Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły hemodynamiczne doświadczane przez serce wpływają na rozwój serca, szczególnie na trabekulację, która tworzy sieć rozgałęziających się wyrostków z mięśnia sercowego. Wady genetyczne programu w kaskadzie sygnalizacyjnej Notch są zaangażowane w wady komór, takie jak kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory lub zespół hipoplazji lewego serca. Korzystając z tego protokołu, można określić, że trabekulacja sterowana naprężeniem ścinającym i sygnalizacja Notch są ze sobą powiązane. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi możliwa była wizualizacja rozwijającego się serca danio pręgowanego. W niniejszej pracy oceniono, czy siły hemodynamiczne modulują inicjację trabekulacji poprzez sygnalizację Notch, a tym samym zachodzi wpływ funkcji kurczliwości. W celu jakościowej i ilościowej analizy naprężeń ścinających uzyskano obrazy 4D (3-D + czas) podczas morfogenezy serca danio pręgowanego, a zintegrowana mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego z synchronizacją 4D uchwyciła ruch komór. Lepkość krwi została zmniejszona poprzez mikroiniekcję GATA1a-morfolinooligonukleotydów (MO) w celu zmniejszenia naprężeń ścinających, a tym samym regulacji w dół sygnalizacji Notch i tłumienia trabekulacji. Jednoczesne wstrzyknięcie mRNA Nrg1 z gata1a MO uratowało geny związane z Notch, aby przywrócić trabekulację. Aby potwierdzić, że sygnalizacja Notch napędzana naprężeniem ścinającym wpływa na trabekulację, skurcz kardiomiocytów został dodatkowo zatrzymany przez tnnt2a-MO w celu zmniejszenia sił hemodynamicznych, a tym samym obniżenia docelowych genów Notch w celu rozwoju niebelekulatowanego mięśnia sercowego. Wreszcie, potwierdzenie wzorców ekspresji genów Notch reagujących na stres ścinający przeprowadzono poprzez poddanie komórek śródbłonka przepływowi pulsacyjnemu. W ten sposób mikroskopia świetlna 4D ujawniła siły hemodynamiczne leżące u podstaw sygnalizacji Notch i trabekulacji, co ma znaczenie kliniczne dla kardiomiopatii bez zagęszczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenia ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W odpowiedzi na hemodynamiczne siły ścinające, grzbiety i rowki mięśnia sercowego rozwijają się w falistej sieci beleczkowej zgodnie z kierunkiem naprężenia ścinającego w poprzek zastawki przedsionkowo-komorowej (AV)1. Trabekulacja serca jest niezbędna do zwiększenia funkcji skurczowej i masy mięśnia sercowego2. Mutacje w szlakach sygnałowych Notch powodują wrodzone wady serca u ludzi i innych kręgowców3. Na przykład wykazano, że gata1a4 i tnnt2a5 oligonukleotydy morfolino (MO) zmniejszają erytropoezę, podczas gdy mRNA erytropoetyny (EPO)6 i Isoproterenol (ISO)7 zwiększają odpowiednio czerwone krwinki i częstość akcji serca, a tym samym naprężenie ścinające ścianę (WSS). Co więcej, sygnalizacja ErbB2, za Notch, promuje proliferację i różnicowanie kardiomiocytów w celu wytworzenia siły skurczowej, która z kolei aktywuje sygnalizację Notch8,9. Sugeruje się, że naprężenie ścinające rządzi trabekulacją sterowaną sygnalizacją Notch dla rozwoju komór. Obecnie istnieje wiele badań, które próbują lepiej zrozumieć zdarzenia związane z programowaniem genetycznym prowadzące do wrodzonych wad serca (CHD)10,11,12, ale bardzo niewiele z nich bada, jak siły mechaniczne wpływają na formujące się serce.

