Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57752

⸱

18 czerwca 2018

 , 
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Streszczenie

Testy zachowań motorycznych są powszechnie używane do określenia funkcjonalnego znaczenia modelu gryzoni i do testowania nowo opracowanych metod leczenia u tych zwierząt. W szczególności analiza chodu pozwala na ponowne uchwycenie fenotypów istotnych dla choroby, które obserwuje się u ludzi, zwłaszcza w chorobach neurodegeneracyjnych, które wpływają na zdolności motoryczne, takich jak choroba Parkinsona (PD), choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i inne. We wczesnych badaniach w tym kierunku pomiar parametrów chodu był pracochłonny i zależał od czynników, które trudno było kontrolować (np. prędkość biegu, bieg ciągły). Rozwój systemów obrazowania w płaszczyźnie brzusznej (VPI) umożliwił przeprowadzanie analizy chodu na dużą skalę, dzięki czemu metoda ta jest użytecznym narzędziem do oceny zachowań motorycznych gryzoni. W tym miejscu przedstawiamy dogłębny protokół wykorzystania kinematycznej analizy chodu do zbadania zależnej od wieku progresji deficytów motorycznych w mysich modelach neurodegeneracji; Jako przykład podaje się linie myszy z obniżonym poziomem endofiliny, w których uszkodzenia neurodegeneracyjne stopniowo zwiększają się wraz z wiekiem.

Wprowadzenie

Choroby neurodegeneracyjne stanowią znaczne obciążenie dla pacjentów, rodzin i społeczeństwa, i staną się jeszcze większym problemem wraz ze wzrostem średniej długości życia i starzeniem się światowej populacji. Jednym z najczęstszych objawów chorób neurodegeneracyjnych są problemy z równowagą i poruszaniem się. Tak więc charakterystyka zachowań motorycznych w starzejących się modelach ssaków (np. gryzoni) i/lub modelach wykazujących fenotypy neurodegeneracyjne jest cennym narzędziem do wykazania znaczenia in vivo konkretnego modelu zwierzęcego (modeli) zwierzęcego lub terapii terapeutycznej, która ma na celu poprawę objawów choroby. Prawie każde podejście do leczenia chorób neurodegeneracyjnych ostatecznie wymaga przeprowadzenia testów na modelu zwierzęcym przed rozpoczęciem badania klinicznego na ludziach. Dlatego tak ważne jest posiadanie wiarygodnych, powtarzalnych testów behawioralnych, które można wykorzystać do konsekwentnego ilościowego określania fenotypów istotnych dla choroby wraz z postępem wieku, aby zapewnić, że potencjalny lek, który wykazał potencjał w modelu in vitro, może skutecznie poprawić fenotyp u żywego zwierzęcia.

Jednym z aspektów oceny zachowań motorycznych u gryzoni jest analiza kinematyczna chodu, którą można przeprowadzić za pomocą VPI (zwanej również wideografią w płaszczyźnie brzusznej)1,2. Ta sprawdzona metoda wykorzystuje ciągłe rejestrowanie spodu gryzoni chodzących po przezroczystym i zmotoryzowanym pasie bieżni1,2,3,4. Analiza danych z kanału wideo tworzy "cyfrowe odciski łap" wszystkich czterech kończyn, które dynamicznie i niezawodnie podsumowują wzorzec chodzenia gryzonia, jak pierwotnie opisali Kale i wsp.2 oraz Amende et al.3.

