Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57756

⸱

24 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Streszczenie

Implanty dentystyczne i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie biofilmu. Stosowanie materiałów, które zapewniają niską adhezję mikrobiologiczną, może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantacyjnych. Ze względu na złożoność środowiska jamy ustnej i niejednorodność biofilmu jamy ustnej potrzebne są techniki mikroskopowe, które mogą umożliwić analizę biofilmu powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych do porównywania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i ceramicznych do łączników protetycznych, a także metody stosowane w analizie biofilmów w jamie ustnej na poziomie morfologicznym i komórkowym. Model in situ do oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych do łączników protez dentystycznych, jak opisano w tym badaniu, zapewnia zadowalające zachowanie biofilmu 48 godzin, wykazując tym samym adekwatność metodologiczną. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na analizę obszaru reprezentatywnego dla biofilmu powstałego na badanych materiałach. Ponadto zastosowanie fluoroforów i przetwarzanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej pozwala na analizę żywotności bakterii w bardzo niejednorodnej populacji mikroorganizmów. Przygotowanie próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej sprzyja strukturalnemu zachowaniu biofilmu, obrazów o dobrej rozdzielczości i braku artefaktów.

Wprowadzenie

Biofilmy bakteryjne to złożone, funkcjonalnie i strukturalnie zorganizowane społeczności mikroorganizmów, charakteryzujące się różnorodnością gatunków drobnoustrojów, które syntetyzują pozakomórkową, biologicznie aktywną matrycę polimerową1,2. Adhezja bakterii do powierzchni biotycznych lub abiotycznych jest poprzedzona tworzeniem się nabytej błonki, składającej się głównie z glikoprotein ślinowych1,3,4. Początkowo ustala się słabe oddziaływania fizykochemiczne między mikroorganizmami a błonką, a następnie następują silniejsze interakcje między adhezynami bakteryjnymi a receptorami glikoproteinowymi nabytej błonki. Różnorodność mikrobiologiczna stopniowo wzrasta poprzez koagregację wtórnych kolonizatorów do receptorów już przyłączonych bakterii, tworząc wielogatunkową społeczność1,3,4,5.

Homeostaza mikrobioty jamy ustnej i jej symbiotyczny związek z gospodarzem jest ważna dla utrzymania zdrowia jamy ustnej. Dysbioza w obrębie biofilmów jamy ustnej może zwiększać ryzyko rozwoju próchnicy i chorób przyzębia2,5. Badania kliniczne wykazują związek przyczynowo-skutkowy między gromadzeniem się biofilmu na zębach lub implantach dentystycznych a rozwojem zapalenia dziąseł lub zapalenia błony śluzowej wokół implantu6,7. Postęp procesu zapalnego prowadzi do peri-implantitis i w konsekwencji do utraty implantu8.

Implanty dentystyczne i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie się biofilmu9. Stosowanie materiałów o składzie chemicznym i topografii powierzchni zapewniającej niską adhezję mikrobiologiczną może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantowych9,10. Tytan jest najczęściej używanym materiałem do produkcji łączników protetycznych do implantów; Jednak materiały ceramiczne zostały wprowadzone niedawno i zyskują popularność jako alternatywa dla tytanu ze względu na ich właściwości estetyczne i biokompatybilność11,12. Co również ważne, materiały ceramiczne zostały powiązane z rzekomo zmniejszonym potencjałem przylegania mikroorganizmów, głównie ze względu na ich chropowatość powierzchni, zwilżalność i energię swobodną powierzchni10,13.

Badania in vitro przyczyniły się do znacznego postępu w zrozumieniu adhezji mikrobiologicznej do powierzchni zaczepów protetycznych9,14,15,16,17. Jednak dynamiczne środowisko jamy ustnej, charakteryzujące się zmienną temperaturą i pH oraz dostępnością składników odżywczych, a także obecnością sił ścinających, nie jest odtwarzalne w protokołach eksperymentalnych in vitro18,19. Aby przezwyciężyć ten problem, alternatywą jest zastosowanie modeli tworzenia biofilmu in situ, które korzystnie zachowują jego trójwymiarową strukturę do analizy ex vivo10,20,21,22,23,24.

