Artykuł metodologiczny

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 września 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna transkrypcja jest wymagana dla wiernego wyrażenia informacji genetycznej. Co zaskakujące, niewiele wiadomo o mechanizmach kontrolujących wierność transkrypcji. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy naukowej, niedawno zoptymalizowaliśmy test sekwencjonowania kołowego w celu wykrycia błędów transkrypcji w całym transkryptomie Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans. Protokół ten zapewni naukowcom nowe, potężne narzędzie do mapowania krajobrazu błędów transkrypcji w komórkach eukariotycznych, dzięki czemu mechanizmy kontrolujące wierność transkrypcji będą mogły zostać wyjaśnione w niespotykanych dotąd szczegółach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom dostarcza precyzyjnego biologicznego planu życia. Aby prawidłowo wdrożyć ten plan, ważne jest, aby genom został przepisany z dużą precyzją. Jednak jest mało prawdopodobne, aby transkrypcja była wolna od błędów. Na przykład, polimerazy RNA od dawna są znane z podatności na błędy in vitro1,2, a ostatnio wykazano, że popełniają błędy również in vivo3,5,6, szczególnie w przypadku uszkodzenia DNA7,8,9,10. Podsumowując, obserwacje te wskazują, że błędy transkrypcji występują w sposób ciągły we wszystkich żywych komórkach, co sugeruje, że mogą one być silnym źródłem zmutowanych białek.

Ten proces, określany jako mutageneza transkrypcyjna, różni się od klasycznej mutagenezy na dwa sposoby. Po pierwsze, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, błędy transkrypcji dotyczą zarówno komórek mitotycznych, jak i postmitotycznych, ponieważ nie zależą od replikacji DNA. Badanie mechanizmów wpływających na wierność transkrypcji dostarczy zatem cennych informacji na temat obciążenia mutacjami zarówno komórek mitotycznych, jak i postmitotycznych. Co ciekawe, błędy w transkrypcji zostały ostatnio powiązane z promowaniem agregacji białek11,12,13 i przypuszcza się, że przyczyniają się zarówno do kancerogenezy10, jak i do rozwoju oporności bakterii na antybiotyki14.

Po drugie, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, błędy w transkrypcji są z natury przejściowe. Ich tymczasowe istnienie jest szczególnie trudne, ponieważ sprawia, że błędy transkrypcji są niezwykle trudne do wykrycia. Na przykład, podczas gdy kilka laboratoriów opracowało cenne testy reporterowe do badania mutagenezy transkrypcyjnej, testy te są w stanie zmierzyć błędy transkrypcji tylko w ograniczonej liczbie kontekstów i organizmów modelowych4,15. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wielu badaczy zwróciło się ku technologii sekwencjonowania RNA (RNA-seq), która teoretycznie umożliwia rejestrowanie błędów transkrypcji w całym transkryptomie dowolnego gatunku. Jednak badania te można łatwo zmylić artefaktami konstrukcyjnymi biblioteki, takimi jak błędy odwrotnej transkrypcji, błędy amplifikacji PCR i podatny na błędy charakter samego sekwencjonowania. Na przykład odwrotne transkryptazy popełniają w przybliżeniu jeden błąd co ~20 000 zasad, podczas gdy polimerazy RNA (RNAP) powinny popełniać tylko jeden błąd co 300 000 zasad5,6. Ponieważ wskaźnik błędów samej odwrotnej transkrypcji przyćmiewa wskaźnik błędów polimeraz RNA wewnątrz komórek, praktycznie niemożliwe jest odróżnienie prawdziwych błędów transkrypcji od artefaktów spowodowanych przygotowaniem biblioteki w tradycyjnych danych sekwencyjnych RNA-Seq (Rysunek 1a).

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zoptymalizowaną wersję testu sekwencjonowania okręgowego (Cirseq lub C-seq dalej)5,16. Ten test pozwala użytkownikowi wykryć błędy transkrypcji i inne rzadkie warianty RNA w całym transkryptomie5. Test sekwencjonowania kołowego nosi tę nazwę, ponieważ kluczowy krok w tym teście obraca się wokół krążenia RNA. Gdy cele RNA zostaną zamknięte, są one transkrybowane wstecznie w sposób toczącego się koła, w celu wytworzenia liniowych cząsteczek cDNA, które zawierają wiele kopii tej samej matrycy RNA. Gdyby błąd był obecny w jednej z tych matryc, błąd ten byłby również obecny w każdym pojedynczym powtórzeniu zawartym w cząsteczce cDNA. W przeciwieństwie do tego, błędy wprowadzone przez odwrotną transkrypcję, amplifikację PCR lub sekwencjonowanie mają tendencję do pojawiania się losowo, a zatem będą obecne tylko w jednym lub dwóch powtórzeniach. W ten sposób, generując sekwencję konsensusu dla każdej cząsteczki cDNA i odróżniając błędy losowe od błędów występujących we wszystkich powtórzeniach, artefakty konstrukcji biblioteki można skutecznie oddzielić od prawdziwych błędów transkrypcji (Rysunek 1b).

