Artykuł metodologiczny

Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57749

⸱

22 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół łączy charakterystykę próbki białka za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego oraz szybkie wiązanie przesiewu dla naładowanych ligandów za pomocą elektroforezy kapilarnej o powinowactwie. Jest zalecany w przypadku białek o elastycznej strukturze, takich jak białka wewnętrznie nieuporządkowane, w celu określenia wszelkich różnic w wiązaniu dla różnych konformerów.

Streszczenie

Rośliny są silnie zależne od swojego środowiska. Aby dostosować się do stresujących zmian (np. suszy i wysokiego zasolenia), rośliny wyższe rozwijają klasy wewnętrznie nieuporządkowanych białek (IDP) w celu zmniejszenia stresu oksydacyjnego i osmotycznego. W artykule wykorzystano kombinację kapilarnej elektroforezy żelowej (CGE) i elektroforezy powinowactwa do zmiany ruchliwości (ACE) w celu opisania zachowania wiązania różnych konformerów IDP AtHIRD11 z Arabidopsis thaliana. CGE służy do potwierdzenia czystości AtHIRD11 i wykluczenia fragmentów, modyfikacji potranslacyjnych i innych zanieczyszczeń jako przyczyn złożonych wzorców pików. W tej części eksperymentu różne składniki próbki są rozdzielane lepkim żelem wewnątrz kapilary według ich różnych mas i wykrywane za pomocą detektora diodowego. Następnie za pomocą ACE bada się wiązanie próbki z różnymi jonami metali. W takim przypadku ligand jest dodawany do roztworu buforowego i mierzone jest przesunięcie czasu migracji w celu określenia, czy wystąpiło zdarzenie wiązania, czy nie. Jedną z zalet stosowania kombinacji CGE i ACE do określania zachowania wiązania IDP jest możliwość zautomatyzowania elektroforezy żelowej i testu wiązania. Co więcej, CGE wykazuje niższą granicę wykrywalności niż klasyczna elektroforeza żelowa, a ACE jest w stanie szybko określić sposób wiązania liganda. Ponadto ACE może być również stosowany do innych naładowanych gatunków niż jony metali. Jednak zastosowanie tej metody do eksperymentów z wiązaniem jest ograniczone pod względem możliwości określenia liczby miejsc wiązania. Niemniej jednak połączenie CGE i ACE można dostosować do scharakteryzowania zachowania wiązania dowolnej próbki białka w stosunku do wielu naładowanych ligandów.

Wprowadzenie

Rośliny są bardziej zależne od swojego środowiska niż wiele innych form życia. Ponieważ rośliny nie mogą przenosić się w inne miejsca, muszą dostosować się do zmian zachodzących w otoczeniu (np. suszy, zimna i wysokiego stężenia soli). W związku z tym rośliny wyższe wytworzyły wyspecjalizowane białka stresu, takie jak dehydryny, które spełniają różnorodne zadania w celu zmniejszenia stresu komórkowego związanego z wysokim zasoleniem. Białka te wiążą wodę i jony wewnątrz komórek, zmniejszają stres oksydacyjny poprzez wiązanie jonówCu2+ i oddziałują z fosfolipidami, a także cytoszkieletami. Co więcej, wiązanie jonów Zn2+ pozwala tym białkom działać jako czynniki transkrypcyjne. Opisano również ich zdolność do wiązania jonów Ca2+ po fosforylacji1.

Wielofunkcyjne zachowanie tych białek jest związane z brakiem hydrofobowych reszt aminokwasowych. W związku z tym nie mają żadnych oddziaływań hydrofobowych wewnątrz łańcucha peptydowego, a także ograniczonej struktury. Ponieważ jednak białka te nie mają restrykcyjnej struktury, mogą zajmować różne konformery w tych samych warunkach. Dlatego najlepiej można je opisać jako zespół struktur, a nie jako pojedynczą konformację. Białka o tych właściwościach są znane jako białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) i są szeroko stosowaną koncepcją dla białek stresu i wzajemnych oddziaływań między różnymi szlakami w komórkach eukariotycznych2.

