Artykuł metodologiczny

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 września 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) w rdzeniu kręgowym dorosłego ssaka to względnie mitotycznie spokojna populacja komórek okołokomorowych, które mogą być badane in vitro za pomocą testu neurosfery. Ten test tworzenia kolonii jest potężnym narzędziem do badania odpowiedzi NSC na czynniki egzogenne w naczyniu; Można to jednak również wykorzystać do badania wpływu manipulacji in vivo z właściwym zrozumieniem mocnych stron i ograniczeń testu. Jedną z manipulacji o znaczeniu klinicznym jest wpływ urazu na endogenną aktywację NSC. Obecne modele uszkodzenia rdzenia kręgowego stanowią wyzwanie do zbadania tego, ponieważ nasilenie powszechnych modeli stłuczenia, ucisku i przecięcia powoduje zniszczenie niszy NSC w miejscu urazu, w którym znajdują się komórki macierzyste. W tym miejscu opisujemy model minimalnego urazu, który powoduje miejscowe uszkodzenie na powierzchownej grzbietowo-bocznej powierzchni dolnego poziomu klatki piersiowej (T7/8) rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Ten model urazu oszczędza kanał centralny na poziomie urazu i umożliwia analizę NSC, które znajdują się na poziomie zmiany w różnych punktach czasowych po urazie. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do badania aktywacji dwóch odrębnych, powiązanych liniowo populacji NSC, które znajdują się w regionie okołokomorowym rdzenia kręgowego - prymitywnych i ostatecznych NSC (odpowiednio pNSC i dNSC). Pokazujemy, jak izolować i hodować te NSC z obszaru okołokomorowego na poziomie urazu i miejsca uszkodzenia istoty białej. Nasze pooperacyjne rozwarstwienia rdzenia kręgowego wykazują zwiększoną liczbę neurosfer pNSC i neurosfer pochodzących z dNSC z obszaru okołokomorowego uszkodzonych rdzeni w porównaniu z grupą kontrolną, co świadczy o ich aktywacji poprzez uraz. Co więcej, po urazie neurosfery pochodzące z dNSC mogą zostać odizolowane od miejsca urazu – co pokazuje zdolność NSC do migracji z niszy okołokomorowej do miejsc urazu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centralny układ nerwowy zawiera subpopulację samoodnawiających się, multipotencjalnych komórek macierzystych, które mają zdolność do tworzenia różnych typów dojrzałych komórek nerwowych1,2,3,4. Te nerwowe komórki macierzyste (NSC) znajdują się w wyspecjalizowanych niszach w mózgu i rdzeniu kręgowym i mogą być aktywowane po urazie, aby namnażać się, migrować i różnicować w dojrzałe komórki nerwowe. Wykazano, że NSC i ich potomstwo migrują do miejsca urazu w modelach uszkodzeń korowych5,6. Wykazano, że w mózgu NSC migrują z komór bocznych do miejsca urazu, gdzie różnicują się w astrocyty, które przyczyniają się do powstawania blizn glejowych7. Jednak w rdzeniu kręgowym przeprowadzono niewiele badań, aby zapytać, czy te same endogenne NSC można wykorzystać do wspomagania powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego. Rzeczywiście, obecnie toczy się debata na temat tego, czy aktywacja puli komórek macierzystych w rdzeniu kręgowym wymaga bezpośredniego fizycznego uszkodzenia niszy okołokomorowej wyściełającej kanał centralny8, czy też uszkodzenie miąższu rdzenia kręgowego (pozostawienie nienaruszonej niszy komórek macierzystych) jest wystarczające do aktywacji endogennych NSCs9.