Jeśli zostanie prawidłowo użyty, test C-seq może być użyty do dokładnego wykrycia szybkości podstawień, insercji i delecji zasad w RNA w transkryptomie dowolnego gatunku (na przykład, zobacz Traverse i Ochman17). Na przykład użyliśmy testu C-seq, aby zapewnić pomiary całego genomu poziomu błędu transkrypcji u Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans z pojedynczą rozdzielczością podstawową5 (obserwacje niepublikowane). Ta zoptymalizowana wersja testu C-seq, pierwotnie używana do dokładnego sekwencjonowania populacji wirusów RNA, została usprawniona w celu zminimalizowania trudnych warunków podczas przygotowywania biblioteki, które przyczyniają się do tworzenia artefaktów związanych z budową biblioteki. Ponadto, dzięki zastosowaniu szeregu dostępnych na rynku zestawów, wydajność testu jest znacznie poprawiona, a także jego przyjazność dla użytkownika. Przy prawidłowym zastosowaniu, test ten może dokładnie wykryć tysiące błędów transkrypcji na powtórzenie, co znacznie poprawia wyniki w porównaniu z poprzednimi badaniami6. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania mutagenezy transkrypcyjnej i pozwoli użytkownikowi uzyskać nowy wgląd w mechanizmy kontrolujące wierność transkrypcji w szerokim zakresie organizmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. RNazy są wszechobecne, dlatego należy dokładnie oczyścić miejsce pracy, spryskując je odczynnikiem odkażającym (np. RNase AWAY) i 70% etanolem. Spryskaj wszystkie pipety, pisaki lub stojaki na probówki, aby usunąć potencjalne źródła zanieczyszczenia RNazą.
  2. Aby jeszcze bardziej zapobiec zanieczyszczeniu próbek przez RNazy, podczas eksperymentów noś fartuch laboratoryjny lub koszulkę z długim rękawem. Należy unikać kontaktu rękawic z wnętrzem tubek, które będą używane, zwłaszcza podczas wyjmowania ich z pudełka lub torby.
  3. Przed odwrotną transkrypcją należy często zmieniać rękawiczki.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, nie przerywaj eksperymentu przed odwrotną transkrypcją.

