Chociaż wiele owadów z podrzędu Heteroptera (Insecta: Hemiptera) jest jadowitych, ich skład jadu i funkcje toksyn jadowych są w większości nieznane. Protokół ten opisuje metody zbierania jadów heteropterów w celu dalszej charakterystyki, przy użyciu elektrostymulacji, nękania i sekcji gruczołów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Heteropterańskie owady, takie jak robaki zabójcze (Reduviidae) i gigantyczne pluskwiaki wodne (Belostomatidae) pochodzą od wspólnego drapieżnego i jadowitego przodka, a większość istniejących heteroptera zachowuje tę strategię troficzną. Niektóre heteropteranie przestawiły się na żywienie się krwią kręgowców (takie jak pluskwy całujące Triatominae i pluskwy Cimicidae), podczas gdy inne powróciły do żywienia się roślinami (większość Pentatomomorpha). Jednak z wyjątkiem śliny używanej przez całujące robaki w celu ułatwienia odżywiania krwią, niewiele wiadomo o jadach heteropterów w porównaniu z jadami pająków, skorpionów i węży.
Jedną z przeszkód w charakterystyce toksyn jadu heteroptera jest struktura i funkcja gruczołów jadowych/wargowych, które są morfologicznie złożone i pełnią wiele ról biologicznych (obrona, chwytanie zdobyczy i trawienie pozaustne). W tym artykule opisujemy trzy metody, które z powodzeniem zastosowaliśmy do zbierania jadów heteropterańskich. Po pierwsze, przedstawiamy elektrostymulację jako wygodny sposób zbierania jadu, który często jest śmiertelny po wstrzyknięciu zwierzętom drapieżnym i który zapobiega zanieczyszczeniu przez tkankę gruczołową. Po drugie, wykazujemy, że delikatne nękanie zwierząt jest wystarczające, aby spowodować wytłaczanie jadu z trąbki i/lub plucie jadem w niektórych grupach heteropterów. Po trzecie, opisujemy metody zbierania toksyn jadowych poprzez sekcję znieczulonych zwierząt w celu uzyskania gruczołów jadowych. Metoda ta jest komplementarna z innymi metodami, ponieważ może pozwolić na zbieranie toksyn z taksonów, w których elektrostymulacja i nękanie są nieskuteczne. Protokoły te umożliwią naukowcom zbieranie toksyn z owadów heteropterowych w celu scharakteryzowania struktury i funkcji oraz możliwych zastosowań w medycynie i rolnictwie.
Wprowadzenie
Jady heteroptera są silnie bioaktywnymi substancjami1. Na przykład wydzieliny jadu/śliny żywiących się krwią Heteroptera, takich jak pluskwy całujące (Triatominae) i pluskwy (Cimicidae), ułatwiają żerowanie, zakłócając hemostazę2. Toksyny w tych jadach działają na wiele szlaków, w tym krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych, a także szlaki bólu i swędzenia. Jady większości innych gatunków heteroptera są przystosowane do ułatwiania drapieżnictwa, a nie do odżywiania się krwią. Ich jady powodują paraliż, śmierć i upłynnienie tkanek po wstrzyknięciu do bezkręgowców3,4. Po wstrzyknięciu do kręgowców ich jad może mieć również drastyczne skutki. Na przykład wstrzyknięcie kręgowcom jadu z robaka zabójcy Holotrichius innesi powoduje ból, paraliż mięśni i krwotok; Myszy zatrute tym robakiem szybko umierają z powodu paraliżu oddechowego5.
Badania transkryptomiczne i proteomiczne ujawniły skład białkowy niektórych jadów heteropterańskich. Jady drapieżnych gatunków są bogate w proteazy, inne enzymy oraz peptydy i białka o nieznanej budowie i funkcji6,7,8. Jad pluskwiaka całującego jest bogaty w rodzinę białek triabin, których członkowie głęboko wpływają na krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych2,9. Nie wiadomo jednak, jakie toksyny leżą u podstaw większości bioaktywności jadu. Na przykład doniesiono, że jad pluskwiaka Triatoma infestans ma działanie przeciwbólowe i hamuje kanały sodowe10, ale odpowiedzialne za to składniki pozostają do wyjaśnienia. Podobnie nie wiadomo, jakie składniki jadu robaka zabójcy powodują paraliż lub ból. Warunkiem wstępnym do zidentyfikowania toksyn odpowiedzialnych za poszczególne bioaktywności jadu oraz do scharakteryzowania struktury i funkcji nowych toksyn jadowych jest uzyskanie jadu.
Venom został uzyskany z heteropteran metodą elektrostymulacji5,6,7,8,11,12,13, prowokacja reakcji obronnych4,8, mechanicznie ściskając Thorax12,14,15,16, preparowanie gruczołów jadowych8,17,18,19,xref"20,21,22 i zastosowanie agonistów receptora muskarynowego acetylocholiny23. Ocena potencjalnych zalet i wad każdej metody jest skomplikowana ze względu na morfologię gruczołów jadowych heteroptera, które składają się z gruczołu głównego z dwoma oddzielnymi światłami, gruczołu głównego przedniego (AMG) i gruczołu głównego tylnego (PMG), a także powiązanego gruczołu dodatkowego (AG). Te różne przedziały gruczołowe wytwarzają różne wydzieliny białkowe, które mogą być wyspecjalizowane w różnych funkcjach biologicznych, w tym chwytaniu zdobyczy, obronie i trawieniu pozaustnym8,17. U robaków zabójców peiratyny i ektrychodyny AMG jest związany z chwytaniem zdobyczy, a PMG z trawieniem pozaustnym17. Jednak u pluskwiaka harfaktorycznego Pristhesancus plagipennis PMG specjalizuje się w chwytaniu i trawieniu zdobyczy, podczas gdy przypuszcza się, że AMG wydziela jad obronny8. AG został opisany jako pełniący niewielką funkcję sekrecji w Assassin bugs8 lub jako główne miejsce przechowywania proteaz w gigantycznych pluskwach wodnych23. Oczywiste jest, że potrzebne są dalsze prace w celu wyjaśnienia funkcji każdego przedziału gruczołu w różnych podgrupach heteropterów oraz określenia funkcji większości toksyn jadowych. W tym raporcie opisujemy protokoły zbierania toksyn jadowych od heteropterów w tym celu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z polityką Uniwersytetu Queensland określoną w Responsible Care and Use of Animals in Teaching and Research (PPL 4.20.11), a także australijskim kodeksem National Health and Medical Research Council dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (8th Edition 2013).
Uwaga: Uważaj, aby nie dać się zatruć podczas obsługi robaków zabójców. Zadbaj o ochronę oczu podczas pracy z gatunkami plującymi jadem w sposób defensywny. Przez cały czas należy uważać, aby nie zranić zwierząt doświadczalnych. Obejmuje to monitorowanie nacisku na urządzenia ograniczające, takie jak gumki recepturki, oraz upewnienie się, że trąba nie jest uszkodzona.
UWAGA: Opcjonalnie, znieczulaj zwierzęta poprzez wystawienie na działanie CO2 przez 0,5-2 min lub schłodzenie do 4-10 °C przed zbiorem jadu w celach 1-3, aby ułatwić bezpieczne przenoszenie i krępowanie. Znieczulenie nie jest bezwzględnie wymagane, ale może ułatwić bezpieczne unieruchomienie zwinnych lub silnych próbek. Jednak zwierzęta muszą być przytomne, aby umożliwić zbieranie jadu. Należy pamiętać o dalszych zastosowaniach przy podejmowaniu decyzji o dodaniu inhibitorów proteazy.
1. Zbieranie toksyn jadowych za pomocą elektrostymulacji
- Zdobądź żywe okazy, z których możesz zebrać toksyny.
- Użyj wstępnie przygotowanej plastikowej pęsety z elektrodami dodatnimi i ujemnymi zamontowanymi na obu końcówkach. Podłącz pęsetę pod napięciem do elektrostymulatora lub źródła stałego napięcia, które umożliwia regulację napięcia.
- W przypadku małych (~10 mm) i dużych (~25 mm) owadów zabójców należy użyć napięć szczytowych odpowiednio 15 i 25 V.
- W przypadku większych heteropterów, takich jak gigantyczne pluskwiaki wodne, użyj do 40 V.
- Powstrzymaj żywe owady, przypinając je do platformy, używając gumki na klatce piersiowej.
- Umieść końcówkę trąbki w odpowiedniej końcówce zbierającej. W przypadku błędów zabójcy użyj końcówki do pipety P200. W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych odetnij koniec końcówki P200, aby zwiększyć rozmiar otworu.
- Delikatnie podnieś trąbkę za pomocą zamkniętej pary czystej pęsety i wepchnij otwarty otwór końcówki zbierającej na koniec trąbki.
- W razie potrzeby pobierz ~5 μl ultraczystej wody przed umieszczeniem trąbki w końcówce zbierającej. Zmniejsza to straty jadu pozostającego wewnątrz końcówki, chociaż zebrany jad zostanie rozcieńczony.
- Zastosuj elektrostymulację. Zanurz elektrody stymulujące w żelu przewodzącym, takim jak 2,5 M NaCl/50% glicerol. Przyłóż elektrody do klatki piersiowej. W przypadku belostomatydów należy przyłożyć dwie elektrody do grzbietowej tylnej powierzchni głowy.
- Przechowuj jad, aby zapobiec autodegradacji. Po wyciśnięciu jadu należy go szybko przenieść do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.
- Powtarzać kroki 1.5 i 1.6 do momentu, gdy pojawi się wystarczająca ilość jadu lub nie pojawi się dalszy jad.
2. Zbieranie toksyn jadu przez nękanie
- Przygotować zwierzęta do zbioru jadu i umieścić końcówkę trąbki w przedsionku do zbierania, jak opisano w podrozdziałach 1.1 i 1.3-1.4.
- Jeśli jad jest wytłaczany spontanicznie, przejdź do kroku 2.3. Jeśli nie, nękaj zwierzęta, delikatnie dotykając nimi pęsetą nóg, brzucha i czułków, aż do wytworzenia jadu.
- Szybko przenieś jad do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy, jeśli jest to pożądane.
3. Zbieranie toksyn jadu poprzez nękanie przez gatunki "plujące" jadem
- Znieczulić lub częściowo znieczulić owada przed wyjęciem go z pomieszczenia, aby zapobiec przedwczesnemu pluciu obronnemu.
- Sprowokuj plucie jadem. Zatrzymać owada i zmienić jego położenie za pomocą głębokiej pokrywy standardowej szalki Petriego o wymiarach 90 x 16 mm. Trzymaj pokrywę nieco z tyłu i 1-4 cm nad owadem, aby zapobiec ucieczce. Większość owadów pluje kilka razy, często w krótkich odstępach czasu. Upewnij się, że cały jad zebrał się na spodzie naczynia.
- Zebrać jad na spodniej stronie szalki Petriego, spłukując ją 10 μl ultraczystej wody. Szybko przenieś go do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.
4. Zbieranie toksyn jadowych poprzez rozwarstwienie gruczołów
- Składaj ofiary ze zwierząt. Silnie znieczulać lub zabijać zwierzęta, stosując >5 minutową ekspozycję na CO2 . Doprowadzać czysty CO2 bezpośrednio do otworów wentylacyjnych w pomieszczeniu dla zwierząt.
- Przypnij owada do tacki preparcyjnej. W przypadku robaków zabójców, przeprowadź sekcję przez powierzchnię brzuszną (4.3). W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych należy przeprowadzić sekcję przez powierzchnię grzbietową (4.4).
- Rozwarstwienie brzuszne
- Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.
- Wytnij krótkie nacięcie w linii środkowej na brzusznej powierzchni brzucha za pomocą miniaturowego skalpela. Użyj miniaturowych nożyczek, aby przedłużyć nacięcie linii środkowej do przodu do głowy, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.
- Aby odsłonić struktury wewnętrzne, wykonaj wiele bocznych nacięć rozciągających się od nacięcia w linii środkowej do boku owada. Następnie przypnij z powrotem każdy płat brzusznego egzoszkieletu, aby odsłonić struktury wewnętrzne.
- W przypadku dużych robaków zabójców wykonaj cztery boczne nacięcia, w środkowej części brzucha, w przedniej części brzucha, między pierwszą a drugą nogą oraz przed pierwszą nogą.
