Otrzymywanie krzemionki funkcjonalnej metodą inspirowaną biologicznie

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół syntezy bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i immobilizacji enzymów w nich. Krzemionka jest syntetyzowana przez połączenie krzemianu sodu i "dodatku" aminowego, które neutralizują się w kontrolowanym tempie. Właściwości i funkcję materiału można zmienić poprzez immobilizację enzymatyczną in situ lub postsyntetyczne elucję kwasową zamkniętych dodatków.

Streszczenie

Celem opisanych tutaj protokołów jest synteza bioinspirowanych materiałów krzemionkowych, przeprowadzenie w nich enkapsulacji enzymów i częściowe lub całkowite ich oczyszczenie przez elucję kwasów. Łącząc krzemian sodu z wielofunkcyjnym dodatkiem inspirowanym biologicznie, krzemionka szybko tworzy się w warunkach otoczenia po neutralizacji.

Badany jest wpływ szybkości neutralizacji i punktu dodawania biomolekuł na wydajność krzemionki, a efektywność immobilizacji biomolekuł jest podawana dla różnych punktów dodawania. W przeciwieństwie do innych metod syntezy porowatej krzemionki, wykazano, że łagodne warunki wymagane do syntezy krzemionki inspirowanej biologicznie są w pełni kompatybilne z enkapsulacją delikatnych biomolekuł. Dodatkowo, łagodne warunki są stosowane na wszystkich etapach syntezy i modyfikacji, co sprawia, że krzemionka inspirowana biologicznie jest obiecującym celem do zwiększenia skali i komercjalizacji zarówno jako surowy materiał, jak i aktywne podłoże nośne.

Wykazano, że synteza jest bardzo wrażliwa na warunki, tj. szybkość neutralizacji i końcowe pH syntezy, jednak ścisła kontrola nad tymi parametrami jest wykazywana poprzez użycie metod automatycznego miareczkowania, co prowadzi do wysokiej powtarzalności ścieżki progresji reakcji i wydajności.

Dlatego też bioinspirowana krzemionka jest doskonałym wyborem dla aktywnego materiału pomocniczego, wykazując wszechstronność w wielu obecnych zastosowaniach, nie ograniczając się do tych pokazanych tutaj, oraz moc w przyszłych zastosowaniach.

Wprowadzenie

Wykorzystanie krzemionki jako strukturalnego wsparcia dla katalizatorów przemysłowych jest dobrze ugruntowane, co pozwala na poprawę aktywności katalizatora, stabilności i przetwarzalności,¹ potencjalnie zmniejszając koszty operacyjne. Korzyści te są spotęgowane w przypadku immobilizacji enzymu, ponieważ przechowywanie w systemie porów krzemionki może przynieść znaczące korzyści w czasie życia enzymu w porównaniu z jego wolnym odpowiednikiem. W związku z tym włożono wiele wysiłku w znalezienie najlepszej metody przyłączania enzymów do gatunków krzemionki, z wieloma przeglądami porównującymi badania przy użyciu różnych metod immobilizacji na krzemionkowych podłogach stałych. ^2,3,4

Enzymy są zazwyczaj łączone za pomocą fizsorpcji lub wiązania kowalencyjnego, oprócz enkapsulacji w porowatym materiale. ⁵ Istnieją jednak istotne wady związane z każdą metodą: fizsorpcja opiera się na przejściowych oddziaływaniach powierzchniowych między krzemionką a biomolekułą, które mogą być bardzo łatwo osłabione przez warunki reakcji prowadzące do niedopuszczalnego wymywania enzymu. Znacznie silniejsze przywiązanie kowalencyjne zwykle skutkuje niższą aktywnością ze względu na zmniejszoną swobodę konformacyjną gatunków aktywnych. Enkapsulacja może powodować zmniejszenie aktywności z powodu niedostępności enzymu lub ograniczeń dyfuzyjnych. ⁶

Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie łagodniejszych (często nazywanych 'bioinspirowanymi') syntez krzemionki ustaliły enkapsulację in situ biomolekuł i innych aktywnych gatunków podczas syntezy materiału. ^7,8,9 Ta metoda neguje wiele wad konwencjonalnej immobilizacji - w przeciwieństwie do podejść chemisorpcyjnych, swoboda konformacyjna biomolekuły jest utrzymywana dzięki zastosowaniu słabszych oddziaływań niekowalencyjnych, ale ponieważ wokół biomolekuły tworzy się jama porowa, nadal zapobiega się wypłukiwaniu. Rzeczywiście, wykazano, że enkapsulacja działa w przypadku szeregu biomolekuł, a nawet całych komórek, ¹⁰, a dzięki enkapsulacji w bioinspirowanej krzemionce można uniknąć efektów, takich jak dezaktywacja z powodu trudnych warunków procesu. ^7,11