Zasada analizy chodu opartej na obrazowaniu polega na pomiarze obszaru łapy stykającego się z pasem bieżni w czasie, dla każdej pojedynczej łapy. Każda postawa jest reprezentowana przez zwiększenie powierzchni łapy (w fazie hamowania) i zmniejszenie powierzchni łapy (w fazie napędu). Po tym następuje faza wychylenia, w której nie jest wykrywany żaden sygnał. Huśtawka i postawa razem tworzą krok. Oprócz parametrów dynamiki chodu, z nagranych filmów można również wyodrębnić parametry postawy. Przykładowe parametry oraz ich definicję zostały wymienione w tabeli 1 i obejmują m.in. szerokość podpory (SW; łączna odległość od przedniej lub tylnej łapy do osi pysk-ogon), długość kroku (SL; średnia odległość między dwoma krokami tej samej łapy) czy kąt ułożenia łapy (kąt nachylenia łapy do osi pysk-ogon). Dane dotyczące postawy i dynamiki chodu pozwalają na wyciągnięcie wniosków na temat równowagi zwierząt (na podstawie parametrów postawy i ich zmienności w kilku krokach) oraz koordynacji (na podstawie parametrów dynamiki chodu). Inne parametry, takie jak współczynnik ataksji (zmienność SL obliczona przez [(max. SL−min. SL)/średnia SL]), czas wspólnej postawy kończyn tylnych (czas, w którym obie kończyny tylne stykają się z pasem) lub opór łapy (całkowita powierzchnia łapy na pasie od pełnego podstawienia do uniesienia łapy) mogą być również wyodrębnione i zgłoszono, że zostały zmienione w różnych modelach chorób neurodegeneracyjnych5, 6,7,8 (patrz Tabela 1).

mm
parametrjednostkadefinicja
czas huśtawkiMsCzas, w którym łapa nie styka się z paskiem
Czas podparciaMsCzas kontaktu łapy z paskiem
% hamulca% czasu podparciaProcent czasu podjęcia, w którym łapy znajdują się w fazie hamowania
% napędu% czasu podparciaProcent czasu, w którym łapy znajdują się w fazie napędu
Szerokość podporucentymetrłączna odległość od przedniej lub tylnej łapy do osi pysk-ogon
Długość krokucentymetrŚrednia odległość między dwoma krokami tej samej łapy
Częstotliwość krokuKroki/sliczba pełnych kroków na sekundę
Kąt ułożenia łapyStopniachkąt nachylenia łapy w stosunku do osi pysk-ogon zwierzęcia
Współczynnik ataksjia.u.Zmienność SL obliczona według wzoru [(max SL-min SL)/średnia SL]
% wspólnej postawy% postawyczas wspólnej postawy kończyn tylnych; czas, w którym obie kończyny tylne stykają się z pasem w tym samym czasie
przeciąganie łapymm2Całkowita powierzchnia łapy na pasie od pełnego podstawienia do uniesienia łapy
Obciążenie kończyncm2MAX dA/dT; maksymalna szybkość zmiany powierzchni łapy w fazie łamania
Zmienność kąta krokuStopniachodchylenie standardowe kąta między tylnymi łapami w funkcji SL i SW

Tabela 1. Definicja kluczowych parametrów chodu, które można badać za pomocą obrazowania w płaszczyźnie brzusznej.

Ocena zachowania motorycznego modeli gryzoni w chorobach neurodegeneracyjnych może być trudna, w zależności od nasilenia fenotypu konkretnego modelu w danym wieku. Kilka chorób, z których najbardziej widoczna jest choroba Parkinsona, wykazuje silne deficyty zachowań motorycznych (lokomocji), zarówno u pacjentów, jak i w modelach zwierzęcych. Jednym z czterech kluczowych objawów PD jest bradykinezja, która postępuje wraz z wiekiem i objawia się ciężkimi zaburzeniami chodu już we wczesnych stadiach PD9. Badania modelu ostrej choroby Parkinsona, gryzonie leczone 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyną (MPTP), korzystały już z analizy chodu VPI10,11,12. Jednak biorąc pod uwagę ostry charakter tego modelu, badania te nie zajmują się progresją deficytów motorycznych związaną z wiekiem. W kilku ostatnich badaniach przeprowadzono analizę chodu u starszych myszy ze zmianami neurodegeneracyjnymi, na przykład13,14,15, podkreślając znaczenie zrozumienia postępu choroby wraz z wiekiem.

Oprócz deficytów motorycznych, zwierzęce modele chorób neurodegeneracyjnych często mają trudności ze skupieniem się na zadaniach egzaminacyjnych i wykazują wyraźne upośledzenia poznawcze, szczególnie wraz z wiekiem. Taki fenotyp może wpływać na wynik testów zachowań motorycznych. Mianowicie, jeden z najczęściej używanych testów do badania deficytów motorycznych, test rotarod16, opiera się na poznaniu, uwadze i stresie17,18. Podczas gdy gotowość do chodzenia na zmotoryzowanej bieżni również zależy od tych czynników, zarejestrowany odczyt jest w toku, co jest bardziej ustandaryzowaną cechą i znacznie mniej wpływa na zmienione poznanie. Efekty stresu i uwagi mogą być widoczne w określonych parametrach, takich jak czas wymachu/podparcia dla stresu i SL dla uwagi19,20, ale nie w ogólnej zdolności do biegania.

