Pomiar poziomu wysiłku fizycznego u Drosophila melanogaster za pomocą Rotacyjnego Systemu Kwantyfikacji Wysiłkowej (REQS)

Podsumowanie

System Oceny Ilościowej Ćwiczeń Rotacyjnych (REQS) może indukować ćwiczenia u Drosophila melanogaster poprzez rotację, jednocześnie mierząc ilość aktywności wykonywanej przez zwierzęta. W tym miejscu przedstawiamy protokół punkt po punkcie, w którym szczegółowo opisano, w jaki sposób mierzyć poziom aktywności zwierząt doświadczających zabiegów ćwiczeń rotacyjnych za pomocą REQS.

Streszczenie

Drosophila melanogaster to nowy organizm modelowy do badań w biologii ćwiczeń. Do tej pory opisano dwa główne systemy ćwiczeń, Power Tower i Treadwheel. Brakowało jednak metody pomiaru ilości dodatkowej aktywności zwierząt wywołanej przez leczenie wysiłkowe. System kwantyfikacji ćwiczeń rotacyjnych (REQS) zaspokaja tę potrzebę, zapewniając miarę aktywności zwierząt dla zwierząt doświadczających ćwiczeń rotacyjnych. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób korzystać z REQS do oceny aktywności zwierząt podczas ćwiczeń rotacyjnych i ilustruje rodzaj danych, które można wygenerować. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób REQS jest używany do pomiaru specyficznych dla płci i szczepu różnic w aktywności wywołanej wysiłkiem fizycznym. REQS może być również wykorzystany do oceny wpływu różnych innych parametrów eksperymentalnych, takich jak wiek, dieta lub wielkość populacji, na aktywność wywołaną wysiłkiem fizycznym. Ponadto może być używany do porównywania skuteczności różnych protokołów treningu fizycznego. Co ważne, daje to możliwość standaryzacji zabiegów ruchowych między szczepami, co pozwala badaczowi osiągnąć równą ilość aktywności między grupami, jeśli zajdzie taka potrzeba. W związku z tym REQS jest godnym uwagi nowym zasobem dla biologów pracujących z systemem modelowym Drosophila i uzupełnia istniejące systemy ćwiczeń.

Wprowadzenie

Ostatnio naukowcy zaczęli używać muszki owocowej Drosophila melanogaster do badania biologii ćwiczeń. D. melanogaster jest modelem genetycznym od ponad 100 lat^1,2. Jednak badania nad Drosophila przyczyniły się nie tylko do genetyki, ale także do wielu innych dyscyplin, w tym neurobiologii, biologii behawioralnej i fizjologii³. W 2009 roku opisano Power Tower, pierwszą maszynę do ćwiczeń dla Drosophila⁴. Wieża Energetyczna wykorzystuje negatywną reakcję zwierząt na geotaksję. W przypadku zakłóceń Drosophila ma tendencję do przemieszczania się na szczyt swojego wybiegu. Ta odpowiedź jest dobrze ugruntowana i stanowi podstawę popularnego testu "RING" (Rapid Iterative Negative Geotaxis⁵), który służy do oceny zdolności wspinaczkowej i/lub sprawności fizycznej u Drosophila. Power Tower wykorzystuje mechaniczne ramię połączone z jednostką silnikową do wielokrotnego podnoszenia grupy zwierząt w ich zagrodach o kilka cali i upuszczania ich z powrotem na ziemię, aby wywołać negatywną reakcję geotaksji (Tinkerhess et al. 2012⁶ dostarczają film ilustrujący użycie Power Tower). Długotrwałe leczenie na Power Tower zwiększa zatem ilość aktywności fizycznej (bieganie lub latanie) wykonywanej przez zwierzęta w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami kontrolnymi i z czasem prowadzi do poprawy wydajności w teście RING dla sprawności fizycznej⁴. W związku z tym praca ta wykazała możliwość wykorzystania Drosophila jako modelu dla biologii wysiłku fizycznego.

