Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Summary

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Abstract

Zmęczenie jest powszechnym i wyniszczającym stanem, który dotyka większość pacjentów z rakiem. Do tej pory zmęczenie pozostaje słabo scharakteryzowane i nie ma testu diagnostycznego, który obiektywnie mierzyłby nasilenie tego stanu. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę oceny funkcji mitochondriów PBMC pobranych od zmęczonych pacjentów z rakiem. Korzystając ze zwartego systemu strumienia zewnątrzkomórkowego i sekwencyjnego wstrzykiwania inhibitorów oddechowych, zbadaliśmy stan funkcjonalny mitochondriów PBMC, mierząc podstawowe oddychanie mitochondrialne, wolną wydolność oddechową i fenotyp energetyczny, który opisuje preferowany szlak energetyczny w odpowiedzi na stres. Świeże PBMC są łatwo dostępne w warunkach klinicznych przy użyciu standardowej flebotomii. Cały test opisany w tym protokole można wykonać w czasie krótszym niż 4 godziny bez udziału skomplikowanych technik biochemicznych. Dodatkowo opisujemy metodę normalizacji, która jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych danych. Przedstawiona prosta procedura i metody normalizacji pozwalają na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego pacjenta i generowanie powtarzalnych danych, które można porównywać między punktami czasowymi w celu oceny potencjalnych efektów leczenia.

Introduction

Zmęczenie jest powszechnym i stresującym stanem, który ma negatywny wpływ na jakość życia pacjentów z rakiem¹. Do tej pory zmęczenie nowotworem pozostaje słabo zdefiniowane i opiera się wyłącznie na subiektywnych raportach pacjentów². W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania łatwego do dostosowania diagnostycznego testu laboratoryjnego, który obiektywnie scharakteryzuje zmęczenie w warunkach klinicznych^3,4.

Zaproponowano, że wiele podstawowych mechanizmów, w tym dysfunkcja mitochondriów, powoduje zmęczenie⁵. Mitochondria są potężnymi organellami, zapewniającymi 95% zapotrzebowania na energię komórkową poprzez fosforylację oksydacyjną i odgrywają ważną rolę w sygnalizacji wapniowej, apoptozie, sygnalizacji immunologicznej i regulacji innych wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych6. W związku z tym upośledzona bioenergetyka mitochondriów i defekty w produkcji energii mogą przyczyniać się do zmęczenia. Potwierdzając tę hipotezę, wcześniejsze badania zaobserwowały mutacje w mitochondrialnym DNA u pacjentów z zespołem chronicznego zmęczenia⁷. Chociaż nie jest jasne, czy patofizjologiczne źródło zmęczenia leży w ośrodkowym układzie nerwowym, czy w tkankach obwodowych, takich jak mięśnie szkieletowe^8,9, obecnie nie ma bezpośredniej metody dokładnej oceny dysfunkcji mitochondriów związanej ze zmęczeniem w żywych, oddychających komórkach.

Wykorzystanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) do badania funkcji mitochondriów oferuje kilka korzyści. Po pierwsze, PBMC są łatwo dostępne w warunkach klinicznych przy użyciu standardowej flebotomii i można je szybko wyizolować przy użyciu podstawowych technik laboratoryjnych. Po drugie, pobieranie krwi jest mniej inwazyjne niż pobieranie innych tkanek, takich jak biopsja mięśni. Dzięki temu próbki krwi mogą być pobierane od tego samego pacjenta wielokrotnie w czasie, co ułatwia długotrwałą ocenę efektów leczenia. Co ciekawe, funkcja mitochondriów w PBMC wydawała się być dobrze skorelowana ze statusem mitochondriów nerek w modelu zwierzęcym¹⁰. Co więcej, mitochondria komórek odpornościowych były używane jako wskaźnik zastępczy do wykrywania zmian ogólnoustrojowych w różnych stanach chorobowych^11,12. Mitochondria w krążących komórkach odpornościowych są szczególnie wrażliwe na zmiany w funkcjach immunologicznych i cząsteczkach sygnalizacji immunologicznej, takich jak cytokiny^13,14,15. Na przykład zaobserwowano, że PBMC od pacjentów z ostrymi reumatycznymi chorobami zapalnymi wykazują wysokie wyjściowe zużycie tlenu¹⁴. Natomiast zużycie tlenu było zmniejszone w PBMC izolowanych od pacjentów z ogólnoustrojowymi stanami zapalnymi, w tym sepsą¹⁶. W stanach zapalnych wolne rodniki wytwarzane przez dysfunkcyjne mitochondria mogą dodatkowo przyczyniać się do podwyższonego stresu oksydacyjnego i przedłużającego się stanu zapalnego¹⁷. Centralna rola mitochondriów w produkcji energii, jak również w stresie oksydacyjnym, sugeruje potencjalną użyteczność wykorzystania funkcji mitochondriów jako wskaźnika zastępczego do badania zmęczenia u pacjentów z rakiem ¹³.

Poprzednie badania badające funkcję mitochondriów wykorzystywały techniki biochemiczne, pomiar potencjału błony mitochondrialnej lub izolację określonych populacji komórek, które mogą nie być łatwo przystosowane w warunkach klinicznych5^,14,18. W ostatnich latach rozwój testów przepływu zewnątrzkomórkowego pozwolił naukowcom łatwo i dokładnie zbadać zmiany wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w odpowiedzi na automatyczne wstrzyknięcia inhibitorów układu oddechowego^19,20,21,22. Jednak większość z tych badań jest przeznaczona dla określonych typów komórek, a duży format o wysokiej przepustowości może nie mieć zastosowania w warunkach klinicznych. W tym manuskrypcie opisujemy zoptymalizowany protokół badania funkcji mitochondriów do użytku klinicznego.

Protocol

Obecne badanie (NCT00852111) zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) of the National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Uczestnikami włączonymi do tego badania byli mężczyźni eutymiczni w wieku 18 lat lub starsi, u których zdiagnozowano raka gruczołu krokowego bez przerzutów z lub bez wcześniejszej prostatektomii i u których zaplanowano radioterapię wiązką zewnętrzną (EBRT). Potencjalni uczestnicy zostali wykluczeni, jeśli mieli postępującą chorobę, która mogła powodować znaczne zmęczenie, mieli chorobę psychiczną w ciągu ostatnich pięciu lat, mieli nieskorygowaną niedoczynność tarczycy lub niedokrwistość lub mieli drugi nowotwór złośliwy. Wykluczono również osoby, które stosowały środki uspokajające, sterydy lub niesteroidowe środki przeciwzapalne. Zdrowe próbki krwi kontrolnej zostały pobrane na Wydziale Medycyny Transfuzjologicznej NIH od zdrowych dawców zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB (NCT00001846). Wszyscy uczestnicy są rekrutowani w Centrum Badań Klinicznych Magnuson w NIH. Podpisane pisemne świadome zgody uzyskano przed udziałem w badaniu.

1. Przygotowanie do pomiaru funkcji mitochondriów (pierwszy dzień eksperymentu)

1. Wkład z czujnikiem hydratu (patrz tabela materiałów; przybliżony czas trwania: 5 min).
   1. Wyjmij wkład czujnika z opakowania. Dodaj 200 μl roztworu Calibrant do każdej studzienki płytki użytkowej, a następnie napełnij każdą fosę 400 μl roztworu Calibrant.
   2. Zwróć płytkę czujnika na tabliczkę narzędziową, w której teraz znajduje się roztwór kalibru. Uwodnić wkład w inkubatorze bez emisji CO₂ w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Wkład czujnika musi być nawodniony przez co najmniej 4 godziny, a maksymalnie 72 godziny.

