Method Article

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej metody jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych pobranych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Zidentyfikowaliśmy pięć etapów w przepływie pracy, które są kluczowe dla uzyskania izolatów RNA ze zwojów jelitowych o wystarczająco wysokiej jakości i ilości dla sekwencjonowania RNA. Po pierwsze, podczas przygotowywania tkanki jelitowej, z każdej próbki należy usunąć cały nadmiar płynu przez osuszenie przed spłaszczeniem surowiczości tak bardzo, jak to możliwe, na dnie dużych form podstawowych. Próbki są następnie szybko zamrażane na zawiesinie suchego lodu i 2-metylobutanu. Po drugie, podczas cięcia tkanki ważne jest, aby ustawić krioformy tak, aby odcinki jelita przebiegały równolegle do pełnej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego, uzyskując w ten sposób największą powierzchnię zwojów jelitowych na szkiełko. Po trzecie, podczas LCM, szkiełka z membraną z polietylenu naftalanowego (PEN) oferują największą szybkość i elastyczność w zarysowywaniu niejednorodnych kształtów zwojów jelitowych podczas zbierania zwojów jelitowych. Po czwarte, w celu wyraźnej wizualizacji zwojów jelitowych w obrębie sekcji, barwniki kompatybilne z etanolem, takie jak fiolet kresylowy, zapewniają doskonałe zachowanie integralności RNA w stosunku do barwników wodnych. Wreszcie, w przypadku ekstrakcji RNA z przechwyconych zwojów, zaobserwowaliśmy różnice między komercyjnymi zestawami do ekstrakcji RNA, które dały lepszą ilość i jakość RNA, jednocześnie eliminując zanieczyszczenie DNA. Optymalizacja tych czynników w obecnym protokole znacznie przyspiesza przepływ pracy i pozwala uzyskać próbki zwojów jelitowych o wyjątkowej jakości i ilości RNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda ma na celu uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA zwojów jelitowych z ludzkiej tkanki jelitowej za pomocą laserowej mikrodysekcji (LCM). Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany w celu zapewnienia wystarczającej jakości RNA i wydajności do sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) i jest przeznaczony do stosowania ze świeżo wyciętą, nieutrwaloną, błyskawicznie zamrożoną ludzką tkanką jelitową.

Funkcjonalne zaburzenia żołądkowo-jelitowe i perystaltyka jelit dotykają co czwartej osoby w Stanach Zjednoczonych. Jelitowy układ nerwowy (ENS), określany również jako drugi brain1, jest często w centrum tych z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj protokoły zostały zatwierdzone przez Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB).

