Egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem

Podsumowanie

Myszy wystawione na działanie dootrzewnowego LPS wydzielają egzosomy w płynie płukania oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL), które są wypełnione miRNA. Korzystając z systemu kohodowli, pokazujemy, że egzosomy uwalniane w płynie BAL zaburzają ekspresję białek połączeń ścisłych w komórkach nabłonka oskrzeli i zwiększają ekspresję cytokin prozapalnych, które uwydatniają uszkodzenie płuc.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) i zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) reprezentują niejednorodną grupę chorób płuc, które nadal charakteryzują się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Patogeneza molekularna ALI jest coraz lepiej definiowana; Jednak ze względu na złożony charakter choroby terapie molekularne nie zostały jeszcze opracowane. Tutaj używamy mysiego modelu ostrego septycznego uszkodzenia płuc indukowanego lipopolisacharydem (LPS), aby określić rolę egzosomów w odpowiedzi zapalnej. Korzystając z tego modelu, byliśmy w stanie wykazać, że myszy, które są narażone na dootrzewnowy LPS, wydzielają egzosomy w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) z płuc, które są upakowane w miRNA i cytokiny regulujące odpowiedź zapalną. Ponadto, wykorzystując system modelu kohodowli, pokazujemy, że egzosomy uwalniane z makrofagów zaburzają ekspresję białek połączeń ścisłych w komórkach nabłonka oskrzeli. Wyniki te sugerują, że 1) wzajemne oddziaływanie między wrodzonymi komórkami odpornościowymi i strukturalnymi poprzez transport egzosomalny przyczynia się do odpowiedzi zapalnej i zakłócenia bariery strukturalnej oraz 2) celowanie w te miRNA może zapewnić nową platformę do leczenia ALI i ARDS.

Wprowadzenie

ALI i ARDS to zagrażające życiu formy niewydolności oddechowej z ciężką hipoksemią spowodowaną niekardiogennym obrzękiem płuc, który dotyka około 1 miliona ludzi na całym świecie rocznie¹. Etiologia ARDS obejmuje bezpośrednie uszkodzenie płuc w wyniku infekcji lub zachłyśnięcia oraz różne pośrednie zniewagi. W ciągu ostatniej dekady pogłębiono wiedzę na temat molekularnej patogenezy ARDS, jednak specyficzne ukierunkowane metody leczenia ARDS nie zostały jeszcze opracowane^2,3.

Opracowano kilka zwierzęcych modeli ostrego uszkodzenia płuc, które stanowią pomost do przełożenia eksperymentalnych terapii na badania na ludziach^4,5. Powszechnie stosowane modele obejmują lokalną instalację kwasu oleinowego, bakterii, LPS i bleomycyny. Inne podejścia obejmują niedokrwienie-reperfuzję, nakłucie podwiązania jelita ślepego, rozciągnięcie wywołane wentylacją mechaniczną, hiperoksję lub ogólnoustrojowe podawanie bakterii i LPS⁵. Modele te stanowią użyteczny system biologiczny do testowania hipotez klinicznych i opracowywania potencjalnych terapii. Aby symulować ludzkie ARDS, modele zwierzęce powinny odtworzyć stan zapalny i ostre uszkodzenie komórek nabłonka i śródbłonka z defektami funkcji bariery w płucach.

Egzosomy to pęcherzyki błonowe o średnicy 20 - 200 nm, których zawartość molekularna zawiera białka, DNA, RNA i lipidy, i ułatwiają komunikację międzykomórkową w mikrośrodowisku tkankowym poprzez transfer składu molekularnego. Egzosomy są wydzielane przez wiele typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, komórki nabłonkowe, komórki mięśni gładkich i komórki nowotworowe i występują w płynie ustrojowym człowieka. Badania wskazują, że egzosomy regulują wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi a komórkami zrębu podczas zakaźnych i sterylnych chorób zapalnych, a ich nieprawidłowe uwalnianie wydaje się być regulowane przez różne naturalne i eksperymentalne bodźce podczas procesów fizjologicznych i patologicznych⁶. Taka sieć komunikacyjna może odgrywać ważną rolę w patogenezie chorób płuc i wpływać na postęp patofizjologiczny^7,8. Jako 18 - 22 nukleotydowe niekodujące RNA, miRNA istnieją zarówno w tkankach, jak i płynach ustrojowych, osoczu, surowicach i modulują ekspresję mRNA na poziomie potranslacyjnym^9,10.

