Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Streszczenie

Celem tej metody jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych pobranych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Zidentyfikowaliśmy pięć etapów w przepływie pracy, które są kluczowe dla uzyskania izolatów RNA ze zwojów jelitowych o wystarczająco wysokiej jakości i ilości dla sekwencjonowania RNA. Po pierwsze, podczas przygotowywania tkanki jelitowej, z każdej próbki należy usunąć cały nadmiar płynu przez osuszenie przed spłaszczeniem surowiczości tak bardzo, jak to możliwe, na dnie dużych form podstawowych. Próbki są następnie szybko zamrażane na zawiesinie suchego lodu i 2-metylobutanu. Po drugie, podczas cięcia tkanki ważne jest, aby ustawić krioformy tak, aby odcinki jelita przebiegały równolegle do pełnej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego, uzyskując w ten sposób największą powierzchnię zwojów jelitowych na szkiełko. Po trzecie, podczas LCM, szkiełka z membraną z polietylenu naftalanowego (PEN) oferują największą szybkość i elastyczność w zarysowywaniu niejednorodnych kształtów zwojów jelitowych podczas zbierania zwojów jelitowych. Po czwarte, w celu wyraźnej wizualizacji zwojów jelitowych w obrębie sekcji, barwniki kompatybilne z etanolem, takie jak fiolet kresylowy, zapewniają doskonałe zachowanie integralności RNA w stosunku do barwników wodnych. Wreszcie, w przypadku ekstrakcji RNA z przechwyconych zwojów, zaobserwowaliśmy różnice między komercyjnymi zestawami do ekstrakcji RNA, które dały lepszą ilość i jakość RNA, jednocześnie eliminując zanieczyszczenie DNA. Optymalizacja tych czynników w obecnym protokole znacznie przyspiesza przepływ pracy i pozwala uzyskać próbki zwojów jelitowych o wyjątkowej jakości i ilości RNA.

Wprowadzenie

Ta metoda ma na celu uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA zwojów jelitowych z ludzkiej tkanki jelitowej za pomocą laserowej mikrodysekcji (LCM). Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany w celu zapewnienia wystarczającej jakości RNA i wydajności do sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) i jest przeznaczony do stosowania ze świeżo wyciętą, nieutrwaloną, błyskawicznie zamrożoną ludzką tkanką jelitową.

Funkcjonalne zaburzenia żołądkowo-jelitowe i perystaltyka jelit dotykają co czwartej osoby w Stanach Zjednoczonych. Jelitowy układ nerwowy (ENS), określany również jako drugi brain¹, jest często w centrum tych zaburzeń, ponieważ odgrywa kluczową rolę w homeostazie i ruchliwości jelit. Manipulacja motoryką jelit była na ogół ograniczona do chirurgicznej resekcji tkanki zwojowej/niekurczliwej, przewlekłych modyfikacji diety i/lub leków. Co zaskakujące, pełna transkryptom dorosłego ENS pozostaje do zsekwencjonowania, co znacznie ogranicza naszą zdolność do identyfikacji cząsteczek w ENS, które mogą być ukierunkowane farmaceutycznie lub wykorzystane w terapiach komórkami macierzystymi.

Istnieje stosunkowo niewiele metod izolowania RNA z ludzkich zwojów jelitowych. Pierwsze podejście, dysocjacja komórek², wymaga wysokich temperatur inkubacji i długiego czasu inkubacji; oba są znane z tego, że sprzyjają degradacji RNA i zmieniają transkryptom^2,3. Alternatywne podejście, LCM, bardziej niezawodnie zachowuje transkryptom i chroni integralność RNA. Chociaż w kilku badaniach wykorzystano LCM do pobrania zwojów nerwowych ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki jelitowej^4,5,6, podejścia te były albo utrudnione przez słabą jakość i ilość RNA, albo były dość pracochłonne, albo wymagały modyfikacji technik barwienia lub ekstrakcji RNA, aby działały w naszych rękach. Inne protokoły LCM zaprojektowane do zachowania RNA, które zostały znalezione w instrukcjach produktów LCM, zapewniały dodatkowe ulepszenia^7,8, ale adaptacja była potrzebna w przypadku zastosowania do izolacji zwojów jelitowych^8,9. Z tych powodów opracowaliśmy zoptymalizowany protokół oparty na tych zasobach, który daje znaczne ilości RNA o wysokiej integralności z ludzkich zwojów jelitowych, ma stosunkowo szybki przepływ pracy i daje spójne wyniki w dużej liczbie próbek.