Aby zbadać siły mechaniczne działające na wsierdzie, należy przeprowadzić ścisłą obserwację w okresie rozwoju. Jednak uzyskanie dobrej jakości obrazów próbek in vivo jest trudne ze względu na nieodłączność tradycyjnej mikroskopii13. Aby zaobserwować rozwój w czasie w próbce, konieczne jest zatem fizyczne przecięcie i barwienie13,14,15. Chociaż mikroskopia konfokalna jest szeroko stosowana do obrazowania trójwymiarowej struktury próbek14,16, akwizycja tych systemów obrazowania jest nadal ograniczona przez niskie prędkości skanowania.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym (LSFM) to unikalna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację dynamicznych zdarzeń in vivo przy dużej odległości roboczej13. Technika ta wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem świetlnym do optycznego przekroju próbki17. Ze względu na oświetlenie tylko cienkiego arkusza światła na próbce, następuje zmniejszenie fotowybielania i fototoksyczności13,18. Duże pole widzenia i duża odległość robocza pozwalają na to, aby duże próbki pozostały nienaruszone podczas ich obrazowania13,14,17. Małe powiększenie pozwala na obrazowanie większego obszaru, podczas gdy duża odległość robocza pozwala na obrazowanie grubszych próbek bez uszczerbku dla stosunku sygnału do szumu. Wiele grup używało LSFM do obrazowania całych embrionów17, brains14,18, muscle and hearts19 wśród innych tkanek, pokazując różne rodzaje próbek, które można obrazować.

Chociaż poprzednie badania wykazały zmniejszenie hemodynamicznej siły ścinającej poprzez zasłanianie ścieżek dopływu lub odpływu serca danio pręgowanego, informacje są wyłącznie jakościowe. Powoduje to nieprawidłową trzecią komorę, zmniejszone zapętlenie serca i upośledzone tworzenie zastawek20. Obrazy 4D LSFM dają nową perspektywę na sposób, w jaki hemodynamiczne siły ścinające wpływają na rozwój tkanki serca. Te siły mechaniczne mogą aktywować wrażliwe na siłę cząsteczki sygnałowe i indukować tworzenie grzbietów beleczkowych. Ze względu na dodatkowy aspekt czasowy obrazowania 4D, można śledzić zmiany w rozwoju w czasie rzeczywistym, co może prowadzić do nowych odkryć, które wcześniej pozostały niezauważone. Danio pręgowany jest idealnym modelem do obrazowania, ponieważ naukowcy mogą obserwować całe zwierzę kręgowe, a nie tylko interakcje komórka-komórka. Tlen może również dyfundować przez cały zarodek, co pozwala na rozwój bez zależności od układu naczyniowego, w przeciwieństwie do rozwoju ssaków. Mimo że serce danio pręgowanego nie ma narządów płucnych, które wymagają czterokomorowego serca, istnieje duża liczba genów sercowych, które są zachowane między danio pręgowanym a ludźmi21.

W tym manuskrypcie opisujemy, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza do obrazowania rozwijających się beleczek w sercach danio pręgowanego w różnych okolicznościach. Po pierwsze, w celu obniżenia lepkości krwi, a tym samym WSS, użyto wstrzyknięcia gata1a4 lub tnnt2a5 MO. Następnie zarejestrowano morfologię serca. W osobnej grupie ryb zwiększyliśmy WSS, podając mRNAEPO="xref">6 lub isoproterenol7 i obserwowaliśmy wyniki. Przeprowadziliśmy również badanie komórek o różnych natężeniach przepływu pulsacyjnego lub oscylacyjnego. Po zobrazowaniu każdej grupy stwierdziliśmy, że WSS wyczuwany przez wsierdzie za pośrednictwem sygnalizacji Notch inicjuje trabekulację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące metody zostały wykonane zgodnie z protokołami UTA i UCLA IACUC. Te grupy eksperymentalne stosowano z transgenicznymi Tg (cmlc2: gfp), mutantami wea (słabe przedsionki) lub clo (cloche): (a) kontrola typu dzikiego (WT), (b) gata1a MO i (c) tnnt2a MO (Tabela 1).

