Metody badania regeneracji w stentorze

Podsumowanie

Gigantyczny orzęsek, Stentor coeruleus, jest doskonałym systemem do badania regeneracji i gojenia się ran. Przedstawiono procedury zakładania hodowli komórek Stentor z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek, indukowania regeneracji poprzez cięcie komórek, chemicznej indukcji regeneracji pasma błoniastego i aparatu jamy ustnej, obrazowania i analizy regeneracji komórek.

Streszczenie

Komórki muszą być w stanie zregenerować swoje części, aby odzyskać siły po zewnętrznych zakłóceniach. Jednokomórkowy rzęsek Stentor coeruleus jest doskonałym organizmem modelowym do badania gojenia się ran i późniejszej regeneracji komórek. Genom Stentora stał się dostępny niedawno, wraz z nowoczesnymi metodami biologii molekularnej, takimi jak RNAi. Narzędzia te umożliwiają badanie regeneracji pojedynczych komórek na poziomie molekularnym. Pierwsza sekcja protokołu obejmuje tworzenie kultur komórek Stentor z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek, wraz z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi utrzymywania kultur Stentora. Hodowla Stentora w dużych ilościach pozwala na wykorzystanie cennych narzędzi, takich jak biochemia, sekwencjonowanie i spektrometria mas. Kolejne sekcje protokołu obejmują różne podejścia do wywoływania regeneracji u Stentora. Ręczne cięcie komórek szklaną igłą pozwala na badanie regeneracji dużych części komórek, podczas gdy traktowanie komórek sacharozą lub mocznikiem pozwala na badanie regeneracji określonych struktur znajdujących się na przednim końcu komórki. Podano metodę obrazowania poszczególnych regenerujących się komórek wraz z rubryką do oceny stopnia zaawansowania i analizy dynamiki regeneracji. Cały proces regeneracji podzielony jest na trzy etapy. Wizualizując dynamikę progresji populacji komórek przez kolejne etapy, wykazano niejednorodność czasu regeneracji.

Wprowadzenie

Komórki nie są zwykłymi workami enzymów, ale raczej bardzo złożonymi maszynami, których komponenty są starannie skalowane do odpowiednich rozmiarów i rozmieszczone w dobrze zdefiniowanych pozycjach. Morfogeneza poszczególnych komórek stanowi kluczowy proces w biologii komórkowej i rozwojowej, ale jej mechanizm molekularny jest nieznany^1,2. Podczas gdy niektóre hodowane komórki przypominają plamy, organizmy jednokomórkowe mogą mieć niezwykle skomplikowaną architekturę, czego przykładem są złożone wzorce korowe widoczne w orzęskach^3,4.

Być może najbardziej ekstremalnym przykładem wysoce zbudowanej komórki jest Stentor coeruleus, gigantyczny heterotrychiczny orzęsek daleko spokrewniony z Tetrahymena i Paramecium. Stentor ma 1 mm długości i jest pokryty ponad 100 podłużnymi paskami niebieskiego pigmentu na przemian z rzędami rzęsek zorganizowanych równoległymi stosami wstążek mikrotubul, które biegną przez całą komórkę. Komórka ma kształt trąbki (Ryc. 1), z pasmem błoniastym i aparatem ustnym (OA) na jej przednim końcu oraz uchwytem, który przyczepia komórkę do podłoża na jej tylnym końcu. Oprócz wyraźnej polaryzacji przednio-tylnej, komórka wykazuje również charakterystyczny wzór chiralny, tak że odstępy między rzędami rzęsek stopniowo zwiększają się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Powoduje to nieciągłość, w której najwęższy rząd spotyka się z najszerszym rzędem, a ten obszar powierzchni komórki, znany jako locus kontrastu prążkowanego, może indukować tworzenie drugiego zestawu przednich struktur końcowych po przeszczepieniu na inną komórkę⁵, co czyni go formalnie równoważnym Organizatorowi Spemanna. Tak więc wszystkie kluczowe procesy biologii rozwoju mają swoje odpowiedniki w Stentorze: aksjonacja, tworzenie wzorców i indukcja. W zarodku procesy te są napędzane przez różnice w losie między różnymi komórkami, ale w Stentorze muszą być napędzane przez różnice losu między różnymi regionami w jednej komórce. To, co definiuje różnice między regionami w Stentorze, pozostaje tajemnicą.

Jeśli jakakolwiek część Stentora zostanie odcięta, brakująca część komórki może się zregenerować, aby w ciągu kilku godzin uzyskać normalną komórkę. Jeśli komórka zostanie przecięta na pół lub nawet na znacznie mniejsze kawałki, każdy fragment reorganizuje się w normalnie wyglądającą, ale mniejszą komórkę i przywraca właściwą proporcję między częściami komórki^6,7. Nawet maleńkie fragmenty, 1/64 wielkości oryginalnej komórki, są w stanie zregenerować się do małej, ale normalnie proporcjonalnej komórki, a następnie urosnąć do pełnego rozmiaru⁶. Projekt Stentor stanowi zatem wyjątkową okazję do zbadania mechanizmów skalowania wielkości organelli i regulacji wzrostu komórek za pomocą metod chirurgicznych, które są zwykle stosowane na poziomie tkanek lub całych organizmów.