W tym badaniu prezentujemy streszczenie zoptymalizowanych procedur, które ułatwiają izolację RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych pochodzących z wyciętej ludzkiej tkanki jelitowej. Nasza metoda obejmuje pięć ważnych aspektów. Po pierwsze, świeżo wycięte, nieutrwalone próbki jelita ludzkiego powinny zostać przycięte do odpowiedniego rozmiaru, nadmiar wilgoci usunięty za pomocą tkanki laboratoryjnej i spłaszczony w dużej formie podstawowej przed błyskawicznym zamrożeniem na zawiesinie suchego lodu i 2-metylobutanu (2-MB). Po drugie, wycinki histologiczne jelita powinny być przygotowane tak, aby uzyskać pełną płaszczyznę splotu mięśniowo-jelitowego na szkiełku, które oferuje dużą ładowność zwojów jelitowych. Powodzenie na tym etapie zależy w dużej mierze od procesu przygotowania tkanki. Po trzecie, niejednorodna struktura zwojów w ENS wymaga zastosowania szkiełek membranowych z polietylenu z naftalanu (PEN) ⁶, które oferują największą szybkość i precyzję podczas procesu LCM. Po czwarte, barwniki kompatybilne z etanolem, takie jak fiolet krezylowy, powinny być stosowane w celu zachowania integralności RNA podczas barwienia zwojów jelitowych. Wreszcie, proces ekstrakcji RNA ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku z RNA-Seq. Poszukiwaliśmy podejścia do ekstrakcji RNA, które zapewnia wysoką integralność RNA, maksymalizuje wydajność RNA przy rozpoczynaniu od małych zbiorów zwojów jelitowych, eliminuje zanieczyszczenie DNA i zachowuje jak najwięcej gatunków RNA.

Podsumowując, optymalizacja tych czynników w obecnym badaniu znacznie przyspiesza przepływ pracy i daje próbki zwojów jelitowych o wyjątkowej ilości i jakości RNA. Wyniki były w dużej mierze spójne w sporej grupie próbek, co wskazuje na spójność tego podejścia. Co więcej, wykorzystaliśmy te podejścia do pomyślnego zsekwencjonowania dziesiątek próbek RNA ze zwojów jelitowych. Przedstawione tutaj strategie można również szeroko zaadaptować do wykonywania LCM pożądanych zwojów lub jąder obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego oraz innych przypadków wymagających izolacji wysokiej jakości RNA.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj protokoły zostały zatwierdzone przez Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB).

1. Przygotowanie przed przybyciem tkanki

1. Uzyskanie odpowiedniej zgody IRB i koordynacja działań z agencjami zajmującymi się dawstwem narządów ludzkich w celu uzyskania świeżo wyciętej, nieutrwalonej tkanki jelitowej od dawców, którzy spełniają wszystkie kryteria badawcze wymagane do badania.
   Uwaga: Ten protokół można dostosować do użytku z myszami i innymi modelami gryzoni.
   1. Natychmiast po resekcji każdego segmentu jelita należy dokładnie przepłukać światło schłodzonym PBS lub pożywką do przechowywania tkanek, aby usunąć resztki materiału świetlnego lub kału.
   2. Po wypłukaniu i wyrzuceniu odpadów do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne, należy zanurzyć tkankę w wystarczającej objętości podłoża do przechowywania tkanek (takiej jak 3-5 razy większa objętość tkanki jelitowej) i przechowywać w indywidualnie oznakowanych, wodoszczelnych pojemnikach z tworzywa sztucznego, zanurzonych w lodzie lub schłodzonych do czasu użycia).
   3. Przetwarzaj tkankę w ciągu 18-26 godzin od momentu pobrania, aby zapobiec znacznej degradacji RNA.
      Uwaga: W zależności od czystości odcinka jelitowego i przechowywania, możliwe jest przedłużenie sugerowanego przez nas limitu czasu.
2. Należy wcześniej przygotować wszystkie materiały potrzebne do pobrania tkanek ludzkich, jak wskazano w niniejszym protokole (bardziej szczegółowe informacje o produkcie znajdują się w Tabeli Materiałów). Upewnij się, że wszystkie wymagane środki ochrony osobistej są noszone przez cały czas.
3. Przygotuj wiadra z suchym lodem wraz z zawiesiną suchego lodu, jak pokazano na Rysunek 1.
   1. Zmiażdż tyle suchego lodu, aby wypełnić 4 standardowe okrągłe wiadra na lód i jedno prostokątne wiadro na lód. W jednym ze standardowych wiader powinny znajdować się małe (11 x 21 cm) chusteczki laboratoryjne umieszczone na powierzchni suchego lodu. Jeśli to możliwe, użyj nowych, nieotwartych pudełek z tkankami laboratoryjnymi.
   2. Przygotuj zawiesinę suchego lodu, sproszkowając 2 litry suchego lodu w czystym prostokątnym wiaderku na lód.
   3. Dodaj wstępnie schłodzone 2 MB do powierzchni suchego lodu. Lekko wymieszaj i spłaszcz gnojowicę za pomocą pokrywy pojemnika na końcówkę do pipet, aby ukształtować powierzchnię gnojowicy w kanał otoczony większymi kawałkami suchego lodu wzdłuż boków prostokątnego wiadra.
   4. Umieść kilka cienkich bloków suchego lodu wzdłuż krawędzi wiadra z lodem, aby zachęcić do szybszego zamrażania. W danym momencie powinno być miejsce na foremki bazowe ≥4, które będą luźno pasować do wiadra na gnojowicę z suchego lodu.
      1. Opcjonalnie ułóż wiaderko na lód w innym prostokątnym wiaderku na lód wypełnionym w 1/4 suchym lodem. Takie ustawienie pomaga lepiej zaizolować zawiesinę suchego lodu i zapobiega konieczności częstego dostosowywania suchego lodu i 2 MB podczas zabiegu.
   5. Umieść wiadra z suchym lodem na linii montażowej w następującej kolejności: 1) wiadro na gnojowicę z suchym lodem, 2) wiadro na suchy lód laboratoryjne, 3 i 4) normalne wiadro na suchy lód, 5) prostokątne wiadro na suchy lód (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie zamrożonej tkanki jelitowej człowieka