Podejście do analizy chodu kinematycznego dodatkowo oferuje tę zaletę, że ma opcje dostosowania wyzwania dla modeli gryzoni. Bieżnia z regulowanym kątem i prędkością pozwala na chód z prędkością od 0,1 do 99,9 cm/s, dzięki czemu gryzonie z poważnymi zaburzeniami chodu mogą nadal być w stanie biegać z niską prędkością (~10 cm/s). Zwierzęta bez upośledzeń mogą być mierzone przy większych prędkościach biegu (30 - 40 cm/s). Obserwacja, czy badane zwierzęta są w stanie biegać z określoną prędkością, czy też nie, sama w sobie dostarcza wyniku. Co więcej, gryzoń może być dodatkowo zmuszony do wbiegania po zboczu lub w dół zbocza, przechylając bieżnię pod żądanym kątem za pomocą goniometru lub przyczepiając obciążone sanki do tylnych kończyn myszy lub szczura.

Oprócz licznych badań nad pojedynczymi białkami, które są zmutowane u pacjentów, ostatnio wzrasta świadomość powiązań między wadliwym procesem endocytozy a neurodegeneracją13,21,22,23,24,25,26, 27,28. Modele myszy z obniżonym poziomem endofiliny-A (odtąd endofiliny), kluczowego gracza w endocytozie za pośrednictwem klatryny13,21,29,30,31,32,33,45 i endocytoza niezależna od klatryny34, stwierdzono neurodegenerację i zależne od wieku upośledzenie aktywności lokomotorycznej13,21. Trzy geny kodują rodzinę białek endofilinowych: endofilinę 1, endofilinę 2 i endofilinę 3. Warto zauważyć, że fenotyp wynikający z wyczerpania białek endofilinowych różni się znacznie w zależności od liczby brakujących genów endofiliny13,21. Podczas gdy potrójny nokaut (KO) wszystkich genów endofiliny jest śmiertelny zaledwie kilka godzin po urodzeniu, a myszy bez zarówno endofiliny 1, jak i 2 nie rozwijają się i umierają w ciągu 3 tygodni po urodzeniu, pojedynczy KO dla którejkolwiek z trzech endofilin nie wykazuje oczywistego fenotypu dla badanych warunków21. Inne genotypy z mutacją endofiliny wykazują skróconą długość życia i rozwijają upośledzenie motoryczne wraz z wiekiem13. Na przykład myszy z endofiliną 1KO-2HT-3KO wykazują zmiany w chodzeniu i problemy z koordynacją ruchową (co zostało przetestowane za pomocą analizy kinematycznej chodu i rotarodu) już w wieku 3 miesięcy, podczas gdy ich rodzeństwo z miotu, zwierzęta z endofiliną 1KO-2WT-3KO, wykazują znaczne zmniejszenie koordynacji ruchowej dopiero w wieku 15 miesięcy13. Ze względu na ogromną różnorodność fenotypów w tych modelach, konieczne jest zidentyfikowanie i zastosowanie testu, który może zintegrować różne wyzwania odpowiadające zdolnościom motorycznym i poznawczym zwierzęcia, a także wiekowi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedury eksperymentalne, które wykorzystują analizę kinematyczną chodu do oceny początku i progresji zaburzeń motorycznych w modelu mysim, który wykazuje zmiany neurodegeneracyjne (tj. mutanty endofiliny). Obejmuje to pomiar parametrów chodu w różnym wieku i różnym stopniu nasilenia zaburzeń lokomocji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z Europejskimi Wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt (2010/63/UE) za zgodą Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), numer rejestracyjny 14/1701.

