Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena funkcjonalności aksonu nerwowego dostarcza szczegółowych informacji na temat postępu zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Zapisy elektrofizjologiczne zapewniają czułe podejście do pomiaru przewodnictwa nerwowego u ludzi i gryzoni. Aby poszerzyć możliwości techniczne elektromiografii u myszy, opisano tutaj pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) z nerwu splotu ramiennego w kończynie przedniej za pomocą elektrod igłowych. Zapisy CMAP po stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych zostały już wcześniej opisane. Nowo wprowadzona metoda pozwala na ocenę przewodnictwa nerwowego w dodatkowym miejscu, a tym samym zapewnia głębszy przegląd funkcjonalności nerwowo-mięśniowej. Technika ta dostarcza informacji zarówno na temat względnej liczby funkcjonalnych aksonów, jak i poziomu mielinizacji. Tym samym metoda ta może być stosowana do oceny zarówno chorób aksonów, jak i stanów demielinizacyjnych. Ta minimalnie inwazyjna metoda nie wymaga ekstrakcji nerwu i dlatego nadaje się do wielokrotnych pomiarów w celu obserwacji podłużnej u tego samego zwierzęcia. Podobne zapisy są wykonywane w konfiguracjach klinicznych, aby podkreślić znaczenie translacyjne metody.
Wprowadzenie
Elektrofizjologia jest używana jako narzędzie diagnostyczne w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych, takich jak zaburzenia neuronu ruchowego, pleksopatie, neuropatie, zaburzenia połączeń nerwowo-mięśniowych i miopatie. W stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS), w którym dotknięte są głównie neurony ruchowe, uszkodzenie aksonów i paraliż mięśni1 znajdują odzwierciedlenie w zmniejszonych amplitudach CMAP w badaniach przewodnictwa nerwowego (NCS). W chorobie Charcota-Mariego-Tootha (CMT) zarówno zwyrodnienie aksonów, jak i demielinizację można oszacować w nerwach obwodowych za pomocą NCS2. Technika ta może być wykorzystana do potwierdzenia diagnozy, a także do oceny postępu choroby3,4. NCS umożliwia oszacowanie patologii aksonalnej, która jest wydedukowana na podstawie wielkości amplitudy potencjału czynnościowego5, oraz zakresu demielinizacji - co skutkuje zmniejszoną prędkością przewodzenia, wydłużonymi opóźnieniami dystalnymi lub blokiem przewodzenia6.
Pomiar CMAP jest szybką i czułą metodą oceny przewodnictwa nerwowego zarówno u ludzi, jak i u myszy. Podczas gdy u pacjentów NCS są wykonywane rutynowo w różnych miejscach w celu zarejestrowania różnych nerwów i mięśni, u myszy pomiary CMAP są zwykle wykonywane tylko dla nerwu kulszowego w celu oceny funkcjonalności nerwów w kończynach tylnych. Jednak w niektórych badaniach na zwierzętach korzystne byłoby rejestrowanie CMAP zarówno w kończynach przednich, jak i tylnych, na przykład w celu śledzenia zróżnicowanego postępu choroby między kończynami przednimi i tylnymi w mysich modelach ALS.
Tutaj wprowadzamy metodę rejestrowania CMAP z przednich kończyn myszy za pomocą elektrod igłowych. Dodatkowo zapewniamy podejście do pomiaru CMAP z kończyn tylnych, również za pomocą elektrod igłowych. Pomiar CMAP z kończyn tylnych za pomocą elektrod pierścieniowych został przedstawiony wcześniej7,8. Rejestracja CMAP za pomocą elektrod igłowych jest szybką metodą pomiaru, nie wymaga golenia sierści, a procedura pomiaru zarówno kończyn tylnych, jak i przednich zajmuje doświadczonemu badaczowi tylko 10 minut na zwierzę. Co więcej, to minimalnie inwazyjne podejście jest wykonalne w przypadku powtarzających się pomiarów, aby umożliwić podłużną obserwację wielu nerwów u zwierząt.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były utrzymywane w standardowych warunkach zgodnie z wytycznymi KU Leuven - Uniwersytetu w Leuven oraz powiązanymi z nimi wytycznymi europejskimi (Dyrektywa Unii Europejskiej 2010/63/EU w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną KU Leuven.