2. Przygotowanie próbki klinicznej (dzień 2 eksperymentu)

1. Zmierz zmęczenie za pomocą 13-punktowej Oceny Funkcjonalnej Terapii Chorób Przewlekłych - Zmęczenie (FACIT-F)^2,23,24 na początku badania (przed rozpoczęciem EBRT), punkt środkowy i zakończenie EBRT oraz 1 rok po EBRT.
   1. Użyj skali od 0 do 4 dla każdej odpowiedzi na pytanie, gdzie 0 oznacza "wcale", a 4 oznacza, że respondent odnosi się do odpowiedniego stwierdzenia "bardzo". Łączne wyniki powinny mieścić się w zakresie od 16 do 53, przy czym niższe wyniki powinny odzwierciedlać wysoką intensywność zmęczenia.
   2. Zdefiniuj zmęczenie jako wynik FACIT-F niższy niż 43, przy czym wynik FACIT-F ≥43 wskazuje na brak lub brak klinicznie istotnego zmęczenia².
      UWAGA: Wynik FACIT-F wynoszący 43 najlepiej dzieli wyniki zmęczenia pacjentów z rakiem i populacji ogólnej².
   3. Uwzględnij następujące 13 pozycji w Skali Zmęczenia FACIT: 1) Czuję się zmęczony; 2) Czuję się słaby na całym ciele; 3) Czuję się apatyczny ("wyprany"); 4) Czuję się zmęczony; 5) Mam problem z uruchomieniem rzeczy, ponieważ jestem zmęczony; 6) Mam problem z kończeniem rzeczy, ponieważ jestem zmęczony; 7) Mam energię; 8) Jestem w stanie wykonywać swoje zwykłe czynności; 9) Muszę spać w ciągu dnia; 10) Jestem zbyt zmęczony, aby jeść; 11) Potrzebuję pomocy w wykonywaniu moich zwykłych czynności; 12) Jestem sfrustrowany tym, że jestem zbyt zmęczony, aby robić rzeczy, które chcę robić; oraz 13) Muszę ograniczyć swoją aktywność społeczną, ponieważ jestem zmęczony.
2. Wyizolować PBMC ze świeżo pobranych próbek krwi (przybliżony czas trwania: 1 godzina).
   1. Zebrać 8 ml krwi do probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Próbki krwi należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od pobrania. Jakość PBMC może być zagrożona, jeśli próbki krwi są przetwarzane dłużej niż 2 godziny po pobraniu próbki.
   2. Wirować przy 1 750 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (18 - 25 °C). Przenieść mętną warstwę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj do 15 ml PBS i odwróć 5 razy.
   3. Wirować przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad, dodając do 10 ml PBS i odwrócić 5 razy.
   4. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić ciekły supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Przenieś PBMC do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
   5. Wirować przy 610 x g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w kompletnym RPMI-1640 (RPMI-1640 uzupełniony o 10% FBS, 10 mM penicyliny/streptomycyny).
3. Pokryj płytki komórkowe dla komórek nieprzylegających (przybliżony czas trwania: 30 min).
   1. Przygotować roztwór klejący do komórek i tkanek (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy w 0,1 M wodorowęglanie sodu o pH 8,0. Roztwór roboczy powinien mieć powierzchnię 3,5 μg/^cm2.
      UWAGA: Ten roztwór zawiera białka polifenolowe ekstrahowane z omułka morskiego Mytilus edulis. Białka te są kluczowymi składnikami kleju wydzielanego przez małże, który zakotwicza się na powierzchni. Uważamy, że Cell-Tak działa najlepiej z PBMC.
   2. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu kleju do każdego dołka i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy wodą DI i wysusz na powietrzu.