Uwaga: Cały ten proces może trwać od 45 do 80 minut na odcinek jelita, w zależności od jakości tkanki jelitowej. Zalecamy również pobranie próbek kontroli jakości w celu oceny jakości RNA i histologii przed przystąpieniem do LCM.

1. Napełnij dużą tacę mokrym lodem i umieść chirurgiczne deski do krojenia na suchym lodzie.
2. W tej konfiguracji schłodzić zlewki o pojemności 500 ml i 100 ml do przechowywania tkanki i przyciętych segmentów w roztworze chłodniczym. Wstępnie schłodzić formy bazowe na deskach do krojenia, aby były gotowe na przyjęcie tkanki.
3. Po otrzymaniu świeżej tkanki jelitowej należy odlać pożywkę, w której tkanka jest transportowana, i zatrzymać ją w wstępnie schłodzonych zlewkach. Zostaw trochę miejsca w tych zlewkach na tymczasowe przechowywanie tkanki jelitowej i przyciętych segmentów, które zostaną przygotowane w kolejnych krokach.
4. Przyciąć odcinek jelita na długość około 20 cm, co zapewnia wystarczającą ilość tkanki (40-60 cm²) do wytworzenia RNA do dalszych zastosowań i próbek kontroli jakości. W zależności od integralności tkanki, możliwe może być wykonanie izolacji RNA do dalszego przetwarzania o znacznie mniejszej długości (tj. 5 cm jelita).
5. Odetnij tkankę tłuszczową i łączną z jelita za pomocą nożyczek chirurgicznych. Zalegająca tkanka tłuszczowa wzdłuż błony surowiczej jelita upośledza zdolność do pełnego spłaszczenia tkanki w kolejnych etapach. Ostrożnie przyciąć tkankę, aby uniknąć nacięcia błony surowiczej podczas usuwania tłuszczu i tkanki łącznej, co może strukturalnie uszkodzić splot mięśniowo-jelitowy lub spowodować nierównomierne spłaszczenie zewnętrznej części tkanki do cięcia.
6. Wykonać podłużne nacięcie na całej długości próbki jelitowej, najlepiej w miejscu przyczepu krezkowego.
7. Wypreparuj i wyrzuć tenia coli z jelita grubego, aby łatwiej się spłaszczyło po uwolnieniu od napięcia.
8. Rozłóż błonę śluzową jelita stroną do dołu na schłodzonej desce do krojenia i wytnij paski o szerokości 1,25 cm z całej długości tkanki.
   Uwaga: Tkanka jelitowa często rozszerza się po przycięciu, dlatego ten rozmiar należy odpowiednio dostosować.
9. Tymczasowo przechowywać paski w schłodzonym roztworze do przechowywania tkanek.
   UWAGA: Używamy rozwiązania chłodniczego Belzer UW, ponieważ ma ono długi okres przydatności do spożycia, jest stosunkowo opłacalne i może być przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będzie potrzebne.
10. Wyjmij pasek chusteczki higienicznej z roztworu chłodniczego i pokrój go na segmenty o długości ~1,5-2 cm.
11. Szybko osusz segmenty jelita na stosie chusteczek laboratoryjnych, aby usunąć nadmiar płynu i zapobiec tworzeniu się kryształków lodu wzdłuż surowicy jelitowej podczas błyskawicznego zamrażania. Jeśli tkanka nie zostanie wystarczająco wysuszona, trudno będzie uzyskać wysokiej jakości wycinki ze splotu mięśniowo-jelitowego.
12. Połóż osuszone kawałki jelita błoną śluzową do góry na wstępnie schłodzonej, dużej, jednorazowej plastikowej formie (37 mm x 24 mm x 5 mm).