2. Hodowla i kolekcja komórek i zwierząt

  1. Wzrost i zbiór Saccharomyces cerevisiae
    1. Jeśli pożądana jest biblioteka C-seq z drożdży, najpierw zaszczepij pojedynczą kolonię S. cerevisiae w 3 ml pożywki zawierającej ekstrakt drożdżowy, adeninę, pepton i dekstrozę (YAPD) i inkubuj ją przez noc w temperaturze 30 °C w bębnie do toczenia.
    2. Rano ponownie zaszczepić kulturę w 50 ml pożywki YAPD do gęstości optycznej (OD) 0,1 i hodować komórki, aż osiągną OD 0,5–0,7 (~7 x 106 komórek/ml).
    3. Zebrać całą 50 ml kultury (około 350 x 106 komórek) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wirować komórki przez 3 minuty przy 2,100 x g. Ostrożnie wyjmij pożywkę YAPD i umyj granulkę raz 1x PBS.
    4. Następnie ponownie zawieś osad w 480 μl buforu do lizy, 48 μl 10% SDS i 480 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1), pH 6,8. Wirować próbkę z maksymalną prędkością przez 5 s i przenieść ją do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml z 750 μl lodowatych kulek cyrkonu (dostarczonych z zestawem). Przejdź do kroku 3 tego protokołu dotyczącego lizy komórek i ekstrakcji całkowitego RNA.
      UWAGA: Wszystkie odczynniki wymagane w kroku 2.1.4 znajdują się w zalecanym zestawie do ekstrakcji RNA drożdży. Odczynniki te działają równie dobrze w przypadku drożdży, robaków i much, tak że po zebraniu drożdży (krok 2.1), robaków (krok 2.2) lub much (krok 2.3) można zastosować ujednolicone podejście do generowania bibliotek C-seq (kroki 3-10).
  2. Kultura i kolekcja Caenorhabditis elegans
    1. Jeśli pożądana jest biblioteka C-seq z robaków, umieść 30 dorosłych robaków na świeżym talerzu agaru nakrapianego bakteriami OP50.
      UWAGA: Pięć płytek wystarcza na 1 replikę.
    2. Hoduj robaki przez 4 dni i zbieraj robaki, delikatnie myjąc płytki 5 ml pożywki M9 i połącz robaki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Obracaj robaki w tempie 100 x g przez 2 minuty, aby uzyskać granulkę. Zwolnij wirówkę z najniższą możliwą prędkością, aby nie naruszyć osadu.
    4. Delikatnie przenieś robaki do probówki o pojemności 1,5 ml, umyj je dwukrotnie w 1,5 ml pożywki M9 i odwiruj probówkę o stężeniu 100 x g przez 1 minutę, aby usunąć bakterie i wytworzyć czystą 100 μl osadki robaków.
    5. Ponownie zawiesić robaki w 480 μl buforu do lizy, 48 μl 10% SDS i 480 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego. Wirować próbkę z maksymalną prędkością przez 5 s i przenieść ją do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl lodowatych kulek cyrkonu. Przejdź do kroku 3 tego protokołu w celu lizy robaków i całkowitej ekstrakcji RNA.
  3. Hodowla i kolekcja Drosophila melanogaster
    1. Jeśli pożądana jest biblioteka C-seq od much, pohoduj 20-25 much w fiolkach zawierających dekstrozę lub pożywkę na bazie melasy. Podzielić muchy na 3 fiolki, tak aby każda fiolka zawierała około 8 much.
    2. Aby zebrać muchy, umieść fiolkę w pojemniku z lodem, aż muchy zostaną uspokojone. Następnie zbierz je szczoteczką do probówki o pojemności 1,5 ml. Nie zbieraj much przez oczyszczanie CO2 .
    3. Pozwól muszkom ogrzać się do temperatury pokojowej (RT) i szybko dodaj do probówki gotową mieszaninę 500 μl buforu do lizy, 50 μl 10% SDS i 500 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego. Użyj mikrotłuczka, aby zmielić muchy około 15 pociągnięciami, którym towarzyszy zdecydowany ruch skręcający, gdy tłuczek dotrze do dna tuby.
    4. Wlej mieszaninę much i pożywki do lizy do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl lodowatych kulek cyrkonu i wiruj ją z maksymalną prędkością przez 5 sekund. Przejdź do kroku 3 tego protokołu dotyczącego lizy muszek i całkowitej ekstrakcji RNA.

3. Całkowite oczyszczanie RNA

UWAGA: W tym momencie wszystkie trzy protokoły zbiegają się i można użyć jednego, ujednoliconego podejścia do generowania bibliotek C-seq.

  1. Mocno przykręć nakrętkę i przymocuj rurkę do wirownika za pomocą adaptera lub taśmy klejącej. Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez 10 minut, aby uzyskać lizę próbek. Następnie odwirować próbkę o masie 16 100 x g przez 5 minut, aby oddzielić rozpuszczalniki organiczne od fazy wodnej.
  2. Ostrożnie usunąć 400–500 μl fazy wodnej, nie naruszając białej, mętnej interfazy, i dodać ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1,9 ml buforu wiążącego. Dokładnie je wymieszaj, wirując.
  3. Dodaj 1,25 ml 100% etanolu i wymieszaj próbkę przez wirowanie. Przenieść 700 μl próbki do wkładu filtracyjnego umieszczonego w probówce zbiorczej i wirować próbkę pod ciśnieniem 14 500 x g przez 30 s. Powtarzaj tę czynność, aż cała próbka zostanie przepuszczona przez wkład.
    UWAGA: W tym momencie próbka może stać się lekko nieprzezroczysta. Jeśli zbyt wiele komórek, robaków lub much zostanie poddanych lizie, mogą pojawić się osady, które mogą zatkać filtr.
  4. Umyć filtr raz 700 μl roztworu myjącego 1 i dwukrotnie 500 μl roztworu płuczącego 2 lub 3. Zakończ mycie, obracając próbki w temperaturze 14 500 x g przez 2 minuty, aby usunąć nadmiar etanolu.
  5. Przenieść wkład filtra do probówki delfina o pojemności 1,5 ml i dodać 108 μl wstępnie podgrzanego roztworu elucyjnego (65 °C).
    UWAGA: Nigdy nie wystawiaj próbek RNA na działanie temperatur wyższych niż 65 °C przed odwrotną transkrypcją, ponieważ spowoduje to zdarzenia deaminacji cytozyny do uracylu, których nie można odróżnić od błędów transkrypcji.
  6. Poddać degradacji zanieczyszczenia DNA w wyizolowanym RNA (patrz kroki 2.1–3.4) poprzez dodanie 11 μl 10x buforu DNazy I, 2 μl inhibitora RNazy i 4 μl inhibitora DNazy I (8 U) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  7. Po roztrawieniu dodać 11 μl odczynnika do inaktywacji DNazy. Zmieszaj mieszaninę i pozostaw w temperaturze RT na 5 minut. Następnie odwirować próbkę o masie 15 000 x g przez 3 minuty, aby zagnieździć odczynnik inaktywacyjny i zebrać 110 μl supernatantu bez naruszania osadu. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Prawidłowe pipetowanie odczynnika do inaktywacji DNazy może być dość trudne, dlatego po każdym pipetowaniu należy sprawdzić wzrokowo końcówkę pipety. Jeśli odczynnik inaktywacyjny staje się zbyt lepki, aby można go było pipetować, dodać 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) równe 1/5 pozostałej objętości.
  8. (Kontrola jakości) Zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Następnie odłóż 1 μl całkowitego RNA i rozcieńcz go do stężenia 10 ng/μl w wodzie wolnej od nukleaz (NF). Uruchom RNA na odpowiednim przyrządzie do analizy nukleotydów z taśmą RNA o wysokiej czułości, aby upewnić się, że RNA nie ulega degradacji i ma wartość eRIN co najmniej 8,5 lub wyższą (Rysunek 2B).