Jednym z tych stresujących IDPów jest AtHIRD11. Jest to jeden z najbardziej narażonych na suszę IDP Arabidopsis thaliana. W związku z tym różne konformery można rozdzielić według ich efektywnego stosunku promienia do ładunku, a do dalszych badań zastosowano elektroforezę kapilarną (CE). Poprzednie eksperymenty ACE wykazały interakcje między AtHIRD11 a jonami metali przejściowych, takimi jak Cu2+-, Zn2+-, Co2+ i jony Ni2+. Szczegółowe wyniki można znaleźć w Hara et al.3 oraz Nachbar et al.4.

Metoda ACE, która zostanie tutaj użyta, jest oparta na naszych wcześniejszych opublikowanych pracach6. Jednakże dodanie markera EOF acetanilidu do próbki białka nie jest odpowiednie. AtHIRD11 pokazuje szerokie wzorce pików, a dodanie markera EOF do próbki ukryłoby dwa piki. W związku z tym znacznik jest używany w osobnym przebiegu. Zanim zachowanie wiązania zostanie zbadane, potwierdzono, że piki znalezione podczas poprzednich eksperymentów pochodzą od różnych konformerów. W związku z tym CGE służy do rozróżniania konformerów białkowych, zmodyfikowanego białka potranslacyjnego i zanieczyszczeń, takich jak fragmenty AtHIRD11, na podstawie ich różnych mas. Następnie badane jest scharakteryzowane zachowanie wiązania próbki AtHIRD11 z różnymi jonami metali.

Celem tego artykułu jest opisanie eksperymentalnego zestawu do rozróżniania IDP od innych składników próbki w celu oceny różnic w zachowaniu wiązania różnych konformistów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie przyrządów do elektroforezy kapilarnej

  1. Przygotuj naczynia włosowate
    1. Za pomocą noża do szkła przeciąć kapilarnę z gołej stopionej krzemionki z zewnętrzną powłoką poliimidową i średnicą wewnętrzną 50 μm na kapilary o długości 33 cm (w eksperymencie CGE) i 30 cm (w eksperymencie ACE). Wykonaj cięcie na szklanej płycie.
      Uwaga: 2 różne konfiguracje eksperymentalne zostały opracowane dla 2 różnych instrumentów. Aby można je było stosować na innych instrumentach, należy wykonać odpowiedni transfer metody i dostosować długość kapilary do dozwolonej długości instrumentu.
    2. Użyj pisaka, aby zaznaczyć środek okna detekcji o szerokości 1 cm w odległości 24,5 cm od jednego końca kapilary w eksperymencie CGE i w odległości 21,5 cm od jednego końca kapilary w eksperymencie ACE (długość efektywna).
    3. Usuń zewnętrzną powłokę poliimidową z naczyń włosowatych, wypalając ją palnikiem, 0,5 cm przed i po znaku. Podobnie użyj lampy lutowniczej, aby usunąć 1 cm powłoki z obu końców naczyń włosowatych.
      Uwaga: Efektywna długość może się nieznacznie różnić, ponieważ zależy od zastosowanego przyrządu do elektroforezy kapilarnej.
    4. Oczyść końce naczyń włosowatych i okienek detekcyjnych etanolem i miękką chusteczką.
      Uwaga: Niepowlekane naczynia włosowate są mniej elastyczne i podatne na pękanie.
  2. Zainstaluj kapilary
    1. Zainstaluj kapilar w systemie CE z okienkiem detekcji w pobliżu wylotu.
      UWAGA: Różne modele instrumentów CE mają różne systemy mocowania naczyń włosowatych. Zapoznaj się z instrukcją obsługi używanego instrumentu, aby uzyskać dokładne instrukcje.

