Frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia prostego frakcjonowania komórkowego w celu subkomórkowej separacji białek cytoplazmatycznych i jądrowych w ludzkich biopsjach jelit świeżych i mrożonych.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest frakcjonowanie ludzkiej tkanki jelitowej uzyskanej za pomocą endoskopii na przedziały jądrowe i cytoplazmatyczne w celu analizy lokalizacji określonych białek lub kompleksów białkowych w różnych stanach tkankowych (np. zdrowe vs. chore). Metoda ta jest przydatna do frakcjonowania zarówno świeżych, jak i mrożonych próbek tkanek jelitowych; Jest łatwo dostępny dla wszystkich laboratoriów i nie zajmuje dużo czasu.

Wprowadzenie

Białka uczestniczą w prawie wszystkich funkcjach biologicznych w komórce, a każda zmiana ich struktury, ilości lub lokalizacji może prowadzić do patogennego scenariusza. Metody frakcjonowania próbek tkanek są użytecznym podejściem do zmniejszania złożoności analiz białek związanych z chorobą. Niektóre badania wykorzystują informacje o lokalizacji białek lub wzbogacają białko z określonego przedziału komórkowego, więc protokół odtwarzalnego frakcjonowania nienaruszonych białek jest przydatny, aby odpowiedzieć na pewne pytania biologiczne. Określenie subkomórkowej lokalizacji białek i monitorowanie ich redystrybucji kompartmentowej lub interakcji w warunkach podstawowych i chorobowych pomoże zidentyfikować różnice funkcjonalne związane z chorobą^1,2. W związku z tym metoda ta ma na celu powtarzalne frakcjonowanie biopsji tkanki jelitowej, zarówno świeżej, jak i mrożonej, do cytoplazmatycznych i jądrowych przedziałów subkomórkowych.

Próbki z biopsji jelita są rutynowo pobierane podczas procedur endoskopowych³ (Rysunek 1) i mogą być skutecznie wykorzystywane do oceny ilościowej białek lub badań immunoprecypitacyjnych. Ponieważ próbki tkanek z nabłonka jelitowego będą zawierały białka, które mogą być bezpośrednio zaangażowane w patogenezę choroby⁴, próbki z biopsji jelita są bardzo cennym źródłem dla skutecznej identyfikacji białek specyficznych dla choroby jelit. Przechowywane zamrożone próbki tkanek pacjenta wraz z informacjami klinicznymi są użytecznymi zasobami do analizy białek, a proste i powtarzalne przygotowanie próbki jest kluczową kwestią w dostarczaniu informacji o kompartmentach komórkowych przy użyciu ograniczonych ilości zamrożonej tkanki⁵.

Istnieje kilka dostępnych na rynku zestawów do rozdzielania frakcji komórkowych, ale są one droższe i ogólnie bardziej czasochłonne niż protokół przedstawiony tutaj. Protokoły oparte na wieloetapowym wirowaniu gradientowym i ciągłych gradientach były również wcześniej używane do frakcjonowania różnych przedziałów komórkowych w różnych tkankach^6,7. Jednak utrzymanie spójności ciągłych gradientów jest często trudnym zadaniem. Podobne protokoły oparte na sekwencyjnej lizie membran zostały opisane wcześniej, ale zazwyczaj wymagają więcej niż dwóch, a czas pracy jest dłuższy⁸ .

Podczas frakcjonowania próbek tkanek pamiętaj, że próbki tkanek prezentują interakcje komórka-komórka i komórka-matryca, które nie występują w hodowanych komórkach, a są ważne przy procesie ekstrakcji białek. Prawidłowy rozkład między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową bez wpływu na jakość białka będzie krytycznym czynnikiem w izolacji białek tkanki jelitowej⁹. W tym protokole kontakty komórka-komórka i komórka-matryca są najpierw zrywane, uwalniając komórki i umożliwiając buforowi dotarcie do poszczególnych komórek. Aby uniknąć mieszania się białek z przedziałami przed frakcjonowaniem, rozpad kontaktów musi nastąpić bez zmiany integralności komórek lub błon jądrowych.

Ze względu na wzbogacenie różnych proteaz w błonie śluzowej jelit¹⁰, ważne jest, aby kontrolować degradację białka podczas ekstrakcji. Aby zminimalizować potencjalną degradację białek, w do ekstrakcji białek musi znajdować się wiele inhibitorów proteazy. Dodatkowo, jeśli ekstrakty mają być używane do testów funkcjonalnych, ważne jest, aby unikać denaturacji białek lub proteolizy, ponieważ spowoduje to utratę aktywności białek¹¹. W tym celu protokół przeprowadza się w temperaturze 4 °C, a świeży fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) dodaje się do w końcowym stężeniu 0,1 mM tuż przed użyciem w celu dalszego zahamowania proteolizy.