Upakowane miRNA w egzosomach wpływają na różnicowanie i funkcjonowanie wielu typów komórek, a ich nadmierne poziomy są związane z różnymi chorobami, w tym rakiem, chorobami płuc, otyłością, cukrzycą i chorobami układu krążenia^{11,12,13,14,15,16}. Wejście do komórek biorcy i transport egzosomalnych miRNA ułatwia komunikację międzykomórkową, modyfikując hemostazę mikrośrodowiska^17,18. Ostre uszkodzenie płuc jest złożonym procesem, obejmującym wiele typów komórek z rozległą komunikacją międzykomórkową za pośrednictwem egzosomów⁸. miR-155 i miR-146a mają wspólny mechanizm regulacji transkrypcji i przyczyniają się do odpowiedzi zapalnej i tolerancji immunologicznej^19,20. Ostatnie badania wskazują, że oba modulują odpowiedź zapalną poprzez egzosomalne miRNA przemieszczające się między komórkami odpornościowymi²¹. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw modulacyjnego wpływu egzosomalnych miRNA na odpowiedź pęcherzyków płucnych na endotoksynę pozostają niejasne, niewątpliwie potencjalne znaczenie kliniczne i implikacje translacyjne zasługują na dalsze badania.

Modele współhodowli są wykorzystywane do definiowania interakcji między określonymi typami komórek w złożonym środowisku, takim jak stany zapalne i nowotwory^22,23. Platformy te zapewniają alternatywną strategię badania wzajemnych oddziaływań między typami komórek, szczególnie w przypadku komórek immunologicznych i strukturalnych.

Dotchawicze, aerozolowe, dootrzewnowe lub ogólnoustrojowe podawanie LPS jest powszechnie stosowane do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia płuc^24,25,26, i wykazały, że wywołują defekty przepuszczalności nabłonka i śródbłonka. Tutaj używamy dootrzewnowego LPS do wywołania septycznego modelu ostrego uszkodzenia płuc u myszy. W ciągu 24 godzin od podania dootrzewnowego LPS dochodzi do powstania zaburzeń przepuszczalności w płucach z rekrutacją komórek zapalnych. Ponadto pokazujemy, że egzosomy z BAL zawierają miRNA-155 i miR-146a, a egzosomy z płynu BAL indukują ekspresję cytokin prozapalnych w komórkach nabłonka biorcy, w tym IL-6 i TNF-α. Dane te są pierwszymi, które pokazują, że egzosomalne miRNA są wydzielane w BAL w tym modelu ostrego septycznego uszkodzenia płuc.

Protokół

Ogólny protokół wymaga 2 dni, w tym pierwszego dnia indukcji sepsy i izolacji płynu BAL od zwierzęcia, a drugiego dnia izolacji egzosomów od mysiego BALF. Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w centrum medycznym Atlanta VA.