Aby poszerzyć repertuar narzędzi dostępnych do badań nad ćwiczeniami Drosophila, w 2016 roku, Mendez i współpracownicy opisali drugą maszynę do ćwiczeń Drosophila, Treadwheel⁷. Podobnie jak Power Tower, Treadwheel wykorzystuje negatywną reakcję geotaksji Drosophila. Jednak ta reakcja jest wywoływana przez ciągłe obracanie wybiegów dla zwierząt, a nie przez podnoszenie i upuszczanie ich, jak w Wieży Energetycznej. Ta metoda indukcji jest łagodniejsza i pozwala na bardziej zorientowany na wytrzymałość reżim ćwiczeń, który pozwala uniknąć wszelkich urazów fizycznych, które mogą wystąpić podczas ćwiczeń w Power Tower (patrz Katzenberger, R. J. et al. 2013⁸ dla wpływu powtarzających się urazów fizycznych na zdrowie Drosophila). Podobnie jak w Power Tower⁴, zabieg fizyczny u zwierząt na Treadwheel prowadzi do różnych reakcji fizjologicznych, w tym zmian w sprawności fizycznej, poziomie trójglicerydów i masie ciała⁷. W związku z tym dwie uzupełniające się metody są dostępne dla biologów Drosophila badających ćwiczenia.

Jednym z ograniczeń zarówno Power Tower, jak i Treadwheel jest niemożność zmierzenia ilości aktywności wywołanej przez zabieg ćwiczeń. Analiza nagrań wideo wykonanych z Treadwheel wykazała, że istnieją znaczące różnice między różnymi szczepami Drosophila w tym, jak reagują na leczenie ćwiczeniami⁷. W szczególności badane szczepy różniły się pod względem ilości dodatkowej aktywności wykonywanej przez zwierzęta po stymulacji⁷. Ta obserwacja skłoniła nas do opracowania trzeciego systemu ćwiczeń, Rotary Exercise Quantification System (REQS), który pozwala nam mierzyć poziom aktywności zwierząt podczas ćwiczeń wywołanych rotacją⁹. REQS wykorzystuje dostępną na rynku jednostkę monitorującą aktywność, która jest zainstalowana na obracającym się ramieniu, aby stymulować ćwiczenia poprzez rotację, tak jak w kole derogacyjnym. Wstępne prace z REQS potwierdzają, że genetycznie różne szczepy Drosophila - i płcie - mogą mieć znacząco różne reakcje na stymulację rotacyjną, a zatem ilość indukowanego wysiłku fizycznego nie jest identyczna między różnymi genotypami⁹. W ten sposób REQS umożliwia teraz biologom Drosophila mierzenie ilości wysiłku fizycznego wywołanego leczeniem, otwierając wiele nowych ścieżek badawczych w dziedzinie ćwiczeń.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak używać REQS do ilościowego oznaczania ćwiczeń rotacyjnych. REQS indukuje ćwiczenia rotacyjne i jednocześnie mierzy poziom aktywności leczonych zwierząt. REQS jest w stanie dostosować się do różnych programów ćwiczeń, począwszy od prostego 2-godzinnego reżimu ciągłych ćwiczeń, który został tutaj pokazany, po bardziej złożone metody treningu interwałowego, jak opisali Mendez i współpracownicy⁷, a stymulację można regulować za pomocą prędkości obrotowej (od około 1 do 13 obrotów na minutę). W zależności od jednostki monitorującej aktywność wykorzystanej do opracowania REQS, metodę tę można dostosować do analizy pojedynczych much lub dużych populacji zwierząt. Ze względu na tę wszechstronność, REQS zapewnia badaczom Drosophila szereg możliwości badania, na przykład, różnych reżimów ćwiczeń, interwencji dietetycznych lub wpływu gęstości zaludnienia.

Protokół

REQS składa się z jednostki Monitora Aktywności Drosophila (informacje o źródłach proszę znaleźć w Tabeli Materiałów) zamontowanej na obrotowym ramieniu, które jest kontrolowane przez jednostkę motoryczną (Rysunek 1). Monitor aktywności określa, jak często w danym przedziale czasu układ wiązek laserowych rozcinających środek probówki testowej jest przerywany. Szczegółowe rysunki i szczegółową charakterystykę można znaleźć w naszej poprzedniej publikacji⁹. Podczas gdy nasz system korzysta z jednostki LAM25H, REQS można zmodyfikować, aby dostosować się również do innych jednostek monitorujących aktywność Drosophila.

