zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Poddaj komórki lizie co najmniej dwa razy, aby zwiększyć wydajność cząstek.
  3. Odwirować lizat w butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml przy 20,621 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  4. Wyrzucić osad i zmierzyć objętość supernatantu w ml. Pomnóż tę wartość przez 0,265 i dodaj tę ilość g siarczanu amonu do supernatantu.
  5. Mieszać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę na płytce mieszającej z prędkością 200 obr./min, aby wytrącić białko.
  6. Wirować w butelkach o pojemności 250 ml przy 20,621 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z około 10 ml 0,1 M buforu fosforanu potasu (pH 7,00).
  8. Dodać równe objętości chloroformu/n-butanolu w stosunku 1:1 do surowej próbki i mieszać przez wirowanie przez kilka sekund.
  9. Wirować w probówkach o pojemności 38 ml w temperaturze 20,621 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odzyskaj górną warstwę wodną za pomocą pipety Pasteura. Należy uważać, aby nie pobrać żadnej warstwy przypominającej żel, która utworzyła się między warstwą wodną a organiczną.
  11. Rozmrozić sześć gotowych gradientów sacharozy o sacharozie 5–40% i naładować na każdy z nich około 2 ml ekstraktu.
  12. Ultrawirówka przy 99,582 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C ze swobodnym opóźnieniem.
  13. Zapal diodę elektroluminescencyjną (LED) pod każdą rurką, a niebieski pasek powinien stać się widoczny. Odzyskaj te cząstki za pomocą strzykawki z długą igłą.
  14. Ultragranulować cząstki w temperaturze 370,541 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.
  15. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić przezroczystą osadkę oczyszczonych cząstek z 0,1 M buforem fosforanu potasu (pH 7,00).

4. Kwantyfikacja i potwierdzenie produktu

  1. Użyj testu Bradforda, aby określić ilościowo produkt13.
  2. Uruchom redukującą i nieredukującą elektroforezę w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), aby potwierdzić produkt14.
    UWAGA: Redukcja SDS-PAGE służy do potwierdzenia masy cząsteczkowej białka płaszcza; nieredukcyjna SDS-PAGE ma na celu potwierdzenie struktury wyższego rzędu.

5. Sprzężenie związków DB na Qβ

  1. Zmniejsz dwusiarczki na Qβ.
    1. Rozpuścić 0,0020 g tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) w 1 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 100-krotny roztwór podstawowy.
      UWAGA: Przygotuj świeży TCEP przed redukcją.
    2. Dodać 200 μl Qβ (5 mg/ml) do probówki mikrowirówkowej.
    3. Następnie dodaj 20 μl 100x roztworu podstawowego TCEP.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Ponowne mostkowanie zredukowanego disiarczku za pomocą glikolu polietylenowego dibromomaleimidu (DB-PEG).
    1. Rozpuścić 0,0017 g glikolu dibromomaleimidowo-polietylenowego (DB-PEG) w 100 μl DMF.
    2. Dodać 680 μl 10 mM roztworu fosforanu sodu (pH 5,00).
    3. Dodać zredukowany Qβ do roztworu DB-PEG i obserwować proces mieszania pod lampą UV 365 nm. Jasnożółtą fluorescencję można natychmiast uwidocznić za pomocą ręcznej lampy UV 365 nm po zmieszaniu.
    4. Pozwól reakcji postępować przez noc w temperaturze pokojowej (RT) na rożnie.
  3. Mieszaninę reakcyjną oczyścić za pomocą filtra odśrodkowego (COMW = 10 kDa) trzykrotnie, używając 1x PBS przy 3,283 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Monitoruj koniugację za pomocą nieredukcyjnej SDS-PAGE i natywnej elektroforezy w żelu agarozowym.
    UWAGA: VLP działają jako nienaruszone cząstki w natywnym żelu agarozowym i są rozdzielane na podstawie ich ładunku, wielkości i kształtu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pochodne dibromomaleimidu mogą być syntetyzowane poprzez reakcję kondensacji między bezwodnikiem dibromomaleimidu a aminami pierwszorzędowymi15. Alternatywnie, zastosowano łagodną metodę syntetyczną16 z wykorzystaniem aktywowanego N-metoksykarbonylo-3,4-dibromomaleimidu, który po reakcji z metoksypolietylenoglikolem (PEG) dał DB-PEG (Rycina 1). Do identyfikacji struktury związku wykorzystano NMR (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z oczyszczaniem mniejszych białek, unikalnym etapem oczyszczania bakteriofaga Qβ jest wirowanie w gradiacji sacharozy. Po etapie ekstrakcji chloroformem/n-butanolem, Qβ jest dalej oczyszczany przy użyciu 5-40% gradientów sacharozy. Podczas wirowania cząstki są oddzielane na podstawie ich rozmiarów. Większe cząstki przemieszczają się do obszaru o wyższej gęstości, podczas gdy mniejsze cząstki pozostają w obszarze o niższej gęstości. Qβ przemieszcza się do dolnej jednej trzeciej gradientu i pozostaje tam, podc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