Jedną z właściwości Stentora, która pozwala mu na regenerację po wielu operacjach chirurgicznych, jest to, że zawiera on pojedyncze guzkowate makrojądro (Rysunek 1) z około 50 000 kopii całego genomu⁸. Dopóki fragment komórki zawiera co najmniej jeden węzeł makrojądrowy, ma zdolność do pełnej regeneracji. Inną właściwością leżącą u podstaw zdolności regeneracji Stentora jest jego niesamowita zdolność gojenia się ran. Chociaż wiele typów komórek jest zdolnych do leczenia swoich ran⁹, Stentor jest w stanie wyzdrowieć z niezwykłego zakresu zaburzeń fizycznych. Przykład odzyskania Stentora po drastycznych zaburzeniach, wraz z metodami wizualizacji przepływu cytoplazmatycznego w Stentor¹⁰ został wcześniej opisany. Metody te pozwalają na badanie, w jaki sposób zranienie i późniejsza regeneracja wpływają na stan fizyczny cytoplazmy.

Ogromne rozmiary Stentora, niezwykła zdolność do regeneracji oraz fakt, że manifestuje on wiele zjawisk rozwojowych obserwowanych w wielokomórkowych embrionach (takich jak organizatorzy, aksjonacja i wzory) przyciągnęły wielu biologów rozwojowych na przełomie XIX i XX wieku, w tym Thomasa Hunta Morgana⁷. W latach 50-tych i 60-tych metody mikrochirurgiczne wykazały zaskakujący wachlarz procesów regeneracyjnych i morfogenetycznych w tym jednokomórkowym organizmie¹¹. Jednak Stentor został opracowany jako model systemu biologii molekularnej dopiero niedawno. W ciągu ostatnich kilku lat genom Stentora został zsekwencjonowany i złożony w ⁸, a następnie opracowano metodę zakłócania ekspresji genów za pomocą RNAi poprzez karmienie¹².

Jednym z powodów, dla których Stentor dopiero niedawno stał się organizmem modelowym dla nowoczesnej biologii molekularnej, była trudność w hodowli dużych kultur ze względu na jego długi cykl komórkowy (3 do 5 dni). Jednak nowoczesne metody genomiczne i proteomiczne wymagają mniej materiału niż kiedyś, a objętość pojedynczej komórki Stentora jest wystarczająca dla tych metod, nawet bez uciekania się do ultraczułych metod, które zostały opracowane do analizy pojedynczych komórek, które są znacznie mniejsze niż Stentor. Sekcja 1 protokołu szczegółowo opisuje procedurę tworzenia dużej hodowli z pojedynczej komórki Stentora. To samo podejście można zastosować do stworzenia dużej kultury z fragmentu komórki uzyskanego przez przecięcie komórki. Sekcja 1 zawiera również wytyczne dotyczące utrzymywania zdrowych kultur Stentor przez długi czas. Sekcja 2 protokołu zawiera metodologię indukowania regeneracji komórek poprzez ręczne cięcie komórek szklaną igłą. Sekcja 3 protokołu poświęcona jest dwóm metodom indukowania regeneracji określonych struktur komórkowych (pasmo błoniaste i aparat doustny): traktowanie komórek sacharozą lub mocznikiem prowadzi do złuszczania tych struktur, a następnie do ich regeneracji. Sekcja 4 protokołu szczegółowo opisuje metodę obrazowania poszczególnych regenerujących się komórek w długich okresach czasu. Rozdział 4 kończy się opisem etapów regeneracji oraz wskazówkami dotyczącymi analizy dynamiki regeneracji.