Do badania patofizjologii ostrych i przewlekłych urazów wykorzystano wiele modeli urazów rdzenia kręgowego (SCI). Modele te zostały również wykorzystane do przetestowania potencjalnych terapii w leczeniu SCI poprzez neuroprotekcję, immunomodulację i opracowywanie strategii przeszczepu/wymiany komórek10,11,13. Obecne modele obejmują urazy kompresyjne i/lub stłuczone, które powodują deficyty funkcjonalne na dużą skalę, a także rozległe zmiany i kawitacje w cord14,15. Powstałe blizny glejowe mogą obejmować kilka segmentów kręgosłupa wraz z większością szerokości/obwodu rdzenia kręgowego16. W związku z tym, chociaż modele te są istotne klinicznie, stanowią poważne wyzwanie dla badania odpowiedzi endogennych NSC po urazie. Istnieją chemiczne modele urazów, które można dostosować do powodowania łagodniejszych form urazu, które mogą oszczędzić kanał centralny17. Jednak te rodzaje urazów koncentrują się na demielinizacji związanej z SCI i nie są klinicznie istotnymi modelami dla fizycznych i/lub mechanicznych uszkodzeń związanych z urazowym SCI.

Aby rozwiązać problemy obecnych modeli urazów, dostosowaliśmy model SCI minimalnego śladu igły, pierwotnie opracowany w klasie rat9, do zastosowania w modelu dorosłej myszy. Nasz dostosowany model urazu może stworzyć spójne uszkodzenie grzbietowo-bocznego odcinka rdzenia kręgowego myszy i oszczędzić kanał centralny na poziomie (poziomach) urazu. Zaletą tego modelu jest to, że pozwala on na badanie kinetyki NSC po urazie i ich potencjalnej migracji promieniowej do miejsca urazu. Zastosowanie modelu mysiego pozwala również na wykorzystanie myszy transgenicznych, które umożliwiają śledzenie linii endogennych NSC i ich potomstwa po urazie. Właściwości NSC można dalej oceniać za pomocą zmodyfikowanej formy testu neurosfery in vitro, która została wprowadzona w tym protokole.

Test neurosfery to test in vitro tworzący kolonie, który pozwala na izolację NSC w obecności mitogenów. Przy gęstości posiewu klonalnego poszczególne NSC namnażają się, dając początek swobodnie unoszącym się sferycznym koloniom komórek, które składają się z niewielkiej subpopulacji NSC i zdecydowanej większości przodków18,19. W naszym protokole demonstrujemy izolację dwóch odrębnych, liniowo powiązanych NSC z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego - w warunkach wyjściowych i zgodnie z naszym minimalnym modelem SCI. Ostateczne nerwowe komórki macierzyste (dNSC) wyrażają gniazdynę i kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i są hodowane w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) i heparyny (razem określanych jako EFH)20. Te dNSC są rzadkie w naiwnym rdzeniu kręgowym, powodując powstanie bardzo niewielu neurosfer in vitro. Pokazujemy jednak, że dNSC są aktywowane po minimalnym SCI, zwiększając liczbę neurosfer izolowanych z obszaru okołokomorowego21. Prymitywne nerwowe komórki macierzyste (pNSC) znajdują się przed dNSC w linii nerwowych komórek macierzystych. pNSC występują niezwykle rzadko, wykazują niski poziom markera pluripotencji Oct4 i reagują na czynnik hamujący białaczkę (LiF)22. pNSC nie tworzą neurosfer po wyizolowaniu z rdzenia kręgowego dorosłej myszy ze względu na obecność zasadowego białka mielinowego (MBP) w hodowlach pierwotnych; jednak neurosfery pNSC można wyizolować od myszy z niedoborem MBP, a ich liczba zwiększa się po urazie — podobnie jak w przypadku dNSCs21. Wreszcie pokazujemy, że neurosfery pochodzące z dNSC można wyizolować z miejsca urazu we wczesnym okresie po minimalnym SCI. Wyniki te pokazują, że nasz model urazu i testy mogą ocenić charakterystykę aktywacji okołokomorowych NSC, taką jak ich zdolność do proliferacji i migracji w odpowiedzi na uraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Toronto i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt doświadczalnych" (2. edycja, Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami, 2017).

1. Minimalna operacja uszkodzenia rdzenia kręgowego

UWAGA: Przed operacją upewnij się, że wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne są sterylizowane odpowiednimi metodami (Rysunek 1A).

  1. Zbuduj łuk podparcia klatki piersiowej, zwijając 4–5 kwadratów gazy i sklejając je ze sobą na środku, aby uzyskać stałą rolkę gazy.
  2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i rozpocznij znieczulenie 5% izofluranem. Potwierdź brak odruchu szczypania palców u nóg przed kontynuowaniem, a także przez cały zabieg. Ponieważ operacja może trwać do 30 minut, zoptymalizuj ją pod kątem minimalnej ekspozycji na izofluran (5 minut przy 5%, a pozostały czas przy 2-3%).
  3. Przenieść mysz do stożka nosowego podłączonego do aparatu znieczulającego w dawce podtrzymującej 2-3% izofluranu. Użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść z grzbietu zwierzęcia od połowy pleców do szyi/uszu, aby odsłonić szeroki prostokątny obszar skóry do operacji.
  4. Przenieś mysz do instrumentu stereotaktycznego, umieszczając jej nos w dołączonym stożku nosowym i stabilizując czaszkę za pomocą pasków na uszy. Utrzymuj izofluran na poziomie 5% podczas zakładania pasków dousznych i w dolnej części pleców do 2–3%, gdy mysz jest zamocowana w urządzeniu stereotaktycznym.
  5. Przedoperacyjne leki przeciwbólowe podawać dootrzewnowo — Meloksykam (2,0 mg/kg). Obficie nałóż smarowanie oczu na otwarte oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu.
  6. Umieść łuk podtrzymujący klatkę piersiową pod brzuchem myszy, jednocześnie prostując ciało i kręgosłup myszy, lekko pociągając za podstawę ogona. Użyj laboratoryjnej taśmy do etykietowania, aby zabezpieczyć ogon i wszystkie wyprostowane kończyny w pozycji przypominającej gwiazdę. Po zabezpieczeniu popchnij podparcie klatki piersiowej w łuk rostralny, od brzucha myszy w kierunku górnej części klatki piersiowej - w celu podparcia kręgosłupa piersiowego (Rysunek 1B).
  7. Przygotować sterylne pole operacyjne, dezynfekując obszar skóry strzyżony sierścią przygotowany w kroku 1.3 70% etanolem, a następnie jodowidonem. Powtórz dwa razy. Zastosuj sterylną serwetę chirurgiczną, aby utrzymać szerokie sterylne pole.
  8. Za pomocą ostrza skalpela #10 wykonaj pionowe nacięcie równoległe do osi podłużnej zwierzęcia od środkowego punktu obu łopatek do krzywizny kręgosłupa piersiowego. Cofnij skórę, aby odsłonić tkankę miękką i kontur kręgosłupa (Rysunek 1C).
  9. Zidentyfikuj dolną granicę poduszeczki tłuszczowej nadłopatkowej (wyznacza ona poziom kręgów T4/5). Tym samym ostrzem #10, ostrożnie, ale z siłą, przetnij wzdłuż obu stron kości kręgowej T5–T8/9, aby odłączyć ścięgna mięśni pleców od kolumny.
  10. Włóż zęby retraktorów w miejsca nacięć po obu stronach kręgosłupa. Dostosuj ekspozycję, rozszerzając zwijacze, aby wystarczająco unieść kręgosłup bez zbytniego obciążania cofniętych warstw mięśniowych (Rysunek 1D).
  11. Pod mikroskopem chirurgicznym ostrożnie oczyść resztki mięśni i inne tkanki miękkie pokrywające kręgosłup, aby odsłonić kość kręgową (Rysunek 1E). Zidentyfikuj kręgi, które zostaną usunięte, obejmując wyrostek kolczysty kręgów kleszczami zębatymi i przesuwając go lekko w górę iw dół.
    UWAGA: Powinno to umożliwić identyfikację stawów międzykręgowych i odsłonić małe otwory (otwory międzykręgowe) pod kręgami będącymi przedmiotem zainteresowania.
  12. Włóż jedną główkę zakrzywionych, nożyczek po obu stronach odsłoniętego otworu międzykręgowego, doogonowo do blaszki kręgowej, która ma zostać wycięta, i obustronnie przetnij łączące stawy międzykręgowe.
  13. Podnieś blaszkę do góry i odetnij górne przyczepienie blaszki, aby wyizolować i usunąć kość.
    UWAGA: Spowoduje to odsłonięcie nienaruszonego worka opony twardej zawierającego rdzeń kręgowy (Rysunek 1F). Może wystąpić nadmierne krwawienie, które można opanować, umieszczając wstępnie przyciętą gazę o wymiarach 1 cm x 1 cm na dotkniętych obszarach i/lub umycie sterylnym PBS.
  14. Mając żyłę grzbietową linii środkowej służącą jako punkt orientacyjny, włóż zgięty pod kątem 45° trzon końcówki igły 30 G (ze skosem igły skierowanym do góry) w grzbietowo-boczną powierzchnię rdzenia kręgowego (o głębokości około 1 mm) w odległości około 0,5 mm z boku po obu stronach linii środkowej.
  15. Przesunąć igłę o ~2 mm od ogona do rostralu (równolegle do linii środkowej) tak, aby cała długość skosu igły została włożona w sznurek. Usuń igłę, przesuwając ją ponownie ścieżką wejścia (Rysunek 1G).
    UWAGA: Krwawienie nie powinno wystąpić, ale na tym etapie może być widoczny obrzęk tkanki rdzeniowej.
  16. Aby zamknąć ranę, zdejmij retraktor i zszyj mięśnie pleców po obu stronach urazu razem w linii środkowej za pomocą szwu wchłanialnego 6-0. Użyj sterylnego jedwabnego szwu 4-0, aby następnie zamknąć leżącą na powierzchni skórę.
  17. Nałóż maść z antybiotykiem na wierzch powierzchownie zszytej skóry, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej za pomocą końcówki bawełnianego wacika. Pooperacyjny lek przeciwbólowy w postaci 0,1 mg/kg buprenorfiny należy podawać podskórnie wraz z płynami (1 ml roztworu Ringera w okresie laktowanym).
  18. Wyłącz parownik izofluranu i tlen. Wyjmij mysz z urządzenia stereotaktycznego i umieść ją w czystej klatce bez ściółki.
  19. Umieść mysz w klatce w odległości około 30 cm od lampy grzewczej w celu odzyskania sił po znieczuleniu i monitoruj zachowanie po przebudzeniu. Mysz powinna obudzić się w ciągu 5–10 minut i mieć funkcję kończyn tylnych z możliwym niedowładem i/lub osłabieniem ogona po przebudzeniu.
  20. Monitoruj zachowanie myszy w ciągu najbliższych kilku dni i zapewnij odpowiednią opiekę pooperacyjną i leki przeciwbólowe (tj. zacier, płyn z mleczanami Ringera podawany podskórnie, 0,1 mg/kg buprenorfiny 2 razy dziennie podskórnie przez 2-3 dni oraz prawidłowe monitorowanie masy ciała) zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi zwierząt i indywidualnie, ponieważ powrót do zdrowia może się różnić.

2. Analiza testu neurosfery

UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurami hodowli tkanek sterylnych przez cały czas.

  1. Przygotowanie roztworu enzymatycznego
    1. Dodaj 32 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) do albuminy zawierającej szklaną butelkę inhibitora ovomukoidów i delikatnie wiruj, aż do rozpuszczenia.
    2. Dodać 5 ml EBSS do porcjowanej szklanej fiolki z papainą i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Rozwiązanie stanie się jasne (Rozwiązanie 1).
    3. Pobrać 500 μl EBSS i dodać do wstępnie porcjowanej szklanej fiolki z DNazą I, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml (roztwór 2). Wymieszać bardzo delikatnie, przechylając fiolkę do przodu i do tyłu, a następnie dodać 250 μl tej mieszaniny do roztworu 1,
      UWAGA: Wszystkie wykonane roztwory (roztwór 1 i 2) wystarczą do przetworzenia dwóch kawałków tkanki. Jeśli przetwarzasz więcej kawałków tkanki, dostosuj się do bardziej przygotowanego roztworu.
  2. Przygotowanie i rozwarstwienie tkanek
    1. Umieść chusteczkę laboratoryjną nasączoną izofluranem w klatce dla myszy i odczekaj 2-3 minuty, aby opary całkowicie znieczuliły mysz. Po znokautowaniu wyjmij mysz z klatki i potwierdź, że nie ma odruchu szczypania palców.
    2. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy metalowym przedmiotem (np. metalową kartą klatkową), aby poddać zwierzę eutanazji. Spryskaj uśpione zwierzę od szyi do połowy pleców obficie 70% etanolem.
    3. U podstawy czaszki użyj nożyczek, aby odciąć głowę i wyrzucić do torby biologicznej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości pleców, aby odsłonić kontur mięśni i kości kręgów (Rysunek 2A).
    4. Podnieś przyśrodkową część każdej łopatki (tj. łopatkę - identyfikowaną przez nałożoną poduszeczkę tłuszczową) i użyj nożyczek, aby odciąć tkankę miękką (między łopatkami a kręgami). Całkowicie oddziel, aby odsłonić znajdujący się pod spodem kręgosłup.
    5. Podążając za krzywizną kręgosłupa, włóż tę samą parę nożyczek do górnego otworu klatki piersiowej i odizoluj kręgosłup, odcinając przyczepione żebra, mięśnie i narządy wewnętrzne (Rysunek 2B).
    6. Włóż nożyczki w otwór/otwór kręgów ogonowych i przetnij stawy międzykręgowe po obu stronach blaszek (powierzchnia grzbietowa). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nienaruszonego przewodu. Kontynuuj ten proces, aż żądany poziom i/lub długość przewodu zostanie odsłonięty.
    7. Ostrożnie przeciąć nerw rdzeniowy (nerwy) wystające bocznie z rdzenia kręgowego przed przeniesieniem tkanki rdzenia kręgowego na szalkę Petriego ze zwykłym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Trzymaj próbkę na lodzie (Rysunek 2C).
    8. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć tkankę rdzenia kręgowego tak, aby obejmowała ~2 mm rostral i ogon do miejsca urazu. Użyj dwóch par kleszczyków, aby delikatnie rozdzielić sznur na 2 połówki wzdłuż szczelin grzbietowych i brzusznych (Rysunek 2C').
    9. Za pomocą mikronożyczek wytnij uszkodzoną grzbietowo-boczną istotę białą. Umieść kawałek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    10. Przytrzymując jedną połowę rdzenia kręgowego kleszczami, drażnij i usuwaj istotę białą za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy wzdłuż rostrocaudalnego zasięgu rdzenia kręgowego, aby wyizolować pożądany obszar okołokomorowy. Powtórz dla drugiej połowy rdzenia kręgowego.
    11. Umieść kawałki tkanki okołokomorowej w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Użyj mikronożyczek i delikatnie zmiel tkankę o ścianki stożkowych rurek.
      UWAGA: Modyfikacje dysocjacji tkanek pochodzą z Protokołu Systemu Dysocjacji Papainy23 i wcześniej opisanych procedur przygotowania tkanek24.
    12. Dodać 2,5 ml nowego roztworu 1 (krok 2.1.3) do próbki tkanki i umieścić na kołysce w temperaturze 37 °C na 30 minut.
    13. Delikatnie rozetrzyj tkankę w roztworze za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Odwirować mętną zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    14. Przygotować roztwór 3 z 2,7 ml zbilansowanego roztworu soli Earle'a, 300 μl roztworu inhibitora owomukoidów (krok 2.1.1) i 150 μl roztworu DNazy I (krok 2.1.3).
    15. Odrzucić supernatant z etapu (etap 2.2.13) i ponownie zawiesić w 1,5 ml roztworu 3 z poprzedniego etapu (etap 2.2.14).
    16. Nałożyć tę nową zawiesinę komórek (krok 2.2.15) na 5 ml roztworu inhibitora ovoimucoid (krok 2.1.1) w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby utworzyć nieciągły gradient gęstości. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    17. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml podłoża nerwowo-podstawowego. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    18. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml podłoża neurobazalnego. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 20 μm, a następnie dodać 4 ml pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość 5 ml.