1. Projekt badania

  1. Ponieważ praca nad zachowaniem zwierząt wymaga starannego planowania, podczas projektowania eksperymentu należy wziąć pod uwagę następujące parametry.
    1. Liczba zwierząt potrzebnych w grupie.
      1. Użyj oprogramowania statystycznego (np. PASS, EDA lub GPower), aby obliczyć wymaganą wielkość grupy.
        UWAGA: Wielkość grupy zależy od różnic między zwierzętami i nasilenia fenotypu. W przypadku analizy kinematycznej chodu liczba myszy wynosi zwykle 10 - 20 na grupę.
    2. Płeć zwierząt doświadczalnych.
      1. Rozważ wpływ poziomu estrogenów na eksperyment, w zależności od szczepu zwierzęcego.
        UWAGA: Wiele badań behawioralnych koncentruje się na mężczyznach, aby uniknąć wpływu poziomu estrogenów na eksperyment. Wpływy te są mniej lub bardziej silne w zależności od szczepu pochodzenia zwierzęcego.
      2. Jeśli będą używane obie płcie, przetestuj wpływ płci i oceń obie płcie niezależnie, jeśli to konieczne.
    3. Wiek zwierząt doświadczalnych.
      1. Używaj dorosłych zwierząt (w wieku 2 miesięcy lub starszych), jeśli potrzebny jest tylko jeden punkt czasowy.
      2. Wybierz kilka punktów czasowych, w których ma być badana zmiana zachowań motorycznych wraz z wiekiem. Najwcześniejszy możliwy punkt czasowy to 1 miesiąc, po odsadzeniu myszy od matek. Testuj zwierzęta w regularnych odstępach czasu, np. co 1, 2 lub 3 miesiące.
  2. Złóż wniosek o zezwolenie od władz lokalnych na przeprowadzanie testów behawioralnych zwierząt.
  3. Sporządź plany pozyskania badanych zwierząt.
    1. Sporządź plan hodowlany lub skontaktuj się z dystrybutorem zwierząt w odpowiednim czasie, aby wystarczająca liczba zwierząt doświadczalnych była dostępna w dniu rozpoczęcia eksperymentów.
    2. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się przez tydzień, jeśli są trzymane w nowym pomieszczeniu/otoczeniu podczas eksperymentów.

2. Nagrywanie wideo

UWAGA: Aby zilustrować użycie kinematycznej analizy chodu, tutaj używany jest komercyjnie dostępny system obrazowania wraz z towarzyszącym mu oprogramowaniem do obrazowania i analizy (patrz Tabela Materiałów).