Protokół

1. Hodowla stentorów i tworzenie kultur stentorów z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek

1. Przygotuj kulturę Chlamydomonas reinhardtii, która będzie używana jako pokarm dla Stentora.
   1. Pozyskać komórki Chlamydomonas reinhardtii od komercyjnego dostawcy (tabela materiałów).
   2. Stwórz płynną hodowlę Chlamydomonas reinhardtii o pojemności 500 ml w dostępnych na rynku pożywkach TAP przy użyciu sterylnej techniki¹³.
   3. Utrzymuj kulturę Chlamydomonas pod lampą w stężeniu bliskim nasycenia (przy średnicy zewnętrznej około 1), rozcieńczając ją pożywką TAP dwa razy w tygodniu.
      Uwaga: Kulturę Chlamydomonas można uprawiać na shakerze.
   4. Regularnie sprawdzaj, czy posiew Chlamydomonas jest zdrowy, umieszczając kroplę kultury na szkiełku podstawowym, przykrywając ją szkiełkiem nakrywkowym i sprawdzając pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu.
      Uwaga: Nie używaj kultury do karmienia Stentora, jeśli jest zanieczyszczona bakteriami lub jeśli komórki Chlamydomonas są agregowane w skupiska. Jeśli wystąpi którykolwiek z tych problemów, rozpocznij nową hodowlę Chlamydomonas.
2. Pozyskać komórki stentora coeruleus od komercyjnego dostawcy (tabela materiałów).
3. Jeśli komórki Stentora są potrzebne z ich naturalnego środowiska, zbierz je ze stawu, jeziora lub rzeki¹¹.
   1. Aby zebrać Stentor ze stawu, jeziora lub rzeki, znajdź obszar z roślinnością, w którym woda jest stosunkowo spokojna, zacieniona i przejrzysta.
      Uwaga: Istnieje większe prawdopodobieństwo znalezienia Stentora w miejscach, w których rośnie rzęsa.
   2. Zbierz co najmniej 2 litry wody w pojemniku, z którego łatwo się wylać.
   3. Po tym, jak detrytus i cząstki stałe osiądą na dnie pojemnika, delikatnie napełnij kilka mniejszych pojemników, aby sprawdzić, czy nie ma Stentora, czekając kilka sekund po każdym pobraniu, aż detrytus osiądzie w dużym pojemniku.
   4. Po zakończeniu pobierania próbek w danym miejscu przenieś się do nowego miejsca, które jest oddalone o co najmniej 10 m i powtórz tam pobieranie próbek.
      Uwaga: Nie każdy staw ma populację Stentora, więc może być konieczne pobranie próbek z wielu stawów.
   5. Wróć z próbkami do laboratorium i przenieś wodę z pojemników na poszczególne szalki Petriego.
   6. Na każdej szalce Petriego szukaj Stentora pod mikroskopem stereoskopowym ze światłem ukośnym przy 5-krotnym powiększeniu. Przenieść poszczególne komórki Stentor za pomocą pipety o pojemności 1 ml do studzienki szklanej płytki punktowej zawierającej co najmniej 100 μl dostępnej w handlu pasteryzowanej wody źródlanej (PSW).
      Uwaga: Komórki stentorowe mają kształt podobny do trąbki, gdy są przymocowane do podłoża (Rysunek 1). Pływające komórki stentorowe są mniej rozciągnięte niż komórki przyczepione do podłoża (wideo 1).
   7. Umyj Stentor w PSW co najmniej 3 razy. Wykonaj płukanie, usuwając około 90% wody ze studni, pozostawiając komórki Stentora w studni, a następnie dodaj 500 μL PSW do studni.
      Uwaga: Przed użyciem pipet z końcówkami do pipet o pojemności 10 μl lub mniejszej, należy odciąć nożyczkami koniec końcówki pipety o około 0,5 mm, aby uniknąć zranienia komórek z powodu sił ścinających, które są generowane, gdy duża komórka przepływa przez zbyt mały otwór końcówki.
4. Preparat Chlamydomonas należy przygotować przed każdym podaniem leku Stentor.
   1. Przenieść 1 ml kultury Chlamydomonas przygotowanej jak w kroku 1.1 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 2 095 x g przez 3 min.
   2. Usunąć sklarowany osad i zawiesić osad w 1 ml PSW. Wirować przy 2 095 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl PSW.
      Uwaga: W związku z tym umyte i skoncentrowane Chlamydomonas będą określane jako "przygotowane Chlamydomonas" w kolejnych krokach. Pożywka TAP jest szkodliwa dla leku Stentor, dlatego ważne jest mycie Chlamydomonas przed podaniem leku Stentor.
5. Jeśli potrzebna jest klonalna hodowla Stentora, rozpocznij hodowlę od pojedynczej komórki Stentora lub fragmentu komórki.
   1. Ponieważ pojedyncze komórki Stentora nie rosną dobrze w PSW, przygotuj kondycjonowaną pożywkę, sterylizując 500 μl pożywki z istniejącej, zdrowej kultury Stentora.
   2. Przenieść 500 μl kondycjonowanej pożywki do jednego z dołków szklanej płytki punktowej.
   3. Przenieść jeden Stentor do studzienki szklanej płytki punktowej zawierającej kondycjonowane media. Użyj jak najmniejszej ilości nośnika do wykonania przelewu.
   4. Podawaj każdemu stentorowi 5 μl przygotowanych Chlamydomonas co 48 godzin. Gdy Stentor podzieli się, policz liczbę komórek w studzience i dodaj 5 μl przygotowanych Chlamydomonas na komórkę.
   5. Trzymaj Stentor w zacienionym miejscu, ponieważ komórki są wrażliwe na światło (na przykład w przezroczystych plastikowych pudełkach przykrytych ręcznikami papierowymi).
   6. Wymieniać pożywkę Stentor w studzience na świeżo kondycjonowaną pożywkę co 96 godzin.
      1. Przygotować świeżo kondycjonowaną pożywkę, jak w kroku 1.5.1.
      2. Spraw, aby wszystkie komórki Stentora oderwały się od dna studzienki, delikatnie pipetując płyn w górę iw dół w studzience.
      3. Ostrożnie odessać płyn ze studzienki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, upewniając się, że wszystkie komórki pozostały w studzience. Dodać 500 μl świeżej kondycjonowanej pożywki do studzienki.
   7. Gdy liczba komórek w studzience przekroczy 20, przenieś komórki do większego pojemnika, na przykład szklanego słoika z szerokim otworem.
      1. Dodaj 20 ml PSW do autoklawowanego szklanego słoika z szeroką szyjką.
         Uwaga: Autoklawowanie naczyń szklanych do Stentor można zastąpić starannym myciem i płukaniem.
      2. Ostrożnie pipetuj pożywkę w górę iw dół w studzience, aby odłączyć wszystkie komórki od dna studzienki. Zbierz wszystkie komórki Stentor za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml i delikatnie przenieś je do szklanego słoika.
   8. Nie dokręcaj pokrywek słoików z kulturami Stentor, aby umożliwić wystarczający dostęp powietrza.
   9. Dodawaj PSW do słoika co 48 godzin, aby utrzymać gęstość stentora na poziomie około 20 komórek/ml. Oszacuj gęstość komórek na oko.
      Uwaga: Alternatywnie, użyj pipety o pojemności 1 ml, aby wprowadzić powietrze do słoika, aby komórki oderwały się od ścianek, odpipetuj 1 ml kultury i policz liczbę komórek w końcówce pipety.
   10. Co 48 godzin podawaj przygotowane Chlamydomonas do kultur Stentor w słoikach (patrz Krok 1.4). Zacznij od karmienia kultury 200 μl przygotowanych Chlamydomonas. Wraz ze wzrostem objętości kultury stopniowo zwiększaj ilość przygotowanych Chlamydomonas używanych do karmienia do 1 ml.
   11. Gdy objętość kultury osiągnie około 90% pojemności słoika, przenieś kulturę do większego pojemnika.
       1. Odpipetować kulturę wewnątrz słoika, w górę i w dół, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby odłączyć Stentor od szklanki.
       2. Wlej całą zawartość słoika do szklanego pojemnika na 2 filiżanki.
       3. Wypłucz słoik z około 25 ml PSW do szklanego pojemnika na 2 filiżanki, aby zebrać pozostały Stentor.
6. Utrzymuj zdrowe kultury w szklanych pojemnikach na 2 filiżanki.
   1. Podawaj kultury Stentor 2 ml przygotowanych Chlamydomonas na 100 ml kultury co 4 - 5 dni. Dodawaj PSW do szklanego pojemnika co 4 - 5 dni, aby utrzymać gęstość Stentora na poziomie około 20 komórek/ml.
      Uwaga: 450 ml to maksymalna objętość, jaką mieści pojemnik na 2 filiżanki.
   2. Raz w tygodniu sprawdzaj kultury pod mikroskopem preparacyjnym 5X pod kątem wrotków, grzybów i innych wzrostów. Aby przedłużyć zdrowie hodowli, usuń zanieczyszczające mikroorganizmy wraz z nieprawidłowo ukształtowanymi i bezbarwnymi komórkami Stentora za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
   3. Gdy szklany pojemnik jest wypełniony w około 90%, podziel kulturę.
      1. Dodaj 25 ml PSW do szklanego pojemnika. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml należy pipetować w górę i w dół, aby odłączyć Stentor od szklanki. Przenieś około 50% kultury do nowego szklanego pojemnika na 2 filiżanki.
      2. Dodać 25 ml PSW do obu kultur i kontynuować utrzymywanie obu kultur zgodnie z opisem w tej sekcji protokołu.
         Uwaga: Ponieważ komórki Stentor są wrażliwe na wysoką temperaturę, utrzymuj temperaturę 25 °C lub niższą w pomieszczeniu, w którym trzymane są kultury. Alternatywnie kultury można trzymać w inkubatorze. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów z hodowlą stentora.

