Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną Ala97Ser

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57743

⸱

9 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Division of Chinese Acupuncture and Traumatology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou Medical Center and Chang Gung University College of Medicine, 2Department of Neurology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou Medical Center and Chang Gung University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół potwierdzający obecność mutacji punktowej do diagnozy dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej, używając jako przykładu Ala97Ser, najpowszechniejszej mutacji endemicznej na Tajwanie.

Streszczenie

Testy genetyczne są najbardziej wiarygodnym testem na dziedziczną amyloidozę związaną z transtyretyną i powinny być wykonywane w większości przypadków amyloidozy transtyretynowej (ATTR). ATTR jest rzadką, ale śmiertelną chorobą o niejednorodnych fenotypach; Dlatego diagnoza jest czasami opóźniona. Wraz z rosnącym zainteresowaniem i szerszym uznaniem wczesnych objawów ATTR, a także pojawiających się metod leczenia, odpowiednie badania diagnostyczne, w tym test genetyczny transtyretyny (TTR), w celu potwierdzenia typów i wariantów ATTR, mają zatem zasadnicze znaczenie dla poprawy rokowania. Analizy genetyczne metodami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) potwierdzają obecność mutacji punktowych TTR znacznie szybciej i bezpieczniej niż konwencjonalne metody, takie jak southern blot. W niniejszym artykule przedstawiamy genetyczne potwierdzenie mutacji ATTR Ala97Ser, najczęstszej mutacji endemicznej na Tajwanie. Protokół składa się z czterech głównych etapów: pobrania próbki krwi pełnej, ekstrakcji DNA, analizy genetycznej wszystkich czterech eksonów TTR za pomocą PCR oraz sekwencjonowania DNA.

Wprowadzenie

Amyloidoza transtyretyny (TTR) (ATTR) jest najczęstszą formą dziedzicznej amyloidozy układowej1, i może być spowodowana przez autosomalną dominująco dziedziczoną mutację w genie transtyretyny (TTR)2. Mutacje TTR destabilizują strukturę białka tetramerycznego i prowadzą do jego dysocjacji na monomery, które ponownie łączą się w fibryle amyloidowe2. Na całym świecie zgłoszono ponad 100 amyloidogennych mutacji TTR1. Analizy genetyczne metodami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) potwierdzają obecność mutacji punktowej TTR i mają zalety, w tym unikanie obsługi radioaktywnie znakowanych sond w porównaniu z southern blot3. PCR to szybka, łatwa, tania i niezawodna technika, która została zastosowana w wielu dziedzinach nowoczesnych nauk ścisłych4.

Wczesna diagnoza tej postępującej i śmiertelnej choroby jest wyzwaniem ze względu na jej fenotypową niejednorodność. Wraz z rosnącym zainteresowaniem i szerszym uznaniem wczesnych objawów ATTR, a także pojawiających się metod leczenia5, odpowiednie badania diagnostyczne, w tym test genetyczny TTR, mają zatem kluczowe znaczenie dla poprawy rokowania. Co więcej, różne mutacje są związane z różną penetracją cechy, wiekiem zachorowania, wzorcami progresji, ciężkością choroby, medianą przeżycia, skutecznością przeszczepu wątroby lub stabilizatorami TTR2,6 oraz zmiennym stopniem zaangażowania neurologicznego i kardiologicznego, co ma ogromne implikacje dla poradnictwa genetycznego7,8,9. Poza tym bardzo dokładny test genetyczny jest jedynym narzędziem, które rozróżnia dwa różne typy ATTR: dziedziczny (zmutowany) i dziki (forma niezmutowana, starcza amyloidoza układowa, SSA)7. Konieczne jest potwierdzenie rodzajów ATTR, ponieważ terapie różnią się znacznie od siebie2. W związku z tym coraz bardziej konieczne jest opisywanie stopniowego protokołu badania genetycznego TTR.

Molekularne podejście do wykrywania mutacji zostanie zilustrowane na przykładzie Ala97Ser, najpowszechniejszej endemicznej mutacji na Tajwanie. Modyfikacje na etapie ekstrakcji DNA zmniejszają ilość trzech użytych roztworów i dają wystarczającą ilość DNA. W tym protokole przeanalizowano wszystkie cztery eksony TTR, podczas gdy regiony, w tym 5' upstream, 3' downstream, promotory, introny i regiony nieulegające translacji (UTR) nie zostały zsekwencjonowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Testy przeprowadzone w laboratorium zostały przeprowadzone zgodnie z wymaganiami Poprawek do Poprawy Laboratoriów Klinicznych (CLIA) z 1988 roku, przepisami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szpitala i Uniwersytetu Chang Gung Memorial (Licencja nr 100-4470A3 i 104-2462A3). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

1. Pobieranie próbek krwi

  1. Zbierz krew pełną do dostępnych na rynku probówek poddanych działaniu EDTA. Delikatnie wymieszać i przechowywać próbkę krwi w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.

2. Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej

Użyj zestawu do ekstrakcji DNA do ekstrakcji genomowego DNA (zobacz Tabelę materiałów).

  1. Dodać 10 ml roztworu 1 do 4,0 ml próbki krwi. Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut.
  2. Odwirować próbkę o masie 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 3 ml roztworu 1.
  3. Ponownie odwirować próbkę o masie 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 3 ml roztworu 2.
  4. Dodać 10 μl roztworu podstawowego pronazy (225 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 100 μg/ml i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Schłodzić probówkę na lodzie przez 10 minut. Dodać 0,8 ml roztworu 3 do próbki i odwrócić 3 - 5 razy. Umieść próbkę na lodzie na 5 minut.
  6. Odwirować próbkę o masie 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść supernatant do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  7. Dodać 6 μl roztworu podstawowego RNazy (10 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  8. Dodaj 2,5 ml alkoholu izopropylowego i dokładnie wymieszaj, delikatnie odwracając kilka razy, aby wytrącić DNA (utworzą się pasma białego, kłaczkowatego materiału). Za pomocą pipety o dużym otworze przenieś środek strącający DNA do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  9. Wirować przy 12 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant. Umyj osad DNA, dodając 500 μl 70% etanolu.
  10. Odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Suchy na powietrzu granulat DNA w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl ddH2O i inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut w celu ponownego zawieszenia DNA.

3. Kwantyfikacja genomowego DNA

Użyj spektrofotometru (zobacz Tabelę materiałów), aby wykryć ilość i jakość genomowego DNA.

  1. Zaloguj się do komputera podłączonego do spektrofotometru. Otwórz oprogramowanie.
  2. Zainicjuj spektrofotometr:
    1. Kliknij "Kwas nukleinowy" w oprogramowaniu spektrofotometru.
    2. Wyczyść cokół jednorazową chusteczką papierową i oczyszczoną wodą.
  3. Ślepe światło spektrofotometru:
    1. Załaduj 2 μl oczyszczonej wody na cokół.
    2. Opuść górne ramię spektrofotometru i kliknij "Puste", aby je skalibrować.
    3. Po zakończeniu podnieś ramię i osusz cokół chusteczką.
  4. Zmierz próbkę:
    1. Kliknij "DNA-50" w typie próbki.
    2. Załaduj 2 μl próbki DNA na cokół.
    3. Opuść górne ramię i kliknij "Zmierz", aby zmierzyć stosunek A260/A280 i stężenie próbki.
    4. Wyczyść cokół między każdym biegiem chusteczką i oczyszczoną wodą.
  5. Kliknij "Print Screen", aby zebrać dane.

4. Analizy genetyczne mutacji

Amplifikuj docelowe DNA za pomocą PCR4. Przeprowadzić PCR w mieszaninie reakcyjnej o objętości 25 μl przy użyciu zestawu do polimerazy DNA (patrz tabela materiałów). Tabela 1 przedstawia startery intronowe genu TTR.

gen Sekwencja podkładowa Ekson1 F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' Ekson2 Prąd: 5'-TCTTGTTTCCCTCCAGATTTC-3'
R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' Ekson3 F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
Światło: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' Ekson4 F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
Nr kat.: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

Tabela 1. Startery intronowe genu TTR. (Sekwencja referencyjna NCBI: NC_000018.10)

  1. Dodać odczynniki z Tabeli 2 do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
Składniki Objętość (μL) Końcowe stężenie 10x Bufor Rozdział 2.5 1x MgCl2 (25 mM) 1,5 1,5 mM Wzmacniacz 360 GC 1 - Polimeraza DNA 360 0,2 pkt. 2 U/reakcja dNTP Mix (25 mM każdy) cyfra arabska 2 mM każdy Podkład F (10 μM) 1 0,4 μM Podkład R (10 μM) 1 0,4 μM DNA (100 ng) cyfra arabska Woda klasy PCR Rozdział 13,8 - Całkowita objętość 25 -

Tabela 2. warunki reakcji PCR.

  1. Delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj na wirówce stołowej, aby zebrać wszystkie składniki na dno probówki. Umieść probówkę w termocyklerze.
  2. Wykonaj PCR przez 30 cykli. Każdy cykl składa się z etapu denaturacji trwającego 30 s w temperaturze 94 °C, wyżarzania startera przez 30 s w temperaturze 58 °C i przedłużania polimerazy przez 45 s w temperaturze 72 °C (zob. tabela 3).
krok Temperatura (°C) Godzina cykl Początkowa denaturacja 95 Rozdział 95 Czas trwania: 5 min 1 Etap denaturacji DNA 94 Rozdział 94 30 sekund 30 cykli Etap wyżarzania gruntu Rozdział 58 30 sekund 30 cykli Krok wydłużania polimerazy 72 Rozdział 72 45 sekund 30 cykli Krok wydłużenia po wydłużeniu 72 Rozdział 72 Czas trwania: 10 min 1 Koniec cyklu PCR 4 nieokreślony

Tabela 3. Warunki cykliczne dla amplifikacji produktów PCR.