  1. Uruchom komputer i oprogramowanie imagera.
  2. Określ stan zdrowia i dobrostan każdego zwierzęcia, obserwując je w jego domowej klatce i ważąc na wadze.
  3. W razie potrzeby delikatnie nałóż czerwoną farbę palcami na łapy zwierzęcia za pomocą pędzla. Pozostaw farbę do wyschnięcia na ~5 minut w zapasowej czystej klatce.
    UWAGA: Unikaj malowania brzucha zwierzęcia, ponieważ farba służy do zwiększenia kontrastu między łapami a ciałem. Przydatne jest posiadanie pod ręką czarnej farby do palców w celu wprowadzenia poprawek. Ten krok jest potrzebny w przypadku zwierząt o brązowym futrze lub w przypadku, gdy łapy zostały wytatuowane w celu identyfikacji. Jeśli zostanie wybrany do pomalowania łap jednego zwierzęcia, wszystkie zwierzęta w tej samej grupie i grupie kontrolnej również muszą zostać pomalowane.
  4. Ustaw prędkość bieżni w prawym górnym panelu urządzenia; Jeśli zostanie zastosowana więcej niż jedna prędkość biegu, zacznij od najwolniejszej prędkości.
  5. Umieść zwierzę w komorze testowej (unikaj zaciskania ogona lub łap podczas zamykania komory). Przykryj komorę ciemną szmatką i pozwól każdemu zwierzęciu dostosować się przez 1 - 2 minuty.
  6. Włącz światło w komorze testowej, przekręcając przełącznik obrotowy światła bieżni do pozycji "włączony". Przekręć przełącznik obrotowy bieżni do "do przodu", aby uruchomić bieżnię, a następnie kliknij przycisk "nagraj" w oprogramowaniu imager.
    UWAGA: Podczas pracy bieżni ważne jest, aby uważnie i stale obserwować wydajność zwierzęcia: natychmiast zatrzymaj bieżnię, jeśli zwierzę nie może nadążyć za prędkością bieżni lub wykazuje objawy wtórne niezwiązane z lokomocją, np. napady padaczkowe). Może być konieczne ponowne dostosowanie warunków testowania.
  7. Gdy zwierzę biegnie stabilnie (bez szybkich ucieczek na boki, przód lub tył), nagrywaj przez co najmniej 5 sekund przed zatrzymaniem bieżni. Zatrzymaj nagrywanie, klikając "stop" w oprogramowaniu imagera i ustaw przełącznik obrotowy bieżni z powrotem w pozycji "off".
    UWAGA: Aby uniknąć niestabilnego biegu zwierząt, pomocne może być pozwolenie im na bieg przez kilka sekund lub umożliwienie im biegania w przeciwnym kierunku (przekręcając przełącznik obrotowy bieżni na "do tyłu" zamiast "do przodu").
  8. Kliknij przycisk "przetwarzanie" w oprogramowaniu imagera, aby otworzyć menu, w którym można ustawić punkt początkowy i końcowy sekcji wideo (która ma być używana do analizy). Aby to zrobić, użyj suwaka u dołu ekranu, aby poruszać się po filmie.
  9. Aby wybrać bieżący punkt czasu jako punkt początkowy lub końcowy, kliknij odpowiednio "od klatki #" i "do". Upewnij się, że sekcja zawiera co najmniej 7 kroków na łapę (w sumie 14 kroków) zwierzęcia biegnącego stabilnie ze stałą prędkością.
  10. Wprowadź dane identyfikacyjne zwierzęcia, datę urodzenia, wagę i płeć. Zapisz dane w wybranej lokalizacji na komputerze lub serwerze. Kliknij "kamera", aby powrócić do interfejsu nagrywania.
  11. Jeśli konieczne jest zarejestrowanie wielu prędkości biegu, powtórz kroki 2.6 - 2.10 z żądanymi prędkościami biegu. Przed nagraniem następnego filmu upewnij się, że czerwona farba jest nadal obecna na łapie, w przeciwnym razie powtórz krok 2.3.
  12. Po nagraniu wypuść zwierzę do jego domowej klatki. Po usunięciu zwierzęcia należy dokładnie wyczyścić pas bieżni wodą z mydłem, a następnie środkiem dezynfekującym, aby przygotować go na przyjęcie następnego zwierzęcia doświadczalnego.