13. Ostrożnie spłaszcz każdy segment, lekko rozciągając tkankę na powierzchni formy bazowej i używając zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie docisnąć i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą być uwięzione pod błoną surowiczą. Zauważ, że tkanka rozszerza się podczas spłaszczania. W razie potrzeby przytnij segmenty i pokrój pozostałe próbki w mniejszym rozmiarze.
    nuta: Jeśli tkanka jest nadmiernie rozciągnięta, spowoduje to zniekształcenie splotu mięśniowo-jelitowego. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza należy ocenić grubość próbki przed zamrożeniem. W razie potrzeby wepchnij krawędzie próbki do środka, aż próbka jelitowa zbliży się do swojej pierwotnej grubości.
14. Umieść załadowaną formę bazową na powierzchni suchego lodu, zawiesiny o pojemności 2 MB. Tkanka powinna całkowicie zamarznąć w ciągu 30-60 s, w zależności od wielkości i grubości odcinka jelitowego.
15. Wysuszyć spód formy podstawowej, aby usunąć resztki 2 MB, szybko pocierając formę bazową o chusteczki laboratoryjne wstępnie schłodzone w drugim wiadrze z suchym lodem.
16. Przenieść wysuszoną próbkę do trzeciego pojemnika z suchym lodem i zakopać ją pod powierzchnią suchego lodu, aż będzie gotowa do owinięcia.
17. Szybko obserwuj spód formy bazowej przed owijaniem, aby sprawdzić jakość przygotowania próbki. Zwróć uwagę na wszelkie próbki, które nie wydają się płaskie lub mają duże pęcherzyki powietrza, ponieważ należy ich unikać podczas kriosekcji i LCM.
18. Zawiń próbkę we wstępnie oznakowaną folię aluminiową, którą układa się na suchym lodzie w wiadrze, tak aby doszło do owinięcia tkanki, gdy jest ona całkowicie zamrożona.
19. Owinąć próbkę warstwą folii plastikowej, aby zminimalizować odwodnienie tkanek podczas przechowywania w temperaturze -80 °C.
20. Próbki należy przechowywać w prostokątnym wiadrze do czasu, aż będą gotowe do przeniesienia do zamrażarki.
21. Wstępnie oznaczone i wstępnie schładzone zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu natychmiastowego przechowywania próbek po pobraniu.
22. Pobrać niewielką porcję tkanki z każdego segmentu jelita w celu oceny integralności RNA przed przeprowadzeniem LCM.
    1. Wstępnie oznacz probówkę wolną od RNaz o pojemności 2 ml dla każdego segmentu, wypełnioną ≥500 μl buforu do lizy. Zalecamy użycie zestawu do ekstrakcji RNA "D", wymienionego w Tabeli Materiałów.
    2. Homogenizuj mały (2 mm x 2 mm) fragment jelita w standardowym mikrohomogenizatorze tkankowym (20-40 s, aż nie pozostaną żadne kawałki tkanki). Następnie należy natychmiast zamrozić lizat RNA na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przystąpienia do ekstrakcji RNA.
    3. Opcjonalnie należy osadzić niektóre skrawki w pożywce do zamrażania tkanek (TFM) jako kopię zapasową. Przygotuj skrawki tkanek dokładnie w taki sam sposób, jak opisano w tym rozdziale, ale zanurz próbki w TFM w formie bazowej przed błyskawicznym zamrożeniem.