1. Testowanie konfiguracji REQS

1. Test obciążeniowy wlatuje do szklanych probówek z próbkami poprzez znieczulenie zwierząt za pomocą CO₂ lub innej wybranej metody obchodzenia się, przeniesienie ich do pustych probówek i zamknięcie probówek.
2. Włóż zaślepione szklane probówki na próbki do szczelin monitora aktywności. Zabezpiecz rurki za pomocą gumowych pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym (o rozmiarze 17-18) i/lub gumowych opasek po obu stronach urządzenia, aby zapewnić, że rurki nie poruszają się podczas obracania:
   1. Nałóż jeden O-ring na probówkę z próbką i umieść O-ring blisko środka probówki. Włóż probówkę z próbką do szczeliny monitora aktywności od przodu i wyśrodkuj ją.
   2. W razie potrzeby przesuń O-ring i upewnij się, że po wyśrodkowaniu rurki z próbką O-ring jest wsunięty jak najbliżej jednostki monitorującej aktywność. Zamocuj probówkę z próbką na miejscu, wsuwając drugi O-ring na szklaną rurkę od tyłu, ponownie przesuwając O-ring jak najbliżej jednostki monitorującej aktywność.
3. Zainicjuj obracanie REQS, przestawiając przełącznik zasilania z przodu urządzenia. Dostosuj prędkość obrotową za pomocą pokrętła z przodu urządzenia do żądanej prędkości (4 obr./min (obroty na minutę) w tym example).
   UWAGA: Prędkość obrotowa w tym przykładzie została wybrana tak, aby pasowała do wcześniej opublikowanego badania⁷. Ponieważ różne prędkości obrotowe będą skutkować różnymi poziomami aktywności zwierząt, podczas rozpoczynania nowego badania może być konieczna optymalizacja prędkości obrotowej dla konkretnego układu doświadczalnego (genotyp, długość wysiłku itp.
   UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że rurki są prawidłowo ustawione, tak aby nie ciągnęły się wzdłuż dolnej części jednostki REQS podczas obracania.
4. Przetestuj połączenie z systemem gromadzenia danych dostarczonym z modułem Drosophila Activity Monitor, otwierając oprogramowanie DAMSystem308 i upewniając się, że kontrolka połączenia pozostaje zielona przez kilka obrotów. Oprogramowanie rozpocznie zapisywanie danych w pliku tekstowym "monitorX" (X to numer jednostki, jeśli używanych jest wiele monitorów) natychmiast po zainicjowaniu. Częstotliwość nagrywania można dostosować w zakładce "Preferencje"; Zazwyczaj nagrywamy w odstępach 5-minutowych.
5. Sprawdź plik tekstowy wygenerowany przez oprogramowanie DAMSystem308, aby upewnić się, że połączenie danych działa poprawnie. Problemy z połączeniem skutkują wycięciami, punktami czasowymi, w których rejestrowana jest aktywność 0 dla wszystkich pozycji w REQS (zob. wyniki reprezentatywne i tabela 2). Jeśli wystąpią przerwy, wyreguluj połączenia danych prowadzące do obracającego się gniazda telefonicznego, ponieważ podczas obracania połączenie to może się poluzować lub skręcić. Uważamy, że stabilizacja połączenia za pomocą taśmy pomaga zapobiec temu problemowi.

2. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były hodowane i testowane w standardowych warunkach w inkubatorze (25 °C, 60-70% wilgotności, 12 godzin cykl jasny/ciemny) na melasie/mące kukurydzianej¹⁰.