powiedział:
modelnazwaZmodyfikowane genyFenotypodniesienie
kontrolaTyp dzikiżadenN/a
Tg(cmlc2:gfp)Łańcuch lekki miozyny sercowej Zielona fluorescencja specyficznie wyrażona w mięśniu sercowymRozdział 34
Zmniejszone naprężenie ścinające ścianęSłaby mutant przedsionka (wea)Łańcuch nasilenia miozyny specyficzny dla przedsionkaPrzedsionek nie może się skurczyć, zwarta komora, gruba ściana mięśnia sercowego, wąskie światło, wybierany przedsionek, 37
Mutant Cloche (clo)N/aCałkowite usunięcie wsierdzia, nienaturalnie duży przedsionek z małą komorą, nieistniejące guzy sercaRozdział 41
gata1a MOgata1a powiedział: Niedokrwistość z powodu braku czerwonych krwinek4
tnnt2a MOTNNT2A powiedział:39 Rozdział 39
Zwiększone naprężenie ścinające ścianęmRNA EPOżadenCiężka czerwienica, zwiększenie liczby krążących krwinek, zwiększenie lepkości6
IzoprotenerolżadenZwiększona częstość akcji serca7

Tabela 1: Opisy danio pręgowanego. Definicje i opisy danio pręgowanego wykorzystywanego w doświadczeniach.