1. Przygotowanie zwierząt i znieczulenie
- Wprowadź mysz w stan znieczulenia poprzez inhalację izofluranu w mieszaninie z tlenem. Do indukcji znieczulenia zastosuj 4% izofluranu, a do jego podtrzymania 2-3% przy przepływie tlenu wynoszącym 2,5 l/min. Dostosuj stężenie izofluranu podczas podtrzymywania znieczulenia w zależności od stanu myszy. t. j.małe i słabe myszy wymagają mniejszej ilości środków anestetycznych. Potwierdź prawidłowe znieczulenie np.wywierając lekki nacisk na podkładkę do chodzenia kończyn tylnych, aby sprawdzić brak odruchu wycofania z powodu bólu.
- Kontroluj temperaturę ciała myszy, korzystając z termostatycznej płyty grzewczej przy 37 °C aby zapobiec obniżeniu temperatury ciała podczas znieczulenia.
- Załóż myszy maskę nosową w celu utrzymania znieczulenia. Upewnij się, że zwierzę otrzymuje wystarczającą ilość tlenu, sprawdzając, czy maska nie blokuje dróg oddechowych oraz czy zwierzę oddycha miarowo.
- Podczas rejestracji należy monitorować, czy mysz jest w wystarczającym stopniu znieczulona, obserwując częstotliwość oddechów (około 1 Hz w znieczuleniu) oraz brak odruchu cofania po lekkim ucisku. W przypadku zbyt płytkiej znieczulenia należy ręcznie zwiększyć stężenie izofluranu.
- Po dokonaniu pomiarów pozostawić mysz na płycie grzewczej lub w cieple lampy podczerwonej do czasu odzyskania przez nią wystarczającej świadomości, aby mogła utrzymać pozycję grzbietową, przez około 2–5 min. Nie pozostawiać myszy bez nadzoru ani w towarzystwie innych myszy do czasu pełnego wybudzenia z narkozy.
2. Pomiar CMAP w kończynach tylnych i przednich
Rysunek 1. Rozmieszczenie elektrod do pomiarów CMAP. Pozycje elektrod przedstawiono dla kończyn tylnych (A) i przednich (B). Elektrody ponumerowano w następujący sposób: 1: anoda i 2: katoda (elektrody stymulujące), 3: aktywna elektroda rejestrująca, 4: elektroda referencyjna oraz 5: elektroda uziemiająca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Do pomiarów CMAP kończyn tylnych i przednich należy użyć elektrod igłowych 27 G. Zalecane miejsca rozmieszczenia elektrod przedstawiono na Rysunku 1.
- Elektrody na kończynie tylnej należy umieścić w następujący sposób:
- Umieścić mysz na podgrzewaczu w pozycji brzusznej. Wyprostować kończynę tylną w stawie kolanowym i przymocować łapę do powierzchni roboczej za pomocą taśmy klejącej (Rysunek 1A).
- Umieścić elektrody stymulujące podskórnie po obu stronach wyrostka kłykciowego z odległością około 2 cm między elektrodami (1 = anoda i 2 = katoda). Unieść skórę, aby wprowadzić igłę prostopadle przez skórę, i przesunąć około 5 mm igły pod skórę, nie przebijając leżących poniżej mięśni.
- Podobnie umieścić podskórnie elektrodę rejestrującą (3), dopasowując ją do mięśnia brzuchatego łydki. Wprowadzić elektrodę referencyjną (4) podskórnie obok ścięgna Achillesa pod kątem 30 stopni, pozostawiając 2-5 mm igły pod skórą. Umieścić elektrodę uziemiającą (5) podskórnie z boku ciała myszy w sposób analogiczny do elektrod stymulujących, przy czym pozycja tej elektrody nie jest krytyczna dla pomiaru.
