Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Prawidłowe funkcjonowanie kory mózgowej wymaga równowagi między pobudzającymi neuronami projekcyjnymi a hamującymi interneuronami GABA-ergicznymi, niezwykle niejednorodną populacją o odrębnych morfologiach, właściwościach elektrofizjologicznych, łączności i markerach neurochemicznych. Nieprawidłowy rozwój i funkcja interneuronów (i określonych podgrup interneuronów) została powiązana z patobiologią zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia, autyzm i padaczka^1,2,3. Co więcej, wiele genów związanych z tymi zaburzeniami mózgu jest silnie wzbogaconych w młodych interneuronach⁴. W związku z tym potrzebne jest lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących determinację i dojrzewanie losu interneuronów, aby zrozumieć prawidłowy rozwój i potencjalną etiologię wielu chorób mózgu.

Interneurony przodomózgowia rodzą się głównie z dwóch przejściowych struktur embrionalnych, przyśrodkowych i ogonowych wyniesień zwojowych (odpowiednio MGE i CGE). Te postmitotyczne komórki (prekursory interneuronów) przechodzą następnie przedłużoną fazę migracji sttycznej, aby rozproszyć się w całym kresomózgowiu, gdzie integrują się z szeroką gamą obwodów. Interneurony pochodzące od MGE składają się z trzech w dużej mierze nienakładających się na siebie, neurochemicznie zdefiniowanych podgrup: interneuronów szybko wystrzeliwujących parwalbuminy (PV⁺), interneuronów somatostatyny o nieszybkim wystrzeliwaniu (SST⁺) i późno wybijających neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS⁺), które tworzą komórki neurogleju hipokampa i bluszczu. Liczne laboratoria zidentyfikowały kilka mechanizmów w MGE, które regulują początkowe decyzje dotyczące losu interneuronów PV⁺ lub SST+, w tym przestrzenne gradienty morfogenów, datę urodzenia prekursorów interneuronów i tryb podziału neurogennego5^,6,7,8,9,10. Zaproponowano, że interneurony początkowo różnicują się w "klasy kardynalne", a następnie stopniowo dojrzewają do "klas ostatecznych" w miarę interakcji z otoczeniem¹¹. Ostatnie dowody wskazują, że niektóre dojrzałe podtypy interneuronów mogą być genetycznie okablowane, ponieważ komórki te stają się postmitotyczne w wypukłościach zwojowych, co wskazuje, że wcześnie zdefiniowane wewnętrzne programy genetyczne mogą odgrywać większą rolę niż wcześniej sądzono^12,13. Jednak kluczowe pytanie, w jaki sposób wewnętrzne programy genetyczne oddziałują na sygnały środowiskowe, aby napędzać różnicowanie w odrębne podtypy interneuronów, pozostaje w dużej mierze niezbadane.

Liczne badania przeszczepiły embrionalne komórki MGE bezpośrednio do różnych regionów mózgu, z konsensusem, że przeszczepione komórki dojrzewają i uwalniają GABA, aby ogólnie hamować lokalne obwody endogenne^{14,15,16,17,18,19}. Te obiecujące obserwacje wzbudziły znaczne zainteresowanie wykorzystaniem interneuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) w leczeniu różnych chorób mózgu. Jednak bardzo niewiele z tych badań ocenia, czy te przeszczepione komórki dojrzewają do oczekiwanych typów dojrzałych interneuronów, co jest krytycznym elementem, gdy myśli się o podejściach translacyjnych.

