Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57716

⸱

13 czerwca 2018

 , 
1Department of Biology, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Streszczenie

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowanym systemem w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, zachowaniu i ewolucji behawioralnej. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych. W tym protokole opisujemy sekcję rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej dorosłego gatunku Drosophila. Najpierw opisujemy, jak etapować i starzeć larwy Drosophila, następnie sekcję tarczy czułkowej od wczesnych stadiów poczwarki, a następnie sekcję czułków od połowy stadium poczwarki i dorosłych. Pokazujemy również metody, w których preparaty mogą być wykorzystywane w technikach molekularnych, takich jak ekstrakcja RNA do qRT-PCR, RNAseq czy immunohistochemia. Metody te można również zastosować do innych gatunków Drosophila po określeniu specyficznych dla danego gatunku czasów rozwoju poczwarki i obliczeniu odpowiednich etapów dla odpowiedniego starzenia.

Wprowadzenie

Układ węchowy Drosophila jest szeroko stosowany w neurobiologii rozwojowej, neuronauce systemowej, a także neurofizjologii, badaniach zachowania i ewolucji behawioralnej1,2,3,4. W tkankach węchowych Drosophila znajdują się neurony receptorów węchowych (ORN), które wykrywają lotne sygnały chemiczne oprócz neuronów hydro- i termoczuciowych1,5,6. Ogólnym celem tego manuskryptu jest pokazanie, jak inscenizować i preparować rozwijającą się poczwarkę i dorosłą tkankę węchową u gatunków Drosophila. Uzasadnieniem dla tej techniki jest generowanie próbek z różnych stadiów poczwarki do analiz molekularnych i rozwojowych obwodowego układu węchowego, takich jak RNAseq i ilościowy RT-PCR, oprócz technik znakowania tkanek in vivo. Technika ta może być szczególnie przydatna do identyfikacji dynamiki profili transkrypcyjnych w rozwijającym się dorosłym układzie węchowym u gatunków Drosophila nienależących do melanogastru, które nie mają wszystkich odczynników transgenicznych do znakowania i analiz specyficznych dla typu komórki. W tym manuskrypcie pokazujemy, jak preparować krążki czułkowe i czułki poczwarek i dorosłych gatunków Drosophila. Po pierwsze, pokazujemy, jak zidentyfikować Drosophila 0 h tworzenia się poczwarki (APF, białe poczwarki lub poczwarki) w celu oceny stopnia zaawansowania i starzenia się specyficznego dla gatunku. Następnie pokazujemy, jak rozciąć krążki antenowe i trzeci segment anteny; w szczególności, jak oddzielić je od tarczy oka i drugiego segmentu anteny w celu uzyskania czystości tkanek wymaganej do RNAseq lub RT-PCR. Stadia u D. melanogaster opisane w tym protokole odpowiadają w przybliżeniu wstępnie wzorzystej tarczy czułkowej (prepupae), doborowi prekursorów z tarczy antenowej (8 h APF), początkowi różnicowania końcówek dla ORN (40 h APF) i dorosłej antenie. Na koniec podajemy przykłady ilościowego RT-PCR z dorosłych czułków wyizolowanych przy użyciu tej metody oraz dla immunohistochemii in vivo. Metoda ta może być stosowana do generowania próbek do analizy RNA/DNA oraz do immunohistochemii rozwoju obwodowych tkanek węchowych różnych gatunków Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Etyki Badań Uniwersytetu Duke'a.