3. Pomiar funkcji mitochondriów

1. Przygotowanie pożywki do oznaczania (przybliżony czas trwania: 10 min).
   UWAGA: Pożywka do oznaczania musi być świeżo przygotowana w dniu doświadczenia.
   1. Dodaj L-glutaminę, pirogronian i glukozę do pożywki bazowej (te same składniki, co zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, ale bez wodorowęglanu sodu, glukozy, glutaminy lub pirogronianu sodu), aby uzyskać pożywkę do oznaczania. Podgrzej podłoże do temperatury 37 °C, a następnie dostosuj pH do 7,4,
      UWAGA: Stężenia L-glutaminy, pirogronianu i glukozy są zwykle takie same jak stężenia w normalnych pożywkach wzrostowych, ale można je dostosować w zależności od testu.
2. Przygotuj PBMC do testu Mito Stress (przybliżony czas trwania: 2 godziny).
   1. Umieść wystarczającą ilość PBMC z kroku 2 w każdym dołku, aby osiągnąć 80-90% zbieżności. Z naszego doświadczenia wynika, że 1,5 x 10⁵ komórek/studnię dało najbardziej spójne wyniki.
      UWAGA: Studzienki A i H są studzienkami tła i powinny zawierać wyłącznie pożywki testowe bez komórek. W studzienkach od B do G zalecamy posiew co najmniej 3-6 dołków na próbkę pacjenta w celu uwzględnienia wartości odstających.
   2. Obracaj płytki w dół o masie 200 x g przez 2 minuty, aby komórki przylgnęły do dna studzienek. Umyj komórki raz pożywką do oznaczania. Ten etap usuwa surowicę i wodorowęglan sodu z pożywki wzrostowej.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że etap mycia zazwyczaj usuwa 20-30% komórek.
   3. Dodać 180 μl pożywki do oznaczania do każdej studzienki, w tym studzienek tła A i H. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisji CO₂ przez 45 - 60 minut.
3. Przeprowadzanie testu warunków skrajnych Mito
   1. Rozpuść leki w zestawie Mito Stress Kit za pomocą pożywki do oznaczania w następujący sposób:
      1. Oligomycyna: Dodać 252 μl pożywki do oznaczania do fiolki, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 μM.
      2. FCCP: Dodać 288 μl pożywki do oznaczania do fiolki, aby wytworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 50 μM.
      3. Antymycyna A/Rotenon: Dodać 216 μl pożywki testowej do fiolki, aby wytworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 25 μM.
   2. Vortex rozpuszczony lek przez około 1 minutę. Rozcieńczyć do roztworów roboczych.
      UWAGA: Stężenia roztworów roboczych powinny być miareczkowane i wstępnie określone przed eksperymentem w zależności od typu komórki. W przypadku PBMC okazuje się, że 1 μM oligomycyny, 1 μM FCCP i 0,5 μM antymycyny A / Rotenonu działają najlepiej.
   3. Pipetować leki do każdego portu we wkładzie czujnika po kolei:
      1. Port A: Odpipetować 20 μl 10 μM oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym dołku 1 μM.
      2. Port B: Odpipetować 22 μL 10 μM FCCP, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym studzience 1 μM.
      3. Port C: Odpipetować 25 μl 5 μM antymycyny A/rotenonu, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym dołku 0,5 μM.
4. Wybierz "Test stresu Mito" na instrumencie do pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego. Postępuj zgodnie z instrukcjami przyrządu i włóż wkład czujnika. Przyrząd automatycznie przeprowadzi kalibrację czujnika. Włóż płytkę ogniwa po kalibracji czujnika, a przyrząd zakończy resztę testu. Dynamika tlenu jest mierzona przy 530 nm (wzbudzenie)/650 nm (emisja), a stężenie protonów jest mierzone przy 470 nm (wzbudzenie)/ 530 nm (emisja).