Aby dowiedzieć się, jak środowisko wpływa na różnicowanie i dojrzewanie interneuronów, opracowano strategię przeszczepiania niedojrzałych prekursorów interneuronów do nowych środowisk mózgu w celu zbadania, czy przeszczepione interneurony przyjmują cechy środowiska gospodarza, czy zachowują cechy środowiska dawcy²⁰. Przeszczepy MGE nie są odpowiednie do odpowiedzi na to pytanie, ponieważ MGE zawiera mieszaną populację komórek interneuronowych i projekcyjnych GABA-ergicznych, które rozpraszają się w wielu regionach mózgu²¹. Nie wiedząc, dokąd migrowałyby te komórki MGE, nie można w pełni ocenić, w jaki sposób środowisko mózgu wpływa na te przeszczepy. Zbierając prekursory interneuronów we wczesnych punktach pourodzeniowych, problem ten można obejść poprzez uzyskanie niedojrzałych komórek, które zakończyły migrację i dotarły do docelowego regionu mózgu, ale mają minimalną interakcję ze środowiskiem. Koncentrując się na specyficznych cechach interneuronów, które są różnie wyrażane między różnymi regionami mózgu, można następnie określić, w jaki sposób środowisko gospodarza zmienia właściwości interneuronów. Ogólne podejście przedstawione w tym protokole powinno mieć zastosowanie do każdego badacza, który chce zbadać, jak zachowują się młode neurony, gdy są zagrożone w nowym środowisku.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NICHD (ACUC). Protokół opisany poniżej wykorzystuje Nkx2.1-Cre^C/+; Ai9 ^+/- młode do zbierania prekursorów interneuronów pochodzących z MGE, ale można je wykonać na dowolnej pożądanej fluorescencyjnej linii myszy reporterowej. Zarówno samce, jak i samice myszy we wczesnym okresie poporodowym (P0-P2) stosowano bezkrytycznie jako tkankę dawcy i gospodarza.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z sacharozą (sACSF) według następującej receptury (jednostka w mM): 87 NaCl, 26 NaHCO₃, 2,5 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 10 glukoza, 75 sacharoza nasycona 95% O₂, 5% CO₂ przy pH = 7,4.
2. Napełnij zlewkę 350 ml czystego ddH₂O w oparciu o ostateczną pożądaną objętość (500 ml sACSF powinno wystarczyć na 1-2 litry), dodaj magnetyczny pręt mieszający i umieść zlewkę na płytce mieszającej.
3. Zważyć wszystkie sole (NaCl, NaHCO₃, KCl, NaH₂PO₄, glukoza, sacharoza) po jednej na raz i dodać do wody zgodnie z poniższą tabelą. Ilości można regulować w zależności od ostatecznej pożądanej objętości. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział

   Odczynnik	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	Gramy/500 ml
   chlorek sodu	Klasa 58,44	Rozdział 87	Godzina 2,54
   Wodorowęglan sodu	84,01	26	Godzina 1,09
   Chlorek potasu	Klasa 74,55	Rozdział 2.5	0,09
   Sodu fosforan jednozasadowy	119,98	Wydanie orzeczenia 1,25	0,08
   glukoza	180,16	10	0,9
   sacharoza	342,3 pkt.	75	Godzina 12,84

4. Bąbelkować roztwór 95%_O2, 5% CO₂ (karboksylen) przez co najmniej 20-30 minut przed dodaniem odpowiedniej ilości CaCl₂ (0,25 ml z 1 M roztworu na 500 ml sACSF) i MgCl₂ (3,5 ml z 1 M roztworu na 500 ml sACSF).
5. Sprawdź pH za pomocą standardowego pH-metru. Prawidłowo przygotowany roztwór powinien mieć pH = 7,4.
6. Doprowadzić roztwór do końcowej objętości 500 ml z czystym ddH₂O w cylindrze miarowym.
7. sACSF można przygotować do 1-2 dni wcześniej. Przed użyciem umieść na lodzie i bąbelkuj z carboxygen przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem sekcji i utrzymuj butelkę sACSF bulgoczącą przez cały czas sekcji.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Następujące narzędzia powinny być sterylizowane/sterylizowane w autoklawie: co najmniej jeden mały cienki ostry nożyczki, 2 cienkie kleszcze (styl #5), zakrzywione cienkie kleszcze, forma matrycowa do cięcia mózgu i kilka żyletek. Mała szpatułka do usunięcia mózgu z czaszki jest opcjonalna.
2. Ustaw stanowisko robocze w pobliżu mikroskopów preparacyjnych z szalkami Petriego (o średnicy 9 cm i 4 cm), stożkowymi plastikowymi rurkami o pojemności 50 ml do zbierania izolowanych obszarów mózgu i plastikowymi pipetami o dużych średnicach, a wszystko to trzymane na lodzie. Przygotuj na lodzie kilka probówek o pojemności 50 ml pełnych karbotlenowego sACSF. W przypadku preparacji więcej niż jednego obszaru mózgu należy upewnić się, że zarówno probówki zbiorcze, jak i pipety transferowe są prawidłowo i wyraźnie oznaczone, aby uniknąć zanieczyszczenia.
3. Miej dodatkowe wiadro na lód do znieczulenia lodem szczeniąt przez hipotermię oraz odpowiedni worek na odpady niebezpieczne do wyrzucania tusz.
4. Przygotuj pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła do rozcierania tkanek. Użyj palnika Bunsena, aby wysterylizować i ukształtować końcówkę pipety. Przygotuj kilka pipet z różnymi otworami: dużymi (~600 μm), średnimi (~300 μm) i małymi (~100 μm). Przetestuj przepływ przez końcówki przy użyciu wody, aby zapewnić różne prędkości rozcierania. Do każdego izolowanego obszaru mózgu potrzebna jest co najmniej jedna pipeta każdego rodzaju, ale w przypadku zatkania lub złamania końcówek zaleca się posiadanie kilku dodatkowych dla każdego rozmiaru.