3. Przetwarzanie wideo

  1. Uruchom oprogramowanie analityczne i kliknij "wybierz folder do nauki", aby wybrać folder z nagranymi filmami.
  2. Wybierz jeden film lub kilka filmów, które mogą być przetwarzane po kolei, i kliknij "przejdź".
  3. Użyj funkcji "przerysuj", aby wybrać obszar, w którym działa mysz; ta sekcja powinna zawierać tylko mysz i białe tło.
  4. Jeśli funkcja bieżni "odwróconej" była wcześniej używana, wybierz "Sprawdź, czy nos fotografowanej osoby znajduje się po twojej prawej >>>", aby odzwierciedlić wideo, ponieważ oprogramowanie jest przeznaczone do analizy tylko zwierząt biegnących w lewo. Kliknij "akceptuj", aby kontynuować.
  5. Użyj funkcji "odśwież", aby zobaczyć domyślną maskę i odcisk łapy, który wykrywa oprogramowanie.
    UWAGA: Oryginalny film jest wyświetlany po lewej stronie, a czarno-biały obraz proponowanych odcisków łap znajduje się po prawej.
  6. Wprowadź wartości w polach "długość" i "szerokość", aby zmienić maskę, która wyklucza czerwony obszar wokół pyska zwierzęcia do analizy; ponieważ kolor jest podobny do łapek, brak maskowania tego obszaru może spowodować, że oprogramowanie przypadkowo zaklasyfikuje obszar pyska jako łapę.
  7. Dostosuj suwaki "filtruj szum" i "filtruj futro i ciemne plamy", aby zoptymalizować czarno-biały odcisk łapy. Ustaw suwak "szum filtra" na ~800 - 950 dla czarnych zwierząt i na ~700 - 800 dla brązowych lub białych zwierząt, w zależności od dokładnego koloru futra zwierzęcia. Wybierz "ok", gdy ustawienia są zadowalające.
    UWAGA: Suwak "filtruj futro i ciemne plamy" zależy od tego, jak "czerwona" jest łapa. W przypadku łap malowanych wartość ta wynosi zwykle około 100 - 120, a w przypadku łap niemalowanych najlepsza wartość to około 50 - 100. Ustawienia te zależą od odcieni kolorów futra i łap i muszą być zoptymalizowane dla każdego zwierzęcia. Czarno-biały odcisk łapy powinien mieć wyraźne odwzorowanie łap z jak najmniejszym szumem tła.
  8. Wybierz jeden lub kilka filmów, które przeszły pierwszą korektę (oznaczone znakiem "@@" przed nazwą filmu) i wybierz funkcję "przejdź", aby rozpocząć analizę tych filmów.
    UWAGA: Analiza trwa od 2 do 5 minut na film. Możliwe jest przeprowadzenie analizy kilku filmów w ciągu nocy, ponieważ ten krok nie wymaga wkładu ze strony eksperymentatora.
  9. Wybierz analizowany film (oznaczony jako "@@@") i kliknij "przejdź". Zwróć uwagę, że obszar łapy (w cm2) stykający się z pasem w czasie (dynamika chodu ) dla każdej oddzielnej łapy może być teraz widoczny. Aby porównać oryginalny film i obliczony odcisk łapy dla wybranego obszaru, użyj funkcji "odtwórz wideo".
  10. Użyj następujących (trzech) narzędzi, aby poprawić drobne błędy popełnione przez oprogramowanie.
    1. Użyj opcji "poprawny", aby usunąć błędny sygnał, np. gdy oprogramowanie rejestruje sygnał, mimo że odpowiadająca mu łapa nie styka się z paskiem. Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar, a następnie zaznacz lewą krawędź obiektu do usunięcia drugim kliknięciem, a prawą krawędź trzecim kliknięciem.
    2. Użyj opcji "połącz", aby połączyć dwa sygnały, np. gdy przez kilka klatek nie jest rejestrowany żaden sygnał, mimo że łapa styka się z paskiem. Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar, a następnie kliknij dwukrotnie w środku dwóch obiektów, które chcesz połączyć.
    3. Użyj opcji "usuń", aby całkowicie usunąć punkty czasowe z analizy. Opcji tej należy używać tylko wtedy, gdy błędu nie można naprawić za pomocą funkcji "poprawny" lub "połącz", np. gdy sygnał z lewej łapy kończyny przedniej zostanie przypadkowo zarejestrowany dla lewej łapy kończyny tylnej. Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar, i zaznacz lewą granicę obszaru do usunięcia drugim kliknięciem, a prawą krawędź trzecim kliknięciem.
      UWAGA: Narzędzia mogą być używane tylko do poprawiania drobnych błędów; Systematyczne awarie (np. jeśli sygnał z jednej łapy był bardzo słaby) nie mogą zostać skorygowane: w miarę możliwości należy wykluczyć nagranie wideo z analizy i powtórzyć nagranie danego zwierzęcia. Zwróć uwagę, że opcja "odtwórz wideo" nie jest już dostępna po użyciu opcji "popraw", "połącz" lub "usuń", a kliknięcie przycisku "cofnij" spowoduje zresetowanie wszystkich 3 narzędzi do edycji.
  11. Wybierz "następną kończynę", aby przejść przez 4 kończyny; gdy po ostatniej łapie zostanie kliknięta "następna kończyna", oprogramowanie zakończy analizę i wyświetli wyniki dla tego zwierzęcia na 4 ekranach.