- Elektrody na kończynach przednich należy umieścić w następujący sposób:
- Umieścić mysz na podgrzewaczu w pozycji grzbietnej i za pomocą taśmy klejącej wyprostować obie kończyny przednie po bokach ciała (Rysunek 1B).
- Umieścić elektrody stymulujące (1 = anoda i 2 = katoda) podskórnie po obu stronach kończyny przedniej tak, aby odpowiadały przebiegowi splotu ramiennego. Unieść skórę, aby wprowadzić igłę prostopadle przez skórę, i przesunąć około 5 mm igły pod skórę, nie przebijając leżących poniżej mięśni.
- Umieścić elektrodę rejestrującą (3) podskórnie nad mięśniem dwugłowym ramienia, unosząc skórę. Umieścić elektrodę referencyjną (4) w poduszkach łapy na głębokości 3 mm pod kątem 30 stopni. Umieścić elektrodę uziemiającą (5) podskórnie z boku ciała myszy.
UWAGA: W tej konfiguracji elektrody znajdują się w bliskiej odległości od siebie. Należy zapobiegać ich wzajemnemu dotykaniu, ponieważ zniekształca to zapis.
3. Pozyskiwanie danych
- Rozpocznij stymulację, naciskając przycisk recurrent stimulus w jednostce sterującej, a następnie obróć pokrętło regulatora natężenia, aby zwiększyć bodziec. Stymuluj wszystkie aksony, stosując 1 impuls/s o czasie trwania bodźca 0,1 ms. Wybierz odpowiednią częstotliwość i czas trwania z menu rozwijanego w oprogramowaniu.
- Aby osiągnąć bodźce supramaksymalne (5-20 mA; w warunkach demielinizacji do 60 mA), stosuj bodźce o rosnącym natężeniu, obracając pokrętło regulatora natężenia, aż amplituda odpowiedzi CMAP przestanie rosnąć. Następnie zwiększ bodziec o kolejne 20%, aby upewnić się, że amplituda CMAP osiągnęła odpowiedź maksymalną. Zakończ stymulację, ponownie naciskając przycisk recurrent stimulus.
- Użyj narzędzia znacznikowania, aby wskazać następujące punkty w zapisie: początek bodźca, początek odpowiedzi, maksymalny szczyt dodatni oraz maksymalny szczyt ujemny (Rycina 2).
- Wyznacz latencję (w ms) jako opóźnienie od początku bodźca do początku odpowiedzi (Rycina 2). Za początek odpowiedzi uznaj najwcześniejszy punkt, w którym amplituda zaczyna rosnąć. Wykorzystaj latencję do oceny demielinizacji aksonów.
- Zmierz amplitudę (mV) od maksymalnego szczytu ujemnego do maksymalnego szczytu dodatniego (Rycina 2). Wykorzystaj wartość amplitudy do skorelowania liczby funkcjonalnych aksonów.
Rycina 2. Reprezentacyjny obraz odpowiedzi CMAP. Schematyczna odpowiedź CMAP wskazująca punkty wykorzystywane do obliczania amplitudy i latencji (A). Latencję określa się jako opóźnienie od momentu stymulacji do początku odpowiedzi CMAP. Amplitudę szczyt-szczyt mierzy się od maksymalnego piku ujemnego do maksymalnego piku dodatniego fali dwufazowej. Reprezentacyjne zapisy ze zdrowego zwierzęcia nietransgenicznego (B) oraz zwierzęcia chorego z wydłużoną latencją i zmniejszoną amplitudą (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Ponieważ dokładne rozmieszczenie elektrod może wpływać na wartość uzyskaną podczas rejestracji, należy ponownie umieścić elektrody i trzykrotnie zmierzyć ten sam nerw, stosując bodziec nadmaksymalny, aby upewnić się, że uzyskano największą odpowiedź. Należy wykorzystać średnią z tych pomiarów.
Wyniki
Pomiary elektrofizjologiczne CMAP z wykorzystaniem elektrod igłowych stanowią małoinwazyjną i bardzo czułą metodę monitorowania funkcji nerwowo-mięśniowych w czasie. Technika opisana w niniejszym materiale umożliwia ocenę przewodnictwa nerwowego w kończynach przednich myszy, a tym samym dostarcza informacji o funkcjonalności nerwu.