3. Przygotowanie do przeszczepu

1. Użyj ściągacza do elektrod, aby przygotować szklane mikropipety z cienką końcówką. Złam lub ukosuj końcówkę, aby uzyskać ostry kątowy punkt, o średnicy końcówki o średnicy ~20-40 μm. Sprawdź wzrokowo końcówki pod mikroskopem, aby upewnić się, że żaden kurz ani resztki szkła nie zasłaniają otworu.
2. Za pomocą strzykawki z cienką igłą całkowicie napełnij szklaną mikropipetę olejem mineralnym. Włożyć mikropipetę do aparatu Nanoject (lub innego urządzenia do mikroiniekcji). W przypadku Nanoject III skonfiguruj następujący program: Objętość = 60 nL, Szybkość = 30, Cykle = 25, Opóźnienie = 1 s.
3. Przymocuj Nanoject do manipulatora, który jest przymocowany do podstawy magnetycznej, i wyreguluj manipulator tak, aby Nanoject był skierowany prosto w dół, a nie przechylony wzdłuż osi x lub y.
4. Przymocuj trochę szpachli samoprzylepnej (~ 1-2 cm dla szczeniąt P0-P2) do górnej części pokrywy szalki Petriego, tworząc podwyższoną powierzchnię, na której można oprzeć głowę szczeniaka.
5. Wytnij paski taśmy laboratoryjnej o długości ~6-8 cm i wykonaj otwór w kształcie rombu pośrodku. Taśma posłuży do stabilizacji głowy szczeniaka podczas zabiegu, jednocześnie rozciągając skórę i umożliwiając łatwą wizualizację punktów orientacyjnych i docelowego obszaru.
6. Przygotuj poduszkę grzewczą obok stacji wtryskowej i włącz ustawienie "niskie" przed rozpoczęciem wstrzykiwań. Przykryj podkładkę ręcznikami papierowymi lub podkładką do pieluchy.
7. Jeśli wykonujesz wiele warunków przeszczepu, miej małe nożyczki gotowe do wykonania przycinania palców u nóg / ogona, aby oznaczyć szczenięta otrzymujące różne zastrzyki.

4. Usunięcie mózgu myszy P0-P2

1. Tuż przed rozpoczęciem zabiegu napełnij kilka szalek Petriego schłodzonym, nawęglonym sACSF. Napełnij również probówkę (probówki) zbiorczą ~25 ml sACSF.
2. Owiń szczeniaka P0-P2 w jakiś parafilm lub rękawicę i umieść go dobrze przykrytego pod lodem. Ustaw minutnik na 5 minut i uruchom go. Po tym czasie wyjmij szczeniaka i sprawdź, czy nie reaguje na szczypanie tylnej łapy.
3. Odetnij głowę szczeniakowi i zbierz głowę na szalkę Petriego wypełnioną sACSF. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
4. Zlokalizuj otwór w czaszce w tyłomózgowiu/rdzeniu kręgowym i włóż jeden koniec kleszczy wzdłuż grzbietowej części czaszki. Delikatnie chwyć czaszkę na linii środkowej i "oderwij" kawałki z boku, aby odsłonić mózg, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
5. Po usunięciu grzbietowej i bocznej części czaszki użyj kleszczy lub szpatułki, aby delikatnie usunąć mózg z czaszki, zgarniając pod brzuszną powierzchnię mózgu, starając się nie uszkodzić żadnego obszaru. Umieść mózg na innej szalce Petriego wypełnionej karboniowanym sACSF.
   
   UWAGA: Przedstawiamy dwie różne strategie preparowania hipokampa, prążkowia i kory mózgowej. Pierwsza strategia (kroki 5.1-5.10) jest przydatna dla każdej linii myszy, podczas gdy druga strategia (kroki 6.1-6.7) wymagałaby fluorescencyjnej myszy reporterowej, aby czysto oddzielić prążkowie od gałki bladej i innych struktur mózgu. Jeśli prążkowie nie jest pożądane, zignoruj części tych dwóch technik specyficzne dla prążkowia

Rysunek 1: Schemat i obrazy do sekcji mózgu, technika #1
Technika preparacji opisana w krokach 5.1-5.10. Jeśli pożądana jest tkanka prążkowia, umieść mózg P1 w matrycach mózgowych brzuszną stroną do góry. Umieść żyletki w szczelinach matrycy przez przednią część mózgu, aby uzyskać przekroje koronalne przez prążkowie. Usuń kawałki prążkowia z obu półkul, powtórz dla wszystkich sekcji zawierających prążkowie, które znajdują się przed hipokampem. Jeśli tkanka prążkowia nie jest pożądana, po prostu wykonaj półsekcję mózgu, umieść półkule przyśrodkową do góry w naczyniu i usuń brzuszno-przyśrodkowe struktury mózgu (wzgórze, zwoje podstawy itp.), Aby odsłonić hipokamp. Użyj pęsety, aby uszczypnąć hipokamp, a następnie odwróć półkulę i użyj pęsety, aby wyciąć kawałek tkanki korowej. Pionowe czarne linie przechodzące przez schematyczne półkule, w których byłyby nacięcia, usuwają odcinki prążkowia. Pasek skali = 500μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Żniwa prążkowia, hipokamp i kora mózgowa, technika #1

1. Umieść cały mózg na formie matrycy do cięcia, brzuszną stroną do góry. Umieść 1 żyletkę przez najbardziej przednią część mózgu (przez przedni przewód węchowy).
2. Włóż kolejną żyletkę tuż za pierwszą, aby wygenerować plasterek o grubości 0,5 mm, i umieść dodatkową żyletkę za tą.
3. Przenieś te plastry na szalkę Petriego z karbotlenowym sACSF i umieść resztę mózgu w osobnym naczyniu z sACSF. Przenieś plasterki prążkowia do zakresu preparacyjnego, aby uwidocznić prążkowie. Plastry te powinny zawierać duże części przedniego prążkowia i nie powinny być pozbawione hipokampa. Użyj fluorescencyjnej lunety sekcyjnej z Nkx2.1-Cre^+/-; Plastry Ai9 ^+/- w celu odróżnienia słabego sygnału tdTomato prążkowia od silnego sygnału tdTomato gałki bladej.
4. Z fluorescencją lub bez, uszczypnij prążkowie z obu półkul na wszystkich odcinkach i przenieś kawałki prążkowia do odpowiednio oznakowanej probówki 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
5. Wytnij mózg wzdłuż linii środkowej za pomocą kleszczy lub żyletki i połóż półkulę tak, aby powierzchnia przyśrodkowa była skierowana do góry.
6. Usuń brzuszną tkankę mózgową (wzgórze, zwoje podstawy itp.), Ściskając tę tkankę kleszczami. Po zakończeniu hipokamp (struktura w kształcie kiełbasy obejmująca oś przednio-tylną wzdłuż kory grzbietowej) i komorowa strona kory powinny być wyraźnie widoczne.
7. Aby usunąć hipokamp, włóż końcówki kleszczy przed przednim hipokampem i delikatnie oddziel hipokamp od kory, przesuwając kleszcze do tyłu i ściskając wzdłuż granicy hipokampowo-korowej. Przenieś izolowany hipokamp do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
8. Aby wypreparować korę, umieść półwyciętą korę przyśrodkową do dołu. Następnie użyj kleszczy, aby uszczypnąć najbardziej grzbietową, brzuszną, przednią i tylną część kory, aby pozostawić kwadratowy fragment przyśrodkowej kory somatosensorycznej, ~2 mm x 2 mm. W razie potrzeby odwróć korę tak, aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry i oczyszczona z nadmiaru tkanki niekorowej (wzgórze, zwoje podstawy itp.) na powierzchni przyśrodkowej. Przenieś kawałek kory mózgowej do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 50 ml z sACSF, przechowuj na lodzie.
9. Powtórz procedurę z drugą półkulą, aby zebrać zarówno hipokampy, jak i obszary kory.
10. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, upewniając się, że sACSF został wymieniony na szalkach Petriego między szczeniętami, aby upewnić się, że sACSF pozostaje zimny i świeży.

Rysunek 2: Schemat i obrazy do sekcji mózgu, technika #2
Technika preparacji opisana w krokach 6.1-6.7. Przypnij mózg do naczynia preparacyjnego grzbietem do góry. Po odklejeniu kory do przodu, hipokamp i prążkowie są widoczne i można je usunąć, a następnie część kory można usunąć, jak opisano w poprzedniej technice. W zależności od transgenicznej linii myszy, prążkowie można oczyścić w celu usunięcia gałki bladej i innych tkanek. W Nkx2.1Cre; Linia myszy Ai9, gałka blada ma znacznie większą gęstość komórek pomidora + w porównaniu z prążkowiem. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Żniwa prążkowia, hipokamp i kora mózgowa, Technika #2

1. Umieść mózg brzuszną stroną do dołu na pokrytej sylargonem szalce Petriego zawierającej sACSF i przypnij ją przez móżdżek i korę przednią lub opuszki węchowe.
2. Zaczynając od jednej półkuli, użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić tylną korę od leżącego poniżej hipokampa i innych tkanek. Delikatnie połóż obraną korę płasko na szalce Petriego. Powtórz dla drugiej półkuli. Hipokamp i prążkowie powinny być wyraźnie widoczne w odsłoniętym mózgu.
3. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć jeden hipokamp w linii środkowej i obierz hipokamp na boki, aby usunąć. Umieścić w fiolce zbiorczej na lodzie i powtórzyć z innymi hipokampami.
4. W przypadku prążkowia delikatnie zeskrob krawędzie prążkowia, aby poluzować je z otaczającej tkanki. Następnie usuń prążkowie, ściskając je od spodu i dodaj do probówki zbiorczej na lodzie. Powtórz dla innych prążkowi.
5. Skrawki kory mózgowej można pobrać zgodnie z opisem w kroku 5.8.
6. W przypadku korzystania z transgenicznej linii myszy reporterowej (np. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP itp.), przenieść prążkowie na szalkę Petriego za pomocą sACSF i obejrzeć pod fluorescencyjnym zakresem preparacji. Użyj kleszczy, aby usunąć jakąkolwiek tkankę nieprążkowiową z prążkowia (w Nkx2.1-Cre; Myszy Ai9 usuwają całą "jasną" tkankę, ponieważ gałka blada ma znacznie wyższą gęstość komórek pochodzących z MGE, tdTomato+ w porównaniu z prążkowiem). Powtórz dla całego prążkowia.
7. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, upewniając się, że sACSF został wymieniony na szalkach Petriego między szczeniętami, aby upewnić się, że sACSF pozostaje zimny i świeży.

7. Generowanie dysocjacji pojedynczych komórek

1. Po zakończeniu sekcji należy przygotować roztwór pronazy o stężeniu 1 mg/ml, ważąc 10 mg pronazy i rozpuszczając w 10 ml karbokoksydowanego sACSF.
2. Przenieść tkankę z fiolek zbiorczych o pojemności 50 ml do probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml zawierających 2 ml roztworu Pronase-sACSF. Inkubować tkankę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, potrząsając/przesuwając probówkę 3-4 razy palcem podczas inkubacji, aby wymieszać próbki.
3. Podczas tej inkubacji należy przygotować roztwór do rozpuszczenia: 1% FBS (100 μL) + DNAza (1 μL 1:10 000 podstawowego DNAzy) w 10 ml karbokoksydowanego sACSF.
4. Po upływie 20 minut ostrożnie usuń roztwór pronazy, aby nie naruszyć tkanki na dnie, i zastąp go 1-2 ml roztworu do rozpuszczenia (całkowita objętość zależy od początkowej ilości tkanki).
5. Mechanicznie dysocjować tkankę poprzez rozcieranie tkanki za pomocą wcześniej przygotowanych, polerowanych ogniowo pipet Pasteura. Zaczynając od pipety o dużym otworze (~600 μm), odessać i wydalić roztwór tkankowy co najmniej dziesięć razy, aby rozbić tkankę. Nie wprowadzaj pęcherzyków do roztworu. Powtórz ten proces dla pipety o średnim otworze i pipety o małym otworze. Roztwór powinien być mętny, a w probówkach nie powinien być widoczny żaden przezroczysty kawałek tkanki.
6. Odpipetować roztwór lizatu komórkowego przez filtr 50 μm do stożkowych probówek o pojemności 5 ml, aby usunąć wszelkie grudki komórek. Kontynuuj z tymi roztworami pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej (lub potencjalnie bezpośrednio do zliczania komórek, jeśli sortowanie nie jest potrzebne).

8. Przygotowanie roztworów komórkowych oczyszczonych metodą FACS do przeszczepu

1. Po otrzymaniu roztworów komórek z cytometru przepływowego przenieść roztwór do jednej (lub wielu) stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml i wirować komórki pod ciśnieniem 500 g przez 5 minut w temperaturze 4^oC. Po odwirowaniu usuń pożywkę tak, aby w probówce pozostało ~20-40 μL. Rozpuść komórki w pozostałym pożywce (i połącz roztwór, jeśli potrzebnych jest wiele probówek).
2. Na małym kawałku parafilmu wymieszaj ze sobą 2 μl roztworu komórkowego + 8 μl sACSF + 10 μl niebieskiego barwnika trypanowego. Odmierzyć 10 μl do hemocytometru z pokrywą wsuwaną.
3. Policz liczbę żywych komórek w każdej z kwadratowych siatek 4 x 4 w rogach hemocytometru za pomocą standardowego laboratoryjnego licznika ręcznego (martwe komórki będą niebieskie od barwnika) i uśrednij te 4 zliczenia. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić liczbę komórek na μl.
4. W razie potrzeby dostosuj objętość tak, aby komórki miały stężenie 10 000-30 000 komórek/μl w roztworze do rekonstytucji. Końcowe stężenie zależy od całkowitej ilości komórek i pożądanej liczby przeszczepów. Utrzymuj komórki na lodzie do przeszczepu

9. Przeszczepienie do szczeniąt P0-2 WT

1. Owiń szczeniaka WT w jakiś parafilm lub rękawicę i umieść go dobrze przykrytego pod lodem. Ustaw minutnik na 5 minut i uruchom go. Po tym czasie wyjmij szczeniaka i sprawdź, czy nie reaguje na szczypanie tylnej łapy.
2. Gdy szczenię znajduje się na lodzie, należy wymieszać roztwór komórkowy, odpipetowując go kilka razy, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed załadowaniem (wymieszać komórki przed załadowaniem mikropipety przy każdym wstrzyknięciu). Następnie opróżnij mikropipetę z oleju mineralnego i wypełnij ją całkowicie zawiesiną komórkową.
3. Umieść znieczulone szczenię na szalce Petriego z głową leżącą na klejącej szpachli, tak aby czubek głowy był stosunkowo płaski. Umieść taśmę z diamentowym otworem w poprzek głowy szczeniaka, naciągając ją, aby upewnić się, że skóra jest rozciągnięta, a głowa jest jędrna, ale mysz jest wygodna i dobrze oddycha. Lambda powinna być widoczna przez otwór diamentowy.

Rysunek 3: Schemat i obrazy do przeszczepu
(A) Zdjęcia konfiguracji wtrysku. Należy pamiętać, że lambda jest wyraźnie widoczna przez czaszkę szczeniaka i powinna być używana do zerowania mikropipety. Pasek skali = 1 cal. (B) Schemat przedstawiający procedurę wstrzykiwania w celu celowania w hipokamp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przesuń zabezpieczoną końcówkę pod Nanoject i opuść mikropipetę tak, aby końcówka mikropipety znalazła się bezpośrednio nad lambdą. Zapisz współrzędne x-y na manipulatorze.
5. Wyreguluj pokrętła manipulatora, aby przesunąć mikropipetę do żądanych współrzędnych wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej i przednio-tylnej głowy: Kora S1 → 1,0 mm przednia i 1,0 mm boczna, Hipokamp → 0,75-1,0 mm przedni i 1,0-1,2 mm boczny, prążkowie → 2,0-2,2 mm przednie i 1,5 mm boczne. Współrzędne można nieznacznie dostosować, aby skompensować wiek szczeniaka (np. P0 vs. P2) lub szczep myszy (np. myszy CD1 są większe niż i C57/B6 w P2).
6. Opuścić mikropipetę, aż utworzy się niewielka wklęsłość na skórze. Następnie mocno, ale delikatnie przekręć pokrętło manipulatora osi z, aby przebić mikropipetę przez skórę i czaszkę i wprowadzić ją do mózgu. Kiedy mikropipeta dostanie się do mózgu, nacisk na czaszkę zostanie zwolniony, a wklęsłość zniknie.
7. Lekko cofnąć mikropipetę, aż końcówka zostanie otoczona stożkiem skóry w kształcie namiotu. Odczytaj współrzędne wzdłuż osi z: Będzie to punkt zerowy osi z.
8. Obniż mikropipetę na żądaną głębokość: kora → 0,75-1,0 mm, Hipokamp → 1,2-1,5 mm, Prążkowie → 2,0-2,5 mm. Głębokość można nieznacznie zregulować, aby skompensować wiek lub obciążenie szczeniaka.
9. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową za pomocą programu Nanoject III opisanego powyżej. Po zakończeniu programu wstrzykiwania należy odczekać 15-20 s przed powolnym cofnięciem mikropipety, aby zminimalizować wyciek roztworu z miejsca wstrzyknięcia.
10. W przypadku wykonywania wstrzyknięć obustronnych należy ponownie wyzerować mikropipetę powyżej lambdy i przesunąć do odpowiednich współrzędnych na drugiej półkuli. Alternatywnie można wykonać dwa wstrzyknięcia do kory mózgowej tej samej półkuli, przesuwając mikropipetę o 1 mm przed pierwszym wstrzyknięciem.
11. Po zakończeniu przeszczepu usuń taśmę i przenieś szczenię na poduszkę grzewczą. W razie potrzeby oznacz szczeniaka obcinaniem ogona lub palca. Gdy szczenię odzyska czerwony kolor i zacznie się poruszać, umieść je z powrotem w klatce z matką.

Ten protokół pokazuje, jak pobierać określone obszary mózgu z mózgów wcześnie pourodzonych (Rysunek 1-2), zbierać dysocjacje pojedynczych komórek prekursorów interneuronów i przeszczepiać te komórki do różnych regionów mózgu u naiwnych pourodzeniowych szczeniąt WT (Rysunek 3). Do analizy post-hoc mózgi, które otrzymały przeszczepy prekursorowe interneuronów, zostały pobrane między P30-35 w celu scharakteryzowania morfologii komórek, markerów neurochemicznych i właściwości elektrofizjologicznych. Tego typu testy są często przeprowadzane między P21-P30 u normalnych myszy, ale ponieważ dojrzewanie przeszczepionych komórek może być nieco opóźnione z powodu procedury rozwarstwienia/dysocjacji, zaleca się odczekanie dodatkowych 5-10 dni, aby zrekompensować to opóźnione dojrzewanie. Rodzaj analizy, która ma zostać przeprowadzona, będzie dyktował właściwą strategię zbierania danych z mózgu. Warto zauważyć, że nie zaobserwowaliśmy preferencyjnej śmierci komórek w określonych podgrupach interneuronów, które mogłyby skłaniać się za lub przeciwko określonym podtypom20.

Do analizy immunohistochemicznej myszy poddano perfuzji 4% paraformaldehydu, a mózgi usunięto. Warstwy wibratomu o grubości 50 μm zostały przygotowane przez wybrany obszar mózgu i przechowywane w roztworze przeciw zamarzaniu i/lub przetworzone do barwienia immunologicznego, jak wcześniej opisano20. Niektóre mózgi nie zawierały żadnych komórek tomato+, co mogło być spowodowane niewłaściwym celowaniem (np. wstrzyknięciem zbyt głęboko w komorę), komórkami utraconymi lub ulegającymi apoptozie podczas procedury szczepienia lub odrzuceniem przeszczepionych komórek przez gospodarza. Na podstawie końcowej liczby komórek szacuje się, że przeżywa tylko 2-5% przeszczepionych komórek20, co jest zgodne z innymi procedurami transplantacji22,23.

Nic dziwnego, że wystąpiła znaczna zmienność w całkowitej liczbie komórek pomidora+ w udanych przeszczepach, wahająca się od kilkudziesięciu do kilku tysięcy komórek pomidora+ (Rysunek 4A). Przeszczepione komórki zostały zlokalizowane we właściwych regionach, przy czym wiele z nich wykazywało morfologię interneuronów i dobrze scharakteryzowane markery neurochemiczne interneuronów (Figura 4B). Podobne liczby przeżycia komórek i profile dojrzewania zaobserwowano nawet wtedy, gdy komórki zostały przeszczepione do nowych środowisk w przeszczepach heterotopowych (Figura 4C).

Oprócz analizy immunohistochemicznej, przeprowadzono analizę elektrofizjologiczną przeszczepionych komórek, aby potwierdzić, że zintegrowały się one z obwodami mózgu i wykazują oczekiwane właściwości wewnętrzne i wypalania. Mózgi pobrano od myszy P30-35 i przygotowano je do zapisów fizjologicznych, jak opisano wcześniej20. Przeszczepione interneurony wykazywały właściwości fizjologiczne podobne do dorosłych i można było scharakteryzować różne wzorce odpalania, które były reprezentatywne dla dobrze scharakteryzowanych podtypów interneuronów (Figura 5A), co sugeruje, że przeszczepione interneurony były w stanie prawidłowo dojrzeć w środowisku gospodarza. Aby sprawdzić, czy przeszczepione komórki zostały zintegrowane z siecią neuronalną, zarejestrowano również sEPSC (Ryc. 5B). Ponadto przeprowadzono podzbiór przeszczepów z interneuronami wyrażającymi ChR2, a następnie zapisano z komórek piramidowych zlokalizowanych w pobliżu przeszczepionych interneuronów. Dane te wykazały, że postsynaptyczne prądy GABA-ergiczne są wywoływane przez niebieskie światło (Rysunek 5C-D).

Rysunek 4: Szczepione prekursory interneuronów zasiedlają obszary mózgu gospodarza Reprezentatywne sekcje myszy P30 WT, którym przeszczepiono prekursory interneuronów pomidor+ w P1. (A) W homotopowych przeszczepach kory mózgowej, przeszczepione komórki wypełniają wszystkie warstwy korowe i wykazują morfologie, które naśladują endogenne interneurony. Wybrane obrazy podkreślają zmienność liczby komórek z różnych przeszczepów, przy czym lewy obraz ma znacznie większą liczbę komórek pomidora+ na sekcję w porównaniu z przeszczepem po prawej stronie. (B) Małe powiększenie (po lewej) i duże powiększenie (po prawej) reprezentatywne przekroje z homotopowych przeszczepów hipokampa do hipokampa. Należy zauważyć, że większość komórek pomidora + w warstwie oriens (SO) wyraża SST (prawdopodobne komórki O-LM), podczas gdy wiele komórek pomidora + w warstwie piramidalnej (SP) wyraża PV (prawdopodobne komórki koszyczkowe), podobnie jak endogenne interneurony hipokampa. (C) Przykład przeszczepu heterotopowego (kora mózgowa do prążkowia) z pomidorem+ obecnym w prążkowiu. Podziałka = 200 μm w A w panelu low mag w B, 50 μm w C i high power mag w B. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przeszczepione interneurony są elektrofizjologicznie dojrzałe i integrują się z siecią neuronalną gospodarza
(A) Reprezentatywne przykłady najwyższych częstotliwości wyzwalania zarejestrowanych z przeszczepionych interneuronów. Po lewej, interneuron Fast Spiking z przeszczepu Hip-to-Ctx, wstrzyknięte kroki prądu: -100 pA i 520 pA; po prawej, interneuron Non-Fast Spiking z przeszczepu Ctx do Ctx, wstrzyknięte kroki prądu: -100 pA i 360 pA. (B) Przykład sEPSC zarejestrowanych w interneuronie Late Spiking po przeszczepie z biodra do biodra. (C) Reprezentatywny obraz przedstawiający Nkx2.1-Cre; Komórki Ai32 (YFP) z przeszczepu Ctx do Ctx z wypełnioną biocytyną (czerwoną) komórką piramidową. Pasek skali = 50 μm. (D) Przykład GABA-ergicznego prądu postsynaptycznego wywołanego przez impulsy światła niebieskiego rejestrowane w komórkach piramidalnych, rejestrowane za pomocą [145 mM] Cl-. W kolorze czarnym średnie ślady; na czerwono, średnia odpowiedź zarejestrowana w obecności Gabazine. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.