2. Wywoływanie regeneracji poprzez cięcie komórek stentorowych

1. Za pomocą ściągacza igieł wykonaj kilka igieł z kapilar za pomocą programu w następujący sposób: ciepło - 735, ciągnięcie - 100, prędkość - 110, czas - 150, ciśnienie - 400.
2. Przygotować 4% roztwór metylocelulozy w 50 ml PSW.
   1. Dodać 1 g metylocelulozy (lepkość: 1500 cP) do 50 ml PSW.
   2. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 8 godzin, aby ułatwić rozpuszczenie metylocelulozy.
   3. Przechowywać 4% roztwór metylocelulozy w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj szklaną płytkę punktową do przechowywania fragmentów komórek po wykonaniu cięć.
   1. Filtruj pożywkę sterylizacyjną ze zdrowej kultury, potrzebne jest 500 ml na szklaną płytkę punktową.
   2. Przenieś 500 ml wysterylizowanej pożywki do każdej z potrzebnych studzienek.
4. Zbierz jeden zdrowy stentor (o określonym kształcie trąbki, żywym niebiesko-zielonym kolorze i bez dużych wakuoli) w kropli o pojemności 2 μl i umieść go na szkiełku nakrywkowym lub szkiełku podstawowym. Dodać 2 μl 4% metylocelulozy (Rysunek 2). Pozwól Stentorowi zwolnić przed cięciem (Wideo 2).
5. Szklaną igłę należy trzymać jak najbliżej powierzchni tnącej, aby zapobiec złamaniu igły.
6. Używając stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, zlokalizuj końcówkę szklanej igły i przesuń ją bliżej komórki (Rysunek 3A). Obserwuj skurcz stentora po kontakcie z igłą (Rysunek 3B i C).
   Uwaga: Jeśli komórka jest w orientacji, która utrudnia oddzielenie przedniego końca od tylnego końca, obróć go bardzo delikatnie bokiem igły.
7. Delikatnie naciśnij skurczony Stentor bokiem szklanej igły, aby przeciąć komórkę na dwie części (Rysunek 3D i E, Wideo 3). Odsuń dwa fragmenty od siebie, upewniając się, że nie ma między nimi połączenia cytoplazmatycznego, aby uniknąć fuzji fragmentów (ryc. 3F).
8. Sprawdź, czy oba fragmenty mają co najmniej jeden węzeł makrojądrowy każdy, badając fragmenty pod mikroskopem preparacyjnym przy ukośnym oświetleniu.
   Uwaga: Posiadanie co najmniej jednego węzła makrojądrowego jest niezbędne do przetrwania komórki. Komórka może zrzucić błonkę (przezroczystą powłokę) wraz z niebiesko-zielonym pigmentem podczas lub po cięciu. W większości przypadków nie wpłynie to na długoterminową żywotność komórki.
9. Przenieś fragmenty do studzienek szklanej płytki punktowej przygotowanej w kroku 2.3.
10. Wytnij wiele komórek, ponieważ część przeciętych komórek nie zregeneruje się.
11. Jeśli wykonujesz wiele cięć podczas jednej sesji, wymień szklaną igłę, gdy zostanie mocno pokryta pozostałościami Stentora lub gdy jej końcówka jest złamana. Alternatywnie, wyczyść igłę, delikatnie przecierając ją o kawałek silikonowej przekładki.
    Uwaga: Szklane igły mogą być używane do wielu sesji cięcia komórek.
12. Szklaną płytkę punktową z fragmentami komórek należy przechowywać w komorze wilgotnościowej.
13. Przejdź do sekcji 4 protokołu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obrazowania i interpretacji wyników regeneracji Stentora.