Celem opisanej tutaj metody jest przygotowanie porowatej krzemionki o kontrolowanych właściwościach, w warunkach otoczenia, przy użyciu bioinspirowanego dodatku organicznego. Metodę tę można łatwo zmodyfikować tak, aby obejmowała kapsułkowanie cząsteczek nieorganicznych lub bioorganicznych, z których wybrane powinny być przedstawione. Ponadto pokazujemy łatwą metodę modyfikacji zsyntetyzowanych materiałów w celu uzyskania pożądanych właściwości objętościowych i oczyszczania poprzez usunięcie matrycy organicznej poprzez elucję kwasów.

W porównaniu do tradycyjnej syntezy szablonowych porowatych nośników krzemionkowych (np. materiałów krzemionkowych szablonowanych za pomocą supramolekularnych zespołów surfaktantów, takich jak MCM-41 lub SBA-15)¹² ta metoda jest znacznie szybsza i łagodniejsza, umożliwiając dostosowaną do potrzeb enkapsulację in situ bez potrzeby licznych etapów immobilizacji i pracochłonnego oczyszczania. Co więcej, zastosowanie elucji kwasowej zamiast kalcynacji otwiera możliwość funkcjonalnej powierzchni organicznej.

Ta metoda jest wysoce przydatna dla osób pracujących nad aktywną immobilizacją gatunków, którzy stwierdzili, że fizysorpcja lub kowalencyjna immobilizacja są nieskuteczne. Jest to również przydatne dla osób prowadzących badania nad zwiększeniem skali procesu, ponieważ synteza inspirowana biologicznie ma wyjątkową pozycję do uprzemysłowienia w porównaniu z konwencjonalnymi materiałami krzemionkowymi typu templated. ^13,14 Ta metoda nie jest zalecana do zastosowań, które wymagają uporządkowanego układu porów w materiale, np. dla fotoniki, ponieważ struktura materiału jest nieuporządkowana pomimo jakiegokolwiek podobieństwa właściwości masowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów prekursorowych (i opcjonalnych roztworów enkapsulantów)

1. Do plastikowego pojemnika o pojemności 180 ml odmierz 1,5 mmol pięciowodnego krzemianu sodu (318,2 mg) i rozpuść w 20 ml wody dejonizowanej.
2. Podobnie w drugim pojemniku odmierz 0,25 mmol heksaminy pentaetylenowej (PEHA, 58,1 mg) i rozpuść w 20 ml wody dejonizowanej.
   1. W przypadku stosowania alternatywnych związków zawierających aminy, np. dietylenotriaminy (DETA) lub trietylenotetraaminy (TETA), należy upewnić się, że całkowity stosunek molowy Si:N pozostaje stały na poziomie 1 (tj. odpowiadającym 0,5 mmol DETA lub 0,375 mmol TETA w opisanej procedurze)¹⁵.
   2. W przypadku stosowania dodatków amin polimerowych, np. poli(etyleniminy) (PEI) lub poli(chlorowodorku alliloaminy) (WWA), należy utrzymać stężenie 1 mg/ml (końcowa objętość reakcji)¹⁵.
      UWAGA: Z tymi aminami należy obchodzić się tylko wewnątrz dygestoria, ponieważ są one lub toksyczne w czystej postaci (zwłaszcza w postaci oparów).
3. Aby przeprowadzić enkapsulację in situ podczas syntezy, rozpuść wcześniej określoną masę białka (w tym przypadku 50 mg albuminy surowicy bydlęcej, BSA) w 5 ml wody dejonizowanej. Odejmij tę ilość wody od objętości wody dejonizowanej, która ma być użyta do rozpuszczenia pentahydratu krzemianu sodu.
   1. Aby ułatwić rozpuszczanie białka bez zmiany jego struktury, po zmieszaniu z wodą dejonizowaną należy zakryć pojemnik i przechowywać w temperaturze 4 °C. Od czasu do czasu sprawdzaj postęp rozpuszczania, najlepiej bez mieszania.

2. Synteza krzemionki

1. Połączyć roztwory pięciowodnego krzemianu sodu i PEHA w jednym z pojemników o pojemności 180 ml i dodać wystarczającą ilość wody dejonizowanej, aby końcowa objętość roztworu wynosiła 41 ml (lub 46, jeśli pominięto kapsułkowanie in situ).
2. Umieść świeżo przygotowaną mieszaninę roztworów krzemianu sodu i PEHA na wierzchu płyty mieszadła, dodając mieszadło, aby zapewnić równomierne mieszanie.
3. W tym naczyniu zawiesić sondę pH i zapisać początkowe pH.
   1. Na tym etapie, fakultatywnie, należy pobrać 750 μl podwielokrotności mieszaniny wyjściowej w celu późniejszego oznaczenia początkowego stężenia [Si] przy użyciu testu spektrofotometrycznego błękitu molibdenowego, jak opisano w kroku 8.1.
4. Rozpocznij syntezę od dodania z góry określonej ilości 1 M HCl, zgodnie z obliczeniami ze wzoru Rysunek 1, i obserwuj natychmiastową ewolucję zmętnienia (patrz Rysunek 2)
5. Jak tylko dodanie kwasu dobiegnie końca, dodaj roztwór kapsułkujący (jeśli występuje) tak szybko, jak to możliwe.
   UWAGA: Ostateczna objętość przy tych ilościach wynosi 50 ml całkowitej mieszaniny reakcyjnej, co prowadzi do stężeń Si i N wynoszących 30 mM. Można to dowolnie skalować, mnożąc wszystkie powyższe ilości przez stałą wartość.
6. Zapisać pH po 5 minutach w celu określenia zakończenia reakcji; upewnić się, że pH wynosi 7 ± 0,05.

3. Kwasowe wymywanie materiałów

1. Zmodyfikować skład wytworzonej krzemionki po osiągnięciu zakończenia reakcji (albo jako koagulum po sporządzeniu, albo przez ponowne zawieszenie poprzednio zsyntetyzowanej próbki krzemionki) przez dodanie dalszego kwasu.
2. W przypadku ponownego zaparcia krzemionki wymieszaj około 150 mg przygotowanej krzemionki inspirowanej biologicznie ze 100 ml wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku o pojemności 180 ml i umieść na wierzchu płytki mieszadła.
3. Gdy zawiesina jest dobrze wymieszana, zawiesić sondę pH w naczyniu.
4. Miareczkować kolejne HCl aż do osiągnięcia pożądanego pH (między 7 a 2) i pozostawić do ustabilizowania przez ok. 1 min.
5. Odczekaj kolejne 5 minut, aby upewnić się, że system jest w pełni zrównoważony, a następnie przystąp do izolowania stałej krzemionki.

4. Separacja i suszenie krzemionki

1. Zdekantować inspirowaną biologicznie zawiesinę krzemionkową do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
2. Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 g przez 15 min.
3. Usunąć supernatant po odwirowaniu i przechowywać do dalszej analizy (np. test Bradforda, patrz poniżej). Napełnij probówki wirówkowe wodą dejonizowaną i ponownie zawiesić krzemionkę za pomocą mieszalnika wirowego.
4. Powtórzyć wirowanie, przechowywanie w supernatencie i dwukrotne ponowne zawieszenie zawiesiny.
5. Po końcowym odwirowaniu usunąć sklarowany osad i zeskrobać krzemionkę do tygla ceramicznego.
6. Suszyć w piekarniku przez noc w temperaturze 85 °C.
   1. Jeśli enkapsulacja miała miejsce, użyj urządzenia do liofilizacji lub pieca pracującego w próżni, aby uniknąć denaturacji białka.

5. Produkcja odczynnika MBR (Molibdenum Blue) do oznaczania [Si]

1. Do plastikowej kolby miarowej o pojemności 1 l dodać 8 mmol (10 g) tetrahydratu molibdenianu amonu w dygestorium.
2. Rozpuść to w 500 ml wody dejonizowanej, mieszając.
3. Zakwasić roztwór, ostrożnie dodając 60 ml 10 M roztworu HCl.
4. Dostosuj końcową objętość do 1 l.

6. Produkcja środka redukującego siarczan para-aminofenolu (RA) do oznaczania [Si]

1. Umieścić szklaną kolbę miarową o pojemności 500 ml w łaźni wodnej o temperaturze otoczenia na mieszadle w dygestorium.
2. Dodać 111 mmol (10 g) bezwodnego kwasu szczawiowego, 19,5 mmol (3,35 g) siarczanu para-aminofenolu i 16 mmol (2 g) siarczynu sodu i rozpuścić w 250 ml wody.
3. Ostrożnie i powoli dodawać 92 g (50 ml) nasyconego kwasu siarkowego, mieszając i poczekaj, aż roztwór ostygnie.
4. Na koniec rozcieńczyć do 500 ml wodą dejonizowaną.

7. Test kwasu silikomolibdynowego na monomerycznych gatunkach krzemionki

1. W plastikowej fiolce o pojemności 5 ml rozcieńczyć 300 μl MBR wyprodukowanego w kroku 5.4 3 ml wody dejonizowanej.
2. Dodać 10 μl roztworu testowego kwasu krzemowego i wstrząsnąć do wymieszania.
   UWAGA: Ten roztwór powoli zmieni kolor na żółty.
3. Dokładnie po 15 minutach dodać 1,6 ml środka redukującego przygotowanego z sekcji 6 w celu zredukowania żółtego kompleksu krzemolibdenianu do jego niebieskiego izomeru.
4. Pozwól, aby niebieski kolor rozwinął się przez co najmniej 2, ale nie dłużej niż 24 godziny.
5. Zmierzyć absorbancję próbki przy długości fali 810 nm w spektrofotometrze UV-vis i obliczyć [Si] w stosunku do krzywej kalibracyjnej.

8. Test kwasu molibdenowego Silico na polimerowych gatunkach krzemionki

1. Aby zmierzyć stężenie gatunków polikrzemianów metodą błękitu molibdenowego, w probówce do mikrowirówek należy połączyć 750 μl 2 M roztworu wodorotlenku sodu z 750 μl zawiesiny krzemionki.
2. Zamknij i umieść w pływaku do mikrowirówki.
   1. Upewnij się, że w rurze pozostało wystarczająco dużo miejsca nad głową, aby zapobiec pęknięciu z powodu wzrostu ciśnienia.
      UWAGA: Aby tego uniknąć, zwykle wystarcza przestrzeń nad głową wynosząca 500 μl. Alternatywnie, procedurę można przeprowadzić w otwartych fiolkach, o ile uwzględni się utratę płynu w wyniku parowania.
3. Umieścić probówki do mikrowirówek w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 80 °C i pozostawić do rozpuszczenia na 1 godzinę.
4. Po upływie 1 godziny wyjmij probówki do mikrowirówek i wytrzyj zewnętrzną część do sucha.
5. Po schłodzeniu [Si] można wyznaczyć zgodnie z powyższym opisem, jak opisano w krokach od 7.2 do 7.5.

9. Procedura testu Bradforda do oznaczania stężenia białka w krzemionce

1. Wprowadzić z góry określoną ilość (w temperaturze pokojowej) odczynnika Bradforda i próbki do każdej przypisanej kuwety (patrz Tabela 1 i Tabela 2 dla określonych objętości). Do każdej kuwety należy używać jednorazowych końcówek do pipet, aby uniknąć zmian objętości spowodowanych charakterem odczynnika, i powtórzyć każdy punkt w trzech egzemplarzach.
2. Wymieszaj każdą kuwetę, odwracając 3 razy i pozostaw do rozwinięcia na 10 minut.
3. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm, używając czystego supernatantu jako próby ślepej.
4. Obliczyć pierwotną absorbancję każdej kuwety, odejmując od każdego pomiaru absorbancję stwierdzoną dla próbki kontrolnej (kuweta nr 0 w obu testach).
5. Oblicz stężenie białka w nieznanej próbce, używając krzywej kalibracyjnej (Rysunek 3). W przypadku rozcieńczenia pierwotnej próbki należy uwzględnić współczynnik rozcieńczenia.
   1. Utwórz krzywą kalibracyjną dla każdego zestawu eksperymentów, wykreślając zmierzoną absorbancję w stosunku do stężenia BSA, aby uniknąć losowych wahań, które mogą wpływać na czułość testu.
   2. Chociaż ten test białkowy ma na celu wykorzystanie BSA jako standardu do ilościowego oznaczania dowolnego rodzaju białka, należy utworzyć krzywą kalibracyjną dla każdego konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać większą dokładność.
   3. Jeżeli oczekuje się, że zawartość białka w nieznanej próbce będzie wyższa niż zakres objęty krzywą wzorcową, należy ją rozcieńczyć w razie potrzeby.
6. Określić zawartość białka w każdej próbce podczas ponownego zawieszania, aby monitorować możliwą utratę białka.

Wyniki

Techniki opisane powyżej są w stanie konsekwentnie i powtarzalnie wytrącać krzemionkę. Najłatwiej jest to określić na podstawie szybkiego początku zmętnienia w naczyniu reakcyjnym, które po ustaniu mieszania spontanicznie osiądzie w gęstym skrzepie wytrąconej krzemionki (Rysunek 2). Zakres reakcji, a co za tym idzie wydajność, można potwierdzić poprzez pomiar masy tego skrzepu po rozdzieleniu i wynosi on zazwyczaj od 58 ± 6,5% (Rysunek 4, żółty).

Dalsze wgląd w przebieg reakcji można uzyskać, dostosowując metodę spektroskopową błękitu molibdenowego do wykrywania ilości nieprzereagowanych monomerycznych gatunków krzemianu, jak również tych gatunków, które zareagowały tworząc polikrzemiany lub 'oligomery', ale nie zdołały osiągnąć wystarczającej wielkości do koagulacji (Rysunek 4, odpowiednio czerwony i niebieski).

Te specyficzne dane dotyczące specjacji krzemionki są szczególnie interesujące przy porównywaniu różnych efektywności miareczkowania w reakcji wytrącania - tj. jak końcowe pH reakcji i szybkość, przy której jest ona osiągana, wpływa na polimeryzację monomeru krzemionki do 'oligomeru' i jej późniejszą koagulację do stałej krzemionki. Modyfikując nieznacznie ilość kwasu dodawanego w etapie 2.4, można przeprowadzić niedostateczne lub nadmierne miareczkowanie mieszaniny reakcyjnej (Rysunek 5). Mierząc ponownie specjację krzemionki dla tych dwóch przypadków, można zauważyć wyraźną różnicę w zakończeniu reakcji (Rysunek 4) pomimo tylko niewielkich zmian w profilu miareczkowania reakcji (Rysunek 5).

Chociaż nie ma różnicy między spożyciem gatunków monomerycznych w trzech przypadkach reakcji (pozostałe między 29 - 33%), istnieje wyraźna różnica w ilości oligomerycznych form krzemionki, które wytrącają się w każdym przypadku. Jest to zgodne z tradycyjną teorią krzemionki zol-żel - w przypadku "niedoregulowania" pH utrzymuje się na wyższym poziomie przez dłuższy czas, co pozwala na wzrost pojedynczych cząstek, a tym samym wspomaga wydajną koagulację; W przypadku "przeregulowania" koagulacja jest indukowana znacznie szybciej ze względu na szybkie miareczkowanie, stąd mniej gatunków krzemionki urosło do wystarczającej wielkości, aby skoagulować i pozostać uwięzionymi w fazie koloidalnej. ¹⁶

Biorąc pod uwagę znaczenie miareczkowania dla tworzenia się krzemionki, niezbędna jest wiedza a priori na temat odpowiedniej objętości miareczkowania. Chociaż nie można ich wyodrębnić ze stechiometrii reakcji ze względu na złożone zachowanie protonacji dodatków aminowych i zmianę kwasowości powierzchniowej krzemionki podczas koagulacji, łatwo generowane są wysoce wiarygodne empiryczne zależności między zawartością systemu, stężeniami i objętościami miana (Rysunek 1).

Po zakończeniu koagulacji, powierzchnie materiału mogą być łatwo modyfikowane za pomocą elucji kwasowej, jak to ostatnio zostało zgłoszone przez autorów w innym miejscu. ¹³ Pozwala to na precyzyjne dostrojenie właściwości materiału, takich jak skład, porowatość i aktywność chemiczna dodatku (Rysunek 6a i b).

W tym badaniu, BSA zostało użyte jako przykładowy enzym enkapsulant, jednak opisane tutaj techniki mogą być używane do wielu enzymów^17,18. Procedura stosowana do wykrywania białek to protokół testu Bradforda, ¹⁹ przy użyciu supernatantów przechowywanych z każdego cyklu wirowania. Ilość białka w supernatancie oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej utworzonej ze znanych ilości BSA rozpuszczonych w supernatancie próbki o zerowej zawartości białka (próbka kontrolna). Ilość białka zamkniętego w krzemionce zostanie obliczona przez odjęcie wykrytego białka w supernatantach od początkowej ilości dodanego białka. Jedynym odczynnikiem potrzebnym do testu jest odczynnik Bradford (zakupiony lub wykonany zgodnie ze standardowymi recepturami).

Istnieją trzy rodzaje formatów testów, w zależności od objętości próbki, oczekiwanej ilości białka do wykrycia i zastosowanej metody pomiaru. W tym przypadku następujący format jest określony dla spektrofotometru, wymaga jednorazowych kuwet o rozmiarach makro i mikro i może wykryć od 10 μg/ml do 1,4 mg/ml białka.

W Rysunek 7 ilość białka wykryta po każdym praniu (krok 4.3) jest pokazana jako % początkowej ilości białka (która wynosiła 50 mg). Około ~50% BSA wykryto w supernatancie po pierwszym odwirowaniu, co odnosi się do ~50% skuteczności immobilizacji. Ponieważ w kolejnych płukaniach nie wykryto BSA, BSA (lub dowolny inny enzym) może być bezpiecznie zamknięty w kapsułkach podczas syntezy krzemionki bez wymywania - jest to istotna zaleta tej metody. W celu potwierdzenia obecności BSA w wytwarzanej krzemionce przeprowadzono analizę spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR). Obecność charakterystycznych pasm amidu I i II w zakresie 1 500/cm i 1650/cm (Rysunek 8) w próbkach przygotowanych w obecności BSA, ale nie w próbkach kontrolnych (brak BSA) potwierdziła obecność BSA w ciałach stałych.

Oprócz metody dodawania enzymów opisanej powyżej (BSA dodawane podczas neutralizacji mieszaniny reakcyjnej), istnieją inne możliwe warianty, np. dodawanie BSA podczas mieszania krzemianu i roztworów dodatków, przed neutralizacją lub dodanie enzymu do roztworu krzemianu lub dodatku przed ich zmieszaniem i neutralizacją. Niektóre z tych możliwości zostały dalej zbadane i zmierzono skuteczność immobilizacji (masa BSA unieruchomionego jako procent enzymu dodanego do układu reakcyjnego, obliczona na podstawie testu Bradforda) oraz ilość BSA w końcowej krzemionce (stężenie BSA w krzemionce jako procent całkowitej masy wytworzonego kompozytu, zobacz Rysunek 9). Było jasne, że po dodaniu BSA do nieprzereagowanych odczynników (przypadki A-C w Rysunek 9) nie było znaczących różnic w skuteczności immobilizacji lub ilości BSA w otrzymanym kompozycie. Jednakże, gdy BSA jest dodawany podczas tworzenia krzemionki (przypadek D w Rysunek 9), skuteczność immobilizacji i ilość BSA w produkcie końcowym były znacznie niższe. Pomimo tych różnic średnia ilość wytwarzanej krzemionki pozostała niezmieniona (w granicach 85-90 mg). Obserwacje te można wyjaśnić na podstawie jonizacji (lub punktu izoelektrycznego) BSA, krzemianu/krzemionki i dodatku. Różne metody dodawania pozwalają na różne interakcje między enzymem a prekursorami krzemionki. Ponieważ zmienia się pH w momencie dodawania enzymu, jonizacja każdego gatunku będzie determinować interakcje międzycząsteczkowe, które z kolei będą kontrolować skuteczność immobilizacji.

pkt. pkt.

Nr kuwety	Stężenie BSA (mg/ml)	Odczynnik Bradforda (ml)	Próbka (ml)
0	0 (kontrola)	1,5	0,05
1	0,1	1,5	0,05
cyfra arabska	0,25	1,5	0,05
3	0,5	1,5	0,05
4	0,75	1,5	0,05
5	1	1,5	0,05
6	Wydanie orzeczenia 1,25	1,5	0,05
7	Próbka nieznana (X)	1,5	0,05

Tabela 1: Konfiguracja testu Macro Bradford i obliczone objętości składników. Ważny dla zakresu oznaczania 0,1-1,4 mg/ml (objętości dla 1 kontrpróby)

Nr kuwety	Stężenie BSA (ug/ml)	Odczynnik Bradforda (ml)	Próbka (ml)
0	0 (kontrola)	1	1
1	1	1	1
cyfra arabska	Rozdział 2.5	1	1
3	5	1	1
4	7,5	1	1
5	10	1	1
6	Próbka nieznana (X)	1	1

Tabela 2: Konfiguracja testu Micro Bradford i obliczone objętości składników. Ważny dla zakresu oznaczania 1-10 μg/ml (objętości dla 1 kontrpróby)

Rysunek 1: Wymagana objętość miana w stosunku do stężenia krzemionki dla systemów reakcyjnych wykorzystujących DETA lub PEHA jako dodatek. Krzemionkę zsyntetyzowano w różnych stężeniach, zachowując stosunek [N]:[Si] wynoszący 1, dla dwóch różnych dodatków chemicznych. Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe wokół średniej.

Rysunek 2: Fotografie skrzepu krzemionki w naczyniu reakcyjnym (a) podczas i (b) po mieszaniu, pokazujące zmętnienie i osiadanie roztworu, które wskazują na optymalną reakcję. 

Rysunek 3: Przykładowa krzywa kalibracyjna dla testu makro Bradforda. Supernatant z syntezy krzemionki inspirowanej biologicznie przy braku BSA miesza się ze znaną ilością białka, po czym przeprowadza się analizę Bradforda zgodnie z opisem w kroku 9.1.

Rysunek 4: Końcowe stany polimeryzacji gatunków krzemionki dla różnych warunków reakcji. Krzemionka jest syntetyzowana w optymalnych (wyjściowych) warunkach, a także z nadmiernym lub niedostatecznym miareczkowaniem, po czym względne stężenie krzemionki określa się ilościowo dla monomerycznych lub dimerycznych krzemianów (kolor czerwony), "oligomerów" polikrzemianów (kolor niebieski) i niestabilnej krzemionki krzepnącej (kolor żółty).

Rysunek 5: Postęp pH w systemie reakcyjnym w funkcji początkowej objętości miana. Kwas dozuje się natychmiast po ok. 38 sekundach mieszania, powodując gwałtowny spadek pH poniżej 8. Następnie kolejne ilości kwasu są automatycznie dozowane tak, aby pH wynosiło 7,0 ± 0,05 300 s po początkowym dodaniu. W przypadku nadmiernego miareczkowania nie było to osiągalne, ponieważ początkowa dawka była wystarczająca, aby obniżyć pH poniżej 7, osiągając pH 6,65 po 300 sekundach. Początkowa objętość HCl dodana dla "niedoregulowania", "wartości wyjściowej" i "przeregulowania" wynosiła odpowiednio 6,90, 7,05 i 7,20 ml.

Rysunek 6: Reprezentatywne zmiany właściwości po zakwaszeniu skoagulowanego materiału krzemionkowego. (a) Zmiana stężenia dodatku w odniesieniu do pH, oraz (b) zmiana porowatości krzemionki w odniesieniu do pH. Reprodukowane z Manning et al. ¹³ na licencji Creative Commons.

Rysunek 7: Stężenie BSA w bioinspirowanych supernatantach syntezy krzemionki. Testy Bradforda przeprowadzono na supernatantach reakcyjnych po odwirowaniu, z których określono względną ilość pozostałą (a więc okludowaną z syntetyzowanej krzemionki).

Rysunek 8: Analiza FTIR na bioinspirowanej krzemionce z enkapsulacją i bez niej. Widma pokazane: linia: krzemionka inspirowana biologicznie, szara linia: czyste BSA, niebieska linia: krzemionka inspirowana biologicznie załadowana BSA. Pionowe linie przerywane oznaczają charakterystyczne pasma amidowe.

Rysunek 9: Skuteczność immobilizacji i ilość BSA w kompozycie dla krzemionki produkowanej przy użyciu PEHA. BSA dodawano (A) do roztworu PEHA przed zmieszaniem z krzemianem, (B) do roztworu krzemianu przed zmieszaniem z PEHA, (C) po wstępnym zmieszaniu roztworów PEHA i krzemianów oraz (D) po zmieszaniu PEHA i roztworów krzemianów i zobojętnieniu. Wydajność mierzy się jako % BSA zamkniętego w kapsułkach z mieszaniny reakcyjnej jako proporcję całkowitego dodanego BSA, podczas gdy BSA w krzemionce oznacza % stężenia BSA w końcowym kompozytzie krzemionkowym w masie. Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe wokół średniej.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono metodę szybkiego wytrącania bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i enkapsulacji w nich biomolekuł. Pokazujemy krytyczne etapy procedury, a mianowicie ilość kwasu inicjującego reakcję, który należy dodać, oraz czas dodania kapsułki biomolekułowej. Pokazujemy wpływ ilości dodatku kwasu zarówno na postęp reakcji, jak i wydajność (odpowiednio rysunek 4 i rysunek 5) oraz zademonstrowaliśmy metodę ścisłej kontroli warunków syntezy, pozwalającą na spójność pomimo tej czułości. Jeśli chodzi o enkapsulację związków aktywnych, chociaż jest to proste pod względem procedury, wykazano, że enkapsulacja jest wrażliwa na warunki eksperymentu (kolejność dodawania, pH dodawania, warunki środowiskowe), jednak spójność właściwości materiału jest ponownie osiągalna.