Analiza złożonej struktury biofilmu utworzonego na podłożach doustnych wymaga użycia technik mikroskopowych zdolnych do wyświetlenia optycznie gęstej materii25. Wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa to nowoczesna opcja do analizy strukturalnej biofilmu26. Charakteryzuje się zastosowaniem optyki nieliniowej ze źródłem oświetlenia zbliżonym do długości fali podczerwonej, pulsowanym do femtosekund27. Metoda ta jest wskazana do pozyskiwania obrazów materiałów autofluorescencyjnych lub materiałów oznaczonych fluoroforami, oprócz obrazów generowanych przez nieliniowe sygnały optyczne pochodzące ze zjawiska znanego jako generacja drugiej harmonicznej. Jedną z zalet mikroskopii wielofotonowej jest duża głębia obrazu uzyskana przy minimalnym uszkodzeniu komórek spowodowanym intensywnością światła wzbudzenia27.

Do analizy żywotności biofilmu na powierzchniach abiotycznych za pomocą mikroskopii wielofotonowej wymagane jest użycie fluorescencyjnych barwników kwasów nukleinowych o różnych charakterystyce widmowej i zdolności penetracji w komórkach bakteryjnych28. Fluorofory SYTO9 (zielono-fluorescencyjne) i jodek propidyny (czerwono-fluorescencyjne) mogą być używane do wizualnego rozróżniania żywych i martwych bakterii28,29,30. Jodek propidyny wnika tylko do bakterii z uszkodzonymi błonami, podczas gdy SYTO9 wnika do komórek bakteryjnych z nienaruszoną i naruszoną błoną. Gdy oba barwniki są obecne wewnątrz komórki, jodek propidyny ma większe powinowactwo do kwasów nukleinowych i wypiera SYTO9, oznaczając go na czerwono28,30.

Ze względu na złożoność środowiska jamy ustnej i niejednorodność biofilmu jamy ustnej, potrzebne są techniki mikroskopowe, które umożliwią analizę biofilmu powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych do porównywania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i ceramicznych do łączników protetycznych, a także metody stosowane w analizie biofilmów w jamie ustnej na poziomie morfologicznym i komórkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the School of Dentistry of Ribeirão Preto, a uczestnik ochotnik podpisał pisemną zgodę (Proces 2011.1.371.583).

1. Tworzenie biofilmu in situ

  1. Selekcja uczestników
    1. Wybieraj pacjentów na podstawie następujących kryteriów włączenia: zdrowa osoba z pełnym uzębieniem i bez klinicznych objawów chorób jamy ustnej.
    2. Wyklucz pacjentów na podstawie następujących kryteriów wykluczenia: ciąża, laktacja, próchnica, choroba przyzębia lub antybiotykoterapia w ciągu ostatnich 3 miesięcy, palanie tytoniu lub jakakolwiek choroba ogólnoustrojowa, która może mieć wpływ na stan przyzębia.
  2. Przygotowanie aparatu wewnątrzustnego
    1. Zarejestrować łuk szczęki za pomocą wycisku alginianowego.
    2. Przygotuj kamień typu IV, dodając 19 ml wody do 100 g proszku kamiennego. Wlej kamień do formy alginianowej, aby wykonać model łuku szczęki.
    3. Zaprojektuj i wyprodukuj akrylowe urządzenie wewnątrzustne do podtrzymywania próbek testowych (krążki tytanowe i ceramiczne).
      1. Za pomocą szczypiec ortodontycznych #139 wykonaj zapięcia retencyjne z drutu NiCr (o średnicy 0,7 mm) i umieść je na modelu. Aby ustawić zacisk między górnymi zębami przedtrzonowymi, zegnij jeden koniec każdego drutu tak, aby tworzyły pętlę.
        1. Dostosuj pętlę w okolicy brodawki międzyzębowej. W zgryzie należy wprowadzić delikatną krzywiznę, aby nie kolidować z punktami styku i z okluzją. Wykonaj zagięcie pod kątem 90° na końcu zacisku, aby utrzymać go w akrylu.
        2. Aby dopasować zacisk do górnego drugiego zęba trzonowego, dostosuj krzywiznę drutu w trzeciej części szyjnej (przedsionkowej) do konturu zęba (dystalnej) i wykonaj fałd pod kątem 90° na końcu zacisku w celu utrzymania w akrylu.
          UWAGA: W celu zapewnienia odpowiedniej retencji/stabilności wyrobiska wewnątrzustnego, klamry retencyjne umieszczono między górnymi zębami przedtrzonowymi a dystalną stroną drugiego zęba trzonowego po obu stronach łuku zębowego.
      2. Manipuluj samoutwardzalną żywicą akrylową zgodnie z instrukcjami producenta i wciśnij żywicę akrylową między 2 szklane płytki (z umieszczoną przekładką o grubości 3 mm) podczas fazy plastycznej, aby uzyskać arkusz o grubości 3 mm.
      3. Połóż arkusz akrylowy na obszarze podniebiennym modelu, zgodnie z projektem urządzenia, a nadmiar żywicy akrylowej odetnij rzeźbiarką przed polimeryzacją.
      4. Wytwarzać krążki woskowe za pomocą metalowej matrycy [o średnicy 10 mm, grubości 2 mm (powierzchnia 78,5 mm2)], umieszczając stopiony wosk w matrycy i czekając, aż wosk zastygnie. Ręcznie zanurz 4 krążki woskowe w żywicy akrylowej, 2 z nich między zębami przedtrzonowymi, a pozostałe 2 obok drugich zębów trzonowych.
      5. Pozwól żywicy akrylowej polimeryzować w zbiorniku ciśnieniowym pod ciśnieniem sprężonego powietrza 20 psi przez 20 minut.
      6. Wykończ urządzenie wewnątrzustne elektryczną rękojeścią i nożem do laboratorium dentystycznego, a następnie wypoleruj je gumą ścierną.
      7. Wyreguluj urządzenie, aby zapewnić prawidłowe dopasowanie do ust, korzystając z opisanego powyżej sprzętu.
  3. Przygotowanie próbek tytanu i tlenku cyrkonu
    Uwaga: Próbki (n = 14) mają średnicę 10 mm i grubość 2 mm oraz powierzchnię 78,5 mm2.
    1. Powierzchnie próbek należy wypolerować papierami ściernymi chłodzonymi wodą o malejącej ścieralności (ziarnistość 600, 1200 i 2000) przez około 20 minut
      UWAGA: Polerowanie próbek zostało przeprowadzone w celu ujednolicenia chropowatości powierzchni na poziomie 0,2 μm.
    2. Oczyść i zdezynfekuj próbki i urządzenie wewnątrzustne płynnym detergentem i wodą z kranu, a następnie użyj kąpieli ultradźwiękowej z alkoholem izopropylowym przez 15 minut. Osusz je chłonnymi ręcznikami papierowymi.
    3. Utrwal próbki w wewnątrzustnym urządzeniu doustnym za pomocą około 0,1 ml nietoksycznego kleju topliwego (Rysunek 1).
    4. Zainstaluj urządzenie zawierające próbki w jamie ustnej.
      UWAGA: Wkładkę wewnątrzustną zawierającą próbki należy nosić przez 48 godzin. Urządzenie zostało usunięte i przechowywane w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), podczas gdy pacjent jadł i czyścił jamę ustną.