3. Wywoływanie regeneracji pasma błoniastego i aparatu ustnego przez leczenie sacharozą lub mocznikiem

1. Usuwanie pasma błoniastego i aparatu ustnego za pomocą sacharozy
   1. Przygotować 25% roztwór sacharozy w PSW.
   2. Dodać 500 μl 25% sacharozy w PSW do probówki do mikrowirówki z zatrzaskiem.
   3. Przygotować 3 probówki do mikrowirówek z zatrzaskami z 1 ml PSW w każdej probówce do przemycia komórek po podaniu sacharozy.
   4. Zbierz 30 - 60 komórek Stentor w 1 ml ich pożywki hodowlanej do oddzielnej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml (Rysunek 4, strzałka A).
   5. Zebrać wszystkie komórki z probówki w końcowej objętości 125 μl za pomocą pipety o pojemności 200 μl za jednym pobraniem. Przenieś je do probówki z 500 μl 25% sacharozy (przygotowanej w kroku 3.1.2), aby otrzymać 625 μl 20% roztworu sacharozy (Rysunek 4, strzałka B). Uruchom stoper.
   6. Inkubuj Stentor w tym 20% roztworze sacharozy i obracaj probówkę mikrowirówki w stojaku przez 1 minutę.
   7. Zbierz wszystkie komórki za jednym pobraniem (dostosuj pipetę do maksymalnej pojemności 200 μl, aby ułatwić pobieranie).
   8. Trzymaj komórki w końcówce pipety, aż stoper pokaże 2 minuty leczenia sacharozą.
   9. Wysuń Stentor do jednej z probówek do mikrowirówek przygotowanych w Kroku 3.1.3 (Rysunek 4, strzałka C). Zakręć rurką w stojaku.
   10. Umyj komórki jeszcze dwa razy, po jednym w każdej z dwóch pozostałych probówek mikrowirówek zawierających PSW przygotowanych w Kroku 3.1.3 (Rysunek 4, strzałki D i E).
       Uwaga: Technika zbierania pojedynczych komórek nie jest ważna między praniami.
   11. Przejdź do sekcji 4 protokołu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obrazowania i interpretacji dynamiki regeneracji stentora (Rysunek 4, strzałki F i G).
2. Usuwanie opaski błoniastej i aparatu doustnego za pomocą mocznika
   1. Przygotować roztwór 4% mocznika w PSW.
   2. Dodać 300 μl 4% mocznika w PSW do probówki mikrowirówki z zatrzaskiem.
   3. Przygotować 3 probówki do mikrowirówek z zatrzaskami zawierającymi 1 ml PSW w każdej probówce do przemycia komórek po leczeniu mocznikiem.
   4. Zbierz 30 - 60 komórek Stentor w 1 ml ich pożywki hodowlanej do oddzielnej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml (Rysunek 4, strzałka A).
   5. Zebrać wszystkie komórki z probówki w końcowej objętości 300 μl za pomocą pipety o pojemności 1 ml za jednym pobraniem. Przenieś je do probówki z 300 μl 4% mocznika (przygotowanego w kroku 3.2.2), aby uzyskać 600 μl 2% roztworu mocznika (Rysunek 4, strzałka B). Uruchom stoper.
   6. Inkubuj Stentor w tym 2% roztworze mocznika i obracaj probówkę mikrowirówki w stojaku przez 1 minutę.
   7. Zbierz wszystkie komórki w jednym losowaniu.
   8. Trzymaj komórki w końcówce pipety, aż stoper pokaże 2 minuty leczenia mocznikiem.
   9. Wysuń Stentor do jednej z probówek do mikrowirówek przygotowanych w kroku 3.2.3 (Rysunek 4, strzałka C). Zakręć rurką w stojaku.
   10. Umyj komórki jeszcze dwa razy, po jednym w każdej z dwóch pozostałych probówek do mikrowirówek zawierających PSW przygotowanych w Kroku 3.2.3 (Rysunek 4, strzałki D i E).
       Uwaga: Technika zbierania pojedynczych komórek nie jest ważna między praniami.
   11. Przejdź do sekcji 4 protokołu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obrazowania i interpretacji dynamiki regeneracji stentora (Rysunek 4, strzałki F i G).

4. Obrazowanie i analiza regeneracji komórek

1. Jeśli używasz mikroskopu pionowego, użyj metody wiszącej kropli, aby zobrazować regenerację pojedynczych komórek.
   1. Umieść 100 μl PSW w studzience szklanej płytki punktowej.
   2. Wyizolować 1 komórkę Stentor w 4 μl pożywki hodowlanej (pożywce, w której się znajdują), używając pipety o pojemności 10 lub 20 μl. Umieść kroplę w środku szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 x 22 mm⁽Rysunek 5).
      Uwaga: Jeśli komórki, które są 1) niezdrowe (o nieprawidłowym kształcie lub silnie wakuolizowane) lub 2) nadal mają pasma błoniaste lub aparaty doustne (do eksperymentów z leczeniem chemicznym), nie używaj ich do obrazowania.
   3. Ułóż 4 kolejne kropelki Stentora w pożywce hodowlanej wokół poprzedniej kropli, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między kropelkami.
   4. Odwróć szkiełko nakrywkowe za pomocą kropelek i delikatnie umieść je nad zagłębieniem szklanej płytki punktowej, do której dodano PSW w kroku 4.1.
   5. Uwaga: PSW w studni zminimalizuje parowanie kropelek (Rysunek 5).
   6. Przygotuj pozostałe komórki do obrazowania, wykonując kroki 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Zobrazuj regenerujące się komórki pod mikroskopem z żądaną rozdzielczością czasową. Alternatywnie, obserwuj regenerację za pomocą mikroskopu stereoskopowego do preparacji.
      Uwaga: Regeneracja rozpocznie się natychmiast po przecięciu komórek lub potraktowaniu sacharozą lub mocznikiem. Jednak widoczne nowe struktury jamy ustnej uformują się po około 3 godzinach od rozpoczęcia regeneracji.
2. Dla każdego punktu czasowego przypisz jeden z trzech etapów regeneracji do każdej z komórek. Aby to zrobić, porównaj każdą komórkę z reprezentatywnymi obrazami ilustrującymi etapy (Rysunek 4 i Rysunek 6).
   1. Przypisz etap 1 do komórek, które nie mają jeszcze pasma membranellar (Rysunek 6A).
   2. Przypisz etap 2 do komórek z pasmem membranellar.
      Uwaga: Pasma membranellar pojawia się 3 - 6 godzin po zabiegu ( Rysunek 4, Rysunek 6B). Na samym końcu tego etapu pojawi się dodatkowa krzywizna tylnego końca pasma błoniastego tuż przed pojawieniem się zawiązka jamy ustnej.
   3. Przypisz etap 3 komórkom z zawiązkiem jamy ustnej.
      Uwaga: Zawiązek jamy ustnej to wgłębienie pojawiające się 6 - 8 godzin po leczeniu na tylnym końcu pasma błoniastego (Ryc. 4, Figura 6C i 6D). Regeneracja jest zakończona, gdy komórki mają pasmo błoniaste na przednim końcu i charakterystyczny kształt komórki trąbki (Ryc. 4, Ryc. 6E). Większość komórek Stentora jest w pełni zregenerowana w ciągu 8-9 godzin od rozpoczęcia regeneracji.
3. Wykreśl procent komórek w każdym z etapów regeneracji dla każdego punktu czasowego w postaci ułożonego wykresu pudełkowego (Rysunek 7).
   Uwaga: Ten typ wykresu umożliwia wizualizację dynamiki regeneracji w populacji komórek.