1. Konfiguracja badania

  1. Przygotuj mRNA Nrg1 i EPO do ratowania trabekulacji.
    1. Uzyskaj ludzkie cDNA Nrg1 i amplifikuj z plazmidu dawcy.
      nuta: Ludzkie cDNA Nrg1 zostało podarowane przez Williama Talbota z Uniwersytetu Stanforda.
      1. Wyjąć niezbędne odczynniki i materiały, a mianowicie PCR mastermix (przechowywany w temperaturze -20 °C), startery (patrz tabela 2) (przechowywany w temperaturze -20 °C), płytkę PCR (przechowywaną w temperaturze pokojowej) i pipetę o pojemności 20 μl (przechowywaną w temperaturze pokojowej). Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się na przykład z produktami.
        figure-protocol-1
        Tabela 2: Startery do klonowania ludzkiego Nrg1.
      2. Przygotować mastermix dla każdego zestawu starterów w trzech egzemplarzach za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Na 1 zestaw trzech prób użyj 37,5 μl mastermixu, 3 μl wody wolnej od DNA, 4,5 μl podkładu. Aby uzyskać więcej próbek, po prostu pomnóż przez liczbę próbek.
      3. Rozcieńczyć roztwór roboczy ludzkiego cDNA Nrg1 (stężenie 20 ng/μg) w pasku startera wodą wolną od DNA, tak aby na próbkę przypadało łącznie 10 μl na studzienkę.
        nuta: Upewnij się, że każdy roztwór w kroku 1.1.1 jest równomiernie rozłożony. W tym celu należy wymieszać każdy roztwór, pipetując w górę i w dół. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, należy używać jednej końcówki pipety tylko do jednej próbki.
      4. Porcję cDNA Nrg1 za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 10 μl należy podać do żądanych dołków na płytce PCR.
      5. Dodać 14,5 μl mastermixu do cDNA w studzienkach. Nałóż lepką pokrywę na płytkę PCR, aby uszczelnić dołki i umieść w maszynie do PCR.
      6. Uruchom maszynę do PCR i upewnij się, że cykl osiąga odpowiednie temperatury zgodnie z użytymi enzymami i starterami.
    2. Sklonuj cDNA Nrg1 do plazmidu pCS2+ w miejscach BamHI i EcoRI przy użyciu nadmiaru enzymów BamHI i EcoRI, aby zapewnić ligację cDNA we wszystkich plazmidach.
      1. Wymieszaj cDNA Nrg1 z plazmidem dawcy pCS2+, dostępnym w handlu roztworem mieszanki głównej i starterami (Tabela 2).
        nuta: Całkowita objętość reakcji powinna wynosić 50 μl z 25 μl mieszanki wzorcowej, 3 μl starterów i 1 μl 20 ng/μl plazmidu dawcy z cDNA Nrg1.
      2. Umieść mieszaninę z kroku 1.1.2.1 w maszynie do PCR i ustaw parametry tak, aby spełniały następujące specyfikacje: 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 5 s i 72 °C przez 5 s/kb.
      3. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować produkt do 50 μl buforu elucyjnego.
      4. Oczyszczony produkt PCR i 5 μg pCS2+ należy roztrawić oddzielnie za pomocą BamHI i EcoRI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w objętości reakcyjnej 200 μl. Oczyść powstałe trawienie za pomocą dostępnego zestawu i eluuj odpowiednio 20 μl i 100 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Zligować 4 μl cDNA Nrg1 i 2 μl strawionego plazmidu pCS2+ w reakcji 25 μl z 1 μl katalizatora ligazy w temperaturze 16 °C przez noc.
        nuta: Procedurę można przerwać w tym miejscu w celu inkubacji przez noc.
      6. Użyć 2 μl roztworu do ligacji z kroku 1.1.2.5 i przekształcić w 50 μl komórek bakterii E. coli nadających się do klonowania (patrz tabela materiałów).
    3. Potwierdź, że transformacja miała miejsce, przeprowadzając badania przesiewowe klonów cDNA Nrg1 za pomocą PCR. Wybierz losowo klony i dodaj do roztworu określonych starterów, polimerazy i trifosforanów dezoksyrybonukleotydowych (dNTP).
