Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Streszczenie

Potencjał pola lokalnego (LFP) powstaje w wyniku ruchów jonów przez błony nerwowe. Ponieważ napięcie rejestrowane przez elektrody LFP odbija zsumowane pole elektryczne dużej objętości tkanki mózgowej, wydobycie informacji o lokalnej aktywności jest trudne. Badanie mikroobwodów neuronalnych wymaga jednak wiarygodnego rozróżnienia między zdarzeniami prawdziwie lokalnymi a sygnałami przewodzonymi objętościowo pochodzącymi z odległych obszarów mózgu. Analiza gęstości źródła prądu (CSD) oferuje rozwiązanie tego problemu, dostarczając informacji o pochłaniaczach prądu i źródłach w pobliżu elektrod. W obszarach mózgu o cytoarchitekturze laminarnej, takich jak hipokamp, jednowymiarowy CSD można uzyskać, szacując drugą pochodną przestrzenną LFP. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania wielolaminarnych LFP za pomocą liniowych sond krzemowych wszczepionych do grzbietowego hipokampa. Ślady CSD są obliczane wzdłuż poszczególnych trzpieni sondy. Protokół ten opisuje zatem procedurę rozwiązywania przestrzennie ograniczonych oscylacji sieci neuronalnych w hipokampie swobodnie poruszających się myszy.

Wprowadzenie

Oscylacje w LFP są krytycznie zaangażowane w przetwarzanie informacji przez obwody neuronalne. Obejmują one szerokie spektrum częstotliwości, od fal wolnych (~1 Hz) do szybkich oscylacji tętnień (~200 Hz)¹. Odrębne pasma częstotliwości są związane z funkcjami poznawczymi, w tym pamięcią, przetwarzaniem emocjonalnym i nawigacją^2,3,4,5,6,7. Przepływ prądu przez błony neuronalne stanowi największą część sygnału LFP⁸. Kationy dostające się do komórki (np. poprzez aktywację glutaminergicznego synaps pobudzających) stanowią aktywny pochłaniacz prądu (gdy ładunek opuszcza ośrodek zewnątrzkomórkowy). W przeciwieństwie do tego, przepływ netto ładunku dodatniego do ośrodka zewnątrzkomórkowego, na przykład poprzez aktywację synaps hamujących GABA-ergicznych, obrazuje aktywne źródło prądu w tym miejscu. W dipolach neuronalnych pochłaniacze prądu są sparowane ze źródłami pasywnymi i odwrotnie ze względu na prądy kompensacyjne wpływające na ładunek błony w odległych miejscach.

Pole elektryczne wytwarzane przez odległe procesy neuronowe może również powodować znaczne odchylenia napięcia na elektrodzie rejestrującej i dlatego może być błędnie uważane za zdarzenie lokalne. Takie przewodzenie objętości stanowi poważne wyzwanie dla interpretacji sygnałów LFP. Analiza CSD dostarcza informacji o lokalnych ujściach prądu i źródłach leżących u podstaw sygnałów LFP, a zatem stanowi sposób na zmniejszenie wpływu przewodzenia objętościowego⁸. W strukturach laminowanych, takich jak hipokamp, jednowymiarowe sygnały CSD mogą być uzyskiwane przez drugą przestrzenną pochodną LFP rejestrowaną z równoodległych elektrod ustawionych prostopadle do płaszczyzn laminarnych⁹. Pojawienie się komercyjnie dostępnych liniowych sond krzemowych umożliwiło naukowcom wykorzystanie metody CSD do badania lokalnej aktywności oscylacyjnej w hipokampie. Wykazano na przykład, że wyraźne oscylacje gamma pojawiają się w sposób specyficzny dla warstwy w obszarze CA1¹⁰. Co więcej, analiza CSD zidentyfikowała niezależne gorące punkty aktywności gamma w głównej warstwie komórkowej zakrętu zębatego¹¹. Co ważne, wyniki te były widoczne tylko w lokalnych CSD, ale nie w sygnałach LFP. Analiza CSD stanowi zatem potężne narzędzie do uzyskania wglądu w operacje mikroobwodów hipokampa.