3. Kriosekcja

1. Przed kriosekcją należy przygotować wszystkie wymagane materiały do barwienia i odwodnienia, a następnie przenieść żądane próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze -80 °C do wiadra z suchym lodem.
2. Przygotuj kriostat do użycia, ustawiając optymalną temperaturę cięcia (od -18 do -22 °C) i przecierając powierzchnie 100% etanolem oraz traktując ostrze i tackę szczotki roztworem do odkażania RNazy.
3. Aby jak najlepiej przykleić próbkę do uchwytu, zastosuj następujące podejście.
   1. Umieść kleszcze w suchym lodzie na co najmniej 30 sekund przed odpakowaniem próbki jelitowej i umieszczeniem jej na powierzchni suchego lodu surowiczą stroną do góry.
   2. Wlej 3-5 mm kopczyk pożywki do zamrażania tkanek (TFM) na duży uchwyt próbki kriostatu i natychmiast przenieś próbkę jelita surowiczą stroną do góry na TFM.
   3. Szybko przenieś uchwyt próbki do suchego lodu i przykryj sproszkowanym suchym lodem po pozostawieniu TFM do przylegania do próbki przez 2-5 s w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że TFM pozostaje poniżej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zewnętrzna powierzchnia błony śluzowej jelit w pełni przylegała do TFM, zanim TFM zacznie zamarzać bez rozmrażania próbki.
4. Zamontuj uchwyt próbki w głowicy próbki kriostatu i wyrównaj próbkę z ostrzem kriostatu tak, aby płaszczyzna splotu mięśniowo-jelitowego była równoległa do ostrza tnącego.
5. Ustawić grubość przekroju na kriostacie na 8 μm. Celem idealnego wyrównania próbki jest uzyskanie jak największej powierzchni splotu mięśniowo-jelitowego na każdym szkiełku. Ta grubość jest ogólnie zalecana zarówno dla tkanek ludzkich, jak i gryzoni, ale w razie potrzeby można ją dostosować.
6. Przekrój przez mięsień surowiczy i mięsień podłużny aż do dotarcia do splotu mięśniowo-jelitowego.
   1. Aby zlokalizować splot mięśniowo-jelitowy, zamontuj fragment próbki na szkiełku i zabarwić go barwnikiem wodnym, takim jak 1% fiolet kresylowy lub błękit toluidynowy itp.
   2. Obejrzyj przekrój pod mikroskopem świetlnym w powiększeniu 40-2000X, aby zidentyfikować połączenie między podłużnymi i kolisty warstwami mięśni. Parametry mikroskopu podane są w Tabeli Materiałów. Na początku sekcji surowiczość będzie zaznaczona obecnością tkanki łącznej. Część pozostałego tłuszczu krezkowego może być również obecna wzdłuż błony surowiczej. Następnie zaczyna się arkusz zewnętrznej podłużnej warstwy mięśniowej. Po osiągnięciu granicy między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni obserwuje się część zwojów jelitowych.
      UWAGA: W kilku następnych sekcjach splot mięśniowo-jelitowy stanie się bardzo widoczny, z dużymi połaciami zwojów obecnych w jednej sekcji (Rysunek 2C). Jeśli tkanka nie jest całkowicie płaska na początku cięcia, to tylko część zwojów będzie obecna w każdym odcinku w danym momencie. Czasami próbka jelitowa może mieć z natury nierówny splot mięśniowo-jelitowy, mimo że tkanka wydaje się idealnie płaska. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku próbek dwunastnicy. Z naszego doświadczenia wynika, że przetwarzanie tych próbek za pomocą LCM może zająć znacznie więcej czasu, ale wystarczającą ilość RNA można zebrać w ciągu jednego dnia. Dokładna lokalizacja splotu mięśniowo-jelitowego może się znacznie różnić między próbkami, w zależności od tkanki i jej przygotowania przed zamrożeniem.
7. Rozpocznij zbieranie odcinków szeregowych dla LCM, z optymalnymi kolekcjami zapewniającymi największą liczbę neuronów i gleju na szkiełko. W zależności od pola powierzchni próbki, wiele sekcji można połączyć na jednym szkiełku membranowym PEN.
8. Zamontuj sekcje na szkiełkach membranowych PEN, krótko schłodzone w kriostacie przez 5-10 s. Podczas montażu tkanka powinna stopić się tylko nieznacznie, maksymalnie zachowując integralność RNA.

4. Barwienie

Uwaga: Aby zapoznać się z przeglądem procesu barwienia, patrz Tabela 1. Wszystkie stosowane roztwory są przygotowywane w standardowych stożkowych fiolkach o pojemności 50 ml. Wydaje się, że traktowanie zewnętrznej części probówek roztworem do odkażania RNazy nie poprawia wyników (dane nie pokazane).