1. Na dwa tygodnie przed planowanym eksperymentem należy ustawić fiolki o kontrolowanym zagęszczeniu zwierząt, z których będą zbierane eksperymentalne muchy; zazwyczaj ustawiamy fiolki z 7 samcami i 10 samicami. Przy zdrowym bulionie, z jednej fiolki, można zebrać około 15 dziewiczych samców i 15 samic w ciągu 4 dni. Dostosuj liczbę ustawionych fiolek w oparciu o liczbę zwierząt potrzebnych do testu; Typowy test w naszym laboratorium obejmuje 10 zestawów po 10 dziewiczych samców i samic na genotyp (100 samców i 100 samic).
   UWAGA: Muchy inne niż pierwotne mogą być używane w zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego. W przypadku prowadzenia długoterminowych eksperymentów na zwierzętach innych niż pierwotne, pełzające larwy mogą zakłócać dokładne monitorowanie aktywności.
2. Usunąć muchy rodzicielskie tydzień po ustawieniu fiolek.
3. Począwszy od 10 dnia po umieszczeniu fiolek, należy zbierać dziewicze muchy z fiolek i przechowywać je oddzielnie według płci.
4. Zbierz wystarczającą ilość zwierząt do eksperymentu i postarzaj je w razie potrzeby, w tym przykładzie 3 dni.
   UWAGA: Zazwyczaj znieczulamy zwierzęta za pomocą CO₂ do pracy. Wiadomo, że CO₂ wpływa na poziom aktywności zwierząt przez dłuższy czas po zastosowaniu środka (na przykład patrz Bartholomew et al. 2015¹¹). Jeśli efekt CO₂ zakłóca planowane dalsze testy lub analizy, należy zastosować inną metodę znieczulenia, taką jak znieczulenie lodem.

3. Zbieranie danych za pomocą REQS

1. Znieczulić zwierzęta, które mają być wykorzystane do badania ilościowego wysiłku fizycznego, za pomocą CO₂ lub innej metody znieczulenia. W razie potrzeby podziel je na grupy i załaduj grupy zwierząt do pustych szklanych probówek monitora aktywności; W tym przykładzie 10 zwierząt w tym samym wieku jest ładowanych do szklanej probówki, z 10 powtórzeniami dla każdego typu zwierzęcia (płci/genotypu). Upewnij się, że zwróciłeś uwagę, jaki typ zwierzęcia jest załadowany do każdej tuby.
   UWAGA: W przypadku dłuższych eksperymentów do probówek z próbkami można dodać jedzenie. W takim przypadku ważne jest, aby żywność była bezpieczna i nie wysunęła się podczas obracania.
2. Załaduj szklane probówki do jednostki REQS i zabezpiecz je gumowymi pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym. W przypadku pracy z więcej niż jedną płcią/genotypem, zastosowanie randomizowanego projektu blokowego lub randomizacji pozycji zwierząt w REQS wyeliminuje wszelkie potencjalne efekty pozycji. Randomizację można osiągnąć, przypisując każdej fiolce liczbę losową, na przykład z internetowego generatora liczb losowych (np. https://www.randomizer.org/ ) lub w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie porządkując fiolki na podstawie liczby losowej.
3. Umieść REQS w inkubatorze, aby zapewnić stałą temperaturę, wilgotność i warunki oświetleniowe. Upewnij się, że zarówno danych, jak i zasilające są prawidłowo podłączone.
4. Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu i zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 1 godzinę.
5. Rozpocznij eksperyment od zainicjowania rotacji REQS z żądaną prędkością.
   UWAGA: Inną opcją jest najpierw zebranie danych o podstawowej aktywności zwierząt przed rozpoczęciem rotacji, a następnie zarejestrowanie poziomów aktywności w odpowiedzi na stymulację rotacyjną.
6. Rozpocznij zbieranie danych, otwierając oprogramowanie DAMsystem308 (samo otwarcie oprogramowania inicjuje zbieranie danych). Dane są zapisywane do pliku tekstowego w ustalonym odstępie czasu (w tym przypadku 5 min); w razie potrzeby zmień ustawienia interwału w zakładce "Preferencje" (patrz krok 1.4).
7. Aby upewnić się, że dane zostały pomyślnie przesłane do komputera, po upływie jednego lub dwóch odstępów czasu otwórz plik tekstowy wygenerowany przez oprogramowanie DAMsystem308 i potwierdź, że dane są zapisywane do pliku. Zamknij i ponownie otwórz ten plik, aby wyświetlić dane z dodatkowych punktów czasowych. Zbieraj dane przez żądany okres czasu; W tym przykładzie 2 H.
   UWAGA: Nie otwieraj inkubatora w okresie testu, ponieważ zwierzęta są bardzo wrażliwe na wszelkie zakłócenia i prawdopodobnie zareagują zwiększoną aktywnością.
8. Po zakończeniu testu ćwiczenia zakończ zbieranie danych, zamykając oprogramowanie DAMsystem308, a następnie wyłącz REQS. Wyjmij zwierzęta ze szklanych probówek i wyczyść probówki. Zwierzęta mogą być przenoszone z powrotem do fiolek z karmą, jeśli konieczne jest powtórzenie pomiarów w różnym wieku.
   UWAGA: Jeśli podczas ćwiczeń dojdzie do zgonu, należy to odnotować, ponieważ obecność martwych much może mieć wpływ na liczbę aktywności. Z naszego doświadczenia z liniami muchowymi DGRP2^12,13, ćwiczenia przy 4 obr./min przez 2 godziny nie spowodowały żadnych zgonów, ale słabsze szczepy mogą reagować inaczej.