2. Przygotuj rozwiązania

  1. Przygotowanie rozwiązań do analizy CGE
    1. Przygotować bufor tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris)-SDS (100 mM/1% w/v) o pH 8,0.
      1. Użyj maski oddechowej i kabiny do zważenia 1,00 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) w zlewce o pojemności 100 ml.
      2. Dodać 1,21 g Tris do zlewki o pojemności 100 ml i rozpuścić za pomocą 50 ml wody dejonizowanej i mieszadła magnetycznego na mieszadle magnetycznym.
      3. Umieścić elektrodę pH w roztworze i dostosować pH do 8,0 za pomocą 1,0 M HCl.
      4. Wlać roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml i dodać wodę dejonizowaną do kreski. Delikatnie potrząśnij, aby uniknąć tworzenia się piany.
    2. Przygotować 0,1 M roztwór NaOH.
      1. Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.
      2. Za pomocą pipety gruszkowej o pojemności 10 ml przenieś 10 ml tego roztworu do innej kolby miarowej o pojemności 100 ml i napełnij ją wodą dejonizowaną do kreski.
    3. Przygotować roztwór 0,1 M HCl.
      1. Umieścić 10 ml 10 M HCl w kolbie miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety miarowej o pojemności 10 ml i napełnić ją wodą dejonizowaną do kreski do kreski. Powtórz ten krok, aby uzyskać 0,1 M HCl.
    4. Przygotować roztwór próbki.
      1. Odważyć 0,5 mg białka do probówki o pojemności 1 ml. Dodać 0,5 ml żelowego buforu Tris-SDS z kroku 2.1.1 za pomocą mikropipety.
      2. Rozpuść białko, delikatnie wstrząsając, aby uniknąć tworzenia się piany i degradacji białka.
        UWAGA: Stosować ultradźwięki, jeśli białko nie może zostać rozpuszczone zgodnie z opisem; Unikaj podgrzewania roztworu.
    5. Wlać roztwory do fiolek.
      1. Przefiltrować każdy roztwór przez filtr z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,22 μm za pomocą odpowiedniej strzykawki bezpośrednio do fiolki.
        UWAGA: W przypadku roztworów zawierających żel ciśnienie wsteczne może być wysokie ze względu na jego wysoką lepkość.
      2. Przygotuj w sumie 15 fiolek i zaznacz każdą z nich, aby uniknąć pomyłki.
        1. Napełnij 3 fiolki dostępnym w handlu buforem żelowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS) o pH 8,
          UWAGA: Zastosowanie dostępnego na rynku buforu żelowego SDS zapewnia bardziej precyzyjne wyniki.
        2. Napełnić 1 fiolkę 0,1 M NaOH i 1 fiolkę 0,1 M HCl do przepłukiwania.
        3. Napełnić 1 fiolkę roztworem próbki.
        4. Napełnij 5 fiolek wodą dejonizowaną i 4 fiolki 0,1 ml wody dejonizowanej (fiolki do zanurzania).
          UWAGA: Fiolki do zanurzania są używane jako fiolki na odpady podczas płukania kapilary przed każdym uruchomieniem. Końce kapilarne zanurza się w wodzie w celu spłukania wszelkich pozostałości żelu.
  2. Przygotowanie rozwiązań do analizy ACE
    1. Przygotować 1 M roztwór NaOH.
      1. Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
      2. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.
    2. Przygotować 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w 0,1 M roztworze NaOH.
      1. Przenieść 10 ml 0,1 M NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety z bańką o pojemności 10 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną.
      2. Zważyć 2,42 g EDTA na łodzi wagowej i rozpuścić związek stały w 100 ml 0,1 M NaOH.
    3. Przygotować roztwór buforowy Tris (30 mM).
      1. Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 3,63 g Tris, 200 ml wody dejonizowanej i kostkę mieszającą. Umieść zlewkę na płytce mieszającej i włącz ją.
      2. Umieścić elektrodę pH-metru w zlewce i dostosować pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl.
      3. Napełnij roztwór kolbą miarową o pojemności 1 l i napełnij do kreski wodą dejonizowaną.