1. Przygotowanie tkanek i stopień rozwoju poczwarki Drosophila melanogaster

  1. Najpierw określ, ile much będzie potrzebnych do sekcji. W przypadku RT-PCR i RNAseq należy pobrać od osobników 100 - 200 krążków antenowych i czułków, które są niezbędne w stadium prepulalnym, 8 godzin APF, 40 godzin APF i dorosłym. W przypadku immunohistochemii przeprowadź sekcję 10-20 osób.
  2. Wyczyść wszystkie materiały, w tym podkładki preparacyjne i kleszcze, za pomocą chusteczek z 70% EtOH. Jeśli wypreparowany materiał ma być użyty do ekstrakcji RNA, wyczyść wszystko neutralizatorami RNazy i przygotuj wszystkie roztwory, używając wody uzdatnionej bez nukleaz lub pirowęglanu dietylu (DEPC).
    UWAGA: W tym protokole do sekcji używa się silikonowych podkładek preparacyjnych zamiast szkła. Podkładki silikonowe są przyjazne dla ultracienkich kleszczy i sprzyjają szybkim i wysokiej jakości preparacjom.
  3. Zbierz poczwarkę w 0 h fazie APF/poczwarki.
    1. Aby zapewnić najbardziej precyzyjną inscenizację, monitoruj larwy w odstępach od 30 minut do 1 godziny.
      UWAGA: Wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego w umiarkowanie zatłoczonej butelce prawdopodobnie przepoczwarzają się w ciągu kilku godzin.
    2. Gdy larwy staną się nieruchome i zostaną otoczone bardzo jasną (prawie białą) skrzynką poczwarki, przenieś je na małą 2-calową szalkę Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną.
    3. Kontynuuj przez 1 - 2 godziny, od czasu do czasu monitorując, identyfikując i przenosząc prepupae.
      UWAGA: Alternatywnie, wyczyść butelkę ze wszystkich poczwarek i pozwól larwom rozwijać się przez 2 godziny. Wszystkie poczwarki zebrane po 2 godzinach będą mieścić się w zakresie APF 0 - 2 godzin.
  4. Natychmiast przejdź do kroku 3.1, aby wyciąć tarczę czułkową poczwarki dla etapu APF 0 h. Jeśli prepupa musi zostać poddana leżakowaniu, zbierz je do naczynia, przykryj naczynie i umieść warstwę parafinową wokół krawędzi, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie umieść szalkę Petriego w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Poczwarki mogą być teraz postarzane do eclosion.
  5. W przypadku poczwarek zebranych w ciągu 2 godzin, poczwarki należy postarzać o 2 godziny krócej niż pożądany wiek, aby upewnić się, że poczwarki nie starzeją się nadmiernie.
  6. Używaj ultracienkich kleszczyków (Dumont 55), ponieważ tkanka jest bardzo mała i delikatna.

2. Przygotowanie tkanek i etap rozwoju poczwarek innych gatunków Drosophila

  1. Aby określić długość rozwoju poczwarki u innych gatunków Drosophila, umieść próbki w optymalnej temperaturze, zapisz daty, w których obserwuje się poczwarki, posortuj je do świeżej fiolki i zapisz liczbę dni od poczwarki do dorosłości.
  2. Zapisać stosunek czasu do rozwoju poczwarki dla gatunków innych niż melanogaster i dla melanogaster. Pomnóż stosunek czasu rozwoju przez liczbę godzin wykorzystanych do oceny stopnia zaawansowania melanogaster, aby uzyskać liczbę godzin do starzenia się gatunków niemelanogasterowych.

3. Sekcja dysku poczwarkowego D. melanogaster

Uwaga: Wszystkie czasy starzenia i protokoły sekcji są opisane dla Drosophila melanogaster. W przypadku wszystkich innych gatunków wymagana będzie modyfikacja protokołu starzenia się w oparciu o punkty czasowe rozwoju specyficzne dla gatunku, jak opisano powyżej.

  1. W przypadku rozwarstwienia dysku czułkowego poczwarki zbierz 50 - 100 0 - 2 h lub 6 - 8 h za pomocą szpatułki i umieść je na podkładce preparucyjnej.
  2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odpipetować 150 μl roztworu izolacyjnego RNA do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml bez RNaz i umieścić probówkę na lodzie.
  3. Rozetnij poczwarki w 150 - 200 μL 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez nukleaz). Umieść wiele kropel PBS (150 - 200 μl na kroplę) na podkładce do preparacji.
  4. Na podkładce preparacyjnej umieścić poczwarki w wieku 0 - 2 godzin lub 6 - 8 godzin (jedna poczwarka na kroplę) do wypreparowania w jednej z kropel 1x PBS. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby ustabilizować ciało.
  5. W przypadku poczwarek w wieku 0 - 2 godzin, używając kleszczy w drugiej ręce, przytrzymaj najbardziej przednią część (haczyki ustne) poczwarki i wyciągnij ją, aby odsłonić mózg i wyimaginowane dyski przyczepione do przedniej obudowy poczwarki.
  6. W przypadku 8-godzinnych poczwarek APF najpierw delikatnie oderwij obudowę poczwarki od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, odsłaniając głowę w worku błonowym otaczającym ciało.
    UWAGA: Ciało na tym etapie wygląda jak zwyrodniała larwa.
  7. Zdejmij głowę ze stawu szyjnego.
    UWAGA: Gwarantuje to, że nie zostaną utracone krążki antenowe, które na tym etapie są połączone przede wszystkim z płatami wzrokowymi mózgu.
  8. Przenieś tkankę z mózgiem i wyimaginowanymi dyskami do innej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy lub pipety 20 μL.
  9. Zidentyfikuj tarczę oczno-czułkową połączoną z mózgiem w płatach wzrokowych. Za pomocą kleszczy odłącz krążek oczno-czułkowy od mózgu i obudowy poczwarki. Przenieś go do nowej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy lub pipety 20 μL.
    UWAGA: Tarcza oczkowo-czułkowa przedpleśni jest płaską tkanką. Jednak w wieku 8 godzin krążki oczu są obracane, obejmując dyski czułkowe, które znajdują się przed centralną częścią mózgu.
  10. Za pomocą kleszczy przeciąć tkankę w miejscu połączenia oka z dyskiem antenowym. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl delikatnie przenieś wypreparowaną tkankę do odczynnika do izolacji RNA. Zminimalizuj ilość przenoszonego płynu, pipetując jak najmniejszą ilość.
  11. Powtarzaj, aż wszystkie poczwarki zostaną wycięte.