Amplitudy i latencje CMAP mierzono w kończynach tylnych i przednich w przebiegu choroby w dwóch modelach mysich ALS, SOD1-G93A9 oraz PrP-hFUS-WT310 (Rycina 3), a także w modelu mysim CMT, C61-PMP2211,12 (Rycina 4). Modele mysie ALS stworzono poprzez nadekspresję ludzkich genów związanych z ALS, a mianowicie zmutowanego genu SOD1 lub genu FUS typu dzikiego. W obu modelach u myszy rozwija się obraz ALS przypominający postępującą degenerację neuronów ruchowych prowadzącą do paraliżu. W kontrolnych miotach nie-transgenicznych amplituda CMAP w kończynach tylnych i przednich nie zmieniała się w czasie (Rycina 3A). Z drugiej strony, amplituda CMAP nerwu kulszowego w kończynie tylnej była drastycznie obniżona u myszy SOD1-G93A, jeszcze przed wystąpieniem objawów w okolicach 60 dnia życia (podczas gdy pierwsze objawy ruchowe zazwyczaj obserwuje się w wieku trzech miesięcy)13. Amplituda w tym wieku u miotów nie-transgenicznych (non-tg) wynosiła 90 mV, podczas gdy u myszy SOD1-G93A wynosiła ona zaledwie 30 mV. W miarę postępu choroby do późnego stadium objawowego w wieku 150 dni odnotowano jedynie minimalny dalszy spadek amplitudy. Spadek amplitudy CMAP, a zatem degeneracja aksonów, była opóźniona w nerwach splotu ramiennego kończyn przednich w porównaniu z nerwem kulszowym kończyn tylnych. W kończynach przednich postęp choroby był również bardziej zauważalny, ponieważ amplituda CMAP spadła z 70 mV do 30 mV w pomiarach wykonanych przed i po wystąpieniu deficytów ruchowych u tych myszy.
W modelu mysim ALS PrP-hFUS-WT3 wystąpienie deficytów motorycznych rozpoczyna się mniej więcej w 28. dniu życia10, co zbiega się z początkiem spadku amplitudy CMAP. Jest to model choroby o bardziej przyspieszonym przebiegu, ponieważ myszy osiągają stadium końcowe mniej więcej w 65. dniu życia. Spadek amplitudy CMAP następował szybciej w nerwie kulszowym kończyny tylnej w porównaniu z splotem ramiennym kończyny przedniej, co wskazuje na wcześniejszą degenerację aksonalną w kończynach tylnych (Rycina 3D). Obserwacja ta potwierdza obserwacje kliniczne w obu tych modelach mysich, w których kończyny tylne są sparaliżowane znacznie wcześniej niż kończyny przednie, które pozostają funkcjonalne aż do późnych etapów procesu chorobowego.
Ogólnie czas utajenia od momentu stymulacji do zainicjowania potencjału czynnościowego był krótszy w kończynach przednich w porównaniu do kończyn tylnych (Rycyna 3B, E). Wynika to po prostu z krótszej odległości między elektrodami stymulującymi a rejestrującymi. Czas utajenia dostarcza informacji o stopniu mielinizacji aksonów. Zaobserwowaliśmy, że czasy utajenia CMAP ulegają wydłużeniu w miarę postępu choroby w modelach mysich ALS, mimo że ALS nie jest chorobą demielinizacyjną. Jest to najprawdopodobniej spowodowane utratą większych aksonów ruchowych o szybszym przewodzeniu.