        UWAGA: Procedurę tę należy powtórzyć lub potrzebna jest większa kolba miarowa, ponieważ do całej analizy potrzeba więcej niż 1 l.
    4. Przygotować roztwór markera przepływu elektroosmotycznego (EOF) acetanilidu (60 μM).
      1. Dodać 6 mg acetanilidu i 100 ml buforu Tris do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
      2. Umieścić kolbę miarową w łaźni ultradźwiękowej i włączyć ją na 30 minut.
    5. Przygotować roztwór próbki (1 mg/ml).
      1. Umieść probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 ml na wadze precyzyjnej i dodaj 0,3 mg liofilizowanego proszku AtHIRD11 do probówki.
      2. Za pomocą mikropipety dodaj 0,3 ml 30 mM buforu Tris (pH 7,4) do probówki. Ostrożnie wstrząśnij probówką, aby rozpuścić białko.
    6. Przygotuj roztwory ligandów.
      1. Przygotować roztwór podstawowy CaCl2 (5 mM).
        1. Weź łódkę wagową, umieść ją na wadze analitycznej i zważ 36,76 mg CaCl2*H2O.
        2. Za pomocą mikropipety przepłukać CaCl2*H2Oz łodzi ważącej do kolby miarowej o pojemności 50 ml z uprzednio przygotowanym buforem Tris.
        3. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski.
      2. Przygotować pozostałe roztwory podstawowe (5 mM).
        1. Powtórzyć krok 2.2.6.1, używając innych soli metali zamiast CaCl2*H2O[MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr(NO3)2: 52,91 mg, MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl2*2H2O: 41,47 mg, CuCl2*2H2O: 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg i NiCl2*6H2O: 59,43 mg].
          UWAGA: Roztwór ZnCl2 ma stężenie 0,5 mM. Ponieważ zaobserwowano silne oddziaływania między jonami a wewnętrzną ścianą naczyń włosowatych, stężenie zmniejszyło się o współczynnik 104.
      3. Przygotować roztwór CaCl2 o stężeniu 500 μM.
        1. Napełnić 10 ml roztworu podstawowego CaCl2 i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
        2. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.
      4. Przygotować roztwór CaCl2 o stężeniu 250 μM.
        1. Napełnić 5 ml roztworu podstawowego CaCl2 i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
        2. Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.
      5. Powtórzyć kroki 2.2.6.3 i 2.2.6.4 dla pozostałych roztworów podstawowych.
    7. Napełnij roztwory w fiolkach.
      UWAGA: Każdy powtórzony cykl wymaga zestawu fiolek wlotowych i wylotowych. Zastosowanie świeżych roztworów ligandów na wlocie i wylocie zmniejsza przesunięcia w czasie migracji po każdym przebiegu.
      1. Napełnić 250 μM roztworem CaCl2 w strzykawce o pojemności 10 ml.
      2. Umieścić filtr PVDF 0,22 μm na strzykawce i przepchnąć 2 ml roztworu przez filtr za pomocą strzykawki w celu odrzucenia przefiltrowanego roztworu.
      3. Napełnić 10 fiolek do maksymalnej dozwolonej objętości pozostałym roztworem 250 μM CaCl2 ze strzykawki. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę wlotową roztworu CaCl 2 o objętości 250 μM.
      4. Napełnić 10 fiolek do połowy roztworem CaCl2 o stężeniu 250 μM. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę z wylotem roztworu CaCl 2 o stężeniu 250 μM.
      5. Powtórzyć kroki 2.2.7.1-2.2.7.4 dla pozostałych roztworów zawierających sole metali.
      6. Powtórz kroki dla każdej pary fiolek wlotowych i wylotowych, używając zamiast tego roztworu buforowego Tris o stężeniu 30 mM (pH 7,4).
        Uwaga: Bufor Tris o pH 7,4 o stężeniu 30 mmol/l jest stosowany pomiędzy seriami w celu uzyskania danych dotyczących czasu migracji białka przy braku jonów metali. Jest to konieczne, aby zaniedbywać zmiany w EOF.
      7. Powtórzyć powyższe czynności dla jednej fiolki, używając roztworu markera EOF acetanilidu (60 μM). Powtórz również te kroki, używając roztworu próbki (1 mg/ml).