4. Wzbogacanie mRNA

  1. Wykonaj wzbogacenie mRNA za pomocą zestawu do minipreparacji mRNA (patrz tabela materiałów). Dodać 140 μl wody NF do próbki, aby uzyskać całkowitą objętość 250 μl. Następnie dodaj 250 μl 2x buforu wiążącego, dokładnie wymieszaj próbkę przez wirowanie i dodaj 15 μl kulek oligo(dT).
  2. Wymieszać próbkę pipetując ją w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 minuty. Następnie umieścić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Na koniec odwirować próbkę przy 16 100 x g przez 2 minuty, aby zagnieździć kompleksy kulki: mRNA.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl roztworu do płukania. Przenieś roztwór do kolumny wirującej i wiruj przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Odrzucić przepływowy roztwór i przemyć próbkę dodatkowymi 500 μl roztworu myjącego. Następnie wiruj próbkę przez 2 minuty w temperaturze 15 000 x g, aby usunąć nadmiar etanolu z filtrów wirowych.
  4. Przenieść filtr wirowy do rurki delfina i ponownie zawiesić osad w kolumnie z 80 μl wstępnie podgrzanego roztworu elucyjnego (65 °C). Inkubować próbkę przez 1,5 minuty w temperaturze 65 °C i eluować ją, obracając ją przez 1 minutę przy 15 000 x g.
  5. Zmierzyć stężenie oczyszczonego RNA za pomocą spektrofotometru lub podobnego narzędzia, które pozwala na ilościowe określenie stężenia i jakości RNA.

5. Fragmentacja RNazy III i oczyszczanie RNA

UWAGA: (Ważne) Aby przygotować okrągłe cząsteczki RNA odpowiednie do generowania bibliotek C-seq, RNA musi być rozdrobnione do około 60-80 zasad długości. Podczas gdy poprzednie metody wykorzystywały fragmentację chemiczną do fragmentacji RNA, fragmentacja chemiczna metalami ciężkimi wprowadza uszkodzenia próbek RNA, które mogą zostać błędnie zinterpretowane jako błędy transkrypcji podczas końcowej analizy. Aby obejść ten problem, zamiast tego polegaj na fragmentacji przy użyciu RNazy III w celu wygenerowania małych fragmentów. Dodatkową zaletą tego podejścia enzymatycznego jest to, że tworzy ono kompatybilne końce wymagane do ligacji, eliminując potrzebę naprawy końcówki po fragmentacji chemicznej.