2. Ocena żywotności bakterii

Uwaga: Wielkość próby n = 10.

  1. Przygotować roztwór barwiący, dodając 3 μl SYTO9 (zielony fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego) i 3 μl jodku propidyny (czerwony fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego) do 1 ml sterylnej wody destylowanej.
    UWAGA: Przygotować roztwory chronione przed światłem.
  2. Przenieś próbki na płytkę 24-dołkową i dokładnie umyj je PBS w celu usunięcia wszelkich nieprzylegających komórek.
  3. Dodać odpowiednią objętość (1 ml) roztworu barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć próbkę zawierającą biofilm. Dodaj barwnik bardzo ostrożnie, aby nie zdezorganizować biofilmu.
  4. Inkubować próbkę przez 20 - 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  5. Delikatnie umyj próbkę biofilmu sterylną wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar barwnika.
  6. Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem i wykonaj wielofotonową laserową mikroskopię skaningową w celu analizy biofilmu.
    UWAGA: Analizę żywotności komórek bakteryjnych przeprowadzono przy użyciu systemu mikroskopii wielofotonowej. Fluorescencję jodku propydyny wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia/emisji 546/680 nm i 477/600 nm dla SYTO9. Wielkość uzyskanych obrazów wynosiła 5,16188 x 5,16188 mm, co odpowiada 26,64mm2 całkowitej powierzchni każdego egzemplarza (78,5 mm2) lub 33,94% całkowitej powierzchni. Obrazy zostały wykonane z najbardziej centralnej części próbki, o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. Obrazy kanału czerwonego i zielonego zostały przeanalizowane oddzielnie za pomocą oprogramowania Fidżi31. Każda komórka została wybrana za pomocą narzędzia do zaznaczania, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą zintegrowanej gęstości pikseli, odejmując tło obrazu.

3. Analiza składu chemicznego próbek za pomocą spektroskopii dyspersyjnej energii (EDS)

Uwaga: Wielkość próby n = 3.

  1. Wybierz 3 próbki każdego materiału testowego wolnego od biofilmu i oceń skład chemiczny w 2 różnych obszarach każdej próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego sprzężonego ze spektrometrem energii dyspersyjnej, o napięciu wiązki elektronów 10 kV32.