3. Elektroforetyczne rozdzielanie żelu kapilarnego

Uwaga: Przygotuj separację zgodnie z metodą opisaną w poprzedniej pracy Nachbara i wsp.4.

  1. Przygotowanie analizy
    1. Kondycjonuj naczynia włosowate
      1. Ustaw termostat na 23 °C.
      2. Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M NaOH.
      3. Przepłukiwać kapilar przez 5 minut pod ciśnieniem 2,0 bar 0,1 M HCl.
      4. Przepłukiwać kapilarnę przez 2 minuty pod ciśnieniem 2,0 bara wodą dejonizowaną.
    2. Wypełnij bufor żelu SDS
      1. Napełniaj kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 2,0 bara dostępnym w handlu żelowym buforem SDS o pH 8,0.
    3. Przepłucz kapilę przed każdym biegiem separacji
      1. Przepłukiwać kapilarnę przez 3 minuty pod ciśnieniem 4,0 bar 0,1 M NaOH.
      2. Przepłukiwać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 4,0 bar 0,1 M HCl.
      3. Przepłukiwać kapilarę przez 1 minutę pod ciśnieniem 4,0 bara wodą dejonizowaną.
      4. Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 4,0 bara za pomocą buforu żelowego SDS.
  2. Uruchamianie separacji
    1. Wstrzyknąć roztwór próbki do eksperymentów CGE (krok 2.1.4) hydrodynamicznie, stosując 0,1 bara przez 4 minuty na wlocie.
    2. Stosować -16,5 kV i ciśnienie 2,0 bar na obu końcach kapilary przez 25 minut.

4. Analiza elektroforetyczna kapilarna o powinowactwie

Uwaga: Przygotuj separację zgodnie z metodą opisaną w poprzednich pracach Nachbara i wsp.4 oraz Alhazmi et al.5.

  1. Kondycjonuj naczynia włosowate
    1. Ustaw termostat na 23 °C.
      UWAGA: Temperatura jest używana zgodnie z opublikowanymi protokołami i może być zmieniona na inne temperatury4,5. Jednak interakcje są zależne od temperatury i odpowiednio się zmieniają.
    2. Przepłukać kapilarnę przez 40 minut pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M NaOH.
    3. Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 1,0 bara wodą dejonizowaną.
    4. Przepłukiwać kapilarnę przez 30 minut pod ciśnieniem 1,0 bara za pomocą 30 mM buforu Tris (pH 7,4).
  2. Przygotowanie do metod ACE
    1. Przygotuj metodę pomiarów bez ligandów.
      Uwaga: Acetanilid nie został dodany do roztworu próbki, ponieważ ukrywa on 2 piki białka.
      1. Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.
      2. Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.
      3. Przepłukać kapilarnę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara za pomocą buforu Tris w celu zrównoważenia.
      4. Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i wymienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem Tris.
      5. Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.
      6. Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.
      7. Powtórzyć czynności 4.2.1.1. - 4.2.1.6. używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.
    2. Przygotuj metodę pomiarów za pomocą ligandów.
      1. Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.
      2. Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.
      3. Przepłukać kapilarę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara roztworem liganda w celu zrównoważenia.
      4. Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem zawierającym ligandy.
      5. Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.
      6. Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.
      7. Powtórzyć czynności 4.2.2.1 - 4.2.2.6, używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.
    3. Alternatywnie powtórzyć kroki 4.2.1 i 4.2.2 w celu obliczenia zmiany stosunków ładunku do wielkości dla różnych oddziaływań białko-metal jonowy (opisanych w Reprezentatywnych wynikach).
      1. Zmieniaj roztwór białkowy co 60 godzin na świeży.
        UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać. Procedura ta jest powtarzana co najmniej 10 razy dla każdego stężenia ligandów, ponieważ wzór pików różni się nieznacznie w zależności od przebiegu. Jeśli roztwór jest używany dłużej niż 60 godzin, różnice stają się zbyt duże.
    4. Uruchamianie metod
      1. Uruchomić metodę opisaną w kroku 4.2.2, używając roztworów ligandów ziem alkalicznych (roztwory CaCl2, MgCl2, BaCl2 i SrCl2).
      2. Kontynuuj stosowanie metody opisanej w kroku 4.2.2, używając roztworów MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2 i NiCl2 zamiast roztworów ligandów ziem alkalicznych.
        UWAGA: Te ostatnie chlorki metali przejściowych wykazywały silniejsze oddziaływania z kapilarą i nie można ich całkowicie usunąć. Te interakcje powodują przesunięcia w czasie migracji z uruchomienia na uruchomienie. W związku z tym badano je po innych jonach metali.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia elektroferogram dla próbki AtHIRD11 uzyskany podczas eksperymentów CGE. Wielkość peptydów wzrasta od lewej do prawej. Pik numer 4 ma największą masę i wskazuje na nienaruszone białko. Mniejsze piki 2 i 3 reprezentują mniejsze zanieczyszczenia (np. produkty degradacji). Pierwszy pik oraz niestabilność linii bazowej przed nim mogły zostać odtworzone również bez próbki białka. W związku z tym są one związane z samym żelem SDS i nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku wszystkich eksperymentów CE przygotowanie kapilary jest krytycznym krokiem. Ponieważ jest to szklana rurka o małej średnicy, może łatwo pęknąć w miejscach, w których powłoka jest usuwana podczas obsługi. Montaż kapilary w instrumencie należy wykonać bardzo ostrożnie.