      nuta: Kontrolą był wektor (pCS2+) z wkładką i bez niej (ludzkie cDNA). Nie wybieraj zbyt dużej kolonii, ponieważ nadmiar bakterii może hamować PCR.
      1. Wybierz 8 kolonii z transformacji i przesiewaj klony pCS2+-Nrg1 za pomocą starterów PCR z tabeli 2.
      2. Hoduj jeden klon z cDNA Nrg1 w celu wyizolowania plazmidowego DNA pCS2+-Nrg1. Zaszczepić 100 μl bakterii E. coli plazmidem pCS2+-Nrg1 w 100 ml pożywki LB i wyhodować przez wytrząsanie (160 - 225 RPM) w temperaturze 37 °C.
    4. Transfekcyjnie oczyszczony plazmid pCS2+-Nrg1 do komórek HEK-293 w 6-dołkowej płytce przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. 24 godziny po transfekcji poddać komórki lizie za pomocą buforu do lizy i przepuścić przez żel SDS-PAGE, przenieść do membrany żelowej, a następnie wybarwić przeciwciałem anty-Nrg122. Sprawdź ekspresję białka Nrg1 za pomocą Western Blot.
      nuta: Kontrolą jest pusty plazmid pCS2+. Można go tutaj wstrzymać, jeśli transfer membrany żelowej następuje w nocy.
    6. Zsyntetyzuj mRNA Nrg1 przy użyciu komercyjnego produktu podobnego do tego w Tabeli Materiałów i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Pobrać 5 μl DNA pCS2+-Nrg1 z wyizolowanej kultury bakterii i trawić za pomocą NotI w reakcji 200 μl przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu linearyzacji plazmidu.
      2. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą komercyjnego zestawu i eluuj w 20 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Przeprowadzić transkrypcję in vitro za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA w reakcji 20 μl przy użyciu 5 μl zlinearyzowanego plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta.
      4. Dodać transkrybowany in vitro Nrg1 do 350 μl buforu do lizy RNA, a następnie oczyścić za pomocą zestawu do izolacji RNA. Eluować RNA do 60 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Zmierzyć stężenie RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    7. Wykonaj kroki 1.1.6.1 - 1.1.6.5 powyżej, aby uzyskać przygotowanie cDNA EPO i mRNA, ale zamiast tego sklonuj cDNA do plazmidu pCS2+ w miejscach EcoRI i XhoI.
  2. Wstrzyknij Morpholino danio pręgowanemu
    1. Design23 MO iniekuje za pomocą narzędzia online (Tabela materiałów) przeciwko sekwencji ATG gata1a4 (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) i tnnt2a5 (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Dodaj gata1a i tnnt2a MO oddzielnie do wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 8 ng/nL i 4 ng/nL. Powtórzyć z mRNA EPO o końcowym stężeniu 20 pg/nL. Upewnij się, że ostateczna objętość wynosi 1 ml.
    3. Wstrzyknąć 1 nL z 8 ng/nL gata1a MO i 1 nL z 4 ng/nL tnnt2a MO do oddzielnych zarodków danio pręgowanego na etapie od 1 do 4 komórek, aby zmniejszyć naprężenie ścinające ścianę komory (WSS)24. Aby zwiększyć WSS, wstrzyknij 1 nL 20 pg/nL mRNAEPO class="xref">6 do zarodków danio pręgowanego na etapie od 1 do 4 komórek.
  3. Poddaj się chemicznej obróbce danio pręgowanego, aby zahamować trabekulację
    1. Za pomocą pipety o pojemności 20 ml rozcieńczyć 10 mg/ml AG1478 w 1% DMSO w pożywce E3 do końcowego stężenia 5 μM przy 30 hpf do probówki o pojemności 15 ml. Jako kontrolę, traktuj każdą rybę tylko 1% DMSO.
    2. Dodaj N-[N-(3,5-difluorofenaktyl)-L-alanylo]-S-fenyloglicyny ester t-butylowy (DAPT) w 1% pożywce DMSO (100 μM) do E3 w probówce o pojemności 15 ml, aby zahamować sygnalizację Notch przy 40 hpf w podobny sposób. Jako kontrolę, traktuj tylko 1% DMSO.