4. Sekcja czułków D. melanogaster Śródpoczwarkowych i Dorosłych

Uwaga: Po 40 godzinach APF większość metamorfozy jest zakończona, a dorosłe struktury stają się widoczne, ale nadal są białe i nijakie. W tym momencie rozwoju dorosła antena przybrała swój ostateczny kształt, ale nadal jest przezroczysta, a większość receptorów węchowych, z wyjątkiem kilku, nie rozpoczęła ekspresji.

  1. W przypadku rozwarstwienia czułków poczwarkowych należy zebrać 50 - 100 poczwarek zgodnie z opisem w kroku 1 i starzyć je przez 40 godzin w temperaturze 25 °C.
  2. Odmierzyć pipetą 150 μl roztworu izolacyjnego RNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz za pomocą pipety o pojemności 200 μl i umieścić probówkę na lodzie.
  3. Na podkładce preparacyjnej umieść poczwarkę do wycięcia w jednej z 1x kropel PBS. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby ustabilizować ciało. Używając kleszczy w drugiej ręce, delikatnie oderwij obudowę poczwarki od najbardziej przedniej ćwiartki poczwarki, odsłaniając głowę w worku błonowym, który otacza ciało.
  4. Za pomocą kleszczy ostrożnie odetnij głowę od reszty ciała poczwarki, przytrzymując ciało jednym zestawem kleszczy i odrywając głowę w stawie szyyjnym innym zestawem kleszczy. Delikatnie przenieś głowę do kolejnej kropli 1x PBS za pomocą kleszczy. Pipetuj w górę i w dół, aby oczyścić zawartość głowy (mózg itp.), aby uzyskać przezroczystą błonę, która kiedyś otaczała rozwijającą się głowę Drosophila.
    UWAGA: Po 40 - 50 godzinach APF anteny są połączone z najbardziej wysuniętą do przodu częścią błony. Staną się one widoczne do rozbioru, gdy zawartość głowicy zostanie oczyszczona za pomocą pipetowania.
  5. Za pomocą kleszczy odłącz czułki poczwarki od błony. Odłącz 2. segment anteny od 3. za pomocą kleszczy, aby przeciąć staw segmentowy, ponieważ tylko 3. segment będzie zawierał neurony receptorów węchowych.
  6. Użyj pipety o pojemności 20 μl, aby delikatnie przenieść wypreparowaną tkankę do odczynnika do izolacji roztworu RNA. Zminimalizuj ilość przenoszonego płynu, pipetując jak najmniejszą ilość. Powtarzaj, aż wszystkie poczwarki zostaną wycięte.
  7. W przypadku preparacji czułków u dorosłych, zbierz około 50 dorosłych osób i postażuj je przez tydzień po ekluzji.
    UWAGA: Ekspresja genów receptorów węchowych i innych genów osiąga szczyt tydzień po zamknięciu. Dorosłe osobniki są starzone przez tydzień, aby zapewnić, że biologicznie istotne geny z transkryptami o niskiej liczebności wzrosną powyżej progu wykrywalności.
  8. W przypadku ekstrakcji RNA należy przeprowadzić sekcję much, gdy są jeszcze żywe, na podkładce CO2 . Leczyć elektrodę CO2 inhibitorami RNazy. W przypadku obrazowania konfokalnego należy wypreparować muchy na podkładce preparacyjnej w 1x PBS lub PBS + 0,2% Triton.
  9. Najpierw ułóż dorosłe osoby spać na podkładce stacji CO2 pod lunetą sekcyjną. Na podkładce stacji CO2, używając kleszczy w jednej ręce do stabilizacji ciała, użyj kleszczyków w drugiej ręce, aby delikatnie wyciągnąć / uszczypnąć trzeci segment anteny z drugiej.
  10. Przenieś anteny do roztworu izolującego RNA, używając kleszczy, aby umieścić anteny bezpośrednio w cieczy. Powtarzaj, aż wszystkie dorosłe osoby zostaną wypreparowane.
    UWAGA: Upewnij się, że anteny są zanurzone w roztworze izolacyjnym RNA. Anteny mogą utknąć z boku rurki. Spowoduje to zwiększoną degradację RNA, zmniejszając jakość i ilość RNA.
  11. Bezpośrednio przejść do ekstrakcji RNA lub umieścić probówkę w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