Myszy C61-PMP22 wykazujące nadekspresję 3-4 kopii ludzkiego genu PMP22 oraz myszy heterozygoczne odtwarzają bardzo łagodny fenotyp choroby CMT1A z niewielką demielinizacją i zredukowanymi CMAP, jednak bez widocznego fenotypu11,12. U myszy C61-PMP22 w wieku 1,5-2 lat amplitudy CMAP są zredukowane, a latencje wydłużone zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich (Rycina 4). Reprezentatywne zapisy wykazujące zmniejszoną amplitudę i opóźnioną odpowiedź w porównaniu z zapisem od zdrowego osobnika przedstawiono odpowiednio na Rycini 2C, B. Latencje CMAP w kończynach przednich nie są w takim stopniu zaburzone, jak w kończynach tylnych. Jest to zgodne z obrazem klinicznym pacjentów z CMT1A, u których częściej stwierdza się znacznie zredukowane lub niewykrywalne CMAP w kończynach dolnych ze względu na patofizjologiczną naturę CMT jako zaburzenia zależnego od długości włókien14. Dodatkowo stopień ciężkości choroby koreluje z amplitudą CMAP, a nie z latencją czy prędkością przewodzenia, ponieważ amplitudy korelują ze stopniem integralności aksonalnej14,15. Niemniej jednak wyniki wskazują, że metoda ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć procesy demielinizacyjne, takie jak te obserwowane w CMT1A.
Zmienność amplitudy i latencji była najniższa w grupach nietransgenicznych (współczynnik zmienności odpowiednio 2-15% i 1-13%). We wszystkich przypadkach zwierząt transgenicznych odnotowano większą zmienność pomiarów (współczynnik zmienności dla amplitudy 8-51% oraz dla latencji 1-21%), co najprawdopodobniej wynika z różnic w postępie choroby u poszczególnych zwierząt. We wszystkich przypadkach zmienność była podobna w kończynach tylnych i przednich. Zgłoszono, że zmienność przy zastosowaniu elektrod igłowych i powierzchniowych jest zbliżona16.
Wymagane natężenia bodźca nie różniły się znacząco pomiędzy modelami nietransgenicznymi a modelami ALS (Rysunek 3C, F). Podobnie, bodziec wymagany do osiągnięcia stymulacji supramaksymalnej w tych przypadkach był zbliżony dla kończyn przednich i tylnych i wynosił od 5-12 mA. W przypadku CMT odnotowano konieczność zwiększenia natężenia bodźca17 i ten sam fenotyp zaobserwowano u myszy C61-PMP22 (Rysunek 4C). Zjawisko to wyjaśniono zwiększoną impedancją elektryczną wynikającą z hipertroficznych zmian endoneuralnych17.
Aby potwierdzić, że amplituda CMAP zarejestrowana z przednich kończyn wynikała ze stymulacji nerwu, a nie stymulacji mięśnia, wykonaliśmy jednostronną częściową aksotomię splotu ramiennego u 5-miesięcznych nietransgenicznych myszy C57BL/6Jax (samców i samic) (Rysunek 5). Aksotomia zmniejszyła amplitudę CMAP z 90 mV do 20 mV, co wskazuje, że w wyniku operacji odcięta została większość aksonów. Nie odnotowano zmian amplitudy w przeciwległej kończynie przedniej ani w kończynach tylnych. Wynik ten jednoznacznie wskazuje, że odpowiedź wykryta w mięśniu dwugłowym ramienia była efektem stymulacji nerwu, a nie stymulacji mięśnia.