Wyniki

Stentor kultury zostały w sposób wiarygodny ustanowione i utrzymane z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek zgodnie z Sekcją 1 protokołu. Reprezentatywny przykład dużej, zdrowej kultury pokazano w Video 1.

Przebieg czasowy regeneracji zmierzono u Stentor, stosując metodę indukcji regeneracji za pomocą sacharozy opisaną w kroku 3.1, w połączeniu z metodą obrazowania i analizy omówioną w sekcji 4 (Rycina 7). Wykres ten wskazuje, że czas potrzebny populacji komórek na osiągnięcie dowolnego konkretnego etapu rozciąga się w przedziale jednej godziny. Ten rodzaj analizy pozwala na badanie heterogeniczności czasowej procesu regeneracji w populacji regenerujących się komórek.

Poniżej przedstawiono podsumowanie czasu regeneracji zaobserwowanego do tej pory po kilkudziesięciu zabiegach z użyciem sacharozy (Rycina 4 i Rycina 6). Etap 1 następuje, gdy komórki Stentor przypominają krople łez i nie posiadają pasma membranellarnego (etap ten rozpoczyna się bezpośrednio po wypłukaniu sacharozy). Etap ten trwa od 3 do 6 h. Etap 2 to moment, w którym pojawia się i rozwija pasmo membranellarne (3–6 h po zabiegu z sacharozą). Etap ten trwa od 3 do 4 h. Etap 3 polega na pojawieniu się primordium oralnego na tylnym końcu pasma membranellarnego (6–8 h po zabiegu z sacharozą), a następnie przesunięciu obu struktur w stronę przedniego końca komórki. Etap ten trwa od 1 do 2 h. Moment, w którym zarówno pasmo membranellarne, jak i aparat oralny dotarły do przedniego końca komórki, oznaczał zakończenie regeneracji. Komórka przybrała charakterystyczny dla Stentor kształt przypominający trąbkę. Komórki uległy całkowitej regeneracji 8–9 h po zabiegu z sacharozą.