  1. Ustawić reakcję fragmentacji RNA z 1 μg oczyszczonego RNA, 10 μl buforu reakcyjnego, 5 μl RNazy III i wystarczającą ilością wody NF, aby uzyskać objętość do 100 μl (patrz tabela materiałów). Dodaj enzym na końcu i pipetuj mieszaninę w górę iw dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 25 minut, co prowadzi do wytworzenia fragmentów RNA o długości około 60-80 zasad.
  2. Po zakończeniu 25-minutowej inkubacji należy natychmiast oczyścić reakcję za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora oligonukleotydów (patrz tabela materiałów), aby zapobiec dalszemu trawieniu. Dodać 200 μl buforu wiążącego oligonukleoty do próbki, dokładnie wymieszać przez wirowanie i dodać 800 μl 100% etanolu. Wymieszaj próbkę przez wirowanie i przenieś ją do dostarczonej kolumny wirowej w probówce zbiorczej.
  3. Odwirować próbkę przy 10 000 x g przez 30 s i przepłukać ją 750 μl buforu do przemywania w celu usunięcia RNazy III. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 30 s, odrzucić przepływowy przepływ i ponownie przepłukać próbkę 750 μl buforu do przemywania zgodnie z powyższym opisem. Po odrzuceniu drugiego przepływu należy odwirować kolumnę przy 15 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia nadmiaru etanolu.
  4. Przenieść kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i eluować próbkę w 24 μl wody NF, obracając ją w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę.
  5. KONTROLA JAKOŚCI: Weź 2 μl oczyszczonych fragmentów RNA i rozcieńcz je 2-krotnie, dodając do nich 2 μl wody NF. Uruchom rozdrobniony RNA na taśmie sitowej, aby upewnić się, że rozdrobniony RNA ma długość 50–100 zasad (Rysunek 2c).

6. Cyrkularyzacja RNA i odwrotna transkrypcja toczącego się koła

  1. Aby wprowadzić fragmenty RNA do cyrkulacji, należy poddać denaturacji termicznej 20 μl próbki w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i natychmiast umieścić ją na lodzie na 2 minuty. Następnie dodaj 4 μl 10x buforu ligazy T4 RNA, 4 μl 10 mM ATP, 1 μl inhibitora RNazy, 1 μl wody NF i 8 μl 50% glikolu polietylenowego (PEG).
  2. Dokładnie wymieszać próbkę przez wirowanie, a następnie dodać 2 μl 10 U/μL ligazy T4 RNA Ligazy I. Ponownie wymieszać próbkę pipetując ją i inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 godziny w termocyklerze o temperaturze pokrywki ustawionej na 30 °C.
  3. Po 2 godzinach dodać do próbki 10 μl wody NF i oczyścić próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania i zatężania oligonukleocytów zgodnie ze specyfikacją producenta. Eluować próbkę w 20 μl wody NF.
  4. Aby odwrócić transkrypcję kolistych cząsteczek RNA, dodaj 4 μl 10 mM dNTP, 4 μl losowych heksamerów 50 ng / μL i 9 μl wody NF do 9 μl RNA. Wszystko dokładnie wymieszać pipetując, zdenaturować próbkę w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i umieścić ją na lodzie na 2 minuty. Przechowuj pozostały RNA jako kopię zapasową.
  5. Dodaj 8 μl 5x buforu do syntezy pierwszej nici, 2 μl 0,1 mM DTT i 4 μl 200 U/μL odwrotnej transkryptazy i wymieszaj wszystko przez pipetowanie. Inkubować próbkę w temperaturze 25 °C przez 10 minut, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 42 °C z pokrywką ustawioną na temperaturę o 5 °C wyższą niż temperatura inkubacji.
    UWAGA: Na tym etapie należy użyć odwrotnej transkryptazy z możliwością przemieszczania nici, aby umożliwić odwrotną transkrypcję w okręgu tocznym.
  6. Do próbki dodać 10 μl wody NF i oczyścić ją za pomocą zestawu oligo clean-up and concentration kit zgodnie z zaleceniami producenta. Eluować próbkę w 42 μl roztworu elucyjnego.
  7. KONTROLA JAKOŚCI: Rozcieńczyć 2 μl jednoniciowego cDNA w 2 μl wody NF i uruchomić tę próbkę na przyrządzie do analizy nukleotydów z taśmą RNA o wysokiej czułości. Jeśli odwrotna transkrypcja działała prawidłowo, biblioteka cząsteczek cDNA o długości około 60-1500 zasad powinna być widoczna. Idealnie, większość cDNA mieści się w zakresie 500–1000 zasad (Rysunek 2d).

7. Synteza i naprawa końca drugiej nici cDNA

  1. Użyj zestawu do syntezy drugiej nici, aby wygenerować dwuniciową bibliotekę cDNA. Umieść próbki na lodzie i dodaj 30 μl wody NF do 38 μl próbki. Następnie dodać 8 μl 10-krotnego buforu drugiej nici i 4 μl enzymu drugiej nici i wymieszać próbkę za pomocą delikatnego pipetowania przed jej inkubacją w temperaturze 16 °C przez 2,5 godziny.
  2. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i zagęszczania oligonugotechników zgodnie z zaleceniami producenta dla reakcji 100 μl i eluuj próbki w 38 μl wody NF.
  3. Ustaw reakcję naprawy końcowej, dodając 20 μl wody NF do 35,5 μl dwuniciowego cDNA, 6,5 μl buforu reakcyjnego naprawy końcowej i 3 μl mieszanki enzymów przygotowania końca. Dokładnie sprawdzić bufor reakcyjny pod kątem białych osadów i rozpuścić je przez ręczne ogrzewanie, jeśli jest obecne.
  4. Wymieszać reakcję naprawy końcowej przez pipetowanie i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut, a następnie drugą 30 minutową inkubację w temperaturze 65 °C. Ustawić temperaturę pokrywy termocyklera na 5 °C wyższą niż temperatura inkubacji.