  3. Poszycia
    1. Przygotować pożywkę hodowlaną do wzrostu neurosfery poprzez uzupełnienie pożywki neuropodstawowej o naskórkowy czynnik wzrostu (20 ng/ml) / czynnik wzrostu fibroblastów (20 ng/ml)/ heparynę (2 μg/ml) [dla ostatecznych NSC] lub czynnik hamujący białaczkę (10 ng/ml) [dla pierwotnych NSC]. Dodać 10 ml dowolnej pożywki do kolby do hodowli tkankowych o pojemności 25 ml.
    2. Użyj hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego, aby obliczyć liczbę komórek w zawiesinie od (krok 2.2.18)25. Po obliczeniach dodać komórki do kolb do hodowli tkankowych przygotowanych w (krok 2.3.1) do gęstości klonalnej 10 komórek/μl i umieścić kolbę do hodowli tkankowej z dodanymi komórkami w inkubatorze na 24 godziny (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2).
      UWAGA: Przykładowa technika liczenia jest następująca: Weź 10 μl zawiesiny komórek i wymieszaj z 10 μl barwnika błękitu trypanowego. Dodać 10 μl tej mieszaniny do hemocytometru. Pod mikroskopem świetlnym 10X policz liczbę żywych komórek i zsumuj wszystkie komórki zliczone w 4 z 4 kwadrantów 4 x 4. Użyj wzoru: 100 000/[(X komórek/4) x 2 x 10 x 1,000], aby podać objętość zawiesiny komórek, która ma być posiewana w każdej kolbie do hodowli tkankowej o pojemności 25 ml, aby zapewnić gęstość klonalną (10 komórek/μl).
    3. Po upływie 24 godzin delikatnie zamieszać kolbę i przelać jej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1–2 ml świeżego podłoża neurobazalnego.
    5. Powtórzyć krok 2.3.2, aby policzyć liczbę komórek w zawiesinie i komórkach płytki o gęstości klonalnej na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej 500 μl każdej z odpowiednich pożywek uzupełnionych mitogenem (EFH dla ostatecznego wzrostu NSC i LIF dla pierwotnego wzrostu NSC).
      UWAGA: Użyj dostosowanego wzoru (5,000/[X komórek/4) x 2 x 10 x 1,000), aby obliczyć objętość zawiesiny komórek, która ma być posiewana w każdym dołku zawierającym 500 μl pożywki.
    6. Umieść płytki zawierające komórki w inkubatorze (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ) do wzrostu przez 7 dni.
  4. Liczenie
    1. Po 7 dniach w hodowli usuń płytki i obejrzyj pod mikroskopem świetlnym. Określ ilościowo neurosfery, licząc kuliste kolonie o średnicy >80 μm w przypadku kultur dNSC i >50 μm w przypadku kultur pNSCs.
      UWAGA: W razie potrzeby neurosfery mogą być dalej pasażowane26 lub różnicowane. Jeśli komórki nie są już potrzebne, należy je usunąć, dodając przyspieszony nadtlenek wodoru do studzienek (ok. 1 ml) na 20 minut, aby kolor pożywki zmienił kolor na żółty. Następnie wyrzuć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po operacji, myszy powinny doświadczyć minimalnych deficytów motorycznych, które mogą obejmować niedowład ogona i możliwych kończyn tylnych przez okres do 24 godzin. Po tym czasie myszy nie powinny odczuwać paraliżu kończyn tylnych i/lub niedowładu oraz minimalnych zmian w chodzie.