Pierwszym krokiem w frakcjonowaniu komórek jest rozerwanie tkanek i ich liza. Jak wspomniano wcześniej, celem jest zdezagregacja komórek i rozbicie ich przy minimalnych uszkodzeniach. Próbki tkanki jelitowej muszą być homogenizowane, a komórki poddawane lizie, aby osiągnąć maksymalne pęknięcie błony komórkowej. W tym protokole używamy zmotoryzowanego miksera tłuczkowego do rozbijania tkanki jelitowej, która jest homogenizowana w ciągu kilku sekund za pomocą szybkiego wirowania. Po homogenizacji komórki tkankowe inkubuje się w hipotonicznym buforze, który rozerwie błonę komórkową, ale utrzyma jądra w stanie nienaruszonym, a następnie dodaje się niedenaturujący detergent (nonyl fenoksyetoksyetanol) i krótki wir w celu oddzielenia jąder od frakcji cytoplazmatycznej. Po usunięciu cytoplazmy błona jąder komórkowych jest rozrywana do buforu hipertonicznego z potrząsaniem.

Przedstawiona tutaj metoda jest odpowiednią metodą do subkomórkowego frakcjonowania świeżych i mrożonych biopsji jelitowych, które zostały uzyskane podczas zabiegów endoskopowych i mieszczą się w zakresie od 2 do 10 mg wagi. Protokół jest łatwy i powtarzalny i można go wykonać przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników w mniej niż godzinę.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego Cruces, a analizy zostały przeprowadzone po uzyskaniu świadomej zgody od wszystkich badanych lub ich rodziców.

1. Kolekcja biopsji

UWAGA: Próbki biopsji z dystalnego dwunastnicy pacjentów są pobierane podczas rutynowej endoskopii diagnostycznej, która zarządza biopsjami o wadze od 2 do 10 mg. Tkanka poddana biopsji to złożona tkanka złożona z różnych typów komórek, w tym komórek nabłonkowych, odpornościowych i śródbłonka. Gastroenterolodzy kliniczni wykonują endoskopię zgodnie z ustalonymi wytycznymi klinicznymi.

1. Umieść biopsję na sterylnej bibule filtracyjnej zaraz po endoskopii.
2. Użyj kleszczy, aby przenieść biopsje w probówkach o pojemności 1,5 ml, namocz je PBS i umieść w krioprobówce.
3. Trzymaj probówki na lodzie, dopóki nie dotrą do laboratorium.
   1. Natychmiast rozpocznij przetwarzanie świeżych biopsji.
4. W przypadku biopsji mrożonej należy błyskawicznie zamrozić probówki zawierające biopsję i przechowywać w ciekłym azocie do czasu użycia.
   UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać próbkę w stanie zamrożonym do momentu dodania buforu 1 uzupełnionego na zimno.

2. Przygotowanie bufora

Uwaga: Zanim zaczniesz, uzupełnij w następujący sposób.

1. Dodać 1 mM DTT (stężenie końcowe) oraz koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (1x stężenie końcowe) do buforu hipotonicznego 1 i buforu hipertonicznego 2 (Tabela 1).
   1. Przygotować 1,5 ml buforu 1 i 150 μl buforu 2 na próbkę. Naziemna telewizja cyfrowa zapobiegnie utlenianiu próbek.
2. Przygotować bufor do przemywania jąder przez dodanie 1% detergentu (nonyl fenoksyetoksyetanolu) do końcowego stężenia 0,1% do już uzupełnionego buforu 1. Przygotować 1 ml buforu do przemywania jąder na próbkę.

