Method Article

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie, jeden z najważniejszych czynników wywołujących różne choroby roślin, wydzielają zestaw białek efektorowych do komórki rośliny gospodarza, aby osłabić układ odpornościowy rośliny. Podczas infekcji efektory cytoplazmatyczne są dostarczane do cytozolu gospodarza za pośrednictwem systemu wydzielania typu III (T3SS). Po dostarczeniu do komórki roślinnej efektor (efektory) celuje w określony przedział (przedziały), aby modulować procesy komórek gospodarza w celu przetrwania i replikacji patogenu. Chociaż przeprowadzono pewne badania nad subkomórkową lokalizacją białek efektorowych w komórkach gospodarza, aby zrozumieć ich funkcję w patogenności przy użyciu białek fluorescencyjnych, badanie dynamiki efektorów wstrzykiwanych bezpośrednio z bakterii było trudne ze względu na niekompatybilność między T3SS a białkami fluorescencyjnymi.

Tutaj opisujemy naszą najnowszą metodę zoptymalizowanego systemu zielonego białka fluorescencyjnego (sfGFPOPT) do wizualizacji lokalizacji efektorów dostarczanych przez bakteryjny T3SS w komórce gospodarza. Efektor znakowany sfGFP11 (11. nićβ sfGFP) wydzielany przez T3SS może być połączony ze specyficznymi organellami ukierunkowanymi na sfGFP1-10OPT (1-10th β-nić sfGFP), co prowadzi do emisji fluorescencji w tym miejscu. Protokół ten zapewnia procedurę wizualizacji odtworzonego sygnału fluorescencji sfGFP za pomocą białka efektorowego z Pseudomonas syringae w określonych organellach w roślinach Arabidopsis i Nicotiana benthamiana.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny to osiadłe organizmy, które napotykają liczne atakujące patogeny, w tym bakterie, grzyby, wirusy, owady i nicienie przez cały swój cykl życia. Wśród fitopatogenów bakterie Gram-ujemne, takie jak Pseudomonas spp. i Ralstonia spp., infekują swoje rośliny żywicielskie, wnikając przez rany lub naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe i hydathode1. Aby skutecznie skolonizować rośliny żywicielskie, patogeny bakteryjne ewoluowały, rozwijając różne czynniki wirulencji2. Kiedy bakterie atakują roślinę żywicielską, wstrzykują szereg białek wirulencji - znanych jako efektory - bezpośrednio do komórek ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie materiałów roślinnych (4 tygodnie)

  1. Przygotowanie dla roślin N. benthamiana
    1. Zasiej 2 nasiona N. benthamiana na powierzchni gleby każdej doniczki, przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować w komorze wzrostu o temperaturze 25 °C i wilgotności 60% z 16/8-godzinnym cyklem fotoperiodu jasnego/ciemnego.
    2. Po dwóch tygodniach wybierz i wyrzuć najmniejszą sadzonkę z każdej doniczki i kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, jakie zastosowano do kiełkowania ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura β-beczkowa GFP składa się z jedenastu β nici i może być podzielona na dwie części, 1 - 10nitkę (GFP1-10OPT) i 11nitkę (GFP11). Chociaż żaden z dwóch fragmentów nie fluorescencyjny samodzielnie, samoorganizujący się sfGFP może emitować fluorescencję, gdy dwa fragmenty znajdują się w bliskiej odległości (Rysunek 1A). W tym systemie rośliny Arabidopsis lub N. benthamiana wykazujące ekspresjęOPT sfGFP1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół służy do monitorowania dokładnej lokalizacji białek efektorowych wstrzykiwanych przez bakteryjną T3SS do komórki rośliny gospodarza po zakażeniu. Wcześniej podzielony system GFP był używany jako narzędzie do badania subkomórkowej lokalizacji białekssaków 23,36, lokalizacji Salmonella T3E i dostarczania Agrobacterium VirE2 przez T4SS do komórek roślinnych37. Aby zastosować ten system w komórkach rośl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2018R1A2A1A05019892) dla DC oraz przez grant z Centrum Hodowli Molekularnej Roślin (PMBC) programu Next Generation Biogreen 21 Administracji Rozwoju Obszarów Wiejskich (PJ013201) dla EP. Dziękujemy centrum obrazowania Narodowego Centrum Instrumentacji Zarządzania Środowiskiem do Zapewnij mikroskop konfokalny do filmowania.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linie transgeniczne ArabidopsisPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organelle-ukierunkowany plazmid sfGFP1-10OPTPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged Wektor kompatybilny z bramką dla systemu dostarczania efektorów opartego na T3SSPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug / ml)
< silny> szczepy bakteryjne< / strong>
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz i Jeff Schell, Promotor genu TL-DNA 5 kontroluje specyficzną tkankowo ekspresję genów chimerycznych przenoszonych przez nowy typ wektora binarnego Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Odporny na gentamycynę (50 ug/ml) i ryfampicynę (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. i wsp. Delecje w repertuarze genów efektorowych wydzielania Pseudomonas syringae pv. DC3000 typu III pomidora ujawniają funkcjonalne nakładanie się efektorów. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Odporny na ryfampicynę (100 ug/ml)
składniki pożywki
Pożywka do kiełkowania roślinDodać 2,165 g/L Murashige i Proszek Skoog, 10 g/l sacharozy do wody. Dostosuj do pH 5,8 i dodaj 2,2 g/l fitagelu. Automatyczne cielenie.
Murashige & Pożywka Skoog z witaminamiDuchefa BiochemieM0222Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
SacharozaDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB podłożedo wody 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl. W przypadku pożywek stałych dodać 15 g/l mikro agaru. Autoklaw.  Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 55 stopni Celsjusza; C i w razie potrzeby dodaj antybiotyk.
TryptonBD Bioscience211705
Ekstrakt z drożdżyBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Mikro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 g/L proteazy pepton #2, 1,5 g/L bezwodny K2HPO4, 15 g/L agaru do wody. Autoklaw. Schłodzić do 55 stopni C i dodać do podłoża sterylne 15 ml/l glicerolu, 5 ml/l MgSO4. W razie potrzeby dodaj antybiotyki.
Pepton proteozyBD Bioscience212120
Bezwodny K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerolDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Mannitol-glutaminian (MG) płynne podłoże Dodaj do wody 10 g/l mannitolu, 2 g/l kwasu L-glutaminowego, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/L NaCl i 0,2 g/L MgSO4. Dostosuj do pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
Kwas L-glutaminowyDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Bufor10 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy), 10 mM MgCl2, 150 &mikro; M acetosyringon. pH 5,6; Przed użyciem przygotuj świeży bufor.
MESDuchefa BiochemieM1503Przygotować 100 mM (pH 5,6) w wodzie. Filtruj sterylizację.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Przygotować 100 mM zapasu w wodzie. Autoklaw.
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406Przygotuj 150 mM zapasu w DMSO.
mikroskopu konfokalnego
710 laserowy skaningowy system konfokalnyCarl Zeiss
Axio observer Z1 mikroskop odwróconyCarl Zeiss
Propidium jodekThermoFisherP1304MP
Dodaj infiltracyjny Sprzęt/materiały do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles