Tutaj prezentujemy protokół syntezy bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i immobilizacji enzymów w nich. Krzemionka jest syntetyzowana przez połączenie krzemianu sodu i "dodatku" aminowego, które neutralizują się w kontrolowanym tempie. Właściwości i funkcję materiału można zmienić poprzez immobilizację enzymatyczną in situ lub postsyntetyczne elucję kwasową zamkniętych dodatków.
Artykuł metodologiczny
Otrzymywanie krzemionki funkcjonalnej metodą inspirowaną biologicznie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem opisanych tutaj protokołów jest synteza bioinspirowanych materiałów krzemionkowych, przeprowadzenie w nich enkapsulacji enzymów i częściowe lub całkowite ich oczyszczenie przez elucję kwasów. Łącząc krzemian sodu z wielofunkcyjnym dodatkiem inspirowanym biologicznie, krzemionka szybko tworzy się w warunkach otoczenia po neutralizacji.
Badany jest wpływ szybkości neutralizacji i punktu dodawania biomolekuł na wydajność krzemionki, a efektywność immobilizacji biomolekuł jest podawana dla różnych punktów dodawania. W przeciwieństwie do innych metod syntezy porowatej krzemionki, wykazano, że łagodne warunki wymagane do syntezy krzemionki inspirowanej biologicznie są w pełni kompatybilne z enkapsulacją delikatnych biomolekuł. Dodatkowo, łagodne warunki są stosowane na wszystkich etapach syntezy i modyfikacji, co sprawia, że krzemionka inspirowana biologicznie jest obiecującym celem do zwiększenia skali i komercjalizacji zarówno jako surowy materiał, jak i aktywne podłoże nośne.
Wykazano, że synteza jest bardzo wrażliwa na warunki, tj. szybkość neutralizacji i końcowe pH syntezy, jednak ścisła kontrola nad tymi parametrami jest wykazywana poprzez użycie metod automatycznego miareczkowania, co prowadzi do wysokiej powtarzalności ścieżki progresji reakcji i wydajności.
Dlatego też bioinspirowana krzemionka jest doskonałym wyborem dla aktywnego materiału pomocniczego, wykazując wszechstronność w wielu obecnych zastosowaniach, nie ograniczając się do tych pokazanych tutaj, oraz moc w przyszłych zastosowaniach.
Wprowadzenie
Wykorzystanie krzemionki jako strukturalnego wsparcia dla katalizatorów przemysłowych jest dobrze ugruntowane, co pozwala na poprawę aktywności katalizatora, stabilności i przetwarzalności,1 potencjalnie zmniejszając koszty operacyjne. Korzyści te są spotęgowane w przypadku immobilizacji enzymu, ponieważ przechowywanie w systemie porów krzemionki może przynieść znaczące korzyści w czasie życia enzymu w porównaniu z jego wolnym odpowiednikiem. W związku z tym włożono wiele wysiłku w znalezienie najlepszej metody przyłączania enzymów do gatunków krzemionki, z wieloma przeglądami porównującymi badania przy użyciu różnych metod immobilizacji na krzemionkowych podłogach stałych. 2,3,4
Enzymy są zazwyczaj łączone za pomocą fizsorpcji lub wiązania kowalencyjnego, oprócz enkapsulacji w porowatym materiale. 5 Istnieją jednak istotne wady związane z każdą metodą: fizsorpcja opiera się na przejściowych oddziaływaniach powierzchniowych między krzemionką a biomolekułą, które mogą być bardzo łatwo osłabione przez warunki reakcji prowadzące do niedopuszczalnego wymywania enzymu. Znacznie silniejsze przywiązanie kowalencyjne zwykle skutkuje niższą aktywnością ze względu na zmniejszoną swobodę konformacyjną gatunków aktywnych. Enkapsulacja może powodować zmniejszenie aktywności z powodu niedostępności enzymu lub ograniczeń dyfuzyjnych. 6
Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie łagodniejszych (często nazywanych 'bioinspirowanymi') syntez krzemionki ustaliły enkapsulację in situ biomolekuł i innych aktywnych gatunków podczas syntezy materiału. 7,8,9 Ta metoda neguje wiele wad konwencjonalnej immobilizacji - w przeciwieństwie do podejść chemisorpcyjnych, swoboda konformacyjna biomolekuły jest utrzymywana dzięki zastosowaniu słabszych oddziaływań niekowalencyjnych, ale ponieważ wokół biomolekuły tworzy się jama porowa, nadal zapobiega się wypłukiwaniu. Rzeczywiście, wykazano, że enkapsulacja działa w przypadku szeregu biomolekuł, a nawet całych komórek, 10, a dzięki enkapsulacji w bioinspirowanej krzemionce można uniknąć efektów, takich jak dezaktywacja z powodu trudnych warunków procesu. 7,11
Celem opisanej tutaj metody jest przygotowanie porowatej krzemionki o kontrolowanych właściwościach, w warunkach otoczenia, przy użyciu bioinspirowanego dodatku organicznego. Metodę tę można łatwo zmodyfikować tak, aby obejmowała kapsułkowanie cząsteczek nieorganicznych lub bioorganicznych, z których wybrane powinny być przedstawione. Ponadto pokazujemy łatwą metodę modyfikacji zsyntetyzowanych materiałów w celu uzyskania pożądanych właściwości objętościowych i oczyszczania poprzez usunięcie matrycy organicznej poprzez elucję kwasów.
W porównaniu do tradycyjnej syntezy szablonowych porowatych nośników krzemionkowych (np. materiałów krzemionkowych szablonowanych za pomocą supramolekularnych zespołów surfaktantów, takich jak MCM-41 lub SBA-15)12 ta metoda jest znacznie szybsza i łagodniejsza, umożliwiając dostosowaną do potrzeb enkapsulację in situ bez potrzeby licznych etapów immobilizacji i pracochłonnego oczyszczania. Co więcej, zastosowanie elucji kwasowej zamiast kalcynacji otwiera możliwość funkcjonalnej powierzchni organicznej.
Ta metoda jest wysoce przydatna dla osób pracujących nad aktywną immobilizacją gatunków, którzy stwierdzili, że fizysorpcja lub kowalencyjna immobilizacja są nieskuteczne. Jest to również przydatne dla osób prowadzących badania nad zwiększeniem skali procesu, ponieważ synteza inspirowana biologicznie ma wyjątkową pozycję do uprzemysłowienia w porównaniu z konwencjonalnymi materiałami krzemionkowymi typu templated. 13,14 Ta metoda nie jest zalecana do zastosowań, które wymagają uporządkowanego układu porów w materiale, np. dla fotoniki, ponieważ struktura materiału jest nieuporządkowana pomimo jakiegokolwiek podobieństwa właściwości masowych.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów prekursorowych (i opcjonalnych roztworów enkapsulantów)
- Do plastikowego pojemnika o pojemności 180 ml odmierz 1,5 mmol pięciowodnego krzemianu sodu (318,2 mg) i rozpuść w 20 ml wody dejonizowanej.
- Podobnie w drugim pojemniku odmierz 0,25 mmol heksaminy pentaetylenowej (PEHA, 58,1 mg) i rozpuść w 20 ml wody dejonizowanej.
- W przypadku stosowania alternatywnych związków zawierających aminy, np. dietylenotriaminy (DETA) lub trietylenotetraaminy (TETA), należy upewnić się, że całkowity stosunek molowy Si:N pozostaje stały na poziomie 1 (tj. odpowiadającym 0,5 mmol DETA lub 0,375 mmol TETA w opisanej procedurze)15.
- W przypadku stosowania dodatków amin polimerowych, np. poli(etyleniminy) (PEI) lub poli(chlorowodorku alliloaminy) (WWA), należy utrzymać stężenie 1 mg/ml (końcowa objętość reakcji)15.
UWAGA: Z tymi aminami należy obchodzić się tylko wewnątrz dygestoria, ponieważ są one lub toksyczne w czystej postaci (zwłaszcza w postaci oparów).
- Aby przeprowadzić enkapsulację in situ podczas syntezy, rozpuść wcześniej określoną masę białka (w tym przypadku 50 mg albuminy surowicy bydlęcej, BSA) w 5 ml wody dejonizowanej. Odejmij tę ilość wody od objętości wody dejonizowanej, która ma być użyta do rozpuszczenia pentahydratu krzemianu sodu.
- Aby ułatwić rozpuszczanie białka bez zmiany jego struktury, po zmieszaniu z wodą dejonizowaną należy zakryć pojemnik i przechowywać w temperaturze 4 °C. Od czasu do czasu sprawdzaj postęp rozpuszczania, najlepiej bez mieszania.
2. Synteza krzemionki
- Połączyć roztwory pięciowodnego krzemianu sodu i PEHA w jednym z pojemników o pojemności 180 ml i dodać wystarczającą ilość wody dejonizowanej, aby końcowa objętość roztworu wynosiła 41 ml (lub 46, jeśli pominięto kapsułkowanie in situ).
- Umieść świeżo przygotowaną mieszaninę roztworów krzemianu sodu i PEHA na wierzchu płyty mieszadła, dodając mieszadło, aby zapewnić równomierne mieszanie.
- W tym naczyniu zawiesić sondę pH i zapisać początkowe pH.
- Na tym etapie, fakultatywnie, należy pobrać 750 μl podwielokrotności mieszaniny wyjściowej w celu późniejszego oznaczenia początkowego stężenia [Si] przy użyciu testu spektrofotometrycznego błękitu molibdenowego, jak opisano w kroku 8.1.
- Rozpocznij syntezę od dodania z góry określonej ilości 1 M HCl, zgodnie z obliczeniami ze wzoru Rysunek 1, i obserwuj natychmiastową ewolucję zmętnienia (patrz Rysunek 2)
- Jak tylko dodanie kwasu dobiegnie końca, dodaj roztwór kapsułkujący (jeśli występuje) tak szybko, jak to możliwe.
UWAGA: Ostateczna objętość przy tych ilościach wynosi 50 ml całkowitej mieszaniny reakcyjnej, co prowadzi do stężeń Si i N wynoszących 30 mM. Można to dowolnie skalować, mnożąc wszystkie powyższe ilości przez stałą wartość. - Zapisać pH po 5 minutach w celu określenia zakończenia reakcji; upewnić się, że pH wynosi 7 ± 0,05.
3. Kwasowe wymywanie materiałów
- Zmodyfikować skład wytworzonej krzemionki po osiągnięciu zakończenia reakcji (albo jako koagulum po sporządzeniu, albo przez ponowne zawieszenie poprzednio zsyntetyzowanej próbki krzemionki) przez dodanie dalszego kwasu.
- W przypadku ponownego zaparcia krzemionki wymieszaj około 150 mg przygotowanej krzemionki inspirowanej biologicznie ze 100 ml wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku o pojemności 180 ml i umieść na wierzchu płytki mieszadła.
- Gdy zawiesina jest dobrze wymieszana, zawiesić sondę pH w naczyniu.
- Miareczkować kolejne HCl aż do osiągnięcia pożądanego pH (między 7 a 2) i pozostawić do ustabilizowania przez ok. 1 min.
- Odczekaj kolejne 5 minut, aby upewnić się, że system jest w pełni zrównoważony, a następnie przystąp do izolowania stałej krzemionki.
4. Separacja i suszenie krzemionki
- Zdekantować inspirowaną biologicznie zawiesinę krzemionkową do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
- Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 g przez 15 min.
- Usunąć supernatant po odwirowaniu i przechowywać do dalszej analizy (np. test Bradforda, patrz poniżej). Napełnij probówki wirówkowe wodą dejonizowaną i ponownie zawiesić krzemionkę za pomocą mieszalnika wirowego.
- Powtórzyć wirowanie, przechowywanie w supernatencie i dwukrotne ponowne zawieszenie zawiesiny.
- Po końcowym odwirowaniu usunąć sklarowany osad i zeskrobać krzemionkę do tygla ceramicznego.
- Suszyć w piekarniku przez noc w temperaturze 85 °C.
- Jeśli enkapsulacja miała miejsce, użyj urządzenia do liofilizacji lub pieca pracującego w próżni, aby uniknąć denaturacji białka.
5. Produkcja odczynnika MBR (Molibdenum Blue) do oznaczania [Si]
- Do plastikowej kolby miarowej o pojemności 1 l dodać 8 mmol (10 g) tetrahydratu molibdenianu amonu w dygestorium.
- Rozpuść to w 500 ml wody dejonizowanej, mieszając.
- Zakwasić roztwór, ostrożnie dodając 60 ml 10 M roztworu HCl.
- Dostosuj końcową objętość do 1 l.
6. Produkcja środka redukującego siarczan para-aminofenolu (RA) do oznaczania [Si]
- Umieścić szklaną kolbę miarową o pojemności 500 ml w łaźni wodnej o temperaturze otoczenia na mieszadle w dygestorium.
- Dodać 111 mmol (10 g) bezwodnego kwasu szczawiowego, 19,5 mmol (3,35 g) siarczanu para-aminofenolu i 16 mmol (2 g) siarczynu sodu i rozpuścić w 250 ml wody.
- Ostrożnie i powoli dodawać 92 g (50 ml) nasyconego kwasu siarkowego, mieszając i poczekaj, aż roztwór ostygnie.
- Na koniec rozcieńczyć do 500 ml wodą dejonizowaną.
7. Test kwasu silikomolibdynowego na monomerycznych gatunkach krzemionki
- W plastikowej fiolce o pojemności 5 ml rozcieńczyć 300 μl MBR wyprodukowanego w kroku 5.4 3 ml wody dejonizowanej.
- Dodać 10 μl roztworu testowego kwasu krzemowego i wstrząsnąć do wymieszania.
UWAGA: Ten roztwór powoli zmieni kolor na żółty. - Dokładnie po 15 minutach dodać 1,6 ml środka redukującego przygotowanego z sekcji 6 w celu zredukowania żółtego kompleksu krzemolibdenianu do jego niebieskiego izomeru.
- Pozwól, aby niebieski kolor rozwinął się przez co najmniej 2, ale nie dłużej niż 24 godziny.
- Zmierzyć absorbancję próbki przy długości fali 810 nm w spektrofotometrze UV-vis i obliczyć [Si] w stosunku do krzywej kalibracyjnej.
8. Test kwasu molibdenowego Silico na polimerowych gatunkach krzemionki
- Aby zmierzyć stężenie gatunków polikrzemianów metodą błękitu molibdenowego, w probówce do mikrowirówek należy połączyć 750 μl 2 M roztworu wodorotlenku sodu z 750 μl zawiesiny krzemionki.
- Zamknij i umieść w pływaku do mikrowirówki.
- Upewnij się, że w rurze pozostało wystarczająco dużo miejsca nad głową, aby zapobiec pęknięciu z powodu wzrostu ciśnienia.
UWAGA: Aby tego uniknąć, zwykle wystarcza przestrzeń nad głową wynosząca 500 μl. Alternatywnie, procedurę można przeprowadzić w otwartych fiolkach, o ile uwzględni się utratę płynu w wyniku parowania.
- Upewnij się, że w rurze pozostało wystarczająco dużo miejsca nad głową, aby zapobiec pęknięciu z powodu wzrostu ciśnienia.
- Umieścić probówki do mikrowirówek w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 80 °C i pozostawić do rozpuszczenia na 1 godzinę.
- Po upływie 1 godziny wyjmij probówki do mikrowirówek i wytrzyj zewnętrzną część do sucha.
- Po schłodzeniu [Si] można wyznaczyć zgodnie z powyższym opisem, jak opisano w krokach od 7.2 do 7.5.
9. Procedura testu Bradforda do oznaczania stężenia białka w krzemionce
- Wprowadzić z góry określoną ilość (w temperaturze pokojowej) odczynnika Bradforda i próbki do każdej przypisanej kuwety (patrz Tabela 1 i Tabela 2 dla określonych objętości). Do każdej kuwety należy używać jednorazowych końcówek do pipet, aby uniknąć zmian objętości spowodowanych charakterem odczynnika, i powtórzyć każdy punkt w trzech egzemplarzach.
- Wymieszaj każdą kuwetę, odwracając 3 razy i pozostaw do rozwinięcia na 10 minut.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm, używając czystego supernatantu jako próby ślepej.
- Obliczyć pierwotną absorbancję każdej kuwety, odejmując od każdego pomiaru absorbancję stwierdzoną dla próbki kontrolnej (kuweta nr 0 w obu testach).
- Oblicz stężenie białka w nieznanej próbce, używając krzywej kalibracyjnej (Rysunek 3). W przypadku rozcieńczenia pierwotnej próbki należy uwzględnić współczynnik rozcieńczenia.
- Utwórz krzywą kalibracyjną dla każdego zestawu eksperymentów, wykreślając zmierzoną absorbancję w stosunku do stężenia BSA, aby uniknąć losowych wahań, które mogą wpływać na czułość testu.
- Chociaż ten test białkowy ma na celu wykorzystanie BSA jako standardu do ilościowego oznaczania dowolnego rodzaju białka, należy utworzyć krzywą kalibracyjną dla każdego konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać większą dokładność.
- Jeżeli oczekuje się, że zawartość białka w nieznanej próbce będzie wyższa niż zakres objęty krzywą wzorcową, należy ją rozcieńczyć w razie potrzeby.
- Określić zawartość białka w każdej próbce podczas ponownego zawieszania, aby monitorować możliwą utratę białka.
Wyniki
Opisane powyżej techniki pozwalają na spójne i powtarzalne wytrącanie krzemionki. Najłatwiej określić to po szybkim pojawieniu się zmętnienia w naczyniu reakcyjnym, które po zaprzestaniu mieszania samoistnie osadza się w postaci gęstego koagulatu wytrąconej krzemionki (Rysunek 2). Stopień przeprowadzenia reakcji, a tym samym wydajność, można potwierdzić poprzez pomiar masy tego koagulatu po oddzieleniu; wynosi ona zazwyczaj 58 ± 6,5% (Rysunek 4, kolor żółty).
Dalsze informacje na temat postępu reakcji można uzyskać poprzez adaptację spektroskopowej metody molibdenowego błękitu w celu wykrycia ilości nieprzereagowanych monomerycznych gatunków krzemianów, a także tych gatunków, które przereagowały, tworząc polikrzemiany lub „oligomery”, lecz nie osiągnęły jeszcze wystarczającego rozmiaru, aby ulec koagulacji (Rysunek 4, odpowiednio kolor czerwony i niebieski).
Te konkretne dane dotyczące specjacji krzemionki są szczególnie istotne przy porównywaniu różnych wydajności miareczkowania dla reakcji wytrącania – t. j. tego, jak końcowe pH reakcji oraz szybkość jego osiągania wpływają na polimeryzację monomerowej krzemionki do „oligomeru” i jej późniejszą koagulację do krzemionki stałej. Poprzez niewielką modyfikację ilości kwasu dodanego w etapie 2.4, można przeprowadzić niedomiareczkowanie lub nadmiarowe miareczkowanie mieszaniny reakcyjnej (Rysunek 5). Powtórne pomiary specjacji krzemionki dla tych dwóch przypadków wykazują wyraźną różnicę w stopniu ukończenia reakcji (Rysunek 4), mimo jedynie niewielkich zmian w profilu miareczkowania reakcji (Rysunek 5).
Chociaż nie stwierdzono różnic w zużyciu gatunków monomerycznych dla trzech przypadków reakcji (pozostających na poziomie 29–3%), widoczna jest wyraźna różnica w ilości wytrąconych gatunków krzemionki oligomerycznej w każdym z tych przypadków. Jest to zgodne z tradycyjną teorią dotyczącą krzemionek sol-gel – w przypadku „niedostrzału” (undershoot) pH jest utrzymywane na wyższym poziomie przez dłuższy czas, co pozwala na wzrost poszczególnych cząstek i tym samym sprzyja efektywnej koagulacji; w przypadku „przedostrzału” (overshoot) koagulacja jest indukowana znacznie szybciej ze względu na gwałtowne miareczkowanie, w związku z czym mniej gatunków krzemionki osiągnęło rozmiar wystarczający do koagulacji i pozostały one uwięzione w fazie koloidalnej.16
Biorąc pod uwagę znaczenie miareczkowania dla procesu powstawania krzemionki, niezbędna jest wiedza a priori na temat odpowiedniej objętości miareczkowania. Chociaż nie można jej wyznaczyć z treści stechiometrycznej reakcji ze względu na złożone zachowanie protonowania dodatków aminowych oraz zmianę kwasowości powierzchni krzemionki podczas koagulacji, można łatwo opracować wysoce niezawodne zależności empiryczne pomiędzy zawartością układu, stężeniami a objętościami miareczkowania (Rysunek 1).
Po zakończeniu koagulacji powierzchnie materiału mogą zostać łatwo zmodyfikowane poprzez eluowanie kwasem, co zostało niedawno opisane przez autorów w innej publikacji.13 Pozwala to na precyzyjne dostrojenie właściwości materiału, takich jak skład, porowatość i aktywność chemiczna dodatku (Rysunek 6a i b).
W niniejszym badaniu BSA została wykorzystana jako przykładowy enzym do enkapsulacji, jednak opisane tutaj techniki można zastosować w przypadku wielu enzymów17,18. W celu wykrycia białka zastosowano protokół analizy Bradforda,19 wykorzystując nadosady z każdego cyklu wirowania. Ilość białka w nadosadzie oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej stworzonej z znanych ilości BSA rozpuszczonych w nadosadzie próbki o zerowej zawartości białka (próbka kontrolna). Ilość białka zamkniętego w krzemionce zostanie obliczona poprzez odjęcie ilości białka wykrytego w nadosadach od początkowej ilości dodanego białka. Jedynym odczynnikiem potrzebnym do analizy jest odczynnik Bradforda (zakupiony lub przygotowany zgodnie ze standardowymi recepturami).
Istnieją trzy rodzaje formatów analizy, zależnie od objętości próbki, spodziewanej ilości białka do wykrycia oraz zastosowanej metody pomiarowej. W niniejszym opisie określono format przeznaczony dla spektrofotometru, który wymaga jednorazowych kuwet w rozmiarze makro i mikro i pozwala na wykrycie białka w zakresie od 10 µg/mL do 1,4 mg/mL.
Na Rysunku 7 ilość białka wykrytego po każdym płukaniu (krok 4.3) przedstawiono jako % początkowej ilości białka (która wynosiła 50 mg). Po pierwszej wirowce w supernatancie wykryto około ~50% BSA, co odpowiada ~50% wydajności immobilizacji. Ponieważ w kolejnych płukaniach nie wykryto BSA, można stwierdzić, że BSA (lub jakikolwiek inny enzym) mógł zostać bezpiecznie zamknięty podczas syntezy krzemionki bez wymywania – jest to istotna zaleta tej metody. Aby potwierdzić obecność BSA w otrzymanej krzemionce, przeprowadzono analizę metodą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR). Obecność charakterystycznych pasm amidu I i II w obszarze 1,50/cm i 1650/cm (Rysunek 8) w próbkach przygotowanych w obecności BSA, a ich brak w próbkach kontrolnych (bez BSA), potwierdziła obecność BSA w ciałach stałych.
Oprócz opisanej powyżej metody dodawania enzymu (BSA dodawana podczas neutralizacji mieszaniny reakcyjnej), istnieją inne możliwe warianty, np. dodawanie BSA podczas mieszania roztworów krzemianu i dodatków, przed neutralizacją, lub dodawanie enzymu do roztworu krzemianu bądź roztworu dodatków przed ich zmieszaniem i neutralizacją. Niektóre z tych możliwości zostały poddane dalszym badaniom, a następnie zmierzono wydajność immobilizacji (masa immobilizowanego BSA jako procent enzymu dodanego do układu reakcyjnego, obliczona na podstawie testu Bradforda) oraz ilość BSA w końcowej krzemionce (stężenie BSA w krzemionce jako procent całkowitej masy otrzymanego kompozytu, patrz Rycina 9). Wyraźnie zaznaczono, że gdy BSA była dodawana do niereagujących reagentów (przypadki A-C na Rycynie 9), nie wystąpiły znaczące różnice w wydajności immobilizacji ani w ilości BSA w otrzymanym kompozycie. Jednakże w przypadku dodania BSA podczas formowania się krzemionki (przypadek D na Rycynie 9), zarówno wydajność immobilizacji, jak i ilość BSA w produkcie końcowym były znacznie niższe. Pomimo tych różnic, średnia ilość otrzymanej krzemionki pozostała niezmieniona (od 85-90 mg). Obserwacje te można wyjaśnić na podstawie jonizacji (lub punktu izoelektrycznego) BSA, krzemianu/krzemionki oraz dodatku. Różne metody dodawania umożliwiają odmienne oddziaływania między enzymem a prekursorami krzemionki. Wraz ze zmianą pH w momencie dodawania enzymu, jonizacja każdego z gatunków determinuje oddziaływania międzycząsteczkowe, co z kolei kontroluje wydajność immobilizacji.
| Nr kuwety | Stężenie BSA (mg/mL) | Odczynnik Bradforda (mL) | Próbka (mL) |
| 0 | 0 (kontrola) | 1.5 | 0.05 |
| 1 | 0.1 | 1.5 | 0.05 |
| 2 | 0.25 | 1.5 | 0.05 |
| 3 | 0.5 | 1.5 | 0.05 |
| 4 | 0.75 | 1.5 | 0.05 |
| 5 | 1 | 1.5 | 0.05 |
| 6 | 1.25 | 1.5 | 0.05 |
| 7 | Próbka nieznana (X) | 1.5 | 0.05 |
Tabela 1: Konfiguracja makroanalizy Bradforda i obliczone objętości składników. Obowiązuje dla zakresu oznaczania 0.1-1.4mg/mL (objętości dla 1 powtórzenia)
| Nr kuwety | Stężenie BSA (µg/ml) | odczynnik Bradforda (ml) | Próbka (ml) |
| 0 | 0 (kontrola) | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 2.5 | 1 | 1 |
| 3 | 5 | 1 | 1 |
| 4 | 7.5 | 1 | 1 |
| 5 | 10 | 1 | 1 |
| 6 | Próbka nieznana (X) | 1 | 1 |
Tabela 2: Konfiguracja mikro-analizy metodą Bradforda i obliczone objętości składników. Ważne dla zakresu oznaczania 1-10 µg/mL (objętości dla 1 powtórzenia)
Rysunek 1: Wymagana objętość miana w funkcji stężenia krzemionki dla układów reakcyjnych z zastosowaniem DETA lub PEHA jako dodatkuKrzemionkę syntezowano przy różnych stężeniach, utrzymując stosunek [N]:[Si] wynoszący 1, dla dwóch różnych substancji dodatkowych. Słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe od średniej.
Rysunek 2: Fotografie koagulatu krzemionki w naczyniu reakcyjnym (a) podczas i (b) po mieszaniu, obrazujące mętność roztworu oraz sedymentację, które świadczą o optymalnym przebiegu reakcji.
Rysunek 3Przykładowa krzywa kalibracyjna dla makroanalizy metodą Bradforda. Nadpływ z bioinspirowanej syntezy krzemionki w obecności BSA miesza się ze znaną ilością białka, po czym wykonuje analizę metodą Bradforda zgodnie z opisem w punkcie 9.1.
Rycina 4Końcowe stany polimeryzacji form krzemionkowych dla różnych warunków reakcji. Krzemionkę syntetyzuje się w optymalnych (bazowych) warunkach, a także z nadmiarem lub niedoborem miarecznika, po czym określa się względne stężenie krzemionki dla krzemianów monomerycznych lub dimerycznych (czerwony), „oligomerów” polikrzemianowych (niebieski) oraz niestabilnej krzemionki koagulującej (żółty).
Rysunek 5: Zmiana pH w układzie reakcyjnym w funkcji początkowej objętości miareczkującego. Kwas dozowany jest niezwłocznie po około 38 s mieszania, co powoduje szybki spadek pH poniżej 8. Następnie automatycznie dozowane są kolejne ilości kwasu w taki sposób, aby po 30 s od pierwszej aplikacji pH wynosiło 7,0 ± 0,05. W przypadku nadmiernego miareczkowania nie udało się osiągnąć tej wartości, ponieważ początkowa dawka była wystarczająca, aby obniżyć pH poniżej 7, osiągając wartość 6,65 po 30 s. Początkowa objętość dodanego HCl dla wariantów „undershoot”, „baseline” oraz „overshoot” wynosiła odpowiednio 6,90, 7,05 i 7,20 ml.
![Wykres zależności [PEHA] od pH oraz powierzchni właścizej od pH, przedstawiający wyniki miareczkowania kwasowo-zasadowego i adsorpcji.](/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg "figure-results-6")
Rysunek 6: Reprezentatywne zmiany właściwości po zakwaszeniu materiału z koagulowanego krzemiona. (a) Zmiana stężenia dodatku w zależności od pH oraz (b) zmiana porowatości krzemionki w zależności od pH. Odtworzono z Manning i in. 13 na licencji Creative Commons.
Rycina 7Stężenie BSA w supernatantach z syntezy bioinspirowanej krzemionkiPrzeprowadzono analizy metodą Bradforda na nadfiltrach po wirowaniu, aby określić względną ilość pozostałej substancji (a tym samym ilość uwięzioną w syntetyzowanej krzemionce).
Rysunek 8: Analiza FTIR krzemionki bioinspirowanej z enkapsulacją i bez enkapsulacji gatunków aktywnychWidma przedstawiają: linia czarna: bioinspirowana krzemionka, linia szara: czyste BSA, linia niebieska: bioinspirowana krzemionka z zaabsorbowanym BSA. Pionowe linie przerywane wskazują charakterystyczne pasma amidowe.
Rysunek 9: Wydajność immobilizacji oraz ilość BSA w kompozycie dla krzemionki otrzymanej przy użyciu PEHA. Dodano BSA (A) w roztworze PEHA przed zmieszaniem z krzemianem, (B) w roztworze krzemianów przed zmieszaniem z PEHA, (C) po wstępnym zmieszaniu roztworów PEHA i krzemianów, oraz (D) po zmieszaniu roztworów PEHA i krzemianu oraz neutralizacji. Wydajność mierzono jako % BSA zamkniętego w kapsułkach z mieszaniny reakcyjnej w stosunku do całkowitej ilości dodanego BSA, natomiast BSA w krzemionce oznacza % stężenie BSA w końcowym kompozycie krzemionkowym w przeliczeniu na masę. Słupki błędów przedstawiają jedno odchylenie standardowe od średniej.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiono metodę szybkiego wytrącania bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i enkapsulacji w nich biomolekuł. Pokazujemy krytyczne etapy procedury, a mianowicie ilość kwasu inicjującego reakcję, który należy dodać, oraz czas dodania kapsułki biomolekułowej. Pokazujemy wpływ ilości dodatku kwasu zarówno na postęp reakcji, jak i wydajność (odpowiednio rysunek 4 i rysunek 5) oraz zademonstrowaliśmy metodę ścisłej kontroli warunków syntezy, pozwalającą na spójność pomimo tej czułości. Jeśli chodzi o enkapsulację związków aktywnych, chociaż jest to proste pod względem procedury, wykazano, że enkapsulacja jest wrażliwa na warunki eksperymentu (kolejność dodawania, pH dodawania, warunki środowiskowe), jednak spójność właściwości materiału jest ponownie osiągalna.