4. Normalizacja danych o funkcjach mitochondriów

1. Przygotować roztwór do testu proliferacji komórek (przybliżony czas trwania: 5 min).
   1. Dodaj 48 μl barwnika kwasem nukleinowym (500x) i 240 μl supresora tła do 11,7 ml PBS (2x). Barwienie kwasem nukleinowym jest barwnikiem wiążącym DNA przenikającym komórkę, a supresor tła jest barwnikiem maskującym, który blokuje martwe komórki lub komórki z naruszoną integralnością błony komórkowej przed zabarwieniem. Połączenie barwnika wiążącego DNA i supresora tła zapewnia, że barwione są tylko żywe komórki.
   2. Dodać równą objętość 2x roztworu roboczego (180 μl) bezpośrednio do pożywki w każdym dołku po zakończeniu testu warunków skrajnych Mito.
2. Inkubować komórki w obecności roztworu do oznaczania proliferacji komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 45 - 60 minut. Określić ilościowo liczbę żywych komórek (fluorescencyjnych) na czytniku płytek przy 508 nm (wzbudzenie)/527 nm (emisja) i znormalizować dane OCR (przybliżony czas trwania: 10 min).
   UWAGA: oprócz liczby żywych komórek, użytkownicy mogą również znormalizować swoje dane za pomocą całkowitej liczby komórek, ilości kwasu nukleinowego, stężeń białek itp.

Results

Test stresu Mito polega na pomiarze wskaźnika zużycia tlenu (OCR) po sekwencyjnym wstrzyknięciu różnych inhibitorów układu oddechowego w celu odwzorowania pełnego profilu mitochondrialnego. Pomiary OCR po każdym wstrzyknięciu leku można wykorzystać do obliczenia następujących parametrów związanych ze zdrowiem mitochondriów: Podstawowy OCR jest najpierw mierzony przed wstrzyknięciem leku w celu oceny zużycia tlenu potrzebnego do zaspokojenia zapotrzebowania na ATP na pozio...

Discussion

Zmęczenie u pacjentów z rakiem jest wyniszczającym stanem, który nie jest dobrze zdefiniowany ani scharakteryzowany¹. Diagnoza zmęczenia całkowicie opiera się na subiektywnym zgłoszeniu i nie ma aktualnego standardu diagnostycznego ani leczenia tego schorzenia, głównie z powodu braku zrozumienia jego patobiologii². Spośród proponowanych mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia u pacjentów z rakiem, upośledzenie funkcji mitochondriów jest jednym z najbardziej terapeutycznie ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych CPT	BD Biosciences	362761	Do izolacji PBMC po flebotomii
RPMI-1640	Corning	10-040	Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Corning	35-010-CV	Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC
Penicylina/Streptomycyna	ThermoFisher	15140122	Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC
Cell-Tak	Corning	354240	Roztwór adhezyjny do komórek i tkanek; umożliwia przyleganie komórek zawiesiny do powierzchni
Seahorse XF Calibrant Solution	Agilent	103059-000	Do wkładów nawilżających
XFp Fluxpak (minipłytki i wkłady czujników)	Agilent	103022-100	Zawiera minipłytki do hodowli komórkowych XFp i wkłady z czujnikami
Pożywka bazowa XF	Agilent	103335-100	Do wytwarzania pożywki testowej XF
45% hodowla komórkowa D-(+)-Roztwór glukozy	Corning	25-037-CI	Do wytwarzania XF pożywka do oznaczania
Roztwór pirogronianu sodu	Corning	25-000-CI	Do wytwarzania pożywki testowej XF
Roztwór L-glutaminy	ThermoFisher	25030081	Do wytwarzania pożywki testowej
XF Seahorse XFp Mito Stress Test	Kit Agilent	103010-100	Zawiera oligomycynę, FCCP, antymycynę A/rotenon
CyQUANT Bezpośredni test proliferacji komórek	ThermoFisher	C35011	Do oznaczania ilościowego żywych komórek i normalizacji danych
Seahorse XFp Analyzer	Agilent	S7802AEA	Do pomiaru funkcji mitochondriów w żywych komórkach
Cytacja 5 Obrazowanie komórek Multi-Mode Reader (lub dowolny instrument, który może określić ilościowo komórki fluorescencyjne na płytce)	BioTek	BTCYT5PV	Do ilościowego oznaczania żywych komórek i normalizacji danych