Rycina 3. Amplituda CMAP, latencja i wymagany bodziec w przebiegu choroby w kończynach tylnych i przednich w modelach mysich ALS. Pomiary u myszy transgenicznych (tg) SOD1-G93A (A-C) i PrP-hFUS-WT3 (D-F) oraz u nietransgenicznych (non-tg) osobników z jednego miotu przeprowadzono w momencie wystąpienia objawów ruchowych, w stadium objawowym oraz w późnej fazie objawowej procesu chorobowego, odpowiednio w wieku 57, 91 i 147 dni (d) lub w dniach 29, 38 i 53 dla myszy SOD1-G93A i PrP-hFUS-WT3. Kolor czarny: kończyna tylna nietransgeniczna, czarna przerywana linia: kończyna przednia nietransgeniczna, kolor szary: kończyna tylna transgeniczna, szara przerywana linia: kończyna przednia transgeniczna. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD. Amplitudy (A, D) były stabilne w czasie u zwierząt nietransgenicznych zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich. U zwierząt transgenicznych amplitudy spadały w przebiegu procesu chorobowego. Latencje (B, E) były w mniejszym stopniu dotknięte chorobą, a główne różnice zaobserwowano między kończynami tylnymi i przednimi, niezależnie od genotypu. Zmienność wymaganego bodźca (C, F) była minimalna we wszystkich grupach. Dla SOD1-G93A N = 4 we wszystkich grupach z wyjątkiem tg 147 d, gdzie N = 3. Dla myszy PrP-hFUS-WT3 w grupach wiekowych 29, 38 i 53 N wynosi odpowiednio 4, 5 i 4 dla non-tg oraz 7, 5 i 3 dla tg. Symbole oznaczają różnice między grupami w następujący sposób: *: kończyna tylna non-tg vs. kończyna tylna tg, #: kończyna przednia non-tg vs. kończyna przednia tg, ¤: kończyna tylna non-tg vs. kończyna przednia non-tg, szara *: kończyna tylna tg vs. kończyna przednia tg. Dwuway ANOVA z testem porównań wielokrotnych Tukeya, *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001, ****: p < 0.0001.#: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001, ####: p < 0.0001.¤: p < 0.05, ¤¤: p < 0.01, ¤¤¤: p < 0.001, ¤¤¤¤: p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. Amplituda CMAP, latencja i wymagany bodziec w kończynach tylnych i przednich u myszy CMT1A. Pomiary u myszy transgenicznych (tg) C61-PMP22 oraz nietransgenicznych (non-tg) z tego samego miotu przeprowadzono w wieku 1,5-2 lat. Amplituda (A) była obniżona zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich u myszy transgenicznych. Latencja (B) była wydłużona we wszystkich kończynach u myszy z CMT, a pomiar ten pozwolił na wykrycie nawet subtelnych zmian w kończynach przednich. Wymagana intensywność bodźca (C) była zwiększona u myszy C61-PMP22, co odpowiada fenotypowi stwierdzanemu u pacjentów z CMT1A. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, dla non-tg N = 4 i tg N = 3. Dwuczynnikowa analiza ANOVA z testem porównań wielokrotnych Sidaka,**: p < 0.01, ****: p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5. Potencjały czynnościowe kończyny przedniej są wywołane stymulacją nerwu. Aby wykluczyć możliwość, że obserwowana odpowiedź CMAP była spowodowana stymulacją mięśni, przeprowadzono (częściową) aksonotomię splotu ramiennego. Amplitudę (A) i czas utajenia (B) CMAP rejestrowano przed (pre) oraz 4 dni po (post) aksonotomii splotu ramiennego u dorosłych myszy nietransgenicznych. Aksonotomia zmniejszyła amplitudę CMAP, co wskazuje, że odpowiedź wynikała ze stymulacji nerwu. Czarny: kończyna tylna, szary: przeciwległa kończyna przednia, szary przerywany: jednostronna kończyna przednia. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, N = 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Czułe metody rejestracji są niezbędne do oceny postępu choroby, a zwłaszcza skuteczności terapii w zwierzęcych modelach zaburzeń neuronalnych. Oznaczanie CMAP jest minimalnie inwazyjną techniką elektrofizjologiczną, która jest rutynowo stosowana w klinikach i w warunkach eksperymentalnych do oceny przewodnictwa nerwowego w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych i neuropatycznych 3,18. W tym miejscu opisujemy nowatorskie zastosowanie do rejestracji CMAP u myszy w celu pomiaru przewodnictwa nerwowego w nerwie splotu ramiennego kończyny przedniej. Przedstawiona metoda pozwala na bardziej wszechstronną i szczegółową ocenę podłużną funkcji neuronów w mysich modelach neurodegeneracji.