8. Podwiązanie adaptera i wybór rozmiaru przygotowanych bibliotek

  1. Do końcowego przygotowania biblioteki należy skorzystać z wieloetapowego modułu przygotowania biblioteki (patrz Spis materiałów). Najpierw należy rozcieńczyć adaptery do sekwencjonowania nowej generacji 10-krotnie w 10 mM Tris-HCl do końcowego stężenia 1,5 μM. Następnie dodaj 2,5 μl rozcieńczonego łącznika i 1 μl wzmacniacza ligacji do każdej próbki i wymieszaj je przez wirowanie.
  2. Dodać 15 μl Blunt/TA Ligase Master Mix, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut. Następnie dodać 3 μl enzymu odczynnika do wycinania swoistego dla uracylu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po zakończeniu ligacji dodać do próbki 13,5 μl wody NF o całkowitej objętości 100 μl i przystąpić do wyboru wielkości.
    UWAGA: Najlepiej jest dokonać selekcji rozmiarów cząsteczek cDNA o długości 600–800 zasad. Jeśli rozdrobnione cząsteczki RNA miały około 60-80 zasad długości, wybór cząsteczek o długości 600-800 zasad zapewni, że większość wybranych cząsteczek będzie zawierała co najmniej trzy powtórzenia tandemowe, co jest idealne do dalszego przetwarzania i analizy.
  3. Aby wybrać cząsteczki o długości 600–800 pz, należy dodać 30 μl zawieszonych kulek magnetycznych (patrz tabela materiałów), zaaklimatyzowanych do RT, do każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym na 5 minut, aby oddzielić kulki od supernatantu. Przenieś supernatant (który zawiera pożądane cząsteczki cDNA) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i wyrzuć kulki magnetyczne (które są związane z dużymi cząsteczkami cDNA).
  5. Do każdej próbki dodać świeżą porcję 15 μl kulek magnetycznych, dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Umieścić próbki na stojaku magnetycznym i inkubować je przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć kulek.
    UWAGA: Nie wyrzucaj kulek magnetycznych, które teraz zawierają pożądane docelowe cDNA.
  6. Dodać 200 μl 80% świeżo przygotowanego etanolu do każdej z próbek, nie naruszając granulowanych kulek magnetycznych i inkubować przez 30 sekund. Wyrzucić etanol i ponownie przemyć próbki 80% etanolem. Następnie całkowicie usuń wszelkie ślady etanolu z próbek i wysusz kulki na powietrzu przez 5 minut, uważając, aby nie przesuszyć kulek. Jeśli koraliki zostaną przesuszone, w granulkach pojawią się pęknięcia.
  7. Aby wymyć próbki z kulek, wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 19 μl 10 mM Tris-HCl. Pipetować w górę i w dół wiele razy, aby ponownie zawiesić kulki i inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli koraliki były przesuszone, inkubuj je przez >10 min.
  8. Umieść próbki z powrotem na stojaku magnetycznym i inkubuj je przez 5 minut, aby oddzielić kulki od supernatantu. Ostrożnie usunąć z probówek 15 μl supernatantu zawierającego oczyszczone, dobrane pod względem wielkości biblioteki cDNA i przenieść je do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.