1. Model ostrego septycznego uszkodzenia płuc u myszy

1. Użyj 6-8 tygodniowych samców myszy C57BL/6J typu dzikiego (waga 20 - 22 g) jako modelu zwierzęcego i wykonuj wszystkie procedury przy użyciu technik i narzędzi aseptycznych. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym kleszcze i nożyczki, należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
2. Losowo rozmieść myszy na grupę eksperymentalną i kontrolną. Unieruchamiaj myszy na desce chirurgicznej. Leczyć myszy lipopolisacharydem Escherichia coli (LPS, 15 mg/kg) drogą dootrzewnową. W zależności od indywidualnej masy ciała rozcieńczyć odpowiednie dawki LPS do 0,1 ml PBS na mysz, a następnie wstrzyknąć roztwór LPS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G i wstrzyknąć równoważną objętość PBS do kontroli zwierząt.   
3. Trzymaj myszy w obiekcie BSL2 dla zwierząt, który składa się z czystych klatek w odpowiedniej temperaturze pokojowej.
4. 24 godziny później poddać myszy eutanazji za pomocą wdychania CO_{2 .}
5. Wybierz obszar chirurgiczny na środku szyi myszy. Wykonaj małe nacięcie (około 5 mm) i delikatnie oddziel mięśnie dostępu do tchawicy za pomocą kleszczy, aż tchawica zostanie odsłonięta.
6. Pobrać płyn BAL myszy za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 27 G. Najpierw delikatnie włóż igłę do tchawicy i powoli wstrzyknij 1 ml sterylnego PBS do tchawicy, a następnie wciągnij BALF do jednorazowej strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G. Po zakończeniu zabiegu strzykawki i igły należy wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
7. Narzędzia chirurgiczne należy traktować dwutlenkiem chloru, jak opisano wcześniej przez Chauret i wsp.²⁷, a następnie wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.

2. Izolacja egzosomów - seryjne ultra-wirowanie i charakterystyka

1. Zbierz mysi płyn BAL w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. W celu pobrania komórek pęcherzyków płucnych należy odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 1 000 g, w temperaturze 4 °C.
2. Przenieść supernatant do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml, a następnie odwirować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
3. Zebrać supernatant do probówek ultrawirówek i odwirowywać próbki przez 60 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia większych cząstek komórkowych.
4. Przenieść supernatant do nowych stożkowych probówek, a następnie przefiltrować próbki przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby usunąć pozostałe większe cząstki.
5. Próbki należy zbierać w probówkach ultrawirówkowych i probówkach równoważących. Odwiruj próbki przez 2 godziny w temperaturze 140 000 x g w temperaturze 4°C w celu osadzenia egzosomów.
   Uwaga: Wielkość egzosomów waha się od 20 do 200 nm. Filtr 0,2 μm służy do usuwania większych cząstek o wielkości powyżej 200 nm.
6. Delikatnie odrzucić supernatanty. Rozpuścić osad w 100 μl PBS lub roztworze do lizy i przenieść próbki egzosomów do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
   Uwaga: Transmisyjny mikroskop elektronowy jest zalecany do weryfikacji izolowanych egzosomów.
7. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem przetwarzania próbek TEM²⁸. Analizuj próbki egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej i rób obrazy, skala 200 nm.

3. Przygotowanie miRNA i przeprowadzenie miRNA-q-RT-PCR

Uwaga: miRNA-q-RT-PCR jest zalecany do analizy poziomu ekspresji miRNA.

1. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem izolacji miRNA i upewnij się, że używasz równej ilości oczyszczonych RNA w jednoniciowej odwrotnej transkrypcji²⁴.
2. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem PCR w czasie rzeczywistym, aby wykryć poziom egzosomalnego mikroRNA w płynie BAL. Użyj specyficznych starterów PCR w czasie rzeczywistym przeciwko miR-155, miR-146a i U6 SnRNA. Przeprowadź reakcję PCR z ilościowym aparatem PCR i znormalizuj wartości ekspresji do kontroli wewnętrznej U6 snRNA.
   Uwaga: Każda grupa składa się z trzech próbek²⁴.