2. Techniki obrazowania

  1. Obrazowanie 4D serca LSFM z algorytmem synchronizacji
    1. Wykonaj zdjęcia 2D całego zarodka ryby w wielu cyklach bicia serca, wykonując poniższe czynności (Rysunek 1). Upewnij się, że grubość lekkiego arkusza wynosi około 5 μm. Zrób 500 klatek x-y z czasem naświetlania 10 ms. Ustaw skanowanie z na 1 μm dla bezstratnego próbkowania cyfrowego zgodnie z zasadą próbkowania Nyquist25.
      1. Stwórz 1% (w/v) żel agarozowy, dodając 1 g agarozy do 100 ml i podgrzewając go, aż cała agaroza się rozpuści. Załaduj małą plastikową rurkę z zarodkiem i agarozą za pomocą pipety o pojemności 20 μl i zabezpiecz ją na stoliku.
      2. Otwórz oprogramowanie do przeglądania obrazów i kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić podgląd na żywo próbki. Wyreguluj obiektyw za pomocą pokrętła tak, aby sample był ostry. Podobnie przesuń stolik tak, aby podgląd na żywo próbki pokazywał górną część zarodka.
      3. Rób zdjęcia 500 razy przez 5 s przy 10-krotnym powiększeniu za pomocą oprogramowania mikroskopu26.
      4. Przesuń stolik za pomocą silnika na nową warstwę (1 μm w osi z) i powtórz procedurę obrazowania.
      5. Powtarzaj powyższe 2 kroki, aż całe serce zostanie w pełni zobrazowane.
    2. Zapewnij integralność danych, ignorując obrazy pierwszego i ostatniego cyklu pracy serca. Znajdź okres cyklu pracy serca, dopasowując obrazy, które zostały wykonane w tym samym punkcie czasowym cyklu pracy serca, ale w różnych okresach. Użyj następującego równania, które zostało opracowane, aby znaleźć okres:
      figure-protocol-2 (1)
      gdzie D jest funkcją kosztu używaną do dopasowania hipotezy okresu, Im przechwyconym obrazem, τ' czasem, w którym obraz został przechwycony, zk indeksem kierunku z obrazu, xm jest wektorem indeksu pikseli, a T' jest hipotezą okresową.
    3. Użyj poniższego równania, aby znaleźć względne przesunięcie między dwoma obrazami na podobnych etapach:
      figure-protocol-3 (2)
      gdzie Qk',k oznacza funkcję kosztu dla względnego przesunięcia, R jest możliwym sąsiedztwem przestrzennym, L jest całkowitym czasem przechwytywania obrazu, x jest indeksem pikseli, zk i zk' są pierwszym i drugim przekrojem kierunku z, t jest czasem, a s jest hipotezą względnego przesunięcia.
    4. Zamień przesunięcie względne na przesunięcie bezwzględne względem pierwszego obrazu i rozwiąż równanie liniowe przy użyciu podejścia pseudo-odwrotnego, aby znaleźć relację bezwzględną do wyrównania następnej sekcji obrazów, jak wcześniej opisano27.
    5. Końcowe obrazy 4D zostały przetworzone za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (Tabela materiałów).
      1. Układanie obrazów 2-W w 3-W
        1. Otwórz komercyjne oprogramowanie do przetwarzania obrazu.
        2. Kliknij Otwórz dane.
        3. Zaznacz wszystkie obrazy, które mają zostać ułożone w stos 3-W> Kliknij przycisk Załaduj.
        4. Dodaj rozmiar woksela 0,65 x 0,65 x 1 > Kliknij przycisk OK.
        5. Kliknij pole Widok wielopłaszczyznowy, aby zwizualizować obraz 3-W.
        6. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole slice_1.tiff > wybierz opcję Wyświetl > wybierz opcję Volren.
        7. Kliknij przycisk Edytuj > Wybierz opcje > wybierz opcję Edytuj mapę kolorów.
        8. Dostosuj kolor za pomocą pól zaznaczonych na czerwono > Kliknij przycisk OK.
      2. Konwersja 3-D do 4-D
        1. Kliknij "Plik> Otwórz dane szeregów czasowych.
        2. Wybierz pliki TIFF 3-W, które zostały właśnie utworzone > Kliknij przycisk Załaduj.
        3. Wprowadź ten sam rozmiar woksela co poprzednio.
        4. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole slice_1.tiff > wybierz "Wyświetl"> Wybierz Volren.
        5. Kliknij przycisk Edytuj > wybierz opcje > wybierz opcję Edytuj mapę kolorów. Dostosuj kolor za pomocą pól > Kliknij przycisk OK.
        6. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Formant szeregów czasowych > kliknij polecenie Movie maker > naciśnij przycisk Odtwórz, aby obejrzeć film.
        7. Dodaj nazwę pliku, rozmiar klatki, liczbę klatek na sekundę, jakość równą 1, wpisz Monoskopijny > Kliknij przycisk Zastosuj
        8. Wyeksportuj wideo. Otwórz film w odpowiednim oprogramowaniu.

3. analiza qRT-PCR

  1. Izolacja RNA serca danio pręgowanego w celu ilościowego określenia ligandów Notch, receptorów i ekspresji genów docelowych
    1. Złóż danio pręgowanego w ofierze, poddając go przedawkowaniu metylanu trikainy28,29. Korzystając z wcześniej opisanego protocol30, serca danio pręgowanego zostały wycięte i przygotowane do izolacji RNA.
    2. Wyizoluj całkowite RNA i zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Zaprojektuj startery PCR dla ligandów Notch Jag1, Jag2, Dll4, receptora Notch1b i genów związanych z sygnalizacją Nrg1 i ErbB2. W Tabeli 3 znajdują się użyte przez nas podkłady.
    4. Dodaj startery z kroku 3.1.3, wyizolowane mRNA z kroku 3.1.2 i komercyjną mieszankę główną do płytki PCR. Uruchom qRT-PCR w odpowiednich temperaturach i czasach zgodnie z użytymi enzymami. Znormalizuj wyniki do danio pręgowanego α-aktyna.
      nuta: Spowoduje to obliczenie poziomów ekspresji dla każdego z ligandów, receptorów i genów.