4. Analiza chodu

  1. Po przeanalizowaniu wszystkich filmów z jednego eksperymentu zaznacz wszystkie filmy i kliknij "reorganizuj wyniki", aby wyeksportować wyniki (listę parametrów w plikach arkuszy kalkulacyjnych).
  2. Otwórz plik z końcówką "reorganized_stride_info" i dodaj informacje, które nie są zawarte w tym arkuszu kalkulacyjnym: informacje o grupie (np. genotyp, leczenie), wiek oraz wymiary długości i szerokości zwierzęcia, które są zapisane w innym pliku arkusza kalkulacyjnego z końcówką "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".
  3. W razie potrzeby znormalizuj parametry chodu do szerokości lub długości zwierzęcia, np. SL do długości zwierzęcia, a SW do szerokości zwierzęcia.
  4. Sortuj wyniki według grupy, wieku i prędkości biegu: analizuj wszystkie te warunki niezależnie.
    UWAGA: Nie można łączyć różnych grup wiekowych lub prędkości biegu w ramach tej samej grupy.
  5. Obliczyć wartości średnie (średnie), odchylenie standardowe i błąd standardowy średniej dla każdego parametru dla wszystkich warunków doświadczalnych.
  6. Przeprowadzić analizę statystyczną zgodnie z planem eksperymentalnym, np. użyć 2-stronnego testu t, aby porównać zmutowane/leczone zwierzę z typem dzikim (WT)/kontrolnym, lub ANOVA w celu porównania kilku niezależnych grup.
  7. Przyjrzyj się wszystkim zmierzonym parametrom: pomocne jest wykreślenie każdego parametru, aby lepiej zobrazować wyniki. Jeśli występują różnice statystyczne w danym parametrze, sprawdź, czy inne parametry zależne zmieniają się odpowiednio.
    UWAGA: Na przykład, jeśli SL jest znacznie zmniejszona w określonej grupie testowej, spowoduje to również wyższą częstotliwość kroku (ponieważ prędkość biegu jest taka sama) i może skutkować zwiększonym SW (w celu utrzymania stabilności postawy).
  8. Wybierz parametry, które są najbardziej istotne dla modelu i/lub są porównywalne z obserwacjami dotyczącymi choroby człowieka. Na potrzeby prezentacji stwórz reprezentatywne filmy dla każdej grupy i uzupełnij je wykresami przedstawiającymi odczyt odpowiednich parametrów, ponieważ subtelne zmiany chodu często nie są oczywiste z filmów.

5. Rozwiązywanie problemów

UWAGA: Niektóre zwierzęta, szczególnie modele mysie z fenotypem lęku, mogą mieć trudności z wykonaniem nawet prostego zadania, takiego jak bieganie na bieżni. Poniżej przedstawiono kroki, które można podjąć, aby obniżyć poziom lęku i zachęcić do biegania.