W tym protokole udostępniamy obszerny przewodnik do uzyskiwania jednowymiarowych sygnałów CSD za pomocą sond krzemowych. Metody te umożliwią użytkownikom badanie zlokalizowanych zdarzeń oscylacyjnych w hipokampie zachowujących się myszy.

Protokół

Wszystkie metody z udziałem żywych zwierząt zostały zatwierdzone przez Regierungspräsidium Freiburg zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.

1. Przygotowania

1. Zaprojektuj i zbuduj odpowiednie narzędzie do wprowadzania, które przejściowo przenosi sondę silikonową i łącznik elektrody podczas procesu implantacji. Zobacz Rysunek 1 dla przykładowego narzędzia do wstawiania zbudowanego na zamówienie.
2. Ostrożnie wyjmij silikonową sondę i złącze elektrody z opakowania za pomocą kleszczyków z ceramiczną końcówką.
3. Podnieś płytkę złącza i bezpiecznie zamocuj ją za pomocą krokodylka clamp przymocowany do stojaka.
4. Za pomocą stereoskopu wyrównaj sondę z narzędziem do wkładania za pomocą kleszczyków z ceramiczną końcówką. Nałożyć warstwę wosku parafinowego o grubości ~2 mm stopionego za pomocą kauteryzatora, aby przykleić sondę do narzędzia wprowadzającego. Uważaj, aby nie dotykać trzonków sondy podczas tej procedury.
5. Przymocuj złącze elektrody do trzonka narzędzia do osadzania za pomocą standardowej taśmy klejącej. Należy pamiętać, że w zależności od producenta, przewody uziemiające mogą wymagać przylutowania do płytki złącza elektrody przed implantacją. Usunąć izolację z dwóch krótkich odcinków drutu miedzianego izolowanego lakierem za pomocą lutu cynowego nałożonego za pomocą lutownicy (400 °C). przewody uziemiające do odpowiednich szczelin w płytce złącza elektrody.
6. Usuń izolację dwóch dodatkowych kawałków drutu miedzianego. Owiń każdy nieizolowany drut miedziany trzy razy wokół ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm, długość 2 mm). Zastosuj topnik odpowiedni do stali i drut miedziany do dolnej części nakrętki. Upewnij się, że dolna połowa gwintu pozostaje wolna od lutu cynowego.
7. Użyj standardowego multimetru, aby sprawdzić, czy między przewodem a śrubą nie ma kontaktu elektrycznego.
8. Zdezynfekuj trzpienie sondy silikonowej i uziemiające przez zanurzenie w 70% etanolu (10 s).
9. Przygotuj osłonę ochronną dla implantu sondy, przecinając główkę plastikowej pipety Pasteura na pół.