4. Eksperymenty in vitro z ludzkimi komórkami śródbłonka aorty (HAEC)

  1. Dynamiczny model naprężeń ścinających
    1. Hodowla komórek HAEC z pożywkami hodowlanymi HAEC. Po pełnym zlewaniu się należy wystawić komórki na przepływ laminarny i przepływ pulsacyjny 23 x 10-5 N z częstotliwością 1 Hz przez 24 godziny.
      1. Rozgrzej pożywkę EC/DMEM 10% FBS w łaźni wodnej przez 20 min.
      2. Pobrać komórki HAEC ze zbiornika z ciekłym azotem i umieścić fiolkę w łaźni wodnej do momentu stopienia.
      3. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl usuń rozmrożone komórki i umieść je w probówce o pojemności 15 ml z 3-5 ml pożywki. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 53 x g przez 3 minuty.
      4. Odessać roztwór i dodać tyle podłoża, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml. Dodać roztwór komórek do sterylnej kolby T75, zakryć kolbę i równomiernie rozprowadzić komórki na dnie płytki.
      5. Oznacz kolbę inicjałami, datą, typem komórki i numerem przejścia. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż komórki zlewają się w 80%. Pamiętaj, aby wymieniać nośniki co 2-3 dni.
      6. Korzystając z komercyjnej pompy, podłącz rurkę do kolby i ustaw parametry wymienione powyżej w kroku 4.1.131,32,33.
    2. Dodawać GI254023X do 50 ml pożywki HAEC o końcowym stężeniu 5 μM przez 30 minut.
    3. Z wstępnie zmieszanym GI254023X, inhibitorem ADAM10, który hamuje sygnalizację Notch, przeprowadź te same eksperymenty z przepływem laminarnym lub pulsacyjnym, jak w 4.1.1.
    4. Określ ilościowo ligandy Notch (Jag1, Jag2 i Dll4) oraz geny docelowe Notch (owłosione i wzmacniające rozszczepienie [Hes]) za pomocą qRT-PCR dla czterech grup próbek HAEC (przepływ laminarny, przepływ laminarny + GI254023X, przepływ pulsacyjny, przepływ pulsacyjny + GI254023X) opisanych wcześniej32.

5. Ratowanie i nadmierna ekspresja sygnalizacji Notch

  1. Wstrzyknąć 1 nL przygotowanego mRNA Nrg1 w stężeniu 5 pg/nL (od kroku 1.1.6) na etapie od 1 do 4 komórek z GATA1a MO w celu nadekspresji Genów docelowych Notch24.
  2. Wstrzyknij 1 nL mRNA Nrg1 do mutanta wea w podobny sposób24.
  3. Podwojenie stężenia mRNA Nrg1 (10 pg/nL) i wstrzyknięcie 24 1 nL do danio pręgowanego, aby obserwować morfologię komór.
  4. Wstrzyknij 1 nL z 20 pg/nL mRNAEPO="xref">6 do zarodków danio pręgowanego na etapie od 1 do 4 komórek, aby wzmocnić hematopoezę w celu zwiększenia WSS komorowego, jak pokazano wcześniej24.
  5. Wstrzyknąć 1 nL 50 μM Isoproterenol7, który zwiększa szybkość kurczliwości, do podłoża E3 przez 24 godziny, podczas gdy danio pręgowany jest hodowany, jak pokazano wcześniej24.
  6. Wykonaj obrazowanie 4D LSFM dla każdej grupy. Postępuj zgodnie z instrukcjami w krokach 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. Kwantyfikacja ułamkowego skrócenia i zmiany objętości w czasie