3. Homogenizacja biopsji

1. Świeże biopsje
   1. Umieść jednorazowy tłuczek w mikserze z napędem. Upewnij się, że tłuczek sięga dna tuby.
   2. Wyjmij biopsję z krioprobówki i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml z końcówką do pipety.
   3. Dodać 200 μl uzupełnionego buforu 1 do probówki o pojemności 1,5 ml.
   4. Homogenizować biopsję za pomocą tłuczka, aż tkanka zostanie całkowicie rozerwana i trzymać ją na lodzie.
   5. Po homogenizacji wszystkich biopsji przejdź do kroku 4.
      Uwaga: Tłuczki jednorazowe należy wymieniać między biopsjami.
2. Biopsje mrożone
   UWAGA: Ostrożnie obchodzić się z ciekłym azotem; Kontakt ciekłego azotu ze skórą lub oczami może spowodować poważne obrażenia spowodowane zamarznięciem. Chroń ręce i oczy zawsze podczas pracy z ciekłym azotem.
   1. Weź trochę ciekłego azotu do pudełka, aby przechowywać krioprobówki pobrane ze zbiornika azotu.
   2. Znajdź biopsję w zbiorniku z azotem i umieść krioprobówkę w pudełku z ciekłym azotem. Powtórz ten krok dla wszystkich biopsji.
   3. Przenieś biopsję z krioprobówki do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Biopsje zostaną podłączone do zamrożonej probówki. Wciśnij biopsję sterylną końcówką pipety, aby odczepiła się od probówki.
   4. Dodać 200 μl uzupełnionego buforu 1.
   5. Homogenizować tkankę za pomocą tłuczka i moździerza, aż do całkowitego rozerwania tkanki, utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C przez cały czas trwania zabiegu.
      Uwaga: Nie pozwól, aby biopsje rozmroziły się przed dodaniem buforu.

4. Izolacja cytoplazmy

1. Inkubować homogenizowaną biopsję na lodzie przez 10 minut.
2. Dodać 10 μl 1% detergentu (nonyl phenoxyethoxylethanol) do każdej próbki do końcowego stężenia 0,05%.
   UWAGA: Komórki pęcznieją i pękają w wyniku lizy osmotycznej, ponieważ łagodny detergent naruszy błonę komórkową.
3. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
4. Krótko przetrząsnąć i odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min.
5. Po wirowaniu usuń supernatant i przenieś go do nowej czystej probówki o pojemności 1,5 ml; będzie to frakcja cytoplazmatyczna. Nie wyrzucaj granulek.

5. Izolacja jądrowa

1. Zawiesić osad z poprzedniego etapu za pomocą 200 μl buforu do przemywania jąder.
2. Wirować probówkę przez 2 minuty w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C.
3. Odrzucić supernatant i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy.
   UWAGA: Mycie usunie zanieczyszczenia cytoplazmatyczne we frakcji jądrowej.
4. Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu 2.
5. Wstrząsać energicznie próbką w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Alternatywnie inkubować próbkę na lodzie i wirować co 5 minut.
6. Po wstrząśnięciu odwirować próbkę przez 10 minut przy maksymalnej prędkości (> 12 000 x g) i temperaturze 4 °C.
7. Po wirowaniu przenieść supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml. To będzie frakcja jądrowa.

6. Kwantyfikacja białka

Uwaga: Określ ilościowo białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasem bicinchoninowym (BCA). Stężenie białek we frakcjach będzie się wahać od 0,5 do 5 μg/μL, przy czym jest niższe we frakcji jądrowej (patrz tabela 2 dla stężeń białek wynikających z biopsji 2 mg).

1. Przygotować krzywą wzorcową z następującymi ilościami albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (μg)¹²: 0-0,5-1-2-3-4-5-6.
2. Przygotować odczynniki potrzebne do użycia 100 μl końcowej mieszanki BCA na próbkę.
3. Odpipetować 2 μl każdej frakcji białkowej na płytce 96-dołkowej, dodać mieszankę BCA i postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi odczytu.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia barwienie hematoksyliną i eozyną przekroju biopsji jelita z zachowanymi strukturami kosmków i krypt.

Reprezentatywne wyniki frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego z zastosowaniem niniejszego protokołu przedstawiono na rycinach 2 i 3. W eksperymencie przedstawionym na rycinie 2, świeżą (Fh) i zamrożoną (Fz) b...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół służy do frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego biopsji jelita. Oczyszczone białka nie są denaturowane i mogą być stosowane nie tylko w analizie western blot, jak pokazano na rysunku 2 i 3 , ale także w testach wymagających natywnie sfałdowanych białek, takich jak immunoprecypitacja, test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) lub natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Opisana metoda polega...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-1kg
KCl	Sigma Aldrich	P9333-1kg
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
NaCl	Sigma Aldrich	5588886-1kg
DTT	Sigma Aldrich	10197777001
PMSF	Thermo Scientific	36978
Inhibitory proteinaz i fosfataz	Thermo Scientific	A32959
NP-40	Sigma Aldrich	CA-630	Test detergentowy
BCA	Thermo Scientific	23227	Zestaw do oznaczania ilościowego białek
Jednorazowe tłuczki plastikowe	Sigma Aldrich	Z359947-100EA
Homogenizator dounce	VWR	431-0100
Mikrowirówka	Eppendorf	5415-R
Shacker	IKA	MS3 basic