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki testu neurosfery 5 dni po minimalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego. Bezwzględ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas zabiegu chirurgicznego istnieje kilka krytycznych etapów, na które badacz powinien zwrócić szczególną uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki i zminimalizować zmienność między zwierzętami. Podczas zabiegu należy zachować ostrożność przy stosowaniu znieczulenia wziewnego (izofluranu), ponieważ wykazano, że środek znieczulający ma działanie neuroprotekcyjne przy długotrwałym narażeniu27. W związku z tym, badając zdolność regeneracyjną rdzenia kręgowego po urazie, postaraj się wykonać operację ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez Fundację Krembil (grant operacyjny CMM). WX został laureatem nagrody studenckiej Carlton Marguerite Smith. Holandia otrzymała stypendium dla absolwentów Ontario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Retraktor AgricolaFine Science Tools17005-04
Nożyczki sprężynowe Moria Vannas-Wolff (zakrzywione)Narzędzia do nauki15370-50Dostosuj przy zamówieniu, aby uzyskać końcówki
Kleszcze Graefe (proste, 1 x 2 zęby)Narzędzia do nauki o wysokiej11053-10
Bardzo cienkie kleszcze Graefe (zakrzywione, ząbkowane)Narzędzia do nauki o naukach11152-10Lub jakiekolwiek inne kleszcze do szycia
Hymotaty Hartmana (proste)Fine Science Tools13002-10Lub inne odpowiednie do szycia
Rękojeść skalpela #3Fine Science Tools10003-12Lub inne odpowiednie
maszynki do strzyżenia włosówamazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAlub inne odpowiednie
stereotaktyczne instrumentStoeling51500lub inna odpowiednia
buprenorfinalub jakikolwiek odpowiedni sankcjonowany przez moją placówkę opieki nad zwierzętami
Meloxicamlub jakikolwiek odpowiedni sankcjonowany przez placówkę opieki nad zwierzętami
Tears Naturale P.M.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXElub inny odpowiedni
IsofluraneBaxter International IncDIN 02225875lub inny odpowiedni do znieczulenia:
Q-tips, waciki Cottomamazon.ca
Gaza bawełnianaFisher Scientific13-761-52
Igły 30 GBecton Dickinson305106Na kontuzje
Igły 25 GBecton Dickinson305122do wstrzykiwań leków
1 ml StrzykawkiBecton Dickinson3090659do wstrzykiwań z lekami
3 ml StrzykawkiBecton Dickinson309657do wstrzykiwań płynów
4-0 Szewuoftmedstore.com2297-VS881do szycia skóry
6-0 Szewuoftmedstore.comVS889do szycia mięśni
Maść Polysporinamazon.ca102051
Waporyzator IsofluraneVetEquip901806
15 ml probówki stożkoweThermoFisherDowolne odpowiednie
szalki PetriegoThermoFisherdowolna odpowiednia
Trypan BlueThermoFisherDowolna
hemocytometrThermoFisherDowolna
odpowiedniawirówkaThermoFisherWszelkie odpowiednie
standardowe narzędzia preparacyjneNarzędzia do nauki precyzyjnej Mikroskop
preparacyjnyZeissStemi 2000
Mikroskop zliczającyOlympusCKX41
Neural Basal-A MediumInvitrogen10888-022
B27Invitrogen17404-044
Penicylina- StreptomycynaGibco15070
L- GlutaminaGibco25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30% GlukozaSigmaG61521 M, 9,01 g w 100 ml dH2O
1 M Glukoza
7,5% NaHCO3SigmaS5761155 mM, 1,30 g w 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523,83 g w 100 ml dH2O
Apo-TransferrinR& D Systems3188-AT
Putrescyna SigmaP7505
InsulinaSigmaI5500
SelenSigmaS9133
ProgesteronSigmaP6149
System dysocjacji papainy Worthington Biochemical CorporationPDS1 fiolka papainy może być użyta do 2 próbek
Naskórkowy czynnik wzrostuInvitrogenPMG8041w proszku rozpuszczony w 1 ml mieszanki hormonalnej i podzielony na fiolki 20 μl do przechowywania w zamrażarce
Czynnik wzrostu fibroblastówInvitrogenPHG0226w proszku rozpuszczony w 0,5 ml mieszanki hormonów i podzielony na 20 μ Fiolki L do przechowywania w zamrażarce
HeparynaSigmaH3149
Czynnik hamujący białaczkęW domu
Hemocytometr
trypanowy niebieski
24-dołkowe płytkiNUNC
2 M NaClSigmaS588611,69 g w 100 ml dH2O
1 M KCLSigmaP54057,46 g w 100 ml dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320,33 g w 100 ml dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021,59 g w 100 ml dH2O
jakości https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki macierzysteobszar oko oiventrykularnyprymitywne neuronalne kom rki macierzystedefinitywne neuronalne kom rki macierzystesekcja tkanekhodowla kom rkowamodel chirurgicznykana centralny

Powiązane artykuły