  1. Wykonaj obrazowanie 4D LSFM dla każdej grupy przy 50, 75 i 100 hpf. Postępuj zgodnie z instrukcjami w krokach 2.1.1-2.1.5.2.8. Podziel każdy obraz tak, aby każdy miał 600 węzłów do replikacji ruchu ściany serca.
  2. Zmierzyć zmianę średnicy komory podczas rozkurczu i skurczu, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-4 (3)
    Ładuj obrazy 3D komór co 0,1 s za pomocą oprogramowania do wizualizacji i mierz objętość.
  3. Wykreśl zmianę objętości w czasie dla każdej grupy eksperymentalnej przy 75 hpf i 100 hpf.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM został użyty w tym manuskrypcie w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości zdjęć 2D i 3D. Jak widać na Rysunek 1A i 1B, soczewka oświetleniowa kieruje arkusz światła na próbkę. Ze względu na cienkość arkusza świetlnego oświetlana jest tylko jedna płaszczyzna. Soczewka detekcyjna jest ustawiona prostopadle do soczewki oświetleniowej i skupia się na oświetlonej płaszczyźnie (Rysunek 1B). Arkusz świetlny z soczewki oświetl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole wykazaliśmy, że obrazowanie 4D może być wykorzystywane do śledzenia rozwoju sieci beleczkowej w odpowiedzi na zmiany sił biomechanicznych. W szczególności naprężenie ścinające doświadczane przez komórki śródbłonka inicjuje kaskadę sygnalizacyjną Notch, która z kolei sprzyja trabekulacji. W tym manuskrypcie wykazaliśmy, że (1) wstrzyknięcie GATA1a MO zmniejszyło hematopoezę, a zatem zmniejszyło naprężenie ścinające ścianę, (2) wstrzyknięcie TNNTT2a MO hamowało funkcję kurczliwości komór w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność Williamowi Talbotowi z Uniwersytetu Stanforda za dostarczenie stylu Human Nrg1 cDNA oraz Deborah Yelon z UCSD za dostarczenie wea mutantów. Autorzy chcieliby również podziękować Cynthii Chen za pomoc w pozyskiwaniu obrazu. Badanie to było wspierane przez granty NIH HL118650 (dla T.K. Hsiai), HL083015 (dla T.K. Hsiai), HD069305 (dla N.C. Chi i T.K. Hsiai), HL111437 (dla T.K. Hsiai i N.C. Chi), HL129727 (dla T.K. Hsiai), T32HL007895 (dla R.R. Sevag Packard), HL 134613 (dla V. Messerschmidta) oraz finansowanie University of Texas System STARS (dla J. Lee).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Premiks Clontech Hifi PCR Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Ludzki Nrg1 cDNAPrezent od Williama Talbota, Uniwersytet Stanforda, Stanford, Kalifornia, USANie dotyczyUżywany do ratownictwa trabekulacyjnego
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855201Maszyna do PCR
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2GE HealthPlazmid używany do syntezy mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Zestaw do oczyszczania nukleospiny   Clontech740609.25Oczyszczanie DNA
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
Ligaza DNA T4 Clontech2011ARoztwór do ligacji PCR
1.1.2.5
Gwiezdne kompetentne komórkiClontech636763E. Komórki coli używane do transformacji
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Odczynnik do transfekcji
1.1.4
Zestaw mMessage SP6InvitrogenAM1340Zestaw do syntezy mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Oczyszcza RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/AOprogramowanie do projektowania starterów
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026zwiększa WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182Inhibitor ErbB
1.3.1
E3 pożywkaDo hodowli zarodków
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-inhibitor sekretazy
1.3.2
Agaroza Sigma-Aldrich A9539Służy do montażu zarodków
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Cyfrowa kamera CMOSHamamatsu PhotonicsC11440-42USłuży do przechwytywania obrazów
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareNie dotyczyWizualizacja i analiza obrazów w 3D i 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate Sigma-Aldrich 886-86-2Służy do humanitarnego uspokojenia lub uśmiercenia embrionów
3.1.1
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad1708890syntetyzuje cDNA
3.1.2
Mikrowirówka Eppendorf 5424Eppendorf05-400-005Mikrowirówka
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5Inhibitor ADAM10
4.1.2, 4.1.3 
Chlorowodorek izoprenalinySigma-Aldrich I5627Izoproterenol zwiększa WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AAnaliza mechaniki serca
+

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Tagi

TrabeculationNotch Signaling4D ImagingGata1a MorpholinoNrg1 mRNATnnt2a MorpholinoHemodynamic Forces

Powiązane artykuły