5. Izolacja RNA z wypreparowanych tkanek

  1. Wyjąć wszystkie próbki z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.
  2. Krótko odwiruj (5 - 6 s, ~6,000 x g) każdą próbkę, aby zebrać materiał na dnie probówki.
  3. Miel każdą próbkę za pomocą autoklawowanego plastikowego tłuczka i silnika elektrycznego przez 10 s na lodzie.
  4. Powtórz kroki 5.2 i 5.3 4.
  5. Wykonaj ekstrakcję RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów i postępując zgodnie z protokołami producenta, aby uzyskać optymalną wydajność.
  6. Wykonaj qRT-PCR przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i specyficznych starterów przeciwko genom będącym przedmiotem zainteresowania i zgodnie z protokołami producenta.
    1. Wszystkie reakcje PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s i 60 °C przez 30 s.
      UWAGA: Pary starterów dla genów DIP i dpr są wymienione w tabeli 1, a startery dla genów receptorów węchowych są wymienione w Hueston CE i wsp.8.

6. Utrwalenie dysków czułkowych i czułków do immunohistochemii

UWAGA: Napraw tkanki w partiach od 10 do 20 osób, aby upewnić się, że tkanki są utrwalone przez ten sam okres czasu. Zminimalizuj czas, przez jaki próbki pozostają w PBT (PBS z detergentem) przed przeniesieniem ich do utrwalacza, aby zmaksymalizować integralność tkanek.