4. Analiza morfologiczna biofilmu bakteryjnego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Uwaga: Wielkość próby n = 1.

  1. Utrwalić biofilm, zanurzając próbki w 2,5% aldehydzie glutarowym rozcieńczonym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,0 - 7,3 na 24 godziny.
  2. Przemyć próbkę w buforze PBS (pH = 7,6).
  3. Utrwalaj biofilm 1% tetratlenkiem osmu przez 1 godzinę.
  4. Przemyć próbkę w buforze PBS (pH = 7,6).
  5. Próbki biofilmu należy ostrożnie odwodnić, zanurzając je w roztworach etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 90%, 95% i 100%).
    UWAGA: Wykonaj 3 wymiany etanolu w stężeniu 100%. Etap całkowitego odwodnienia trwa około 2 godzin.
  6. Przenieść próbki do suszarki w punkcie krytycznym i dokonać kilku podstawień dwutlenkiem węgla (CO2 ), aż próbki wyschną.
  7. Wyjąć wysuszone próbki z aparatu i zamontować je na uchwytach skaningowego mikroskopu elektronowego.
  8. Napylaj warstwę złota o grubości 20 nm na powierzchnię próbki przez 120 s.
  9. Włóż pokryte złotem krążki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Uzyskaj obrazy z 5 różnych obszarów każdej próbki, pod napięciem 20 - 30 kV pod zmiennym ciśnieniem i przy 650-krotnym powiększeniu12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gęstość kolonizacji biofilmu po 48 h wzrostu in situ została w niniejszym badaniu przedstawiona jako proporcja obszaru skolonizowanego na dyskach tytanowych i cyrkonowych w stosunku do całkowitej powierzchni skanowania próbki przy użyciu mikroskopii wielofotonowej (26,64 mm2). Rysunek 2 przedstawia gęstość kolonizacji bakteryjnej na powierzchni trzech badanych materiałów. Wyższą gęstość biofilmu zaobserwowano na powierzchniach odlewanych i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opisany w tym badaniu został opracowany w celu oceny tworzenia biofilmu na materiałach tytanowych i cyrkonowych do łączników protetycznych, w tym analizy żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. W tym celu zaprojektowano model tworzenia biofilmu in situ , składający się z urządzenia wewnątrzustnego zdolnego do przechowywania próbek badanych materiałów i utrzymywania ich w pozycji ekspozycji na dynamiczne środowisko jamy ustnej przez 48 godzin. Urządzenie zostało uznane przez ochotnika za ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują José Augusto Maulin z Microscopy Multiuser Laboratory (School of Medicine of Ribeirão Preto) za hojną pomoc przy analizach EDS i SEM oraz Hermano Teixeira Machado za hojną pomoc techniczną w edycji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
 Morelli55.01.070
JET akryl do automatycznej polimeryzacjiClá ssico
Wosk dentystyczny Clá ssico
Zbiornik ciśnieniowy Papiery ścierne Essencedental
ziarnistości 600Papiery ścierne NORTONT216
ziarnistości 1200Papiery ścierne NORTONT401
ziarnistości 2000NORTONT402
Metalograficzna maszyna polerskaArotec
Alkohol izopropylowySIGMA-ALDRICHW292907
Klej topliwyTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Zestaw do żywotności biofilmuInvitrogenL10316
Końcówki do pipet, 10 i mikro; LKASVIK8-10   
Końcówki do pipet, 1 000 i mikro; LKASVIK8-1000B   
Płytka 24-dołkowa KASVIK12-024
Szklana półmiskaThermo Scientific150680
Mikroskop odwrócony AxioObserver ZEISS
Chameleon vision ii laserKoherentny
obiektyw EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Olej DICZEISS440452-9903-000
Czujniki SDD - X-Max 20mm²Oxford Instruments
Roztwór aldehydu glutarowegoSIGMA-ALDRICHG5882
Bufor kakodylanu sodu SIGMA-ALDRICH97068 
Tetratlenek osmuSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638Służy do wytwarzania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
Absolutny etanol do analizy EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Suszarka punktu krytycznegoBAL-TEC
JSM-6610 Skaningowy mikroskop elektronowyserii JEOL
SCD 050 NapylarkaBAL-TEC
Drut NiCr o o o

Bibliografia

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055(2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729(2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36(2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Materiały tytanowemateriały cyrkonowemikroskopia wielofotonowaskaningowa mikroskopia elektronowaanaliza biofilmużywotność bakteriiprzygotowanie próbekmodel in situ
Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.