Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Jady heteroptera są silnie bioaktywnymi substancjami¹. Na przykład wydzieliny jadu/śliny żywiących się krwią Heteroptera, takich jak pluskwy całujące (Triatominae) i pluskwy (Cimicidae), ułatwiają żerowanie, zakłócając hemostazę². Toksyny w tych jadach działają na wiele szlaków, w tym krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych, a także szlaki bólu i swędzenia. Jady większości innych gatunków heteroptera są przystosowane do ułatwiania drapieżnictwa, a nie do odżywiania się krwią. Ich jady powodują paraliż, śmierć i upłynnienie tkanek po wstrzyknięciu do bezkręgowców^3,4. Po wstrzyknięciu do kręgowców ich jad może mieć również drastyczne skutki. Na przykład wstrzyknięcie kręgowcom jadu z robaka zabójcy Holotrichius innesi powoduje ból, paraliż mięśni i krwotok; Myszy zatrute tym robakiem szybko umierają z powodu paraliżu oddechowego⁵.

Badania transkryptomiczne i proteomiczne ujawniły skład białkowy niektórych jadów heteropterańskich. Jady drapieżnych gatunków są bogate w proteazy, inne enzymy oraz peptydy i białka o nieznanej budowie i funkcji^6,7,8. Jad pluskwiaka całującego jest bogaty w rodzinę białek triabin, których członkowie głęboko wpływają na krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych^2,9. Nie wiadomo jednak, jakie toksyny leżą u podstaw większości bioaktywności jadu. Na przykład doniesiono, że jad pluskwiaka Triatoma infestans ma działanie przeciwbólowe i hamuje kanały sodowe¹⁰, ale odpowiedzialne za to składniki pozostają do wyjaśnienia. Podobnie nie wiadomo, jakie składniki jadu robaka zabójcy powodują paraliż lub ból. Warunkiem wstępnym do zidentyfikowania toksyn odpowiedzialnych za poszczególne bioaktywności jadu oraz do scharakteryzowania struktury i funkcji nowych toksyn jadowych jest uzyskanie jadu.

Venom został uzyskany z heteropteran metodą elektrostymulacji^5,6,7^,8,11,12,13, prowokacja reakcji obronnych^4,8, mechanicznie ściskając Thorax^12,14,15,16, preparowanie gruczołów jadowych8^{,17,18,19,xref"20,21,22} i zastosowanie agonistów receptora muskarynowego acetylocholiny23. Ocena potencjalnych zalet i wad każdej metody jest skomplikowana ze względu na morfologię gruczołów jadowych heteroptera, które składają się z gruczołu głównego z dwoma oddzielnymi światłami, gruczołu głównego przedniego (AMG) i gruczołu głównego tylnego (PMG), a także powiązanego gruczołu dodatkowego (AG). Te różne przedziały gruczołowe wytwarzają różne wydzieliny białkowe, które mogą być wyspecjalizowane w różnych funkcjach biologicznych, w tym chwytaniu zdobyczy, obronie i trawieniu pozaustnym^8,17. U robaków zabójców peiratyny i ektrychodyny AMG jest związany z chwytaniem zdobyczy, a PMG z trawieniem pozaustnym¹⁷. Jednak u pluskwiaka harfaktorycznego Pristhesancus plagipennis PMG specjalizuje się w chwytaniu i trawieniu zdobyczy, podczas gdy przypuszcza się, że AMG wydziela jad obronny⁸. AG został opisany jako pełniący niewielką funkcję sekrecji w Assassin bugs⁸ lub jako główne miejsce przechowywania proteaz w gigantycznych pluskwach wodnych²³. Oczywiste jest, że potrzebne są dalsze prace w celu wyjaśnienia funkcji każdego przedziału gruczołu w różnych podgrupach heteropterów oraz określenia funkcji większości toksyn jadowych. W tym raporcie opisujemy protokoły zbierania toksyn jadowych od heteropterów w tym celu.

Ten protokół jest zgodny z polityką Uniwersytetu Queensland określoną w Responsible Care and Use of Animals in Teaching and Research (PPL 4.20.11), a także australijskim kodeksem National Health and Medical Research Council dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (8^th Edition 2013).

Uwaga: Uważaj, aby nie dać się zatruć podczas obsługi robaków zabójców. Zadbaj o ochronę oczu podczas pracy z gatunkami plującymi jadem w sposób defensywny. Przez cały czas należy uważać, aby nie zranić zwierząt doświadczalnych. Obejmuje to monitorowanie nacisku na urządzenia ograniczające, takie jak gumki recepturki, oraz upewnienie się, że trąba nie jest uszkodzona.

UWAGA: Opcjonalnie, znieczulaj zwierzęta poprzez wystawienie na działanie CO₂ przez 0,5-2 min lub schłodzenie do 4-10 °C przed zbiorem jadu w celach 1-3, aby ułatwić bezpieczne przenoszenie i krępowanie. Znieczulenie nie jest bezwzględnie wymagane, ale może ułatwić bezpieczne unieruchomienie zwinnych lub silnych próbek. Jednak zwierzęta muszą być przytomne, aby umożliwić zbieranie jadu. Należy pamiętać o dalszych zastosowaniach przy podejmowaniu decyzji o dodaniu inhibitorów proteazy.

1. Zbieranie toksyn jadowych za pomocą elektrostymulacji

1. Zdobądź żywe okazy, z których możesz zebrać toksyny.
2. Użyj wstępnie przygotowanej plastikowej pęsety z elektrodami dodatnimi i ujemnymi zamontowanymi na obu końcówkach. Podłącz pęsetę pod napięciem do elektrostymulatora lub źródła stałego napięcia, które umożliwia regulację napięcia.
   1. W przypadku małych (~10 mm) i dużych (~25 mm) owadów zabójców należy użyć napięć szczytowych odpowiednio 15 i 25 V.
   2. W przypadku większych heteropterów, takich jak gigantyczne pluskwiaki wodne, użyj do 40 V.
3. Powstrzymaj żywe owady, przypinając je do platformy, używając gumki na klatce piersiowej.
4. Umieść końcówkę trąbki w odpowiedniej końcówce zbierającej. W przypadku błędów zabójcy użyj końcówki do pipety P200. W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych odetnij koniec końcówki P200, aby zwiększyć rozmiar otworu.
   1. Delikatnie podnieś trąbkę za pomocą zamkniętej pary czystej pęsety i wepchnij otwarty otwór końcówki zbierającej na koniec trąbki.
   2. W razie potrzeby pobierz ~5 μl ultraczystej wody przed umieszczeniem trąbki w końcówce zbierającej. Zmniejsza to straty jadu pozostającego wewnątrz końcówki, chociaż zebrany jad zostanie rozcieńczony.
5. Zastosuj elektrostymulację. Zanurz elektrody stymulujące w żelu przewodzącym, takim jak 2,5 M NaCl/50% glicerol. Przyłóż elektrody do klatki piersiowej. W przypadku belostomatydów należy przyłożyć dwie elektrody do grzbietowej tylnej powierzchni głowy.
6. Przechowuj jad, aby zapobiec autodegradacji. Po wyciśnięciu jadu należy go szybko przenieść do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.
7. Powtarzać kroki 1.5 i 1.6 do momentu, gdy pojawi się wystarczająca ilość jadu lub nie pojawi się dalszy jad.

2. Zbieranie toksyn jadu przez nękanie

1. Przygotować zwierzęta do zbioru jadu i umieścić końcówkę trąbki w przedsionku do zbierania, jak opisano w podrozdziałach 1.1 i 1.3-1.4.
2. Jeśli jad jest wytłaczany spontanicznie, przejdź do kroku 2.3. Jeśli nie, nękaj zwierzęta, delikatnie dotykając nimi pęsetą nóg, brzucha i czułków, aż do wytworzenia jadu.
3. Szybko przenieś jad do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy, jeśli jest to pożądane.

3. Zbieranie toksyn jadu poprzez nękanie przez gatunki "plujące" jadem

1. Znieczulić lub częściowo znieczulić owada przed wyjęciem go z pomieszczenia, aby zapobiec przedwczesnemu pluciu obronnemu.
2. Sprowokuj plucie jadem. Zatrzymać owada i zmienić jego położenie za pomocą głębokiej pokrywy standardowej szalki Petriego o wymiarach 90 x 16 mm. Trzymaj pokrywę nieco z tyłu i 1-4 cm nad owadem, aby zapobiec ucieczce. Większość owadów pluje kilka razy, często w krótkich odstępach czasu. Upewnij się, że cały jad zebrał się na spodzie naczynia.
3. Zebrać jad na spodniej stronie szalki Petriego, spłukując ją 10 μl ultraczystej wody. Szybko przenieś go do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.

4. Zbieranie toksyn jadowych poprzez rozwarstwienie gruczołów

1. Składaj ofiary ze zwierząt. Silnie znieczulać lub zabijać zwierzęta, stosując >5 minutową ekspozycję na CO₂ . Doprowadzać czysty CO₂ bezpośrednio do otworów wentylacyjnych w pomieszczeniu dla zwierząt.
2. Przypnij owada do tacki preparcyjnej. W przypadku robaków zabójców, przeprowadź sekcję przez powierzchnię brzuszną (4.3). W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych należy przeprowadzić sekcję przez powierzchnię grzbietową (4.4).
3. Rozwarstwienie brzuszne
   1. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.
   2. Wytnij krótkie nacięcie w linii środkowej na brzusznej powierzchni brzucha za pomocą miniaturowego skalpela. Użyj miniaturowych nożyczek, aby przedłużyć nacięcie linii środkowej do przodu do głowy, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.
   3. Aby odsłonić struktury wewnętrzne, wykonaj wiele bocznych nacięć rozciągających się od nacięcia w linii środkowej do boku owada. Następnie przypnij z powrotem każdy płat brzusznego egzoszkieletu, aby odsłonić struktury wewnętrzne.
   4. W przypadku dużych robaków zabójców wykonaj cztery boczne nacięcia, w środkowej części brzucha, w przedniej części brzucha, między pierwszą a drugą nogą oraz przed pierwszą nogą.
4. Rozwarstwienie grzbietowe
   1. Usuń skrzydła w pobliżu podstawy. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.
   2. Wytnij nacięcie w linii środkowej od głowy do brzucha za pomocą miniaturowych nożyczek i skalpela, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.
   3. Rozsuń dwie połówki owada. Umieść kilka szpilek z boku wzdłuż owada, aby pozostawić odsłoniętą wewnętrzną jamę.
   4. Usuń mięśnie lotu za pomocą pęsety.
5. Zalej tacę sekcyjną. Dodawaj PBS, dopóki błąd nie zostanie zanurzony, aby umożliwić wewnętrzne struktury unoszenia się w górę i łatwiejszej wizualizacji.
6. Za pomocą pęsety i mikronożyczek ostrożnie usuń tkankę łączną i nerwową oraz tchawicę. Gruczoły jadowe wyglądają jak wydłużone, półprzezroczyste struktury rozciągające się po obu stronach przewodu pokarmowego.
   1. Zidentyfikuj główny gruczoł po jego charakterystycznym wyglądzie, z przednimi i tylnymi płatami oraz dwoma przewodami spotykającymi się na wnęce.
   2. W razie potrzeby zidentyfikuj dławik dodatkowy, śledząc kanał od wnęki. Uwolnij główny dławnicę, przecinając dwa kanały wychodzące z wnęki.
7. Zbierz pożądane lumeny gruczołów. Przenieść gruczoł do mikrowirówki na lodzie zawierającej 30 μl PBS lub PBS plus koktajl inhibitorów proteazy. Nakłuć gruczoły czystym, ostrym szpilką.
   1. Wirować przez 10 s i odwirować (1 min, 5 000 × g, 4 °C) w celu opróżnienia światła gruczołu. Usuń tkankę gruczołową za pomocą pęsety.
8. Sklaruj ekstrakt z toksyny. Odwirować (5 min, 17 000 × g, 4°C) w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych, zachowując supernatant i odrzucając osad. Przechowywać w temperaturze -20°C lub -60°C, aby zapobiec degradacji autoproteolitycznej.

Niektóre gatunki heteropterańskie, takie jak harfaktoryna P. plagipennis i reduviine Platymeris rhadamanthus, niezawodnie wytwarzają duże ilości (5-20 μL) jadu w odpowiedzi na elektrostymulację (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, większość pluskwiaków peiratynowych, reduwiinowych i harfaktorycznych wytwarza jad w odpowiedzi na tę metodę. Wśród pluskwiaków stenopodaine elektrostymulacja wywoływała jad z Oncocephalus sp., ale nie z Thodelmus sp. Pobrane próbki holoptyliny i bakterii emezynowych nie dały znaczącego jadu (np. wystarczającego do analizy za pomocą spektrometrii mas) w odpowiedzi na elektrostymulację. Elektrostymulacja może być również stosowana do zbierania jadu z pluskwiaków belostomatydowych i drapieżnych pluskwiaków śmierdzących. Jednak elektrostymulacja skorpionów wodnych (Nepidae) indukowała uwalnianie tylko zawartości gruczołów głowowych, a nie jadu z trąbki. Niepowodzenie w zbieraniu jadu za pomocą elektrostymulacji u niektórych gatunków jest najprawdopodobniej spowodowane morfologiczną złożonością gruczołów jadowych i fizjologicznymi mechanizmami kontrolującymi uwalnianie jadu8.

Oprócz uwalniania jadu w wyniku elektrostymulacji, reduviidy P. plagipennis, Havinthus rufovarius, P. rhadamanthus i belostomatid Lethocerus distinctifemur, spontanicznie wyrzucają jad z trąbki podczas obchodzenia się z nim. Takiemu wyrzucaniu jadu często towarzyszą pokazy obronne. P. rhadamanthus również pluje jadem defensywnie4, zachowanie, które występuje u snakes24 i spiders25, ale którego nie jesteśmy świadomi u żadnego innego gatunku reduviid.