J.J.G. dziękuje National Science Foundation (DMR-1654405) oraz Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) za ich wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół LB (młynarz) EMD Millipore1.10285.0500
Trypton, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Ekstrakt drożdżowy, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Bezwodny siarczan magnezuP212121CI-06808-1KG
Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS)Fisher ScientificS271-10
Chlorek potasuFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 System oczyszczania wodyFisher Scientific 4474524
Monobasic Fosforan potasuFisher ScientificBP362-1
Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificP288-500
SacharozaFisher Scientific
EtanolFisher ScientificBP2818500
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 Wirnik LEX Fisher Scientific096-041053
Siarczan amonuP212121KW-0066-5KG
ChloroformAlfa Aesar32614-M6
1-butanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor - łyżka wahadłowa, aluminiowaredlica Beckman 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Zestaw
Typ 70 Ti Rotor, stały kąt, Tytan, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Test białkaFisher ScientificPI23200
TRIS Chlorowodorek ProduktyBadawcze MiędzynarodoweT60050-1000.0
TetrametyloetylenodiaminaAlfa AesarJ63734-AC
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfinySigma AldrichC4706-2G
2 3-dibromomaleimid 97%Sigma Aldrich553603-5G
Glikol polietylenowyAlfa Aesar41561-22
Fosforan soduFisher ScientificAC424375000
Akrylamid / bis-akryloamidP212121RP-A11310-500.0
Dodecylosiarczan soduSigma AldrichL3771-100G
Nadsiarczan amonuFisher ScientificBP179-100
FV3000 konfokalny laserowy mikroskop skaningowyOlympus FV3000 
Rewolwer Labnet Regulowany rotator Thomas Naukowy Numer katalogowy 1190P25 
Butelka o wysokiej wydajności 1000 ml Sorvall, PC, z aluminiową nakrętką Thermo Scientific010-1459
Butelki wirówkowe Nalgene z nakrętkami, kopolimer polipropylenuThermo Scientific3141-0250
Nunc Probówki okrągłodenne; 38 ml; PCThermo Scientific3117-0380
2 L Kolby Erlenmeyera z wąską szyjką i obrzeżem o dużej wytrzymałościPyrex4980-2L
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4Millipore SigmaUFC801024
M-110P Procesor materiałów mikrofluidyzatoraMicrofluidicsM-110P
Nalgene Szybkie probówki wirówkowe z poliwęglanu z okrągłym dnemThermo Scientific3117-0380PK
Butelka, z zespołem nakrętki, poliwęglanBeckman Coulter41121703
cylinder, z podziałką - polipropylen 250 mLPolyLab80005
533LS-E SeriesGetinge533LS-E
komórkowych, poddana obróbce, PS, 96 Well, z pokrywkąLabSourceD36-313-CS
Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 15 mlFisher Scientific14-959-53A
Probówka mikrocentyfuga: 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Wytrząsarka orbitalna VWR Os-500VWR Scientifc Products14005-830
Systemy ręcznego odlewania TetraBio-Rad1658000FC
Polipropylen, 250 mlBeckman Coulter41121703
Spektrofluorometr NanoDropThermo Fisher Scientific3300
z długą igłą Hamilton 7693
Strzykawki Exel International o pojemności od 5 do 6 cm³ Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Intel Weighing PM-100 Laboratoryjna klasyczna waga laboratoryjna o wysokiej precyzjiInteligentna technologia ważeniaIWT_PM100
Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 50 mlFisher Scientific14-432-22
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 dołków, 50 i mikro; lBio-Rad456-1084
S25590Błyżek - TrueLine - Płytka do hodowli F144802

Bibliografia

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
  13. Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
  14. Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  15. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  16. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  17. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  18. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  19. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda biokoniugacjichemia dibromomaleimidubakteriofag QBetaredukcja wi za disiarczkowychfluorescencyjna PEGylacjaoczyszczanie bia ekultrawirowanieanaliza SDS PAGEtransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły