Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57723

⸱

8 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Kavli Institute for Systems Neuroscience and Centre for Neural Computation, Norwegian University of Science and Technology, 2Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Streszczenie

Determinacja i dojrzewanie neuronów wymaga skomplikowanej interakcji między programami genetycznymi a sygnałami środowiskowymi. Jednak rozplątanie ról wewnętrznych i zewnętrznych mechanizmów, które regulują ten proces różnicowania, jest zagadką dla wszystkich neurobiologów rozwojowych. Problem ten jest spotęgowany w przypadku interneuronów GABA-ergicznych, niezwykle niejednorodnej populacji komórek, która rodzi się z przejściowych struktur embrionalnych i przechodzi przedłużoną fazę migracji, aby rozproszyć się w całym kresomózgowiu. Aby zbadać, w jaki sposób różne środowiska mózgu wpływają na los i dojrzewanie interneuronów, opracowaliśmy protokół zbierania znakowanych fluorescencyjnie niedojrzałych prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu u nowonarodzonych myszy (P0-P2). W tym wieku migracja interneuronów jest prawie zakończona, a komórki te znajdują się w swoich końcowych środowiskach spoczynku ze stosunkowo niewielką integracją synaptyczną. Po zebraniu roztworów pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, te prekursory interneuronów są przeszczepiane do pourodzeniowych szczeniąt P0-P2 typu dzikiego. Wykonując zarówno przeszczepy homotopowe (np. kora do kory), jak i heterotopowe (np. kora do hipokampa), można ocenić, jak trudne niedojrzałe interneurony w nowym środowisku mózgu wpływa na ich los, dojrzewanie i integrację obwodów. Mózgi mogą być pobierane od dorosłych myszy i oznaczane za pomocą szerokiej gamy analiz post hoc na przeszczepionych komórkach, w tym profilowania immunohistochemicznego, elektrofizjologicznego i transkrypcyjnego. To ogólne podejście zapewnia badaczom strategię do zbadania, w jaki sposób różne środowiska mózgu mogą wpływać na wiele aspektów rozwoju neuronów i określenia, czy określone cechy neuronów są przede wszystkim napędzane przez przewodowe programy genetyczne, czy sygnały środowiskowe.

Wprowadzenie

Prawidłowe funkcjonowanie kory mózgowej wymaga równowagi między pobudzającymi neuronami projekcyjnymi a hamującymi interneuronami GABA-ergicznymi, niezwykle niejednorodną populacją o odrębnych morfologiach, właściwościach elektrofizjologicznych, łączności i markerach neurochemicznych. Nieprawidłowy rozwój i funkcja interneuronów (i określonych podgrup interneuronów) została powiązana z patobiologią zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia, autyzm i padaczka1,2,3. Co więcej, wiele genów związanych z tymi zaburzeniami mózgu jest silnie wzbogaconych w młodych interneuronach4. W związku z tym potrzebne jest lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących determinację i dojrzewanie losu interneuronów, aby zrozumieć prawidłowy rozwój i potencjalną etiologię wielu chorób mózgu.

Interneurony przodomózgowia rodzą się głównie z dwóch przejściowych struktur embrionalnych, przyśrodkowych i ogonowych wyniesień zwojowych (odpowiednio MGE i CGE). Te postmitotyczne komórki (prekursory interneuronów) przechodzą następnie przedłużoną fazę migracji sttycznej, aby rozproszyć się w całym kresomózgowiu, gdzie integrują się z szeroką gamą obwodów. Interneurony pochodzące od MGE składają się z trzech w dużej mierze nienakładających się na siebie, neurochemicznie zdefiniowanych podgrup: interneuronów szybko wystrzeliwujących parwalbuminy (PV+), interneuronów somatostatyny o nieszybkim wystrzeliwaniu (SST+) i późno wybijających neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS+), które tworzą komórki neurogleju hipokampa i bluszczu. Liczne laboratoria zidentyfikowały kilka mechanizmów w MGE, które regulują początkowe decyzje dotyczące losu interneuronów PV+ lub SST+, w tym przestrzenne gradienty morfogenów, datę urodzenia prekursorów interneuronów i tryb podziału neurogennego5,6,7,8,9,10. Zaproponowano, że interneurony początkowo różnicują się w "klasy kardynalne", a następnie stopniowo dojrzewają do "klas ostatecznych" w miarę interakcji z otoczeniem11. Ostatnie dowody wskazują, że niektóre dojrzałe podtypy interneuronów mogą być genetycznie okablowane, ponieważ komórki te stają się postmitotyczne w wypukłościach zwojowych, co wskazuje, że wcześnie zdefiniowane wewnętrzne programy genetyczne mogą odgrywać większą rolę niż wcześniej sądzono12,13. Jednak kluczowe pytanie, w jaki sposób wewnętrzne programy genetyczne oddziałują na sygnały środowiskowe, aby napędzać różnicowanie w odrębne podtypy interneuronów, pozostaje w dużej mierze niezbadane.

Liczne badania przeszczepiły embrionalne komórki MGE bezpośrednio do różnych regionów mózgu, z konsensusem, że przeszczepione komórki dojrzewają i uwalniają GABA, aby ogólnie hamować lokalne obwody endogenne14,15,16,17,18,19. Te obiecujące obserwacje wzbudziły znaczne zainteresowanie wykorzystaniem interneuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) w leczeniu różnych chorób mózgu. Jednak bardzo niewiele z tych badań ocenia, czy te przeszczepione komórki dojrzewają do oczekiwanych typów dojrzałych interneuronów, co jest krytycznym elementem, gdy myśli się o podejściach translacyjnych.

Aby dowiedzieć się, jak środowisko wpływa na różnicowanie i dojrzewanie interneuronów, opracowano strategię przeszczepiania niedojrzałych prekursorów interneuronów do nowych środowisk mózgu w celu zbadania, czy przeszczepione interneurony przyjmują cechy środowiska gospodarza, czy zachowują cechy środowiska dawcy20. Przeszczepy MGE nie są odpowiednie do odpowiedzi na to pytanie, ponieważ MGE zawiera mieszaną populację komórek interneuronowych i projekcyjnych GABA-ergicznych, które rozpraszają się w wielu regionach mózgu21. Nie wiedząc, dokąd migrowałyby te komórki MGE, nie można w pełni ocenić, w jaki sposób środowisko mózgu wpływa na te przeszczepy. Zbierając prekursory interneuronów we wczesnych punktach pourodzeniowych, problem ten można obejść poprzez uzyskanie niedojrzałych komórek, które zakończyły migrację i dotarły do docelowego regionu mózgu, ale mają minimalną interakcję ze środowiskiem. Koncentrując się na specyficznych cechach interneuronów, które są różnie wyrażane między różnymi regionami mózgu, można następnie określić, w jaki sposób środowisko gospodarza zmienia właściwości interneuronów. Ogólne podejście przedstawione w tym protokole powinno mieć zastosowanie do każdego badacza, który chce zbadać, jak zachowują się młode neurony, gdy są zagrożone w nowym środowisku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez NICHD Animal Care and Use Committee (ACUC). Opisany poniżej protokół wykorzystuje szczenięta Nkx2.1-CreC/+;Ai9+/- do pozyskiwania prekursorów interneuronów pochodzących z MGE, ale może być przeprowadzony na dowolnej wybranej linii myszy z reporterem fluorescencyjnym. Zarówno samce, jak i samice myszy wczesnopostnatalnych (P0-P2) były stosowane bez rozróżnienia jako tkanki dawcy i biorcy.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z sacharozą (sACSF) zgodnie z następującą recepturą (jednostki w mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl22, 7 MgCl22, 10 glukozy, 75 sacharozy nasyconej 95% O2, 5% CO22 przy pH=7,4.
  2. Napełnić zlewkę 350 ml czystej wodyy ddestylowanej dwukrotnie (ddH2O).2W zależności od końcowej pożądanej objętości (500 ml sACSF powinno być wystarczające dla 1-2 kociąt), należy dodać mieszadło magnetyczne i postawić zlew na mieszalniku.
  3. Odważ wszystkie sole (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4(glukoza, sacharoza) po jednym i dodać do wody zgodnie z poniższą tabelą. Ilości można dostosować w zależności od pożąganej objętości końcowej.
    OdczynnikMasa cząsteczkowa Stężenie (mM)g/500 ml
    Chlorek sodu58.44872.54
    Wodorowęglan sodu84.01261.09
    Chlorek potasu74.552.50.09
    Wodorofosforan sodu119.981.250.08
    Glukoza180.16100.9
    Sacharoza342.37512.84
  4. Przeznaj roztwór tlenkiem o stężeniu 95% O22, 5% CO22 (karboksygen) przez co najmniej 20–30 minut przed dodaniem odpowiedniej ilości CaCl22 (0,25 ml z roztworu 1 M na 500 ml sACSF) oraz MgCl22 (3,5 ml z roztworu 1 M na 500 ml sACSF).
  5. Sprawdź pH za pomocą standardowego pH-metru. Jeśli roztwór został przygotowany prawidłowo, jego pH powinno wynosić 7,4.
  6. Dopełnić roztwór do końcowej objętości 500 ml czystą wodą ddH2O2O w cylindrze miarowym.
  7. sACSF można przygotować z wyprzedzeniem do 1-2 dni. Przed użyciem należy umieścić roztwór na lodzie i napowietrzać karboksygenem przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem sekcji, a butelkę z sACSF należy stale napowietrzać przez cały czas trwania sekcji.

2. Przygotowanie do sekcji

  1. Należy wysterylizować/autoklawować następujące narzędzia: co najmniej jedne małe, precyzyjne nożyczki ostre, 2 pęsety precyzyjne (model nr 5), zakrzywioną pęsetę precyzyjną, formę do sekcjonowania mózgu oraz kilka żyletek. Opcjonalnie można przygotować małą szpatułkę do usuwania mózgu z czaszki.
  2. Przygotować stanowisko pracy w pobliżu mikroskopów sekcyjnych, wyposażone w szalki Petriego (o średnicach 9 cm i 4 cm), plastikowe probówki stożkowe o pojemności 50 mL do zbierania wyizolowanych obszarów mózgu oraz plastikowe pipety transferowe o szerokim wylocie; wszystkie elementy powinny być utrzymywane w lodzie. Przygotować kilka probówek 50 mL wypełnionych nasyconym karboksygenem sACSF w lodzie. W przypadku sekcji więcej niż jednego obszaru mózgu należy upewnić się, że zarówno probówki zbiorcze, jak i pipety transferowe  są odpowiednio i wyraźnie oznakowane, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych.
  3. Przygotować dodatkowy pojemnik z lodem do znieczulania szczeniąt poprzez hipotermię oraz odpowiedni worek na odpady niebezpieczne do utylizacji ciał zwierząt.
  4. Przygotować wypalane nad ogniem szklane pipety Pasteura do trituracji tkanek. Do sterylizacji i formowania końcówki pipety należy użyć palnika Bunsena. Przygotować kilka pipet o różnych średnicach otworów: duże (~600 µm), średnie (~300 µm) i małe (~100 µm). Przepływ przez końcówki należy sprawdzić przy użyciu wody, aby zapewnić różne prędkości trituracji. Dla każdego wyizolowanego obszaru mózgu potrzebna jest co najmniej jedna pipeta każdego rodzaju, jednak zaleca się przygotowanie kilku dodatkowych egzemplarzy każdego rozmiaru na wypadek zapchania lub złamania końcówek.

3. Przygotowanie do transplantacji

  1. Użyć wyciągacza do elektrod w celu przygotowania szklanych mikropipet o cienkich końcówkach. Odłamać lub ściąć końcówkę pod kątem, aby uzyskać ostrą krawędź o średnicy ok. 20-40 µm. Obejrzeć końcówki pod mikroskopem, aby upewnić się, że otwór nie jest zablokowany przez kurz lub resztki szkła.
  2. Za pomocą strzykawki z cienką igłą całkowicie wypełnić szklaną mikropipetę olejem mineralnym. Wprowadzić mikropipetę do aparatu Nanoject (lub innego urządzenia do mikroiniekcji). W przypadku Nanoject III ustawić następujący program: Volume = 60 nL, Rate = 30, Cycles = 25, Delay = 1 s.
  3. Zamocować Nanoject do manipulatora przymocowanego do podstawy magnetycznej i wyregulować manipulator tak, aby Nanoject był skierowany pionowo w dół, bez nachylenia wzdłuż osi x lub y.
  4. Przykleić masę mocującą (~1-2 cm dla szczeniąt P0-P2) do górnej części pokrywy  szalki Petriego, tworząc podwyższenie, na którym będzie spoczywać głowa szczenięcia.
  5. Wyciąć paski taśmy laboratoryjnej o długości ok. 6-8 cm i wyciąć w nich na środku otwór w kształcie rombu. Taśma posłuży do stabilizacji głowy szczenięcia podczas procedury, jednocześnie napinając skórę i umożliwiając łatwą wizualizację punktów orientacyjnych oraz docelowego obszaru.
  6. Przygotować podkładkę grzewczą obok stanowiska do iniekcji i włączyć ją na ustawienie „low” przed rozpoczęciem iniekcji. Przykryć podkładkę ręcznikami papierowymi lub wkładką higieniczną.
  7. W przypadku przeprowadzania wielu wariantów transplantacji, przygotować małe nożyczki do przycinania palców lub ogona w celu oznaczenia szczeniąt otrzymujących różne iniekcje.

4. Usuwanie mózgu myszy w dniach P0-P2

  1. Bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury napełnić kilka szalek Petri schłodzonym, nasyconym karboksygenem sACSF. Napełnić również probówkę (probówki) do zbierania ok. 25 mL sACSF.
  2. Owiąć poczwarkę P0-P2 parafilmem lub rękawiczką i umieścić ją szczelnie przykrytą pod lodem. Ustawić czasomierz na 5 minut i uruchomić go. Po upływie tego czasu wyjąć poczwarkę i sprawdzić, czy nie reaguje ona na uciśnięcie tylnej łapy.
  3. Odciąć głowę poczwarki i umieścić ją w szalce Petri wypełnionej sACSF. Rozciąć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
  4. Zlokalizować otwór w czaszce na wysokości mózgu tylnego/rdzenia kręgowego i wsunąć jeden koniec pęsety wzdłuż grzbietowej części czaszki. Delikatnie chwycić czaszkę w linii środkowej i „odłupać” fragmenty bocznie, aby odsłonić mózg, uważając, by go nie uszkodzić.
  5. Po usunięciu grzbietowych i bocznych części czaszki, użyć pęsety lub szpatułki, aby delikatnie wyjąć mózg z czaszki, podważając go od strony powierzchni brzusznej, starając się nie uszkodzić żadnego obszaru. Umieścić mózg w innej szalce Petri wypełnionej nasyconym karboksygenem sACSF.
     
    UWAGA: Przedstawiamy dwie różne strategie wycinania hipokampa, prążkowia i kory. Pierwsza strategia (kroki 5.1-5.10) jest przydatna dla każdej linii myszy, natomiast druga strategia (kroki 6.1-6.7) wymagałaby myszy z reporterem fluorescencyjnym, aby precyzyjnie oddzielić prążkowie od gałki bladej i innych struktur mózgu. Jeśli prążkowie nie jest wymagane, należy pominąć części obu technik specyficzne dla prążkowia.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat i obrazy sekcji mózgu, technika nr 1
Technika sekcji opisana w krokach 5.1-5.10. W przypadku zapotrzebowania na tkankę prążkowia, należy umieścić mózg P1 w matrycach do mózgu stroną brzuszną do góry. Żyletki należy wsunąć w szczeliny matrycy przez przednią część mózgu, aby uzyskać przekroje wieńcowe przez prążkowie. Należy usunąć fragmenty prążkowia z obu półkul i powtórzyć czynność dla wszystkich przekrojów zawierających prążkowie znajdujących się przed hipokampem. Jeśli tkanka prążkowia nie jest wymagana, wystarczy przeciąć mózg na pół, umieścić półkule stroną przyśrodkową do góry w naczyniu i usunąć brzuszzno-przyśrodkowe struktury mózgu (wzgórze, jądra podstawy itp.), aby odsłonić hipokamp. Za pomocą pęsety należy odciąć hipokamp, a następnie odwrócić półkulę i za pomocą pęsety wyciąć fragment tkanki korowej. Pionowe czarne linie na schemacie półkul wskazują miejsca cięć w celu usunięcia przekrojów prążkowia. Pasek skali = 500μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

5. Pobieranie prążkowia, hipokampa i kory, technika nr 1

  1. Umieść cały mózg na formie do sekcjonowania, stroną brzuszna do góry. Wsuń jedno żyletkowe ostrze przez najbardziej przednią część mózgu (przez przedni trakt węchowy).
  2. Wsuń kolejne ostrze tuż za pierwszym, aby uzyskać plaster o grubości 0,5 mm, a następnie umieść dodatkowe ostrze za nim.
  3. Przenieś te plastry do szalki Petriego z nasyconym karboksygenem sACSF, a resztę mózgu do osobnej szalki z sACSF. Przenieś plastry prążkowia pod stereomikroskop sekcyjny w celu wizualizacji prążkowia. Plastry te powinny zawierać duże fragmenty przedniego prążkowia i nie zawierać hipokampa. Użyj fluorescencyjnego stereomikroskopu sekcyjnego z plastrami Nkx2.1-Cre+/-;Ai9+/-, aby odróżnić słaby sygnał tdTomato z prążkowia od silnego sygnału tdTomato z gałki bladej.
  4. Z użyciem lub bez fluorescencji, wydziel pęsetą prążkowie z obu półkul we wszystkich sekcjach i przenieś fragmenty prążkowia do odpowiednio oznakowanej probówki 50 mL z sACSF; przechowuj w lodzie.
  5. Przeciąć mózg wzdłuż linii środkowej za pomocą pęsety lub ostrza żyletkowego i ułożyć półkulę tak, aby powierzchnia przyśrodkowa była skierowana do góry.
  6. Usuń brzuszne tkanki mózgu (wzgórze, jądra podstawne itp.), odcinając tę tkankę pęsetą. Po zakończeniu hipokamp (struktura w kształcie parówki rozciągająca się wzdłuż osi przednio-tylnej wzdłuż kory grzbietowej) oraz strona komorowa kory powinny być wyraźnie widoczne.
  7. Aby usunąć hipokamp, wsuń końce pęsety przed przednią część hipokampa i delikatnie oddziel go od kory, przesuwając pęsetę w stronę tylną i ściskając wzdłuż granicy hipokampa i kory. Przenieś wyizolowany hipokamp do odpowiednio oznakowanej probówki 50 mL z sACSF; przechowuj w lodzie.
  8. Aby wypreparować korę, ułóż rozdzieloną półkulę korową stroną przyśrodkową do dołu. Następnie za pomocą pęsety odetnij najbardziej grzbietowe, brzuszne, przednie i tylne fragmenty kory, aby pozostawić kwadratowy fragment przyśrodkowej kory somatosensorycznej o wymiarach ok. 2 mm x 2 mm. Obróć korę stroną przyśrodkową do góry i w razie potrzeby usuń z powierzchni przyśrodkowej wszelkie nadmiarowe tkanki pozakorowe (wzgórze, jądra podstawne itp.). Przenieś fragment kory do odpowiednio oznakowanej probówki 50 mL z sACSF; przechowuj w lodzie.
  9. Powtórz procedurę dla drugiej półkuli, aby zebrać oba hipokampy oraz obszary korowe.
  10. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, pamiętając o wymianie sACSF w szalkach Petriego między kolejnymi osobnikami, aby sACSF pozostawało zimne i świeże.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat i obrazy z sekcji mózgu, technika nr 2
Technika sekcji opisana w krokach 6.1-6.7. Mózg należy przymocować szpilkami do szalki sekcyjnej stroną grzbietową do góry. Po odsunięciu kory do przodu widoczne stają się hipokamp i prążkowie, które można usunąć, a następnie można wyciąć fragment kory zgodnie z opisem w poprzedniej technice. W zależności od linii myszy transgenicznej prążkowie można oczyścić w celu usunięcia gałki bladej oraz innych tkanek. W linii myszy Nkx2.1Cre;Ai9 gałka blada wykazuje znacznie wyższą gęstość komórek tomato+ w porównaniu do prążkowia. Pasek skali = 500 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Pobieranie prążkowia, hipokampa i kory, technika nr 2

  1. Umieść mózg stroną brzuszną do dołu w szalce Petri powlekanej sylgardem, zawierającej sACSF, i przymocuj go za pomocą pinezek przez móżdżek i korę przednią lub opuszki węchowe.
  2. Zaczynając od jednej półkuli, użyj zakrzywionej pęsety, aby delikatnie oddzielić korę tylną od leżącego pod nią hipokampa i innych tkanek. Delikatnie rozłóż oddzieloną korę płasko na szalce Petri. Powtórz czynność dla drugiej półkuli. Hipokampy i prążkowie powinny być wyraźnie widoczne w odsłoniętym mózgu.
  3. Użyj pęsety, aby ucisnąć jeden hipokamp w linii środkowej, a następnie odwarstw go bocznie, aby go usunąć. Umieść go w probówce zbiorczej w lodzie i powtórz procedurę z drugim hipokampem.
  4. W przypadku prążkowia, delikatnie zeskrob krawędzie prążkowia, aby poluzować je z otaczających tkanek. Następnie usuń prążkowie, odcinając je od spodu, i dodaj do probówki zbiorczej w lodzie. Powtórz czynność dla drugiego prążkowia.
  5. Przekroje korowe można pobrać zgodnie z opisem w kroku 5.8.
  6. W przypadku użycia transgenicznej linii myszy reporterowych (np. Nkx2.1-Cre;Ai9, Lhx6-GFP itp.), przenieś prążkowie do szalki Petri z sACSF i obejrzyj pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Użyj pęsety, aby usunąć z prążkowia wszelkie tkanki nieprążkowiowe (u myszy Nkx2.1-Cre;Ai9 usuń wszystkie tkanki „jasne”, ponieważ globus pallidus ma znacznie wyższą gęstość komórek tdTomato+ pochodzących z MGE w porównaniu do prążkowia). Powtórz czynność dla wszystkich próbek prążkowia.
  7. Powtórz tę procedurę dla wszystkich szczeniąt, pamiętając o wymianie sACSF w szalkach Petri pomiędzy kolejnymi osobnikami, aby zapewnić, że sACSF pozostanie zimny i świeży.

7. Uzyskiwanie dysocjacji pojedynczych komórek

  1. Po zakończeniu sekcji przygotować roztwór Pronazy o stężeniu 1 mg/mL, odważając 10 mg Pronazy i rozpuszczając go w 10 mL nasyconego karbondioksydkiem sACSF.
  2. Przenieść tkankę z probówek zbiorczych o pojemności 50 mL do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 mL zawierających 2 mL roztworu Pronazy-sACSF. Inkubować tkankę przez 20 min w temperaturze pokojowej, potrząsając lub delikatnie uderzając palcem w probówkę 3-4 razy podczas inkubacji w celu wymieszania próbek.
  3. W czasie inkubacji przygotować roztwór rekonstytuujący: 1% FBS (100 μL) + DNAza (1 μL roztworu zapasowego DNAzy w stężeniu 1:10 000) w 10 mL nasyconego karbondioksydkiem sACSF.
  4. Po 20 min ostrożnie usunąć roztwór pronazy, aby nie zaburzyć tkanki znajdującej się na dnie, i zastąpić go 1-2 mL roztworu rekonstytuującego (całkowita objętość zależy od początkowej ilości tkanki).
  5. Rozdzielić tkankę mechanicznie poprzez tryturację przy użyciu wcześniej przygotowanych wypalanych pipet Pasteura. Zaczynając od pipety o dużym przekroju (~600 µm), zasysać i wypompowywać roztwór z tkanką co najmniej dziesięć razy, aby rozbić tkankę. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do roztworu. Powtórzyć ten proces dla pipety o średnim przekroju oraz pipety o małym przekroju. Roztwór powinien stać się mętny, a w probówkach zbiorczych nie powinny być widoczne żadne wyraźne fragmenty tkanki.
  6. Przenieść roztwór lizatu komórkowego za pomocą pipety przez filtr 50 µm do probówek stożkowych o pojemności 5 mL, aby usunąć aglomeraty komórkowe. Tak przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek przekazać do cytometrii przepływowej (lub potencjalnie bezpośrednio do liczenia komórek, jeśli sortowanie nie jest wymagane).

8. Przygotowanie oczyszczonych metodą FACS zawiesin komórkowych do transplantacji

  1. Po odebraniu zawiesin komórkowych z cytometru przepływowego, przenieś roztwór do jednej (lub kilku) stożkowych probówek o pojemności 1,5 mL i wiruj komórki przy 500 g przez 5 min w temperaturze 4oC. Po wirowaniu usuń medium tak, aby w probówce pozostało około 20-40 µL. Resuspenduj komórki w pozostałym medium (i połącz roztwory, jeśli użyto kilku probówek).
  2. Na małym kawałku parafilmu zmieszaj 2 µL zawiesiny komórkowej + 8 µL sACSF + 10 µL barwnika trypan blue. Pipetuj 10 µL do komory hemocytometru z nakładką szkiełkiem kryjącym.
  3. Policz liczbę żywych komórek w każdej z czterech siatek 4 x 4 w narożnikach hemocytometru, używając standardowego laboratoryjnego licznika ręcznego (martwe komórki będą zabarwione na niebiesko), a następnie wyciągnij średnią z tych 4 pomiarów. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić liczbę komórek na 1 µL.
  4. W razie potrzeby dostosuj objętość tak, aby komórki w roztworze do resuspensji miały stężenie od 10 000 do 30 000 komórek/µL. Stężenie końcowe zależy od całkowitej liczby komórek i planowanej liczby transplantacji. Przechowuj komórki w lodzie do czasu transplantacji.

9. Transplantacja do młodych szczurów WT w wieku P0-2

  1. Owiń szczenię WT parafilitem lub rękawiczką i umieść je całkowicie przykryte w lodzie. Ustaw minutnik na 5 min i uruchom go. Po tym czasie wyjmij szczenię i sprawdź, czy nie reaguje na uciśnięcie tylnej łapy.
  2. Podczas gdy szczenię znajduje się w lodzie, wymieszaj roztwór komórek, pipetując go kilka razy, aby upewnić się, że zawiesina komórkowa jest dobrze wymieszana przed załadowaniem (mieszaj komórki przed załadowaniem do mikropipety przed każdym wstrzyknięciem). Następnie opróżnij mikropipetę z oleju mineralnego i wypełnij ją całkowicie zawiesiną komórkową.
  3. Umieść znieczulone szczenię na szalce Petriego tak, aby jego głowa spoczywała na masie mocującej w pozycji stosunkowo płaskiej. Przyłóż taśmę z otworem w kształcie rombu w poprzek głowy szczenięcia, naciągając ją tak, aby skóra była rozciągnięta, a głowa unieruchomiona, dbając jednocześnie o to, by mysz czuła się komfortowo i oddychała swobodnie. Lambda powinna być widoczna przez otwór w kształcie rombu.

figure-protocol-3
Rycina 3: Schemat i zdjęcia procesu transplantacji 
(A) Zdjęcia układu do iniekcji. Należy zauważyć, że lambda jest wyraźnie widoczna przez czaszkę szczenięcia i powinna być wykorzystana do ustawienia punktu zero mikropipety. Pasek skali = 1 inch. (B) Schemat przedstawiający procedurę iniekcji skierowanej do hipokampa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przesunąć unieruchomione młode pod Nanoject i opuścić mikropipetę tak, aby jej końcówka znajdowała się bezpośrednio nad lambda. Zapisać współrzędne x-y na manipulatorze.
  2. Regulować pokrętła manipulatora, aby przesunąć mikropipetę do pożądanych współrzędnych wzdłuż osi środkowo-bocznej i przednio-tylnej głowy: kora S1 → 1,0 mm przednio i 1,0 mm bocznie, hipokamp → 0,75-1,0 mm przednio i 1,0-1,2 mm bocznie, prążkowie → 2,0-2,2 mm przednio i 1,5 mm bocznie. Współrzędne można lekko skorygować, aby uwzględnić wiek młodego (np. P0 vs P2) lub szczep myszy (np. myszy CD1 są większe niż C57/B6 w dniu P2).
  3. Opuszczać mikropipetę, aż utworzy małe wgłębienie w skórze. Następnie zdecydowanym, lecz delikatnym ruchem przekręcić pokrętło manipulatora osi z, aby wprowadzić mikropipetę przez skórę i czaszkę do mózgu. W momencie wprowadzenia mikropipety do mózgu nacisk na czaszkę zostanie zniesiony, a wgłębienie zniknie.
  4. Lekko wycofać mikropipetę, aż końcówka zostanie otoczona stożkiem skóry, przypominającym namiot. Odczytać współrzędne na osi z: będzie to punkt zero dla osi z.
  5. Opuszczać mikropipetę na pożądaną głębokość: kora → 0,75-1,0 mm, hipokamp → 1,2-1,5 mm, prążkowie → 2,0-2,5 mm. Głębokość można lekko skorygować w zależności od wieku lub szczepu młodego.
  6. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową, korzystając z programu Nanoject III opisanego powyżej. Po zakończeniu programu wstrzykiwania odczekać 15-20 s przed powolnym wycofaniem mikropipety, aby zminimalizować wyciek roztworu z miejsca wstrzyknięcia.
  7. W przypadku wykonywania wstrzykiwań obustronnych, ponownie ustawić punkt zero mikropipety nad lambda i przesunąć ją do odpowiednich współrzędnych w drugiej półkuli. Alternatywnie można wykonać dwa wstrzyknięcia do kory tej samej półkuli, przesuwając mikropipetę o 1 mm przednio względem pierwszego wstrzyknięcia.
  8. Po zakończeniu transplantacji usunąć taśmę i przenieść młode na podkładkę grzewczą. W razie potrzeby oznaczyć młode poprzez przycięcie ogona lub palca. Gdy młode odzyska czerwony kolor i zacznie się poruszać, umieścić je z powrotem w klatce z matką.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół demonstruje sposób izolacji konkretnych obszarów mózgu z mózgów we wczesnym okresie postnatalnym (Rysunek 1-2), pozyskiwania dysocjacji pojedynczych komórek prekursorów interneuronów oraz transplantacji tych komórek do różnych obszarów mózgu u naiwnych młodych szczurów WT (Rysunek 3). Do analizy post hoc pobrano mózgi, które otrzymały przeszczepy prekursorów interneuronów, pomiędzy P30-35, aby ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z krytycznych aspektów tego protokołu jest maksymalizacja przeżywalności komórek. Zapewnienie, że tkanka i komórki są zawsze w lodowatym karbotlenowym sACSF, jest niezbędne do przetrwania komórek. Wymaga to skutecznej strategii rozwarstwiania i dysocjacji, aby zminimalizować czas, jaki komórki spędzają w różnych roztworach i poza środowiskiem mózgu. W zależności od liczby obszarów mózgu poddawanych sekcji i przeszczepiania, korzystne może być posiadanie partnera pomagającego w etapach sekcji i/lub przeszczepu w ce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (K99MH104595) oraz wewnętrzny program badawczy NICHD dla T.J.P. Dziękujemy Gordowi Fishellowi, w którego laboratorium to podejście zostało pierwotnie opracowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduSigmaS7653
Wodorowęglan soduSigmaS6297
Chlorek potasuSigmaP9541
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS0751
Chlorek wapniaSigmaC5080
Chlorek magnezuSigmaM2670
GlukozaSigmaG7528
SacharozaSigma S7903
Matryce mózguRobozSA-2165Potrzebne tylko do zbioru prążkowia
Szczypce Dumont z drobnym punktemRobozRS-4978
Nożyczki do mikropreparacjiRobozRS-5940
ŻyletkiThermoFisher12-640
Pipety PasteuraThermoFisher1367820C
Nanoject IIIDrummond3-000-207
Manipulator ręczny ze stojakiemWorld Precision Instruments M3301R/M10
ml plastikowe rurki z okrągłym dnemThermoFisher149591A
Szalki Petriego 60 mmThermoFisher12556001
100 mm szalki PetriegoThermoFisher12565100
PronaseSigma10165921001
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher16140063
Filtry DNase ISigma4716728001
Celltrics 50umSysmex04-0042327
Błękit trypanowyThermoFisher15-250-061
HemocytometrThermoFisher02-671-6
5

Bibliografia

  1. Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
  2. Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
  3. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  4. Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
  5. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
  6. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
  7. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
  8. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
  9. Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
  10. Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  13. Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
  14. Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
  15. Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
  16. De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
  17. Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
  18. Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
  19. Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
  20. Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
  21. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
  22. Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
  23. Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowatransplantacja m zgumyszy noworodkowetransplantacja heterotopowaanaliza immunohistochemicznaprofilowanie elektrofizjologiczneprofilowanie transkrypcyjneizolacja kom reknanolitrowa iniekcja
Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.