4. Analiza danych

1. Otwórz plik .txt oznaczony jako "Monitor1" utworzony przez oprogramowanie DAMSystem308.
2. Sprawdź plik danych pod kątem problemów, które mogły wystąpić podczas pozyskiwania danych (pominięte punkty czasowe itp.; Tabela 1). W razie potrzeby ocenzuruj plik, usuwając punkty danych na początku i na końcu nagrania.
3. Korzystając z wybranego przez siebie oprogramowania statystycznego (np. R), analizuj zebrane dane. Generuj statystyki opisowe i przeprowadzaj analizę wariancji (ANOVA) w celu zbadania efektów, takich jak płeć i genotyp, jeśli dane mają rozkład normalny. Jeśli dane nie mają rozkładu normalnego, należy użyć metod nieparametrycznych, takich jak testy Kruskala-Wallisa, aby porównać grupy. Wymagane szczegółowe analizy będą zależały od konkretnego zagadnienia naukowego i projektu doświadczalnego.

Wyniki

Wynikiem indywidualnego uruchomienia za pomocą REQS jest tabela danych utworzona przez oprogramowanie DAMSystem308, która będzie domyślnie oznaczona jako "Monitor1.txt" (dla przykładu zobacz Plik uzupełniający 1). Wyciąg z takiej tabeli znajduje się w tabeli 1. Każda kolumna zawiera dane z pojedynczej probówki testowej, podczas gdy wiersze zawierają aktywność zmierzoną w każdym przedziale czasu od początku eksperymentu (na górze) do końca (na dole). Pierw...

Dyskusja

Jak pokazują reprezentatywne wyniki, REQS jest w stanie dokładnie zmierzyć aktywność ćwiczącą Drosophila. REQS jest elastyczny i pozwala naukowcom na zajęcie się różnymi pytaniami badawczymi związanymi z biologią ćwiczeń lub interwencjami ruchowymi. W protokole należy zwrócić uwagę na dwa kluczowe kroki. Po pierwsze, konieczne jest przetestowanie konfiguracji REQS, aby upewnić się, że transmisja danych z REQS do DAMSystem308 działa poprawnie. Jeśli nie zostanie prawidłowo skonfigurowany, kabel do transmisji danych może s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monitor aktywności Drosophila	Trikinetics	LAM25H	Składnik REQS
Przewód telefoniczny Detangler	Uvital	uv20170719	Składnik REQS
Zamknięcia fiolek (flugs)	Genesee Scientific	49-102	Materiały do hodowli Drosophila
Fiolki	Genesee Scientific	32-120	Zaopatrzenie kultur Drosophila
Siatka do hodowli Drosophila	Carolina Biological Supply	173090	Zapasy kultur Drosophila
Mąka kukurydziana	Pepsico	43375	Drosophila media
Melasa	Golden Barrel	BLA-GAL	Drosophila media
Agar	Apex Bioresearch	66-103	Drosophila media
Nieaktywne suche drożdże	Genesee Scientific	62-106	Drosophila media
Tegosept	Apex Bioresearch	20-258	Drosophila media
Kwas propionowy	Genesee Scientific	20-271	Drosophila media