9. Amplifikacja PCR i końcowe oczyszczanie kulek

  1. Dodać 5 μl uniwersalnego startera i 5 μl unikalnego startera indeksowego (patrz tabela materiałów) do każdej oczyszczonej biblioteki cDNA i dokładnie wymieszać je przez pipetowanie. Dokładnie sprawdzić mieszaninę wzorcową polimerazy pod kątem kryształów i innych osadów i ogrzać mieszankę wzorcową ręcznie, aż osady się rozpuszczą.
    1. Dodać 25 μl głównej mieszanki polimerazy do próbki, wymieszać je przez pipetowanie i postępować zgodnie z poniższymi warunkami cykliczności dla amplifikacji PCR. Przeprowadzić początkową denaturację w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie przeprowadzić dwuetapową reakcję PCR, polegającą na denaturacji próbek w temperaturze 98 °C przez 10 s i wyżarzaniu/przedłużaniu produktów PCR w temperaturze 65 °C przez 75 s (12 razy), a następnie końcowym przedłużeniu w temperaturze 65 °C przez 5 minut i bezterminowym zatrzymaniu w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyść końcowe biblioteki, dodając 45 μl zawieszonych kulek magnetycznych bezpośrednio do reakcji PCR, wymieszaj je przez pipetowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i umieść ją w stojaku magnetycznym. Inkubować przez 5 minut, wyrzucić supernatant i przemyć go dwukrotnie świeżo przygotowanym 80% etanolem przez 30 sekund.
  3. Po drugim płukaniu całkowicie usunąć etanol z próbki i wysuszyć granulkę kulki na powietrzu przez 5 minut i wymyć ją w 35 μl 0,1x TE. Zawiesić kulki przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i po 5 minutach przenieść 30 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać biblioteki w temperaturze -80 °C.
  4. KONTROLA JAKOŚCI: Rozcieńczyć 1 μl końcowej biblioteki w 9 μl wody NF i uruchomić próbkę na dedykowanym przyrządzie do analizy DNA z chipem o wysokiej czułości; większość cDNA powinna mieć długość w zakresie 600–800 pz (Rysunek 2e).
  5. Po elucji wyślij próbki do sekwencjonowania na masowo równoległej platformie sekwencjonowania przy użyciu 250 bp odczytów sparowanych końców lub 300 bp odczytów pojedynczych końców.

10. Bioinformatyczna analiza danych sekwencjonowania okręgów

UWAGA: Analiza i interpretacja surowych danych z testu C-seq wymaga dedykowanego potoku bioinformatycznego. Schemat rurociągu, który został wykorzystany do naszych analiz, jest przedstawiony na Rysunek 3. Pobierz ten potok pod adresem https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Najpierw przytnij odczyty, aby usunąć sekwencje adapterów i wywołania podstawowe o niskiej jakości za pomocą cutadapt18, używając progu wyniku jakości 20.
  2. Następnie zidentyfikuj powtórzenia kodowane przez skonkatemeryzowaną cząsteczkę RNA za pomocą odpowiedniego algorytmu, aby wykryć wszelkie powtórzenia o minimalnym rozmiarze 30 nukleotydów i maksymalnie 2 niezgodnościach między powtórzeniami18. Na podstawie tych powtórzeń wyznacz sekwencję konsensusu i śledź wszystkie podstawowe wywołania oraz powiązane wyniki jakości na każdej pozycji.
    UWAGA: Ponieważ odwrotna transkrypcja może rozpocząć się w dowolnym miejscu na kolistej cząsteczce RNA, początek powtórzenia niekoniecznie odpowiada końcowi 5′ fragmentowanej cząsteczki RNA (dalej nazywanej punktem ligacji). W związku z tym sekwencja konsensusu nie będzie w sposób ciągły odwzorowywana względem odpowiadającego jej transkryptomu, co wymaga identyfikacji punktu podwiązania.
  3. Aby zidentyfikować punkt ligacji, odwzoruj konkatelem sekwencji konsensusu względem transkryptomu referencyjnego za pomocą narzędzia do wyrównania podobnego do BLAST (BLAT)19.
    1. Połącz dwie instancje sekwencji konsensusu, aby upewnić się, że zmapowana sekwencja zawiera co najmniej jedno pełne, nieprzerwane wystąpienie początkowej sekwencji fragmentu RNA. Następnie obróć sekwencję konsensusu, aby rozpocząć się w przewidywanej pozycji punktu podwiązania.
  4. Zmapuj obrócone sekwencje konsensusu względem genomu za pomocą TopHat20 i użyj dopasowań do wykrycia wszelkich polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), które można pomylić z błędami transkrypcji.
  5. Wywołaj błędy transkrypcji z zmapowanych obróconych sekwencji konsensusu i sprawdź, czy błędy kandydujące przejdą cztery dodatkowe testy.
    1. Po pierwsze, upewnij się, że błąd transkrypcji nie nakłada się na SNP (typowym wymaganiem jest to, że co najmniej 20 odczytów musi obejmować określoną bazę, a nie więcej niż 5% odczytów może obsługiwać alternatywne wywołanie podstawowe).
    2. Po drugie, sprawdź, czy sekwencja konsensusu pochodzi z co najmniej 3 powtórzeń tandemowych, z których każde wywołuje tę samą parę podstaw; i po trzecie, upewnij się, że suma wyników jakości tej pozycji musi przekraczać 100.
  6. W celu czwartej i ostatniej kontroli obróć sekwencję konsensusu we wszystkich możliwych kombinacjach (symulując wszystkie możliwe pozycje punktu ligacji) i zmapuj każdą wersję względem genomu referencyjnego za pomocą TopHat.
    UWAGA: Jeśli jedna z obróconych sekwencji znajdzie idealne dopasowanie w genomie, odpowiadający jej punkt ligacji jest teraz uważany za prawidłowy i wywołanie błędu transkrypcji powinno zostać odrzucone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak wszystkie metody sekwencjonowania masowo równoległego, każdy eksperyment C-seq tworzy nieporęczny, duży zbiór danych. W przypadku początkujących użytkowników obsługa tych zestawów danych może być trudna; Dlatego zaleca się, aby wszyscy użytkownicy skontaktowali się z doświadczonym bioinformatykiem przed eksperymentem. Średnio oczekuje się, że użytkownicy będą generować około 55–70 gigabaz (Gbases) na przebieg na większości masowo równoległych platform sekwencjonowania. W przy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół przygotowania bibliotek C-seq do wykrywania błędów transkrypcji u Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans. Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z istniejącymi protokołami, a także alternatywne techniki.