  1. Zebrać wypreparowane krążki czułkowe lub czułki poczwarki do probówki PCR o pojemności 200 μl zawierającej 200 μl 0,2% PBT na lodzie, aby zachować integralność tkanek i uniknąć przywierania próbki do ścianki probówek PCR o pojemności 200 μl, co doprowadzi do niepełnego utrwalenia.
    Uwaga: Czułki poczwarki i dyski czułkowe mogą być trudne do zauważenia, ponieważ są dość przezroczyste. Zaleca się stosowanie lunety preparacyjnej na wszystkich etapach mycia, aby zapobiec utracie tkanki. Alternatywnie, 96-dołkowe płytki Terasaki mogą być używane do utrwalania i barwienia, aby jak najlepiej śledzić tkankę.
  2. Wypreparowany dysk antenowy i próbki czułków poczwarek należy umieścić w około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W tym i kolejnych krokach należy przechowywać probówki z próbkami na nutatorze, aby prawidłowo wymieszać próbki w roztworze. Przechodzenie do kroku 6.7.
  3. W przypadku anteny dla osoby dorosłej należy najpierw wyciąć całą głowę i umieścić ją w około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Umyć 3x 200 μl 0,2% PBT przez 10 min każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.
  5. Wróć do mikroskopu preparacyjnego, aby dokładniej wyciąć drugi segment czułka z nieruchomych głów. Używając kleszczy do ustabilizowania głowy, delikatnie wyciągnij/ściśnij trzeci segment anteny od drugiego.
  6. Przenieś wypreparowane trzecie segmenty czułki do około 200 μl 4% PFA (paraformaldehydu) i utrwal je na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyć 3x 200 μl 0,2% PBT przez 10 min każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.
  8. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio kontynuować immunohistochemię całej góry.
    Uwaga: Skuteczność barwienia może ulec zmianie w przypadku stosowania przeciwciała. Ta metoda powinna być odpowiednia dla mniej obfitych znaczników białkowych lub słabszych przeciwciał. Czasami jednak może to wymagać optymalizacji protokołu (albo tożsamości, albo ilości utrwalacza, albo czasu utrwalenia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wypreparowaną rozwijającą się tkankę węchową można wykorzystać do ekstrakcji RNA z późniejszą analizą RT-PCR w celu oceny ekspresji genów lub poddać procedurom immunohistochemicznym, aby określić wzór ekspresji oraz lokalizację subkomórkową interesujących genów. W tej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane przy zastosowaniu obu tych protokołów. Rycina 1 przedstawiony jest reprezentatywny wynik ilościowej RT-PCR wykazujący transkrypcję genów rece...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten jest przydatnym źródłem informacji dla laboratoriów zainteresowanych identyfikacją programów genetycznych i transkrypcyjnych działających w rozwoju tkanki węchowej Drosophila , a także analizą porównawczą tych programów u różnych gatunków Drosophila . Jest to szczególnie przydatne, jeśli profile transkrypcyjne na poziomie systemowym z różnych etapów rozwoju są potrzebne jako podstawa do przyszłych badań. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak etapować i izolować rozwijającą się tkankę węchową...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte grantem z National Science Foundation dla Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco70011-044Rozcieńczony do 1X w wodzie wolnej od RNaz
CO2 < / sub>zbiornikGaz powietrznyCD R200
Dwa ostre kleszcze (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
TrizolInvitrogen15596-026Roztwory do izolacji RNA
Mikroskop
Małe wiaderko z lodem
Mikropipety P20 i P200 oraz końcówki
1,7 ml ProbówkiKup nukleazę bez nukleazy, aby uzyskać najlepsze wyniki
0,2 ml probówki do PCR Proszek
paraformaldehyduPolysciences380
10% Triton X-100TeknovaT1105Rozcieńczyć do 0,2% v/v w 1X PBS
2" szalki
Bibuła filtracyjna 55 mmWhatman1001-055Zwilż wodą i umieść na szalce Petriego, aby poczwarki były wilgotne
25 C inkubator
dejonizowany H2OKup bez nukleaz lub potraktuj DEPC
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corningdo stosowania do wykonywania podkładek preparacyjnych z pokryw płyt Terizaki.
MicroWell Mini Tacks z pokrywkamiNunc438733Pokrywki mogą być używane do produkcji silikonowych podkładek preparacyjnych
Przeciwciało anty-GFP królikaMiędzynarodowy korpus MBLPrzeciwciało pierwszorzędowePM005
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty RAT CD2AbD seroTecMCA154RHDL
ADL195 (anty lamina, mysz)Badania deweloperskie hydoma banADL195-sprzeciwciało
pierwszorzędoweAlexa Fluor® 488 kozie przeciwciało przeciw królikom IgG (H + L)invitrogenA11008Przeciwciało drugorzędowe
Cy3 Koza Anty-mysie IgGJackson ImmunoResearch115-166-003Przeciwciało drugorzędowe
Triton X-100, detergent klasy białkowej, 10% roztwór, sterylnie filtrowanydetergent CALBIOCHEM648463
Lab RotatorThermo scientificRotator
Woda wolna od nukleazGrowcells.comNUPW-0125Lekkie
wycieraczki do tkanekVWR82003-822Do czyszczenia materiałów preparacyjnych
Indeks górny IIinvitrogen18064014Odwrotna transkryptaza 
QIAshredder (50)Ekstrakcja RNAQIAGEN79654
Oligo(dT)12-18Technologie życiastartera RT18418012
Zestaw do czyszczenia RNeasy MinElute (50)EkstrakcjaRNAQIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER qPCRRoche
06402712001 LIGHTCYCLER 480 - PŁYTKA WIELODOŁKOWA 96qPCRRoche04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master MixqPCRNEBM0541S
preparacyjny do mikrofuge Petriego

Bibliografia

  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).
  3. Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
  4. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  5. Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
  6. Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
  7. Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
  8. Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).
  9. Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
  10. Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).
  11. Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).
  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka węchowa Drosophilaobwodowy układ węchowysekcja tarczki antenowejokreślanie stadium rozwoju poczwarkiprotokół ekstrakcji RNAanaliza immunohistochemicznametoda sekcji antenytechniki rozwojowej neurobiologiianaliza ekspresji genówrozwój układu sensorycznego
Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.