2. Chirurgia implantologiczna

1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze z cienką końcówką, zaciski chirurgiczne) za pomocą sterylizatora z gorącymi koralikami. Przetrzyj wszystkie powierzchnie 70% etanolem.
2. Wywołać znieczulenie 3% izofluranem w tlenie podawanym w tempie ~1 l/min.
   1. Do konserwacji należy użyć 1 - 1,5% izofluranu. Należy pamiętać, że stężenie izofluranu wymagane do osiągnięcia tolerancji chirurgicznej może się różnić w zależności od zwierzęcia.
   2. Stabilną tolerancję chirurgiczną uzyskuje się, gdy zwierzę nie reaguje na szczypanie palcami. Monitoruj częstość oddechów myszy i w razie potrzeby dostosuj stężenie izofluranu.
   3. Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Zamontuj mysz w ramce stereotaktycznej, delikatnie wkładając paski douszne do kanału słuchowego. Gdy głowa myszy zostanie ustabilizowana przez paski uszne, umieść ustnik na pysku, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu. Umieść mysz na ręczniku lub podkładce nad poduszką grzewczą i wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg masy ciała), aby zapewnić analgezję pooperacyjną.
4. Ogol głowę standardową golarką i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze wzdłuż linii środkowej czaszki i otwórz skórę za pomocą zacisków chirurgicznych.
5. Wyrównaj głowę zwierzęcia za pomocą narzędzia do wyrównywania stereotaktycznego, aby wypoziomować bregmę i lambdę. Wysokość przesunięta między bregmą a lambdą powinna być mniejsza niż 50 μm. Ponadto wypoziomuj głowę wzdłuż osi przyśrodkowej-bocznej, mierząc głębokość od bregmy na powierzchni czaszki w określonych odległościach po lewej i prawej stronie (np. 1 mm w lewo i po prawej stronie bregmy). W razie potrzeby wyreguluj nachylenie głowy.
6. Oczyść głowę 3% wodą utlenioną i wytrzyj do sucha sterylnymi bawełnianymi chusteczkami.
7. Określ położenie kraniotomii względem bregmy za pomocą odpowiedniego atlasu stereotaktycznego¹².
8. Za pomocą głowicy wiertarskiej 0,9 mm wywierć dwa otwory w kości nad móżdżkiem, aby umieścić szlifowane i referencyjne. Dodatkowo pożądane są 1 - 3 otwory na kotwiące w celu ustabilizowania implantu. Lokalizacja kotwiących będzie zależeć od lokalizacji kraniotomii. W celu implantacji do hipokampa umieść kotwiące na przeciwległej korze czołowej ciemieniowej i ipsilateralnej. Wkręć w kość za pomocą odpowiedniego śrubokręta. Uważaj, aby nie przeniknąć do mózgu.
9. Kraniotomię należy wykonać, powoli rozrzedzając czaszkę wiertłem w prostokątnym obszarze po stronie implantacji. Często zwilżaj kość wysterylizowanym buforem fosforanowym (PB). Pozostałą przerzedzoną czaszkę można delikatnie przekłuć i usunąć za pomocą cienkiej (27G) igły iniekcyjnej i pęsety.
10. Ostrożnie przekłuć oponę twardą cienką (27G) igłą do wstrzykiwań. Uformuj mały haczyk, zginając końcówkę igły pęsetą i pociągnij oponę twardą w celu usunięcia. Zastosuj PB, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu.
11. Zamontuj narzędzie do wprowadzania elektrod na uchwycie stereotaktycznym, wyzeruj sondę na bregmie i przesuń sondę do współrzędnych stereotaktycznych nad kraniotomią. Powoli przenikaj do powierzchni mózgu. Upewnij się, że wałki sondy nie są wygięte. Unikaj implantacji przez naczynia krwionośne.
12. Powoli opuść sondę do ~200 μm powyżej żądanej głębokości. Przykryj kraniotomię i trzonki sondy silikonowej wysterylizowaną wazeliną dla ochrony. Nałóż cement dentystyczny, aby przymocować podstawę sondy do kotwiącej w czaszce.
13. Zaraz po nałożeniu cementu powoli przesuń sondę na docelową głębokość. Przesunięcie ostatnich ~200 μm po nałożeniu cementu zmniejsza ruch boczny sondy i zapewnia minimalne uszkodzenie tkanki w obszarze docelowym. Należy pamiętać, że czas utwardzania użytego cementu może mieć wpływ na ten etap protokołu. W przypadku szybko utwardzającego się cementu pomiń ten krok i bezpośrednio wszczepij sondę na docelową głębokość, aby uniknąć uszkodzenia sondy silikonowej.
14. Po utwardzeniu cementu zwolnij sondę z narzędzia do wkładania, topiąc wosk za pomocą kauteryzatora.
15. Zwolnij płytkę łączącą z urządzenia do wkładania i umieść ją w odpowiednim miejscu na czaszce za pomocą krokodylka clamp przymocowany do uchwytu do wkładania. W przypadku implantacji sondy do hipokampa, umieść płytkę łączącą na przeciwległej kości ciemieniowej. Przymocuj płytkę łączącą do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
16. przewody uziemiające i odniesienia płytki złącza do przewodów przymocowanych do dwóch nad móżdżkiem.
17. Przytnij osłonę ochronną do odpowiedniej wysokości i umieść ją na sondzie silikonowej. Przymocuj osłonę do płytki łączącej i czaszki za pomocą cementu dentystycznego, omijając skórę wokół odsłoniętej czaszki. Zszywanie skóry wokół miejsca implantacji zwykle nie jest wymagane.