Elektrody igłowe są nieco bardziej inwazyjne niż elektrody pierścieniowe, a zwłaszcza w badaniach podłużnych należy zachować ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek. Jedną z możliwych wad tej metody jest uraz wynikający z przekłucia nerwu lub mięśnia. Jednak po starannym podskórnym umieszczeniu elektrod można zapobiec urazom i zaburzeniom mięśni i nerwów. W przeciwieństwie do metody z wykorzystaniem elektrod pierścieniowych, przedstawiona tutaj metoda nie wymaga golenia sierści z dużych partii ciała. W konsekwencji nie ma dyskomfortu ani wpływu na termoregulację dla zwierzęcia.
Umiejscowienie elektrod ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego i spójnego rejestrowania amplitud i opóźnień CMAP. Zaleca się zmianę położenia elektrod i wykonanie dwóch do trzech pomiarów w każdym miejscu, aby potwierdzić, że osiągnięto maksymalną stymulację i odpowiedzi. Prawidłowe zapisy powinny dać krzywe dwufazowe, jak pokazano na rysunku 2. Aby ustandaryzować metodę, nietransgeniczne myszy bez uszkodzenia nerwów są najlepszymi modelami do ustalenia prawidłowego i spójnego ułożenia elektrod w celu optymalnej stymulacji. Elektrody igłowe wielokrotnego użytku nadają się do wielokrotnego użytku, jeśli są regularnie sterylizowane, np. aldehydem glutarowym przez 20 minut między zwierzętami i sprawdzane pod kątem ostrości.
U zdrowych dorosłych myszy amplitudy CMAP rejestrowane prezentowaną metodą wynoszą zazwyczaj 80-100 mV po stymulacji nerwu kulszowego i splotu ramiennego. Jest to znacznie większe niż odpowiedzi mierzone za pomocą elektrod pierścieniowych, ponieważ istnieje wyższa impedancja spowodowana przez skórę dla elektrod pierścieniowych, która daje wyniki 20-40 mV 8,19,20. W modelach mysich ALS amplituda CMAP po stymulacji nerwu kulszowego lub splotu ramiennego w kończynach sparaliżowanych spada do 10-30 mV. Wielkość amplitudy CMAP jest mniejsza u młodych zwierząt, ponieważ amplituda CMAP wzrasta podczas rozwoju21.
Metoda, którą tutaj opisujemy, jest szczególnie przydatna w mysich modelach ALS, w których odnerwienie i późniejsze deficyty motoryczne występują wcześniej w kończynach tylnych niż w kończynach przednich13. Oprócz denerwacji, metoda może wykrywać reinerwację, która jest określana jako zapobiegnięty lub opóźniony spadek amplitudy CMAP. Dramatyczny spadek amplitudy CMAP w mięśniach kończyn tylnych już w wieku wystąpienia objawów utrudnia śledzenie dalszego postępu choroby; ponieważ amplitudy CMAP osiągają bardzo niskie wartości we wczesnym stadium choroby, nie zmniejszają się dalej w trakcie procesu chorobowego. W przeciwieństwie do tego, utrata aksonów postępuje w wolniejszym tempie w nerwie splotu ramiennego kończyn przednich i stanowi bardziej czułą opcję pomiaru postępu choroby w dłuższym czasie trwania choroby. Co więcej, mniej zdegenerowane kończyny przednie mogą stanowić silniejsze miejsce do oceny podejść terapeutycznych, które mają na celu poprawę funkcji aksonów.