- Rozwarstwienie grzbietowe
- Usuń skrzydła w pobliżu podstawy. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.
- Wytnij nacięcie w linii środkowej od głowy do brzucha za pomocą miniaturowych nożyczek i skalpela, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.
- Rozsuń dwie połówki owada. Umieść kilka szpilek z boku wzdłuż owada, aby pozostawić odsłoniętą wewnętrzną jamę.
- Usuń mięśnie lotu za pomocą pęsety.
- Zalej tacę sekcyjną. Dodawaj PBS, dopóki błąd nie zostanie zanurzony, aby umożliwić wewnętrzne struktury unoszenia się w górę i łatwiejszej wizualizacji.
- Za pomocą pęsety i mikronożyczek ostrożnie usuń tkankę łączną i nerwową oraz tchawicę. Gruczoły jadowe wyglądają jak wydłużone, półprzezroczyste struktury rozciągające się po obu stronach przewodu pokarmowego.
- Zidentyfikuj główny gruczoł po jego charakterystycznym wyglądzie, z przednimi i tylnymi płatami oraz dwoma przewodami spotykającymi się na wnęce.
- W razie potrzeby zidentyfikuj dławik dodatkowy, śledząc kanał od wnęki. Uwolnij główny dławnicę, przecinając dwa kanały wychodzące z wnęki.
- Zbierz pożądane lumeny gruczołów. Przenieść gruczoł do mikrowirówki na lodzie zawierającej 30 μl PBS lub PBS plus koktajl inhibitorów proteazy. Nakłuć gruczoły czystym, ostrym szpilką.
- Wirować przez 10 s i odwirować (1 min, 5 000 × g, 4 °C) w celu opróżnienia światła gruczołu. Usuń tkankę gruczołową za pomocą pęsety.
- Sklaruj ekstrakt z toksyny. Odwirować (5 min, 17 000 × g, 4°C) w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych, zachowując supernatant i odrzucając osad. Przechowywać w temperaturze -20°C lub -60°C, aby zapobiec degradacji autoproteolitycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niektóre gatunki pluskwiaków z podrzędu Heteroptera, takie jak harpactorine P. plagipennis oraz reduviine Platymeris rhadamanthus, wiarygodnie dostarczają dużych ilości (5-20 µL) jadu w odpowiedzi na elektrostymulację (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, większość pluskwiaków z podrodzin Peiratinae, Reduviinae i Harpactorinae wydziela jad przy zastosowaniu tej metody. Wśród pluskwiaków z podrodziny Stenopodainae, elektrostymulacja wywołała wydzielanie jadu ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem w zbieraniu jadu robaka zabójcy jest wybór odpowiedniej metody w zależności od celów badania. Każda z trzech przedstawionych metod zbierania jadów heteroptera ma zalety i wady w zależności od dalszych zastosowań.
Indukowanie owadów do wydalania jadu z trąbki (Protokoły 1-3) pozwala uniknąć zanieczyszczenia jadu przez tkanki gruczołowe. Ponadto metody te nie są śmiertelne i mogą być powtarzane wiele razy w ciągu życia owada. Elektrostymulacja zwykle dostarcza największe i...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy za wsparcie finansowe od Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (Granty DP130103813 i LP140100832 dla G.F.K., stypendium DECRA DE160101142 dla EABU), Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Główne Stypendium Badawcze APP1044414 dla G.F.K.) oraz University of Queensland (Stypendium podoktorskie dla A.A.W.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Elektrostymulator | Grass Technologies | S48 Kwadratowy stymulator impulsów | Elektrostymulator umożliwiający pulsacyjną elektrostymulację |
| Lekka jak piórko pęseta | Australijskie materiały entomologiczne | E122B | Do obchodzenia się z żywymi jadowitymi owadami |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Sigma | 4693124001 | Do zapobiegania autoproteolitycznemu trawieniu jadu |
| Rozwarstwienie sprzęt | Australijskie Materiały Entomologiczne | E152Micro | Do drobnych sekcji |
| Szpilki do owadów Australijskie | Materiały Entomologiczne | E162 | Do drobnych sekcji |
Bibliografia
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43(2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755(2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44(2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