3. Rekonwalescencja po operacji

1. Przez co najmniej 2 dni należy stosować odpowiednie leczenie przeciwbólowe (np. podskórne wstrzyknięcia buprenorfiny co 6 godzin w ciągu dnia i do wody pitnej na noc w połączeniu z karprofenem (4 - 5 mg/kg masy ciała) podskórnie co 24 godziny). Zaleca się pojedynczą obudowę, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.
2. Odczekaj co najmniej tydzień na regenerację. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

4. Akwizycja danych

1. Rejestruj LFP od swobodnie poruszających się myszy za pomocą odpowiedniego systemu akwizycji danych połączonego przez komutator. Aby uzyskać LFP, należy użyć częstotliwości próbkowania 1 - 5 kHz. Wyższe częstotliwości próbkowania (20 - 30 kHz) są wymagane, jeśli wyładowania pojedyncze jednostki mają być rejestrowane wraz z LFP.
2. Przechowuj surowe pliki nagrań poszczególnych kanałów do analizy w trybie offline.

5. Histologia

1. Po zakończeniu zapisu należy głęboko znieczulić zwierzę (np. 2 g/kg masy ciała uretan wstrzyknięty dootrzewnowo). Potwierdź stan znieczulenia przez brak reakcji na szczypanie palców u stóp.
2. Perfuzję myszy przezskórnie z lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (~1 min), a następnie 4% paraformaldehydem (~10 min) przy użyciu standardowych metod perfuzji wewnątrzsercowej¹³. Przed perfuzją można przeprowadzić uszkodzenia elektrolityczne miejsc rejestracji (np. poprzez przyłożenie 10 - 20 V stałego napięcia przez okres do 1 s). Alternatywnie, barwniki fluorescencyjne nałożone na końcówki trzonków przed implantacją mogą być używane do śledzenia identyfikacji. Zaleca się testowanie różnych metod identyfikacji pozycji elektrod w celu uzyskania optymalnych wyników za pomocą różnych typów sond krzemowych.
3. Wytnij skrawki mózgu (~100 μm) i wybarwij je 4'-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI, 1 μg/ml), a następnie wykonaj trzy etapy mycia w PB (każdy 10 minut w temperaturze pokojowej).
4. Umieść skrawki na szkiełku mikroskopowym, nałóż kroplę podłoża do osadzania i przykryj sekcję szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw podłoże do zatapiania do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.
5. Za pomocą epifluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu skaningowego zidentyfikuj lokalizację miejsc rejestracji.
6. Aby podjąć próbę odzyskania sondy silikonowej do dalszego użytku, przytrzymaj sondę za zacisk krokodylkowy i zdejmij sondę z czaszki, ostrożnie topiąc cement dentystyczny za pomocą lutownicy (400 °C). Uważaj, aby nie dotykać trzonków sondy podczas tej procedury!
7. Umyj sondę w gorącej wodzie destylowanej (~80 °C, 15 min), a następnie roztworze enzymatycznym (1% Tergazyme w wodzie destylowanej, 30 min w temperaturze pokojowej) i kolejnym etapie płukania w wodzie destylowanej (15 min). Należy pamiętać, że wskaźnik powodzenia odzyskiwania sondy jest niski.

6. Analiza CSD

1. Korzystając z odpowiedniego środowiska analitycznego (np. Python), przekonwertuj dane LFP pojedynczego trzpienia na CSD, aproksymując drugą pochodną przestrzenną wzdłuż trzpienia jako
   
   gdzie LFP_n,t jest sygnałem LFP na ^n-tej elektrodzie w czasie t, a Δz jest odstępem między elektrodami. Należy pamiętać, że ze względu na operacje n-1 i n+1 nie można oszacować CSD pierwszej i ostatniej elektrody trzpienia, co należy wziąć pod uwagę podczas umieszczania sondy. Zaimplementuj formułę aproksymacyjną za pomocą krótkiego segmentu kodu, który oblicza sygnał CSD dla każdej elektrody podczas iteracji w czasie (patrz Plik kodu uzupełniającego).
2. Uzyskany sygnał CSD można wykorzystać do dalszej analizy (np. badania określonych pasm częstotliwości oscylacji mózgu poprzez zastosowanie filtrów pasmowo-przepustowych).