  1. Przyzwyczajenie i pozytywne egzekwowanie.
    1. Na 2 - 3 dni przed pierwszym testem umieść mysz w komorze testowej, przykryj ją ciemną szmatką i pozostaw wyłączone światło. Pozwól myszy dostosować się do nowego środowiska przez ~5 minut. Dodaj karmę lub masło czekoladowe/orzechowe (np. Nutella) do komory testowej, aby można było uzyskać pozytywne skojarzenie.
  2. Negatywne egzekwowanie przez zaciągnięcia powietrza/tylną granicę.
    1. Myszy nie lubią podmuchów powietrza ani ruchu za nimi i uciekają przed zakłóceniami. Aby zmotywować do biegania, użyj łagodnych zaciągów powietrza lub rytmicznego ruchu elastycznego drążka, który tworzy tylną granicę komory testowej, aby zachęcić mysz do biegania w kierunku przedniej części komory testowej.
  3. Powolny start.
    1. Podczas testowania dużych prędkości biegu uruchom bieżnię z niższą prędkością, a następnie powoli zwiększaj prędkość bieżni w kierunku pożądanych warunków testowych.
  4. Zminimalizuj swobodny ruch.
    1. Długość komory testowej jest ograniczona dwoma regulowanymi drążkami z przodu i z tyłu. Jeżeli badane zwierzę utrzymuje prędkość biegu, ale nie biegnie równomiernie, należy ograniczyć długość komory, aby uzyskać bardziej stabilny bieg.
  5. Jeśli powyższe pomiary nie zakończą się sukcesem, nagrywaj bieg następnego dnia. Jeśli zwierzę nadal odmawia biegania po trzech dniach testu, zapisz to jako wynik i wyklucz zwierzę z dalszych badań.
    UWAGA: Wyniki analizy chodu zależą od dobrej jakości nagrania wideo. Nie ma powodu, aby wykluczać filmy podczas analizy, jeśli zostały one starannie nagrane. Jeśli jakość wideo jest niewystarczająca, stanie się to oczywiste w kroku 3.6, gdy ustawiane są parametry tworzenia cyfrowego odcisku łapy. Jeśli jakakolwiek inna część ciała z wyjątkiem łap i pyska wydaje się czerwona (np. z powodu brakującego futra wokół genitaliów lub posypanych farbą palcami na brzuchu), jakość znacznie spada. Korekty w kroku 3.6 pozwalają na skorygowanie tylko drobnych problemów, a jeśli nie może to doprowadzić do akceptowalnego stosunku sygnału do szumu, wideo musi zostać wykluczone z analizy i nagranie musi zostać powtórzone. Dlatego zaleca się analizowanie filmów wkrótce po wykonaniu nagrań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować zastosowanie kinematycznej analizy chodu, przeprowadziliśmy analizę chodu u myszy WT C57BL/6J w różnym wieku oraz u kilku linii mutantów endofiliny, wykorzystując dostępne komercyjnie instrumentarium i oprogramowanie (patrz Tabela materiałów). W tej konfiguracji kamera wysokiej rozdzielczości umieszczona pod przezroczystą bieżnią rejestruje bieg myszy (Rycina 1A). Następnie oprogramowanie rozpoznaje kontrast między czerwonymi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie koordynacji ruchowej jest użytecznym podejściem w charakterystyce modeli chorób neurodegeneracyjnych, szczególnie w przypadku chorób takich jak PD, w których koordynacja ruchowa jest poważnie zaburzona. Za pomocą testu funkcjonalnego analizy kinematycznej chodu możemy zidentyfikować subtelne zmiany w chodzie zwierząt na początku problemów z lokomocją, lub w modelach ze słabą neurodegeneracją, a zatem stosunkowo skromnym fenotypem. Biorąc pod uwagę szeroki zakres fenotypów w różnych modelach chorób neurodegeneracy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy opiekunom zwierząt w ośrodku dla zwierząt ENI za pomoc w hodowli oraz dr Nuno Raimundo za przydatne komentarze do manuskryptu. I.M. jest wspierany przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) poprzez wspólne centrum badawcze SFB-889 (projekt A8) i SFB-1190 (projekt P02), oraz nagrodę Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. jest wspierany przez stypendium z Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biofizyka i Nauki Molekularne (GGNB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DigiGaitMouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USAOprogramowanie do obrazowania i analizy DigiGait jest dołączone do sprzętu
, nieprzezroczysty koc lub ciemna szmatkazakrywają komorę testową, aby zmniejszyć poczucie równowagi między ekspozycją a stresem
, np. Waga Satoriusz dokładnością do 0,1 g i maksymalnym obciążeniem co najmniej 100 g
czerwony farba do malowania palcami, np. Kreul lub Staedtlerw celu zwiększenia kontrastu między łapami a zwierzęciem" s body
mały pędzelpędzel do nakładania farby palcami na łapy zwierząt
rozcieńczony detergentdo czyszczenia
środek dezynfekujący, np. Meliseptol lub 70% etanolnp. B.Braundo dezynfekcji
do malowania miękki

Bibliografia

  1. Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
  2. Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
  3. Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
  4. Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
  5. Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
  6. Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
  7. Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
  8. Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701(2015).
  9. Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
  10. Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142(2012).
  11. Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
  12. Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
  13. Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
  14. Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367(2016).
  15. Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
  16. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
  17. Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472(2016).
  18. Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
  19. Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
  20. Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
  21. Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
  22. Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
  23. Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
  24. Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
  25. Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
  26. Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458(2012).
  27. Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
  28. Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
  29. Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
  30. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
  31. Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
  32. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
  33. Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  34. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
  35. Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
  36. Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
  37. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
  38. Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
  39. Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
  40. Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
  41. Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
  42. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175(2015).
  43. Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
  44. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
  45. Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele mysieanaliza chodu oparta na wideoobrazowanie w p aszczy nie brzusznejtesty na bie nianaliza odcisk w apkinematyczna analiza chodumutanty endofilin sygna owej
Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.