Warunki syntezy mogą być modyfikowane poprzez stosowanie różnych dodatków, z których wiele zostało opublikowanych gdzie indziej,15 zapewniając szereg morfologii i porowatości. Ponadto opisano postsyntetyczne techniki modyfikacji i chemicznego dostosowywania materiałów krzemionkowych inspirowanych biologicznie, takie jak łagodne oczyszczanie13 i dekorowanie powierzchni aminami. 20 Wreszcie, ze względu na łagodny, wodny charakter syntezy, enkapsulacja in situ jest możliwa dla szerszego zakresu substratów niż te pokazane tutaj, począwszy od enzymów17,18 do całych komórek21, soli metali22, aktywnych składników farmaceutycznych23 i kropek kwantowych. 24
W przeciwieństwie do innych syntez krzemionki za pośrednictwem substancji organicznych (takich jak rodzina materiałów MCM-41 lub SBA-15), wielofunkcyjny charakter dodatków inspirowanych biologicznie nie może wytwarzać uporządkowanych struktur porowych ani wysoce monodyspersyjnych rozkładów wielkości cząstek charakterystycznych dla krzemionki typu Stöbera. 25 Wynika to z braku dobrze zdefiniowanego zachowania micelizacji dodatków inspirowanych biologicznie (poza szczególnymi przypadkami)26 w połączeniu z ich zwiększoną aktywnością katalityczną w porównaniu z monofunkcyjnymi dodatkami zawierającymi aminy. 26
Z drugiej strony, ten wielofunkcyjny charakter dodatku umożliwia stosowanie krótszych czasów reakcji oraz łagodniejszej temperatury i ciśnienia w porównaniu z innymi syntezami krzemionki za pośrednictwem substancji organicznych. Prowadzi to również do możliwości elucji addytywnej w temperaturze pokojowej, jak opisano powyżej, co nie zostało jeszcze osiągnięte w przypadku tych innych rodzin krzemionki ze względu na specyfikę ich chemii powierzchniowej. 27,28,29 W związku z tym wykazano, że materiały krzemionkowe inspirowane biologicznie są zarówno bardziej ekonomiczne, jak i praktyczne do produkcji na większą skalę, co prowadzi do łatwiejszej komercjalizacji i rozwoju. 14
Podsumowując, synteza krzemionki inspirowana biologicznie stanowi szybką, łatwą metodę wytwarzania nośników z form aktywnych lub pożywek sorbentowych gazów. Dzięki ścisłej kontroli pH w trakcie i po reakcji można zsyntetyzować szeroką gamę kompozytów krzemionkowo-aminowych o różnych właściwościach, co jest dodatkowo uzupełnione możliwością enkapsulacji in situ szeregu różnych materiałów organicznych, nieorganicznych lub bioorganicznych. Chociaż niezależna postsyntetyczna modyfikacja bioinspirowanych dodatków i stężeń enkapsulantów nie została jeszcze osiągnięta, metody te stanowią obiecujący krok w kierunku przyjaznych dla środowiska procesów chemicznych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Wydziału Inżynierii Chemicznej i Biologicznej (University of Sheffield) oraz EPSRC (EP/L017059/1 i EP/P006892/1).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Synteza krzemionki | |||
| Pentahydrat krzemianu sodu | Fisher scientific | 10070470 | |
| Heksaminana pentaetylenowa (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Dietylenotriamina (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toksyczna |
| trietylenotetraamina (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poli(etylenimina) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1,2 tys. MW |
| Poli(chlorowodorek alliloaminy) (WWA) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17,5 tys. MW |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Kwas solny (HCl) 1M | Test | ||
| Silicomolibdic | |||
| Ammonium molibdenian tetrahydrat | Sigma-Aldrich | A7302 | Produkt zastąpiony przez M1019 |
| Kwas solny (HCl) 37,0% wag | Fluka Analytical | 84436 | |
| Bezwodny kwas szczawiowy | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Siarczan para-aminofenolu | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sód siarczyn | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Kwas siarkowy | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford test | |||
| Bradford odczynnik | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Sprzęt | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 mieszadło magnetyczne | Metrohm | 2.801.0040 | Do użytku z powyżej |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | Do użytku z powyższym |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | Do użytku z powyższą |
| wirówką Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Kod dotyczy Fisher scientific |
| UV-Vis spektrofotometr Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Kod jest dla Fisher scientific |
Bibliografia
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277(2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844(2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164(2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
Przedruki i uprawnienia