4. Znakowanie i oczyszczanie egzosomów

1. Zawiesić osad egzosomów ze 100 μl roztworu zawiesiny w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml, a następnie dodać 0,4 μl barwnika egzosomów do drugiej probówki ze 100 μl roztworu zawiesiny.
2. Szybko dodaj egzosomy w roztworze do roztworu barwnika i dokładnie wymieszaj, pipetując. Próbki należy przechowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
3. Umieść jedną kolumnę wirową egzosomu w probówce elucyjnej o pojemności 1,5 ml. Przenieś mieszaninę roztworu do środka kolumny wirowej egzosomu.
4. Obracać kolumnę przez 2 minuty w temperaturze 800 x g w temperaturze pokojowej.
5. Wyrzucić kolumnę i przechowywać eluowaną próbkę w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Walidacja egzosomów pobranych przez komórki biorcze

1. Nasiona 1 x 10⁴ MLE 12 / komórkę w 8-dołkowym szkiełku podstawowym i komórki hodowlane w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Dodaj 10 μl znakowanych fluorescencyjnie egzosomów do komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
3. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki PBS, a następnie utrwal komórki 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zamontuj suwak w medium montażowym za pomocą DAPI.
5. Analizuj próbki przez mikroskop fluorescencyjny i rób zdjęcia w powiększeniu 40x.

6. Weryfikacja interakcji między egzosomami a komórkami biorcy

1. Wysiew 2 x 10⁵ MLE12/basenik na 12-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej odpowiednią pożywkę i komórki hodowlane w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Dodaj 20 μg egzosomów z mysiego płynu BAL do komórek MLE12 i ustaw kontrpróby na grupę eksperymentalną.
3. 24 godziny później przemyć komórki PBS i dodać 600 μl buforu do lizy do studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką i zbierz próbki do lizy w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
4. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem izolacji całkowitego RNA i protokołem odwrotnej transkrypcji cDNA, uzupełnij jednoniciową odwrotną transkrypcję cDNA²⁹.
5. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem PCR w czasie rzeczywistym, aby wykryć poziom ekspresji mRNA w komórkach biorcy²⁹. Użyj specyficznych starterów PCR w czasie rzeczywistym przeciwko TNF-α, IL-6 i ZO-1. Przeprowadź reakcje PCR z ilościowym aparatem PCR i znormalizuj wartości ekspresji do kontroli wewnętrznej GAPDH.
   Uwaga: Każda grupa składa się z trzech próbek.

Wyniki

W celu wywołania septycznego uszkodzenia płuc myszy poddano działaniu LPS w drodze podania dosytronicznego (15 mg/kg). W ciągu 24 h od podania LPS w płucach zaobserwowano napływ neutrofilów, co przedstawiono na Rysunku 1A. Pobrano płyn BAL myszy, a następnie przeprowadzono izolację i oczyszczanie egzosomów. Morfologię egzosomów z BALF potwierdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rysunek 1B).

Dyskusja

Mysie modele chorób są powszechnie stosowane do oceny fizjologicznej funkcji określonych genów i zmniejszania kosztów eksperymentów². Opisane tutaj ostre septyczne uszkodzenie płuc naśladuje reakcję zapalną obserwowaną u ludzi z ARDS. Model ten jest istotny dla badania patogenezy molekularnej, rozwoju biomarkerów oraz testowania potencjalnych nowych terapii⁵.

Systemy kohodowli są istotne dla badań in vivo w kontekście badania potencjalny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
lipopolisacharyd	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
Zestaw do izolacji miRNA mirVana	Thermo Fisher	449774
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) podkład	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) starter	Thermo Fisher	4427975
starter U6snRNA	Thermo Fisher	4427975
TNF-α( Mm00443258_m1 ) podkład	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1    ) grunt	Thermo Fisher	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )podkład	Thermo Fisher	4331182
minimalnym niezbędnym podłożem (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Roztwór trysin-EDTA(0,05%)	Termo Fisher	25300054
Egzosomy zostały oznaczone PKH67 przez PKH67 Łącznik zielonych komórek fluorescencyjnych Mini Kit	Kolumny wirujące egzosomu Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
(MW3000)		Ultrawirówka Thermo Fisher
Beckman Coulter Optima L-100XP	Beckman Coulter	L-100XP
Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe	Beckman Coulter	344058
Applied Biosystems 7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	Transmisyjne
(TEM)	JEOL Ltd	120 kV TEM
Mikroskop Olympus BX41	Olympus	BX41

4484449 mikroskopy elektronowe Thermo Fisher