Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Abstract

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowanym systemem w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, zachowaniu i ewolucji behawioralnej. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych. W tym protokole opisujemy sekcję rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej dorosłego gatunku Drosophila. Najpierw opisujemy, jak etapować i starzeć larwy Drosophila, następnie sekcję tarczy czułkowej od wczesnych stadiów poczwarki, a następnie sekcję czułków od połowy stadium poczwarki i dorosłych. Pokazujemy również metody, w których preparaty mogą być wykorzystywane w technikach molekularnych, takich jak ekstrakcja RNA do qRT-PCR, RNAseq czy immunohistochemia. Metody te można również zastosować do innych gatunków Drosophila po określeniu specyficznych dla danego gatunku czasów rozwoju poczwarki i obliczeniu odpowiednich etapów dla odpowiedniego starzenia.

Introduction

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowany w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, badaniach zachowania i ewolucji behawioralnej^1,2,3,4. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych^1,5,6. Ogólnym celem tego manuskryptu jest pokazanie, jak inscenizować i preparować rozwijającą ....

Protocol

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Etyki Badań Uniwersytetu Duke'a.

1. Przygotowanie tkanek i stopień rozwoju poczwarki Drosophila melanogaster

1. Najpierw określ, ile much będzie potrzebnych do sekcji. W przypadku RT-PCR i RNAseq należy pobrać od osobników 100 - 200 krążków antenowych i czułków, które są niezbędne w stadium prepulalnym, 8 godzin APF, 40 godzin APF i dorosłym. W przypadku immunohistochemii przeprowadź sekcję 10-20 osób.
2. Wyczyść wszystkie materiały, w tym podkładki preparacyjne i kleszcze, za pomocą chusteczek z 70% EtOH. Jeśli wypreparowany materiał ma b....

Results

Wypreparowana rozwijająca się tkanka węchowa może być wykorzystana do ekstrakcji RNA, a następnie RT-PCR w celu oceny ekspresji genów lub może być przeprowadzona przez protokoły immunohistochemiczne w celu określenia jej wzorca ekspresji i subkomórkowej lokalizacji interesujących genów. W tej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki z obu protokołów. Rysunek 1 to reprezentatywny ilościowy RT-PCR pokazujący transkrypcję genów receptorów powierzchniowych komórek i rec.......

Discussion

Protokół ten jest przydatnym źródłem informacji dla laboratoriów zainteresowanych identyfikacją programów genetycznych i transkrypcyjnych działających w rozwoju tkanki węchowej Drosophila , a także analizą porównawczą tych programów u różnych gatunków Drosophila . Jest to szczególnie przydatne, jeśli profile transkrypcyjne na poziomie systemowym z różnych etapów rozwoju są potrzebne jako podstawa do przyszłych badań. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak etapować i izolować rozwijającą się tkankę węchową.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco	70011-044	Rozcieńczony do 1X w wodzie wolnej od RNaz
CO2 < / sub>zbiornik	Gaz powietrzny	CD R200
Dwa ostre kleszcze (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Roztwory do izolacji RNA
Mikroskop
Małe wiaderko z lodem
Mikropipety P20 i P200 oraz końcówki
1,7 ml Probówki			Kup nukleazę bez nukleazy, aby uzyskać najlepsze wyniki
0,2 ml probówki do PCR Proszek
paraformaldehydu	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Rozcieńczyć do 0,2% v/v w 1X PBS
2" szalki
Bibuła filtracyjna 55 mm	Whatman	1001-055	Zwilż wodą i umieść na szalce Petriego, aby poczwarki były wilgotne
25 C inkubator
dejonizowany H2O			Kup bez nukleaz lub potraktuj DEPC
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning		do stosowania do wykonywania podkładek preparacyjnych z pokryw płyt Terizaki.
MicroWell Mini Tacks z pokrywkami	Nunc	438733	Pokrywki mogą być używane do produkcji silikonowych podkładek preparacyjnych
Przeciwciało anty-GFP królika	Międzynarodowy korpus MBL	Przeciwciało pierwszorzędowe	PM005
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL
ADL195 (anty lamina, mysz)	Badania deweloperskie hydoma ban	ADL195-s	przeciwciało
pierwszorzędoweAlexa Fluor® 488 kozie przeciwciało przeciw królikom IgG (H + L)	invitrogen	A11008	Przeciwciało drugorzędowe
Cy3 Koza Anty-mysie IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Przeciwciało drugorzędowe
Triton X-100, detergent klasy białkowej, 10% roztwór, sterylnie filtrowany	detergent CALBIOCHEM	648463
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Woda wolna od nukleaz	Growcells.com	NUPW-0125	Lekkie
wycieraczki do tkanek	VWR	82003-822	Do czyszczenia materiałów preparacyjnych
Indeks górny II	invitrogen	18064014	Odwrotna transkryptaza
QIAshredder (50)	Ekstrakcja RNA	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18	Technologie życia	startera RT	18418012
Zestaw do czyszczenia RNeasy MinElute (50)Ekstrakcja	RNA	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche
06402712001 LIGHTCYCLER 480 - PŁYTKA WIELODOŁKOWA 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S