SDS-PAGE i eksperymenty proteomiczne pokazują, że jady zebrane przez elektrostymulację i nękanie są bogate w białko6,7,8. Białka stanowią dużą część obecnego materiału, choć jest również prawdopodobne, że jady zawierają jony nieorganiczne i inne substancje. Jad owada owada zabójcy uzyskany przez elektrostymulację i nękanie zazwyczaj zawiera ponad sto peptydów i białek (Rysunek 1, Rysunek 2). Wcześniej informowano, że jad bielostomatyda jest bogaty w lizofosfolipidy13. Widma absorpcji w podczerwieni jadu belostomatyny wodnej Diplonychus eques są zgodne z zawartością zarówno białek, jak i lizofosfolipidów. W przypadku letocheryny L. distinctifemur znaleziono dane tylko dla białka, a nie lizofosfolipidów6.

Jak podano dla jadów pająków26, jad zebrany z owadów heteroptera może różnić się pod względem stężenia i składu, w zależności od użytego owada i metody, za pomocą której jest zbierany. Spektroskopia UV rozcieńczonych próbek jadu sugeruje wartości absorbancji (A280) 50-250 (długość ścieżki 10 mm) dla nierozcieńczonego jadu, zgodne z wysokim stężeniem białka ~50-250 mg/mL7,12,19. Doniesiono, że deprywacja ofiar powoduje sukcesywny wzrost stężenia jadu i potencjału paraliżu3, a także kolejne spadki pH27. Jednak długotrwałe głodzenie spowoduje utratę kondycji i śmierć. Oprócz stężenia, na jego skład może wpływać metoda zbierania jadu z heteropterów. Skład toksyny jadu robaka zabójcy P. plagipennis różnił się znacznie w zależności od tego, czy został on zebrany przez elektrostymulację, czy nękanie8. W przypadku P. plagipennis wykazano, że jest to spowodowane elektrostymulacją, która doprowadziła do uzyskania zawartości PMG, podczas gdy nękanie doprowadziło do uzyskania zawartości AMG. Jad uzyskany przez elektrostymulację, ale nie nękanie, silnie sparaliżował owady drapieżne (Ryc. 3). Nie jest jednak jasne, w jakim stopniu wynik ten można uogólnić na inne Reduviidae lub inne Heteroptera.

Bezpośrednie zbieranie jadu poprzez preparowanie gruczołów jadowych pozwala na obejście mechanizmów kontroli gruczołów jadowych, kosztem zanieczyszczenia białkami tkanki gruczołowej (niejadowej). Niezależnie od tego, ekstrakty uzyskane z wypreparowanego materiału mogą być używane do oznaczania bioaktywności/toksyczności. Na przykład, ekstrakty PMG, AMG i AG P. plagipennis, przygotowane przy użyciu powyższego protokołu, analizowano przy użyciu chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas8. Proces ten zidentyfikował w sumie 182, 114 i 71 białek, z których 45, 51 i 12 sklasyfikowano jako domniemane białka jadu na podstawie charakterystyki sekwencji aminokwasów, a pozostałe białka sklasyfikowano jako domniemane białka porządkowe. Wstrzyknięcie ekstraktów PMG, ale nie AMG lub AG, do owadów skutkowało paraliżem i śmiercią8.

Tabela 1: Specyfika taksonowa metod stosowanych do zbierania jadu od heteropterów.

Rysunek 1: Białka wykryte przez analizę LC-MS/MS plam 2D SDS-PAGE i frakcji HPLC jadu pobranego z P. plagipennis przez elektrostymulację (Protokół 1), wykazujące obfite proteazy, białka domeny CUB i heteropterańskie białka rodziny Venom 1. (A) Żel 2D SDS-PAGE z surowego P. plagipennis jad, wykazujący rodziny białek zidentyfikowane przez LC-MS / MS plamek żelowych. (B) Chromatogram HPLC z frakcjonowania jadu P. plagipennis, przedstawiający rodziny białek zidentyfikowane za pomocą analizy LC-MS/MS pobranych frakcji. Powielane za zgodą7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proporcja sekwencji należących do każdej głównej klasy białek w jadzie P. plagipennis. Powielane za zgodą7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Jad P. plagipennis uzyskany przez elektrostymulację, ale nie nękanie, paraliżuje owady. (A) Wpływ wstrzyknięcia jadu uzyskanego przez elektrostymulację, nękanie lub wodę, na ucieczkę świerszczy. Dla każdego stanu jadu wstrzyknięto 0,17 μl ekwiwalentu jadu do jamy brzusznej i oceniono czas ucieczki z odwróconej pokrywy szalki Petriego (w s, do 300 s, średnia ± SD). (B) Krzywa dawka-odpowiedź dla zahamowania powodzenia ucieczki przez jad uzyskany z P. plagipennis przez elektrostymulację. Powielane za zgodą8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.