Oczywiste jest, że przedstawiona technika daje nowe możliwości charakterystyki mysich modeli zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Zapisy CMAP z elektrodami igłowymi z nerwu kulszowego i splotu ramiennego to szybka i powtarzalna metoda oceny utraty aksonów i demielinizacji kończyn tylnych i przednich. Czułość metody umożliwia wykrycie deficytów aksonalnych jeszcze przed zarejestrowaniem zauważalnych deficytów motorycznych, a tym samym umożliwia wczesne określenie ilościowe tych wad. Co więcej, możliwość wielokrotnego testowania zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt i zapewnia szczegółowy przegląd postępu chorób nerwowo-mięśniowych i neuropatycznych w różnych miejscach u pojedynczego zwierzęcia.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez KU Leuven ("Otwarcie Przyszłości" i C1), Fundusz Badań Naukowych Flandrii (FWO-Vlaanderen), Fundację Thierry'ego Latrana, Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires (ABMM), Stowarzyszenie Dystrofii Mięśniowej (MDA), Stowarzyszenie ALS oraz ALS Liga (Belgia). PVD jest starszym inspektorem śledczym FWO-Vlaanderen. RP był wspierany przez granty z Central Remedial Clinic (CRC) Ireland, a obecnie jest wspierany przez National University of Ireland (NUI) i FWO.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podskórna elektroda igłowa wielokrotnego użytku, Pl/Ir | Technomed | TE/S61-434 | Igła ma 13 mm (0,51") długości, 0,4 mm (27G) średnicy |
| System elektrodiagnostyczny Natus | Aparat EMG | Natus Neurology | UltraPro S100 |
| Synergy | Natus Neurology | wersja 20.1.0.100 | Oprogramowanie EMG dla UltraPro S100 |
| Physitem Controller | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV | Poduszka grzewcza |
| combi-vet Baza systemu anestezjologicznego Cyfrowy przepływomierz z TEC 3 Vaporize | Rothacher & Partner | CV 30-301-D | Parownik i przepływomierz izofluranu |
| Iso-Vet 1000 mg/g | Piramal Healthcare UK Limited | AP/DRUGS/220/96 | Myszy z izofluranem |
| SOD1-G93A | The Jackson Laboratory | #002726 | ALS tg i rodzeństwo z miotu bez tg, tylko samice |
| myszy PrP-hFUS-WT3 | The Jackson Laboratory | #017916 | Plemiot z grupy kontrolnej ALS tg i nie-tg, wszystkie grupy zrównoważone dla samców i samic |
| Myszy C57BL/6Jax | The Jackson Laboratory | #000664 | Myszy inne niż tg do aksotomii, samce i samice |
| myszy C61-PMP22 | Linia myszy została hojnie podarowana przez prof. M. Seredę (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, Gö ttingen, Niemcy). | Kontrolne rodzeństwo z miotu CMT tg i nie-tg, wszystkie grupy zrównoważone dla samców i samic |
Bibliografia
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).
- Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies. Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).
- de Carvalho, M., et al. Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS. Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).
- Krajewski, K. M., et al. Neurological dysfunction and axonal degeneration in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Brain. 123 (Pt 7), 1516-1527 (2000).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18 (4), 402-408 (1995).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19 (8), 946-952 (1996).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles. J Vis Exp. (103), (2015).
- Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves. J Vis Exp. (86), (2014).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Mitchell, J. C., et al. Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion. Acta Neuropathol. 125 (2), 273-288 (2013).
- Robertson, A. M., et al. Comparison of a new pmp22 transgenic mouse line with other mouse models and human patients with CMT1A. J Anat. 200 (4), 377-390 (2002).
- Huxley, C., et al. Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice. Hum Mol Genet. 7 (3), 449-458 (1998).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Manganelli, F., et al. Nerve conduction velocity in CMT1A: what else can we tell. Eur J Neurol. 23 (10), 1566-1571 (2016).
- Cornett, K. M., et al. Phenotypic Variability of Childhood Charcot-Marie-Tooth Disease. JAMA Neurol. 73 (6), 645-651 (2016).
- Jacobson, W. C., Gabel, R. H., Brand, R. A. Surface vs. fine-wire electrode ensemble-averaged signals during gait. J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 37-44 (1995).
- Parker, V., Warman Chardon, J., Mills, J., Goldsmith, C., Bourque, P. R. Supramaximal Stimulus Intensity as a Diagnostic Tool in Chronic Demyelinating Neuropathy. Neurosci J. 2016, 6796270(2016).
- Benoy, V., et al. Development of Improved HDAC6 Inhibitors as Pharmacological Therapy for Axonal Charcot-Marie-Tooth Disease. Neurotherapeutics. 14 (2), 417-428 (2017).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41 (6), 850-856 (2010).
- Srivastava, A. K., et al. Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice. Neurobiol Dis. 47 (2), 163-173 (2012).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
Przedruki i uprawnienia