Krytyczne kroki związane z użyciem metody ACE odnoszą się głównie do konfiguracji eksperymentalnej. Kolejnym krytycznym krokiem jest znalezienie odpowiednich parametrów wtrysku próbki. Wstrzyknięta ilość próbki musi by...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za to, że Masakuza Hara (Instytut Badawczy Zielonej Nauki i Technologii, Uniwersytet Shizuoka, Japonia) za dostarczenie próbek białka AtHIRD11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Próbka AtHIRD11Shizuoka University (grupa prof. M. Hara)-Dehydrin Białko z Arabidopsis thaliana wyrażone w Escherichia coli
Barefused krzemionka kapilarnaPolymicro Technologies (Phoenix, USA)106815-0017TSP050375, 50 μ m średnica wewnętrzna, 363 μ m średnica zewnętrzna, powłoka poliimidowa
Agilent 1600AAgilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)obecnie niedostępnyPrzyrząd do elektroforezy kapilarnej; Zamiast tego można użyć Agilent 7100 CE
Agilent 7100 CEAgilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)G7100APrzyrząd do elektroforezy kapilarnej
Injekt 2 mLB. Braun (Melsungen, Niemcy)4606051VStrzykawka do filtracji
Filtry strzykawkowe RotilaboCarl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Niemcy)KY62.1PVDF do filtracji roztworowej
Eppendorf Research plus 10 μ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Niemcy)3121 000.023Mikropipeta do obsługi próbek
Eppendorf Research plus 10 μ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Niemcy)3121 000.120Mikropipeta do obsługi roztworów ligandów
Pipeta gruszkowa 10 mlDuran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)24 338 08Przygotowanie roztworu NaOH
Pipeta gruszkowa 25 mlDuran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)24 338 14Przygotowanie roztworu liganda
Kolba miarowa Duran glas 25 mlDuran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)24 671 1457Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Kolba miarowa Duran glas 10 mlDuran Group GmbH (Moguncja, Niemcy)24 671 1054Przygotowanie roztworu podstawowego liganda
Proteome Lab SDS MW Gel BufferBeckman Coulter (Brea, USA)komercyjnie już niedostępnySeparacja podczas elektroforezy kapilarnej w żelu / Alternatywny bufor SDS: Bufor CE-SDS firmy Bio-Rad Laboratories (Mü nchen, Niemcy) Numer katalogowy: 1485032 
AcetanilideSigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)397229-5GElektroosmotyczny marker przepływu
Chlorek manganu(II)Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)13217Ligand
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)431788-100GSkładnik płuczący
Chlorek baruSigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)202738-5GLigand
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)71729-100GBiałko rozpuszczalne do elektroforezy żelu kapilarnego
Sześciowodny chlorek niklu(II)Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)654507-5GLigand
Chlorek selenu(IV)Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)323527-10GLigand
2- amino-2-hydroksy-metylopropano-1.3-diol (Tris)Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)252859-100GSkładnik buforowy
Chlorek(II)Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy) 1088160250Ligand
Azotan strontuMerck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)1078720250Ligand
Chlorek wapnia dwuwodnyMerck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)1371015000Ligand
37% kwas solnyMerck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)1003171000Regulacja pH
Chlorek miedzi(II) dwuwodnyRiedel-de Haë n (Seelze, Niemcy)31286Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45LAllpax (Papenburg, Niemcy)10000084; 0Kąpiel ultradźwiękowa
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)G2070-91126Pakiety oprogramowania do obsługi przyrządów CE, pozyskiwania danych i ich oceny
Filtr membranowy

Bibliografia

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bia ka wewn trznie nieuporz dkowanewi zanie jon w metalianaliza AtHIRD11zmiany konformacyjneprzesuni cie mobilno ci elektroforetycznejoddzia ywanie bia ko ligandprzygotowanie kapilaryroztw r buforu Tris

Powiązane artykuły