1. Przygotować nasycony roztwór 4% fioletu krezylowego w 95% etanolu co najmniej jeden dzień wcześniej i całkowicie zawiesić fiolet krezylowy przed załadowaniem strzykawki.
   Uwaga: Może być konieczne obniżenie stężenia etanolu w celu skutecznego barwienia, zgodnie z opisem w sekcji dyskusji. Nie testowaliśmy, czy użycie 50% czy 75% etanolu podczas barwienia znacząco zmniejsza integralność RNA. Fiolet krezylowy jest wrażliwy na światło, dlatego należy go chronić przed światłem.
2. Po zamontowaniu odcinków splotu mięśniowo-jelitowego na szkiełku, natychmiast zanurz szkiełko w stożkowej fiolce z 95% etanolem (wstępnie schłodzonej w temperaturze -20 °C) na 30 s.
   1. Jeśli sekcje nie przylegały całkowicie do szkiełka w poprzednim kroku, lekko ogrzej spód szkiełka ręką w rękawiczce (chusteczkę laboratoryjną należy umieścić między szkiełkiem a rękawicą), aby uzyskać pełne przyleganie przed zanurzeniem w 95% etanolu. Roztwór ten można ponownie wykorzystać do co najmniej 3-6 szkiełek bez zmniejszania integralności RNA.
3. Połóż szkiełko stroną zadrukowaną do góry na chusteczce laboratoryjnej umieszczonej na wstępnie przetworzonym, wolnym od RNaz pojemniku⁸.
4. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml 4% fioletem krezylowym i podłącz filtr strzykawkowy 0,2 μm.
   nuta: Polecamy filtry z octanu celulozy.
5. Nałóż 6-10 kropli barwnika bezpośrednio na skrawki tkanki⁸ i inkubuj przez 10-30 s lub do momentu, gdy po odbarwieniu zachowa się wystarczająca ilość barwnika. Podczas barwienia delikatnie obróć ręcznie pojemnik szkiełkowy, aby upewnić się, że skrawki tkanki są równomiernie pokryte plamą.
6. Odlej plamę i natychmiast usuń plamę z szkiełka w fiolce zawierającej 75% etanol. Kilkakrotnie zanurzaj szkiełko, aż nadmiar barwnika w większości wycieknie z próbki. Może to potrwać od 10 do 20 sekund.
7. Zakończ odbarwianie, wielokrotnie zanurzając próbkę w fiolce z 95% etanolem na 10 sekund. Zanurzaj próbkę wielokrotnie, aż cały nadmiar plamy zostanie usunięty.
   1. W razie potrzeby zmodyfikuj czas odbarwiania, aby zoptymalizować barwienie zwojów. Jeśli usunięta zostanie zbyt duża ilość plamy, próbka staje się zbyt przezroczysta i może być trudna do wizualizacji
      UWAGA: Ten protokół barwienia został zoptymalizowany w oparciu o kilka publikacji^5,8,10,11, które wymagały modyfikacji przed uzyskaniem zadowalających wyników. Dlatego stężenie etanolu stosowanego w barwniku i podczas procesu odbarwiania powinno być modyfikowane, w razie potrzeby, aby uzyskać optymalny wynik.

5. Odwodnienie

1. Natychmiast zanurz szkiełko w 100% etanolu 2-3 razy, w sumie przez 10-20 sekund.
2. Zanurz zjeżdżalnię w bezwodnym 100% etanolu na co najmniej 30 s. Ponieważ bezwodny etanol jest bardzo higroskopijny, przed rozpoczęciem procedury dodać sita molekularne (8-12 oczek) do fiolki ze 100% etanolem, aby usunąć wchłoniętą wodę, a tym samym całkowicie odwodnić próbkę⁵.
3. Kilkakrotnie zanurz szkiełko w ksylenie na 15-20 s. Ten krok całkowicie usuwa warstwę etanolu ze szkiełka. Dodaj sita molekularne z wyprzedzeniem do probówek z ksylenem, aby w pełni zaadsorbować nadmiar etanolu i cząsteczek wody⁵.
   UWAGA: Ksyleny są klasyfikowane jako drażniące dla oczu i górnych dróg oddechowych i powinny być stosowane w dygestoriach chemicznych.
4. Zanurzyć szkiełko w ksylenie (z sitami molekularnymi, 8-12 oczek) na co najmniej 10 minut.
   nuta: Po tym kroku można zrobić krótką przerwę, jeśli zajdzie taka potrzeba. Próbki można pozostawić w ksylenie na 4-5 godzin bez szkodliwego wpływu na barwienie, LCM lub wydajność/integralność RNA.
5. Opcjonalnie w tym miejscu przygotuj indywidualnie kilka dodatkowych preparatów. W przypadku przygotowania drugiej rundy preparatów po wykonaniu LCM na wszystkich przygotowanych szkiełkach, tkanka w kriostacie może wymagać ponownego pokrycia z powodu odwodnienia powierzchni tkanki. Może być konieczne wyrzucenie od jednej do czterech sekcji, zanim będzie można zebrać nadające się do użytku sekcje.