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje narzędzie do wstawiania sond krzemowych. Nagrania z przewlekle wszczepionych sond krzemowych ukierunkowanych na obszar CA1 i warstwę komórek ziarnistych zakrętu zębatego są pokazane w Rysunek 2. Zarejestrowaliśmy LFP z trzonków sondy podczas swobodnego poruszania się w klatce domowej. Aby zminimalizować efekt przewodzenia objętościowego, uzyskane sygnały zostały przekonwertowane na CSD wzdłuż każdego trzpienia...

Dyskusja

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że oscylacje mózgu w obwodach neuronalnych hipokampa występują w dyskretnych domenach przestrzennych 10,11,16. Analiza CSD drastycznie zmniejsza wpływ przewodzenia objętościowego, co jest kluczowym warunkiem wstępnym do badania lokalnych zdarzeń oscylacyjnych. W tym filmie przedstawiamy przewodnik po wszczepianiu sond krzemowych do hipokampa myszy w celu analizy danych CSD. Pokazujemy repreze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zacisk krokodylkowy ze stojakiem	Reichelt	Elektronik HALTER ZD-10D
Sonda silikonowa	Cambridge Neurotech	P-series 32
Stereoskop	Olympus	SZ51
Drut miedziany izolowany lakierem	Bü rklin Elektronik	89 F 232
uziemiające	& Więcej GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
Flux	Stannol	114018
Kleszcze z ceramiczną końcówką	Fine Science Tools	11210-60
Wosk paraffine	Sigma-Aldrich	327204
Kauteryzator	Fine Science Tools	18010-00
Lutownica	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimetr	Uni-T	UT61C
Etanol	Carl Roth	9065.1
Pipety Pasteura	Carl Roth	EA65.1
Sterylizator ciepła	Fine Science Tools	18000-45
Ramka stereotaktyczna	David Kopf	Model 1900
Stereotaktyczny uchwyt elektrody	David Kopf	Model 1900
Isoflurane	Abbvie	B506
Koncentrator tlenu	Respironix	1020007
Buprenorphine	Indivior UK Limited
Golarka elektryczna	Tondeo	Eco-XS Poduszka
grzewcza	Thermolux	463265/-67
Zaciski chirurgiczne	Fine Science Tools	18050-28
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	H1009
Sterylne chusteczki bawełniane	Carl Roth	EH12.1
Wiertarka	Proxxon	Micromot 230/E
21G igła iniekcyjna	B. Braun	4657527
Bufor fosforanowy/sól fizjologiczna
Atlas stereotaktyczny	Elsevier	9.78012E+12
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools	14094-11
Kleszcze chirurgiczne	Fine Science Tools	11272-40
Igły iniekcyjne 27G	B. Braun	4657705
Wazelina
Cement dentystyczny	Sun Medical	SuperBond T& M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Wzmacniacz nagrywający	Intan Technologies	C3323
Płytka akwizycyjna USB	Intan Technologies	C3004
do nagrywania	Intan Technologies	C3216
Komutator elektryczny	Soczewki Doric	HRJ-OE_FC_12_HARW
Oprogramowanie do akwizycji	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	umożliwia akwizycję danych niezależną od platformy
Komputer do akwizycji
Środowisko analityczne	Python (www.python.org)		umożliwia analizę danych niezależną od platformy
Uretan	Sigma-Aldrich
Vibratome	Leica	VT1000
Szkiełka mikroskopowe	Carl Roth	H868.1
Szkiełka nakrywkowe	Carl Roth	H878.2
Medium do zatapiania	Sigma-Aldrich	81381-50G
Woda destylowana	Millipore	Milli Q	Maszyna stołowa do produkcji wody destylowanej
Tergazyme	Alconox	Tergazyme