W ciągu ostatnich 15 lat opracowano liczne systemy reporterowe, które opierają się na lucyferazy 7,8 lub rekombinacji Cre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja była możliwa dzięki finansowaniu z grantu T32ES019851 (dla C. Fritscha), R01AG054641, oraz grantu dla młodych badaczy AFAR (dla M. Vermulsta).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oczyszczania RiboPure RNAThermoFisherAM1926oczyszczanie RNA
Zestaw do oczyszczania mRNA GeneluteSigma-AldrichMRN70-1KTOczyszczanie mRNA
Woda bez nukleazAmbionAM9937Elucja i rozcieńczenie
Ambion RNaza IIIThermoFisherAM2290Fragmentacja RNA
T4 RNA Ligaza 1 (ssRNA Ligaza)New England BiolabsM0204SCyrkularyzacja RNA
RibolockThermoFisherEO0381Inhibitor RNazy
SuperScript III Odwrotna transkryptaza ThermoFisher18080044Odwrotna transkrypcja w toczeniu
10 mM dNTP mixThermoFisher18427013Odwrotna transkrypcja w kształcie koła
Losowe heksamery (50 ng / & micro; L)ThermoFisherN8080127Rolling circle Odwrotna transkrypcja
Moduł syntezy drugiej nici NEB NewEngland BiolabsE6111SSynteza drugiej nici
NEBNext Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla IlluminaNew England BiolabsE7370SPrzygotowanie biblioteki
cDNA NEB Next Startery indeksu NEBE7335SMultipleksowe startery
PCROligo Czysty & KoncentratorZymo ResearchD4061Oczyszczanie próbek RNA i DNA
DynaMag-2 MagnetThermoFisher12321DMagnetyczne oczyszczanie kulek
Kulki AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetyczne oczyszczanie kulek
Eppendorf 5424Wirówka FisherScientific05-403-93Wirówka
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Hodowla komórkowa
T100 TermocyklerBIO RAD1861096Warunki cykliczne średniej i wysokiej temperatury
Termocykler PTC-200GMI8252-30-0001 Warunki cykliczne w niskiej temperaturze
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Sterylizacja
50 ml Probówka wirówkowaCorning43029015 ml bez nukleaz
Corning430052bez nukleaz
USA Scientific1615-5500System taśm 4200 bez nukleaz
AgilentG2991AAPrzyrząd do analizy nukleotydów do kontroli jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA
Taśma sitowa RNA o wysokiej czułościAgilent5067-5579Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA
Bufor do próbek RNA ScreenTapeAgilent5067-5577Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA
Drabinka RNA ScreenTapeAgilent5067-5578Kontrola jakości próbek RNA i jednoniciowego DNA
2100 Instrument do bioanalizacjiAgilentG2939BAKontrola jakości dwuniciowego DNA
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626Kontrola jakości dwuniciowych próbek cDNA
Kąpiel wodnaVWR462-0244Inkubacja
Spektrofotometr NanoDrop 2000/2000CThermoFisherND-2000COznaczanie stężenia RNA
Całkowite Probówka wirówkowa Probówki Eppendorf

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza sekwencjonowania kolistegowierno polimerazy RNASaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis eleganscyklizacja fragment w RNAligaza RNA T4odwrotna transkrypcjasynteza drugiej niciligacja adapter wselekcja wielko ci za pomoc kulek magnetycznychamplifikacja PCRoczyszczanie biblioteki

Powiązane artykuły