6. Mikrodysekcja laserowa (LCM)

1. Wyjmij szkiełko z ksylenu i wysusz je na powietrzu w dygestoriach chemicznych przez co najmniej 1 minutę. Włóż wkład z nasadkami LCM do stolika mikroskopu LCM. Załaduj slajd na stół montażowy i uzyskaj obraz ogólny slajdu.
2. Zidentyfikuj żądane miejsce dla LCM i załaduj nasadkę na szkiełko.
3. Ustaw laser na podczerwień (IR) i dostosuj jego moc i czas trwania, aby uzyskać plamkę o średnicy 20-30 μm.
4. Zlokalizuj laser ultrafioletowy (UV) i ustaw odpowiednią prędkość i intensywność cięcia.
5. Nakreśl żądane zwoje nerwowe, które mają zostać pobrane za pomocą oprogramowania LCM, upewniając się, że pozostajesz w granicach obszaru zbiorczego na nasadce (przedstawionego na slajdzie view oprogramowania jako zielone kółko).
6. W każdej ze ścieżek wyreguluj punkty IR tak, aby co najmniej jeden punkt IR pojawiał się co 100-500 μm.
7. Naciśnij przycisk odcięcia IR/UV, aby kontynuować zbieranie wszystkich zaznaczonych zwojów.
8. Po zakończeniu pobierania przenieś nasadkę w nowe miejsce i powtórz proces zbierania lub sprawdź nasadkę LCM w stacji kontroli jakości, gdy nasadka zostanie wystarczająco wypełniona zwojami (lub do momentu osiągnięcia zalecanego limitu czasu 60-80 minut).
9. Jeśli na nasadce znajdują się zanieczyszczenia, wytrzyj je za pomocą pędzla z cienką końcówką, który został wstępnie potraktowany roztworem odkażającym RNazy, spłukany wodą wolną od nukleaz i całkowicie wysuszony.
10. Dokładnie zbadaj nasadkę na oko lub w powiększeniu pod mikroskopem jasnego pola, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczenia zostały usunięte. Jeśli zanieczyszczeń nie można usunąć za pomocą wstępnie obrobionego pędzla, użyj cienkiej końcówki pipety (bez RNaz), aby zeskrobać zanieczyszczenia.
11. Przymocuj nakrętkę do probówki do mikrofugi o pojemności 0,5 ml wypełnionej 230 μl buforu do lizy RNA (bufor RLT z zestawu do ekstrakcji RNA "B", z dodatkiem β-merkaptoetanolu w stężeniu 10 μl/ml).
12. Odwróć nakrętkę, krótko wiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
13. Wirować w temperaturze ≥ 5 000 x g przez 5 minut, a następnie przenieść probówkę do mikrofuge do suchego lodu.
    Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Lizaty RNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C bez istotnego wpływu na degradację RNA przez co najmniej 1 tydzień. Jeśli izolacja RNA zostanie przeprowadzona tego samego dnia, próbki należy schłodzić na lodzie, aż będą gotowe do ekstrakcji.
14. Wszystkie dodatkowe pobrania należy wykonać w zalecanym maksymalnym limicie czasu 80-90 minut po wyjęciu szkiełka z ksylenu. Ponieważ odwodnione sekcje są wystawione na działanie wilgoci otoczenia, RNazy mogą stopniowo ulegać reaktywacji. Ograniczenie okresu pobierania może zminimalizować takie skutki i maksymalnie zachować integralność RNA.

7. Izolacja RNA

1. Przygotuj stację roboczą wolną od RNaz do ekstrakcji RNA.
2. Przygotuj wszystkie probówki i odczynniki zgodnie z instrukcją zestawu do ekstrakcji RNA.
   Uwaga: Chociaż dostępnych jest wiele zestawów do izolacji RNA po LCM, największe sukcesy odnieśliśmy przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA "B", wymienionego na liście materiałów. Zobacz Rysunek 5 dla porównania odczynników do ekstrakcji RNA.
3. Wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Natychmiast wirować rozmrożone próbki przez 2-3 sekundy, aby równomiernie rozprowadzić sole tiocyjanianu guanidyny.
5. Połączyć każdą próbkę z równą objętością 70% etanolu. Połączyć 2 lub więcej lizatów razem, jeśli to konieczne, aby osiągnąć wystarczające stężenie RNA.
6. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zawartymi w instrukcji procesu ekstrakcji RNA, korzystając z protokołu zoptymalizowanego dla próbek poddanych mikropreparacji.
7. Na ostatnim etapie eluować RNA do minimalnej zalecanej objętości wody wolnej od nukleaz (14 μl).
8. Po izolacji RNA należy podsycić 1-2 μl RNA z każdej próbki do nowej, wstępnie znakowanej probówki wolnej od RNaz w celu oceny jakości/kontroli jakości za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które może wizualizować małe ilości RNA, takiego jak bioanalizator. Porcję dodatkowego 1 μl należy umieścić w osobnej probówce w celu oceny ilościowej za pomocą zestawu do kwantyfikacji RNA o wysokiej czułości.
   1. Dostosuj te kroki, w razie potrzeby, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do dalszej analizy (tj. Połącz większą liczbę czapek LCM przed ekstrakcją RNA).
9. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu zebrania wystarczającej ilości próbek do dalszej analizy.