Rysunek 1. Zdjęcie Stentor. Pas błonowy oraz aparat gębowy widoczne są na przednim końcu komórki. Dysk przylepny znajduje się na tylnym końcu komórki. Makronukleus Stentor jest guzkowaty. Dobrze odżywiony Stentor posiada zielone wakuole pokarmowe zawierające głównie Chlamydomonas. Pasek skali wynosi 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ustawienie do cięcia Stentor. Cięcie komórki wykonuje się poprzez ręczne manipulowanie szklaną igłą podczas obserwacji komórki przy użyciu dostępnego komercyjnie mikroskopu stereoskopowego. Ręcznik papierowy służy do zapewnienia białego tła w celu lepszej widoczności komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Klatki z filmu 3 ilustrujące sposób przecinania Stentor za pomocą szklanej igły. (A) Stentor bezpośrednio przed dotknięciem go igłą. (B) Stentor delikatnie ściśnięty między igłą a szkiełkiem przedmiotowym. (C) Skurczony Stentor reagujący na nacisk igły. (D) Stentor w trakcie przecinania poprzez delikatny nacisk boku igły na komórkę. (E) Stentor przecięty na dwie części, lecz jeszcze nie rozdzielony. (F) Dwa fragmenty Stentor. Pasek skali wynosi 0.25 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Schematyczna wizualizacja sekcji 3 i 4 protokołu. Jest to zilustrowany protokół przeprowadzania zabiegu sacharozą lub mocznikiem oraz obserwacji regeneracji komórek. Czas wskazany w dolnym panelu mierzony jest od rozpoczęcia etapu Wash 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 5. Układ do obrazowania i/lub bezpośredniej obserwacji regeneracji za pomocą mikroskopu pionowego. W każdej 4 µL kropli zwisającej ze szkiełka nakrywnego znajduje się jedna komórka ulegająca regeneracji. Woda w dołkach szklanej płytki ogranicza parowanie kropel. Układ ten umożliwia równoległe śledzenie regeneracji wielu komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 6. Zdjęcia Stentor w każdym stadium regeneracji pasma membranellarnego i aparatu gębowego. (A) Stadium 1 charakteryzuje się kształtem komórki przypominającym łzę oraz brakiem pasma membranellarnego. (B) Stadium 2 charakteryzuje się pojawieniem się pasma membranellarnego, struktury rzęskowej, która uderza w sposób ciągły. Pasma membranellarne są zaznaczone białymi przerywanymi liniami na panelach B - D. (C i D) Stadium 3 charakteryzuje się pojawieniem się primordium gębowego (zaznaczonego strzałką). Primordium gębowe wygląda jak invaginacja na tylnym końcu pasma membranellarnego. Primordium gębowe przesuwa się następnie ku przedniej części komórki, aby przekształcić się w aparat gębowy. (E) Regeneracja kończy się, gdy komórka przyjmuje charakterystyczny dla Stentor kształt trąbki, a aparat gębowy (zaznaczony strzałką) rozszerza się na przednim końcu komórki. Pasek skali wynosi 0.25 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7. Skumulowany wykres pudełkowy pokazujący, jak zmieniają się w czasie proporcje komórek we wszystkich etapach regeneracji po traktowaniu sacharozą. Wykres obrazuje heterogeniczność czasową etapów regeneracji w populacji regenerujących się komórek. "Reg. end" oznacza zakończenie regeneracji. Liczba komórek: 28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film 1. Przykład zdrowej kultury Stentor. Zazwyczaj, gdy kultura jest tak zagęszczona, zaleca się jej rozdzielenie. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Film 2. Spowalnianie Stentor za pomocą metylocelulozy. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Film 3. Cięcie Stentor. Poszczególne komórki można ręcznie podzielić na kilka części pod stereo-mikroskopem sekcyjnym, przebijając komórkę szklaną igłą. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Problem z kulturą	Możliwe rozwiązanie	Możliwa profilaktyka
Kultura jest zdominowana przez wrotki lub inne duże organizmy.	Przenieść jak najwięcej Stentor do nowej szalki hodowlanej. Następnie trzykrotnie wyprać komórki.	Dokładnie wyprać Stentor po otrzymaniu, nawet jeśli zostały zakupione od komercyjnego dostawcy.
Kultura jest zdominowana przez grzyby lub inne małe organizmy.	Zidentyfikować obszar, w którym znajduje się najmniej Stentor. W tym obszarze usunąć jak najwięcej medium, starając się nie usunąć wielu Stentor, i dolać nowe PSW. Wymieszać delikatnie, ale dokładnie, aby rozproszyć organizmy inwazyjne. Pominąć następne karmienie, a Stentor zjadą zanieczyszczenia.	Regularnie obserwować kulturę i usuwać małe zanieczyszczenia poprzez wymianę medium na świeże PSW.
Stentor nakładają się na siebie.	Rozdzielić kulturę tak, aby stężenie wynosiło mniej niż 20 cells/mL.	Częściej rozdzielać kultury.
Komórki Stentor koją się.	Karmić co 4 dni zamiast co 5 dni.
Kultura zawiera dużo ciemnego materiału odpadowego.	Usunąć jak najwięcej ciemnego materiału (odchodów Stentor), nie usuwając komórek. Jeśli Stentor są przytwierdzone do ciemnego materiału, pipetować w górę i w dół, aby uwolnić komórki Stentor z ich odchodów, a następnie usunąć medium wraz z odpadami, nie usuwając komórek. Alternatywnie usunąć te Stentor i odpowiednio zmniejszyć ilość podawanego pokarmu.	Podawać Stentor o 1 mL mniej pokarmu na każde 100 mL kultury.
Niewłaściwy wygląd Stentor (uwakuolowane/opuchnięte lub zaokrąglone).	Usunąć jak najwięcej medium, starając się nie usunąć wielu komórek Stentor, i dodać nowe PSW.	Regularnie wymieniać medium.

Tabela 1. Przewodnik rozwiązywania problemów przy hodowli Stentor.

Dyskusja

Hodowla Stentora wiąże się z wieloma wyzwaniami. Po pierwsze, aby przeprowadzić eksperymenty, które wymagają dużej liczby komórek, należy utrzymać dużą liczbę kultur Stentora , ponieważ kultury stają się niezdrowe, gdy stężenie Stentora przekracza 20 komórek / ml. Po drugie, organizmy, które mogą zanieczyścić kultury Stentora , często dzielą się szybciej niż Stentor i przytłaczają kulturę (częstym zanieczyszczeniem są wrotki). Dlatego konieczne jest okresowe sprawdzanie kultury pod mikroskopem i usuwanie zanieczyszczeń. Czasami konieczne jest rozpoczęcie nowej hodowli z niewielkiej liczby komórek uratowanych ręcznie z zanieczyszczonej hodowli. Wydłuża to czas potrzebny do utrzymania zdrowych kultur Stentora . Po trzecie, rozszerzenie pojedynczej komórki do hodowli o objętości 400 ml wymaga co najmniej jednego miesiąca, ponieważ cykl komórkowy Stentor trwa 3 - 5 dni. Po czwarte, w przeciwieństwie do innych orzęsków modelowych, Stentor rzadko przechodzi w postać torbieli i nie można ich zamrozić.

Ważnym aspektem hodowli Stentora jest dobór odpowiedniego organizmu pokarmowego. Wcześniej opisano różne metody hodowli Stentora . Jeden z nich sugeruje użycie odtłuszczonego mleka do hodowli bakterii, które następnie karmią Stentora. Taka technika jest skuteczna w hodowli Stentora; Jednak zastosowanie technik genomicznych wymaga czystych próbek, aby uniknąć nieporozumień wynikających z odczytów genomowych z nieokreślonych organizmów pokarmowych. Korzystając z obecnego protokołu, Stentor może być hodowany masowo, a ponieważ ich pokarm, Chlamydomonas, został zsekwencjonowany, obecność zanieczyszczenia genomowego przez organizm pokarmowy może być wykryta i kontrolowana. Z niewiadomych przyczyn Tatar musiał uzupełnić swoje zapasy, wracając do miejsca, w którym wcześniej zastał Stentora . Dzięki obecnemu protokołowi jesteśmy w stanie zatrzymać Stentor od lat.