1. Przygotowanie przed przybyciem tkanki

  1. Uzyskanie odpowiedniej zgody IRB i koordynacja działań z agencjami zajmującymi się dawstwem narządów ludzkich w celu uzyskania świeżo wyciętej, nieutrwalonej tkanki jelitowej od dawców, którzy spełniają wszystkie kryteria badawcze wymagane do badania.
    Uwaga: Ten protokół można dostosować do użytku z myszami i innymi modelami gryzoni.
    1. Natychmiast po resekcji każdego segmentu jelita należy dokładnie przepłukać światło schłodzonym PBS lub pożywką do przechow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadziliśmy kilka ulepszeń do istniejących protokołów, które umożliwiają stosunkowo szybkie pobieranie zwojów jelitowych z próbek jelitowych człowieka za pomocą LCM, spełniając standardy dla RNA-Seq. Po pierwsze, zoptymalizowaliśmy szybkie zamrażanie segmentów tkanki jelitowej w dużych formach bazowych umieszczonych na powierzchni zawiesiny suchego lodu w 2-MB (Rysunek 1B). Najlepszy sukces podczas kriosekcji i następującego po niej LCM uzyskano pop.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura ta umożliwia efektywne zbieranie licznych zwojów jelitowych jako źródła do wyprowadzania RNA do sekwencjonowania RNA. W tym przypadku przyspieszyliśmy procesy opisane w istniejących protokołach, jednocześnie maksymalnie zachowując integralność RNA. Ponieważ wszystkie etapy tej procedury są współzależne, ważne jest, aby wszystkie problemy zostały wyeliminowane od początku badania i aby wszystkie próbki były przygotowane tak podobnie do siebie, jak to możliwe, w celu uzyskania wiarygodnego sekwencjonowania RNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni darczyńcom i ich rodzinom, dzięki którym ta praca była możliwa. Jesteśmy również wdzięczni za pomoc personelu Międzynarodowego Instytutu Medycyny i Tennessee Donor Services za pomoc w koordynacji pobierania tkanek wykorzystywanych w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 do EMS2 oraz wsparcie stypendialne z NIH T32-DK007673 dla AMZ. Jesteśmy wdzięczni pracownikom Vanderbilt Translational Pathology Shared Resource za dostęp do instrumentu LCM i porady dotyczące przygotowania tkanek. Wspólny zasób Vanderbilt Tissue Pathology jest częściowo wspierany przez granty NIH P30-CA068485-1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% Neutralnie buforowana formalinaSigmaHT501128-4L
2-metylobutanFisherO3551-4
3-mL strzykawkaBD309628
50-mL probówki stożkowe, polipropylen Corning05-526B
Formy bazowe 37x24x5mm, jednorazoweMikroskopia elektronowa 5025511
Belzer UW  Rozwiązanie chłodniczeBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCMCzapki Arcturus, ThermoFisherLCM0211
Folia przylegająca, Prasa" n Pieczęć     Zadowolony   Nie dotyczy;
Octan fioletu krezylowegoAcros OrganicsAC405760025
Deska do krojeniaMikroskopia elektronowa Sciences63308
Etanol, 190-proofPharmco-AAPER111000190
Szkiełka mikroskopoweFisher12-550-343
Rękawice z przedłużonym mankietemMicroflex 
Fartuchy chirurgiczno-jednorazoweKimberly-Clark 19-088-2116
Taca, 20 L (duża polipropylenowa miska sterylizacyjna)Nalgene   1335920B
Chusteczki Kimberly-Clark (duże)Kimberly-Clark 34120
Chusteczki Kimwipes (małe)Kimberly-Clark 34133
System mikrodysekcji laserowej (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Uchwyt wiertarski Leica Cryostat Chuck, duży,  40 mm Południowo-wschodnia Służba Instrumentów PatologicznychN.A. 
Mikroskop świetlnyOlympusCX43
Obiektyw mikroskopowy (20x)Olympus UPlanFl 20x/0,50, ∞/0,17N.A.
Obiektyw mikroskopowy (10x)Olympus UPlanFl 10x/0.25, ∞/-N.A. 
Sita molekularneAcros OrganicsAC197255000
Woda bez nukleazAmbionAM9937
Applied Biosystems12204-01
Tłuczek do peletówKimble Kontes4621973
membrana PEN Szkiełka LCMArcturus, ThermoFisherLCM022
Probówki bez RNaz, 1,5 mlAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
Zestaw do ekstrakcji RNA "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
Zestaw do ekstrakcji RNA "B" (RNeasy  Zestaw Micro)Qiagen74004
Metoda ekstrakcji RNA "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
"D" (zestaw RNeasy PLUS Mini)Qiagen74134
Splash Shield, jednorazowa osłona twarzyNożyczki Fisher17-310
, chirurgiczne, 14,5 cm "ostry-ostry"Narzędziado nauki o sztuce14002-14
Filtr strzykawkowy, octan celulozy (0,2 μ m)Nalgene   190-2520
Zamrażanie tkanek PodłożeDane ogólne Opieka zdrowotnaTFM-5
KsylenyFisherX3P1GAL
Etanol, 200-proof Pharmco-AAPER 111000200 19010144 Zestaw do ekstrakcji RNA Zestaw do ekstrakcji RNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionEnteric Ganglia IsolationHuman Intestinal TissueRNA Extraction OptimizationPEN Membrane SlidesCresyl Violet StainingCryostat SectioningMyenteric Plexus LocalizationTFM EmbeddingRNA Integrity Assessment

Related Articles