Wyniki

Wprowadziliśmy kilka ulepszeń do istniejących protokołów, które umożliwiają stosunkowo szybkie pobieranie zwojów jelitowych z próbek jelitowych człowieka za pomocą LCM, spełniając standardy dla RNA-Seq. Po pierwsze, zoptymalizowaliśmy szybkie zamrażanie segmentów tkanki jelitowej w dużych formach bazowych umieszczonych na powierzchni zawiesiny suchego lodu w 2-MB (Rysunek 1B). Najlepszy sukces podczas kriosekcji i następującego po niej LCM uzyskano pop...

Dyskusja

Procedura ta umożliwia efektywne zbieranie licznych zwojów jelitowych jako źródła do wyprowadzania RNA do sekwencjonowania RNA. W tym przypadku przyspieszyliśmy procesy opisane w istniejących protokołach, jednocześnie maksymalnie zachowując integralność RNA. Ponieważ wszystkie etapy tej procedury są współzależne, ważne jest, aby wszystkie problemy zostały wyeliminowane od początku badania i aby wszystkie próbki były przygotowane tak podobnie do siebie, jak to możliwe, w celu uzyskania wiarygodnego sekwencjonowania RNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% Neutralnie buforowana formalina	Sigma	HT501128-4L
2-metylobutan	Fisher	O3551-4
3-mL strzykawka	BD	309628
50-mL probówki stożkowe, polipropylen	Corning	05-526B
Formy bazowe 37x24x5mm, jednorazowe	Mikroskopia elektronowa 5025511
Belzer UW  Rozwiązanie chłodnicze	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM	Czapki Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Folia przylegająca, Prasa" n Pieczęć	Zadowolony	Nie dotyczy;
Octan fioletu krezylowego	Acros Organics	AC405760025
Deska do krojenia	Mikroskopia elektronowa Sciences	63308
Etanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Szkiełka mikroskopowe	Fisher	12-550-343
Rękawice z przedłużonym mankietem	Microflex
Fartuchy chirurgiczno-jednorazowe	Kimberly-Clark	19-088-2116
Taca, 20 L (duża polipropylenowa miska sterylizacyjna)	Nalgene	1335920B
Chusteczki Kimberly-Clark (duże)	Kimberly-Clark	34120
Chusteczki Kimwipes (małe)	Kimberly-Clark	34133
System mikrodysekcji laserowej (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Uchwyt wiertarski Leica Cryostat Chuck, duży,  40 mm	Południowo-wschodnia Służba Instrumentów Patologicznych	N.A.
Mikroskop świetlny	Olympus	CX43
Obiektyw mikroskopowy (20x)	Olympus UPlanFl 20x/0,50, ∞/0,17	N.A.
Obiektyw mikroskopowy (10x)	Olympus UPlanFl 10x/0.25, ∞/-	N.A.
Sita molekularne	Acros Organics	AC197255000
Woda bez nukleaz	Ambion	AM9937
	Applied Biosystems	12204-01
Tłuczek do peletów	Kimble Kontes	4621973
membrana PEN Szkiełka LCM	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Probówki bez RNaz, 1,5 ml	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
Zestaw do ekstrakcji RNA "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Zestaw do ekstrakcji RNA "B" (RNeasy  Zestaw Micro)	Qiagen	74004
Metoda ekstrakcji RNA "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
"D" (zestaw RNeasy PLUS Mini)	Qiagen	74134
Splash Shield, jednorazowa osłona twarzy	Nożyczki Fisher	17-310
, chirurgiczne, 14,5 cm "ostry-ostry"	Narzędzia	do nauki o sztuce14002-14
Filtr strzykawkowy, octan celulozy (0,2 μ m)	Nalgene	190-2520
Zamrażanie tkanek Podłoże	Dane ogólne Opieka zdrowotna	TFM-5
Ksyleny	Fisher	X3P1GAL