Eksperymenty z regeneracją z użyciem Stentora są na ogół proste, ale należy pamiętać o kilku kluczowych szczegółach. Jeśli chodzi o sekcję 2, przecięcie komórek Stentora na pół można opanować w ciągu kilku minut. Opanowanie bardziej zaawansowanych procedur mikrochirurgicznych preparatu Stentor może wymagać tygodnia praktyki. Podczas wykonywania zabiegu sacharozy lub mocznika (sekcja 3), jeśli na początku obrazowania większość komórek nadal ma prążki membranellar, należy wydłużyć czas inkubacji o 10 - 30 s, aby można było przeprowadzić następne leczenie sacharozą. Nie należy wydłużać czasu leczenia sacharozą powyżej 3 minut inkubacji, ponieważ spowoduje to śmierć komórki.

Obrazowanie regeneracji stentora wymaga metod obrazowania dużych komórek przez długi czas. Metoda obrazowania opisana w rozdziale 4 może być stosowana wyłącznie przy użyciu mikroskopu pionowego. Jeśli zamiast tego dostępny jest mikroskop odwrócony, komórki można umieścić na szkiełku podstawowym lub nakrywkowym w małych komorach. Jedną z metod jest stworzenie komory z wazeliny i przykrycie innym szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec parowaniu. Alternatywnie, komorę na pojedynczą komórkę można wykonać poprzez wykonanie otworu z dziurkaczem o pożądanej wielkości w kwadracie 1 x 1 cm² z silikonowej przekładki (Tabela Materiałów), umieszczenie przekładki na szkiełku nakrywkowym, umieszczenie komórek w komorze i przykrycie komory kolejnym szkiełkiem nakrywkowym. Podczas obrazowania, jeśli Stentor nie jest w odpowiedniej orientacji, aby zaobserwować charakterystyczne cechy każdego etapu regeneracji, mocno postukaj w płytkę, aby komórka się skurczyła. Obserwuj, jak ogniwo się rozciąga, aby określić etap regeneracji (pełne wyprostowanie trwa około 45 s). Jeśli komórka nadal znajduje się w złej orientacji, powtórz stukanie. Obrazy pokazane na rys. 1 i ryc. 6 zostały wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego z zoomem; jednak wszystkie szczegółowe eksperymenty można przeprowadzić przy użyciu mikroskopu stereoskopowego 5X.

Kolejnym wyzwaniem, oprócz hodowli i obrazowania Stentora , jest śledzenie regeneracji, a konkretnie czasu potrzebnego do zidentyfikowania etapów. Jeśli komórka regenerująca jest idealnie zorientowana, a obszar zawiązka jamy ustnej jest wyraźnie widoczny, identyfikacja etapu zajmuje kilka sekund. Czasami jednak komórka Stentor znajduje się w orientacji uniemożliwiającej wyraźne przypisanie etapu regeneracji, co zajmuje więcej czasu na identyfikację. Znaczna ilość czasu potrzebna do etapowania poszczególnych regenerujących się komórek może opóźnić kwantyfikację wszystkich regenerujących się komórek, zmniejszając w ten sposób czasową precyzję etapowania i wymagając od obserwatora oczekiwania i ponownego zobrazowania komórki po tym, jak przejdzie do nowej orientacji. W związku z tym eksperyment ten jest zarówno czasochłonny, jak i pracochłonny. Z tych powodów wysoce pożądane byłoby opracowanie zautomatyzowanych metod wykrywania komórek Stentora i przypisywania etapów regeneracji w danych z mikroskopii wideo. Pozwoliłoby to również na bardziej powtarzalne eksperymenty, zwiększenie wielkości próby i usunięcie ludzkich uprzedzeń.

Pojawienie się wysoce czułych metod genomicznych i proteomicznych zaczęło otwierać badania nad pojedynczymi komórkami. W przypadku takich analiz jednokomórkowych gigantyczny rozmiar komórki Stentora sprawia, że jest ona pożądanym obiektem testowym dla eksperymentów potwierdzających słuszność koncepcji. Aby takie eksperymenty były możliwe, hodowla Stentora ma fundamentalne znaczenie, a zatem opisane tutaj metody powinny odegrać rolę w dalszym rozwoju bardziej zaawansowanych technik jednokomórkowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stentor coeruleus żywa kultura	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii na agarze	Carolina Biological Supply	152040
Pasteryzowana woda źródlana, butelka	1 litr Carolina Biological Supply	132458
Metyloceluloza, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Szklana płytka punktowa Pyrex	Fisher Scientific	13748B
Szklany słoik z szerokim otworem i zakrętką, 60 ml	Carolina Biological Supply	715740
Szklany pojemnik na 2 filiżanki ze szklaną pokrywką	Pyrex	1095600
Materiał arkusza silikonowego CultureWell	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Rurka do mikrowirówek Posi-Click 1,7 ml	Denville	C2170
Szkło osłonowe	Fisher finest	12-548-B
TAP Pożywka wzrostowa, zoptymalizowana pod kątem hodowli Chlamydomonas	ThermoFisher	A1379801
Silikonowa przekładka, arkusz silikonowy CultureWell, grubość 0,25 mm / 13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Wazelina, wazelina, białe	widmo	P1037
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, długość: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Ściągacz igieł P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 mikroskop stereoskopowy	Zeiss
Axiozoom V16, stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowy	Zeiss