Warunki syntezy mogą być modyfikowane poprzez stosowanie różnych dodatków, z których wiele zostało opublikowanych gdzie ^indziej,15 zapewniając szereg morfologii i porowatości. Ponadto opisano postsyntetyczne techniki modyfikacji i chemicznego dostosowywania materiałów krzemionkowych inspirowanych biologicznie, takie jak łagodne oczyszczanie¹³ i dekorowanie powierzchni aminami. ²⁰ Wreszcie, ze względu na łagodny, wodny charakter syntezy, enkapsulacja in situ jest możliwa dla szerszego zakresu substratów niż te pokazane tutaj, począwszy od enzymów^17,18 do całych ^komórek21, soli ^metali22, aktywnych składników farmaceutycznych23 i kropek kwantowych. ²⁴

W przeciwieństwie do innych syntez krzemionki za pośrednictwem substancji organicznych (takich jak rodzina materiałów MCM-41 lub SBA-15), wielofunkcyjny charakter dodatków inspirowanych biologicznie nie może wytwarzać uporządkowanych struktur porowych ani wysoce monodyspersyjnych rozkładów wielkości cząstek charakterystycznych dla krzemionki typu Stöbera. ²⁵ Wynika to z braku dobrze zdefiniowanego zachowania micelizacji dodatków inspirowanych biologicznie (poza szczególnymi przypadkami)²⁶ w połączeniu z ich zwiększoną aktywnością katalityczną w porównaniu z monofunkcyjnymi dodatkami zawierającymi aminy. ²⁶

Z drugiej strony, ten wielofunkcyjny charakter dodatku umożliwia stosowanie krótszych czasów reakcji oraz łagodniejszej temperatury i ciśnienia w porównaniu z innymi syntezami krzemionki za pośrednictwem substancji organicznych. Prowadzi to również do możliwości elucji addytywnej w temperaturze pokojowej, jak opisano powyżej, co nie zostało jeszcze osiągnięte w przypadku tych innych rodzin krzemionki ze względu na specyfikę ich chemii powierzchniowej. 27,28,29 W związku z tym wykazano, że materiały krzemionkowe inspirowane biologicznie są zarówno bardziej ekonomiczne, jak i praktyczne do produkcji na większą skalę, co prowadzi do łatwiejszej komercjalizacji i rozwoju. ¹⁴

Podsumowując, synteza krzemionki inspirowana biologicznie stanowi szybką, łatwą metodę wytwarzania nośników z form aktywnych lub pożywek sorbentowych gazów. Dzięki ścisłej kontroli pH w trakcie i po reakcji można zsyntetyzować szeroką gamę kompozytów krzemionkowo-aminowych o różnych właściwościach, co jest dodatkowo uzupełnione możliwością enkapsulacji in situ szeregu różnych materiałów organicznych, nieorganicznych lub bioorganicznych. Chociaż niezależna postsyntetyczna modyfikacja bioinspirowanych dodatków i stężeń enkapsulantów nie została jeszcze osiągnięta, metody te stanowią obiecujący krok w kierunku przyjaznych dla środowiska procesów chemicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Synteza krzemionki
Pentahydrat krzemianu sodu	Fisher scientific	10070470
Heksaminana pentaetylenowa (PEHA)	Sigma-Aldrich	292753
Dietylenotriamina (DETA)	Sigma-Aldrich	D93856	Toksyczna
trietylenotetraamina (TETA)	Sigma-Aldrich	90460
Poli(etylenimina) (PEI)	Polysciences	6088	1,2 tys. MW
Poli(chlorowodorek alliloaminy) (WWA)	Sigma-Aldrich	283215	17,5 tys. MW
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Kwas solny (HCl) 1M	Test
Silicomolibdic
Ammonium molibdenian tetrahydrat	Sigma-Aldrich	A7302	Produkt zastąpiony przez M1019
Kwas solny (HCl) 37,0% wag	Fluka Analytical	84436
Bezwodny kwas szczawiowy	Sigma-Aldrich	75688
Siarczan para-aminofenolu	Fisher Scientific	10446880
Sód siarczyn	Fisher Scientific	10234400
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	84727
Bradford test
Bradford odczynnik	Sigma-Aldrich	B6916
Sprzęt
Autotitrator Titrando 902	Metrohm	2.902.0010
801 mieszadło magnetyczne	Metrohm	2.801.0040	Do użytku z powyżej
800 Dosino	Metrohm	2.800.0010	Do użytku z powyższym
Aquatrode Plus	Metrohm	6.0253.100	Do użytku z powyższą
wirówką Sorvall ST16	Thermo Scientific	11814243	Kod dotyczy Fisher scientific
UV-Vis spektrofotometr Genesys 10A	Thermo scientific	12104972	Kod jest dla Fisher scientific