  1. Walidacja produktu PCR poprzez wizualizację za pomocą elektroforezy żelowej:
    1. Przygotuj żel agarozowy 1,2%:
      1. Wymieszaj 1,2 g proszku agarozowego ze 100 ml 0,5 x TBE w kolbie kuchennej mikrofalowej. Mikrofaluj przez 2 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Schłodzić mieszaninę agarozy do temperatury 55 °C.
      2. Dodać 2 μl roztworu bromku etydyny (10 mg/ml) do mieszaniny agarozy i delikatnie wymieszać. Wlej mieszaninę agarozy do tacki na żel na około 5 - 7 mm, a następnie dodaj grzebień (grzebienie) na miejsce. Pozwól mu zastygnąć (co najmniej 30 minut) i ostrożnie usuń grzebień(y).
    2. Załaduj próbki i uruchom żel agarozowy:
      1. Umieść żel i tackę w komorze elektroforetycznej. Napełnij komórkę elektroforetyczną 0,5x TBE, aż żel zostanie pokryty.
      2. Ostrożnie załadować 2 μl drabinki DNA o długości 100 pz (patrz Tabela materiałów) do jednego pasa żelu jako marker wielkości cząsteczki. Załaduj mieszaninę barwnika/próbki (5 μl mieszanki produktów PCR z 1 μl 6-krotnie obciążającym barwnikiem) do dodatkowych pasów.
      3. Włącz zasilanie. Uruchom żel na 25 minut przy napięciu 100 V.
      4. Usuń żel z komory elektroforetycznej. Wizualizacja fragmentów DNA w świetle UV w systemie obrazowania.

5. Sekwencjonowanie DNA

  1. Produkty do PCR należy oczyszczać za pomocą komercyjnego zestawu i sekwencjonowania komercyjnie lub za pomocą automatycznego sekwencera (patrz tabela materiałów).
  2. Prześlij sekwencje nukleotydowe do serwera NCBI BLAST, aby porównać zapytanie nukleotydowe z bazami danych nukleotydów10. Po wyświetleniu wyników wykonaj wyrównanie sekwencji i zidentyfikuj oczekiwaną mutację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Elektroforeza w żelu agarozowym próbek od dwóch pacjentów i jednej zdrowej osoby wykazała prążki o oczekiwanych rozmiarach, w tym produkt PCR o długości 454 bp dla eksonu 4 genu TTR (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole istnieją dwa kluczowe kroki. Po pierwsze, aby mieć wystarczającą liczbę białych krwinek, należy unikać próbki hemodyluowanej11. Po drugie, stosowanie odpowiednich starterów PCR ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników12. Do zaprojektowania podkładów 4,13 użyliśmy narzędzia sieciowego Primer-BLAST; należy pokryć co najmniej 40 par zasad z każdej strony czterech eksonów TTR. Uruchamiamy r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Pani Shin-Fun Wu za pomoc w eksperymentach. Badanie to było wspierane przez grant z Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) oraz IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Tajwan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki poddane działaniu EDTA Zestaw
Stratagen200600
Spektrofotometr NanoDrop ND2000 Wycieraczki Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Delicate TaskKimberly-ClarkKimtech Science Kimwipes
Zestaw polimerazy DNA AmpliTaq Gold 360 AppliedBiosystems4398823
Startery intronowe genu TTR Ekson1F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
Ekson1R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Ekson2F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
Ekson2R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Ekson3F: 5'-GTGTTAGTTGGGGGGGGTGT-3'
Ekson3R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Ekson4F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
Ekson4R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'
termocyklerApplied BiosystemsGeneAmp PCR System 9700
komórka do elektroforezy ADVANCEMupid-2plus
Drabinka DNAProtechPT-M1-100
barwnikBioLabsB7021
AlphaImager ECAlpha InnotechAlphaImager Automatyczny
 Applied Biosystems3730xl
do ekstrakcji DNA BD sekwencer ECAnalizator DNA

Bibliografia

  1. Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
  2. Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
  3. Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
  4. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  5. Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).
  6. Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
  7. Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
  8. Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
  9. Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
  10. Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
  11. Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  12. Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
  13. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  15. Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
  16. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
  17. Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
  18. Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
  19. Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
  20. Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
  21. Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).
  22. Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
  23. Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
  24. Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
  25. Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).
  26. Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
  27. Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
  28. Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Amyloidoza transtyretynowametody PCRekstrakcja DNAelektroforeza w elu agarozowymsekwencjonowanie DNAmutacja genu TTRmutacja Ala97Serdziedziczna ATTRpr bka krwi
Analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną Ala97Ser
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.