Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły hemodynamiczne doświadczane przez serce wpływają na rozwój serca, szczególnie na trabekulację, która tworzy sieć rozgałęziających się wyrostków z mięśnia sercowego. Wady genetyczne programu w kaskadzie sygnalizacyjnej Notch są zaangażowane w wady komór, takie jak kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory lub zespół hipoplazji lewego serca. Korzystając z tego protokołu, można określić, że trabekulacja sterowana naprężeniem ścinającym i sygnalizacja Notch są ze sobą powiązane. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi możliwa była wizualizacja rozwijającego się serca danio pręgowanego. W niniejszej pracy oceniono, czy siły hemodynamiczne modulują inicjację trabekulacji poprzez sygnalizację Notch, a tym samym zachodzi wpływ funkcji kurczliwości. W celu jakościowej i ilościowej analizy naprężeń ścinających uzyskano obrazy 4D (3-D + czas) podczas morfogenezy serca danio pręgowanego, a zintegrowana mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego z synchronizacją 4D uchwyciła ruch komór. Lepkość krwi została zmniejszona poprzez mikroiniekcję GATA1a-morfolinooligonukleotydów (MO) w celu zmniejszenia naprężeń ścinających, a tym samym regulacji w dół sygnalizacji Notch i tłumienia trabekulacji. Jednoczesne wstrzyknięcie mRNA Nrg1 z gata1a MO uratowało geny związane z Notch, aby przywrócić trabekulację. Aby potwierdzić, że sygnalizacja Notch napędzana naprężeniem ścinającym wpływa na trabekulację, skurcz kardiomiocytów został dodatkowo zatrzymany przez tnnt2a-MO w celu zmniejszenia sił hemodynamicznych, a tym samym obniżenia docelowych genów Notch w celu rozwoju niebelekulatowanego mięśnia sercowego. Wreszcie, potwierdzenie wzorców ekspresji genów Notch reagujących na stres ścinający przeprowadzono poprzez poddanie komórek śródbłonka przepływowi pulsacyjnemu. W ten sposób mikroskopia świetlna 4D ujawniła siły hemodynamiczne leżące u podstaw sygnalizacji Notch i trabekulacji, co ma znaczenie kliniczne dla kardiomiopatii bez zagęszczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenia ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W odpowiedzi na hemodynamiczne siły ścinające, grzbiety i rowki mięśnia sercowego rozwijają się w falistej sieci beleczkowej zgodnie z kierunkiem naprężenia ścinającego w poprzek zastawki przedsionkowo-komorowej (AV)1. Trabekulacja serca jest niezbędna do zwiększenia funkcji skurczowej i masy mięśnia sercowego2. Mutacje w szlakach sygnałowych Notch powodują wrodzone wady serca u ludzi i innych kręgowców3. Na przykład wykazano, że gata1a4 i tnnt2a

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące metody zostały wykonane zgodnie z protokołami UTA i UCLA IACUC. Te grupy eksperymentalne stosowano z transgenicznymi Tg (cmlc2: gfp), mutantami wea (słabe przedsionki) lub clo (cloche): (a) kontrola typu dzikiego (WT), (b) gata1a MO i (c) tnnt2a MO (Tabela 1).

modelnazwaZmodyfikowane genyFenotypodniesienie
kontrola

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM został użyty w tym manuskrypcie w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości zdjęć 2D i 3D. Jak widać na Rysunek 1A i 1B, soczewka oświetleniowa kieruje arkusz światła na próbkę. Ze względu na cienkość arkusza świetlnego oświetlana jest tylko jedna płaszczyzna. Soczewka detekcyjna jest ustawiona prostopadle do soczewki oświetleniowej i skupia się na oświetlonej płaszczyźnie (Rysunek 1B). Arkusz świetlny z soczewki oświetl.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole wykazaliśmy, że obrazowanie 4D może być wykorzystywane do śledzenia rozwoju sieci beleczkowej w odpowiedzi na zmiany sił biomechanicznych. W szczególności naprężenie ścinające doświadczane przez komórki śródbłonka inicjuje kaskadę sygnalizacyjną Notch, która z kolei sprzyja trabekulacji. W tym manuskrypcie wykazaliśmy, że (1) wstrzyknięcie GATA1a MO zmniejszyło hematopoezę, a zatem zmniejszyło naprężenie ścinające ścianę, (2) wstrzyknięcie TNNTT2a MO hamowało funkcję kurczliwości komór w.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność Williamowi Talbotowi z Uniwersytetu Stanforda za dostarczenie stylu Human Nrg1 cDNA oraz Deborah Yelon z UCSD za dostarczenie wea mutantów. Autorzy chcieliby również podziękować Cynthii Chen za pomoc w pozyskiwaniu obrazu. Badanie to było wspierane przez granty NIH HL118650 (dla T.K. Hsiai), HL083015 (dla T.K. Hsiai), HD069305 (dla N.C. Chi i T.K. Hsiai), HL111437 (dla T.K. Hsiai i N.C. Chi), HL129727 (dla T.K. Hsiai), T32HL007895 (dla R.R. Sevag Packard), HL 134613 ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Premiks Clontech Hifi PCR Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Ludzki Nrg1 cDNAPrezent od Williama Talbota, Uniwersytet Stanforda, Stanford, Kalifornia, USANie dotyczyUżywany do ratownictwa trabekulacyjnego
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855201Maszyna do PCR
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2GE HealthPlazmid używany do syntezy mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Zestaw do oczyszczania nukleospiny   Clontech740609.25Oczyszczanie DNA
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
Ligaza DNA T4 Clontech2011ARoztwór do ligacji PCR
1.1.2.5
Gwiezdne kompetentne komórkiClontech636763E. Komórki coli używane do transformacji
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Odczynnik do transfekcji
1.1.4
Zestaw mMessage SP6InvitrogenAM1340Zestaw do syntezy mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Oczyszcza RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/AOprogramowanie do projektowania starterów
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026zwiększa WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182Inhibitor ErbB
1.3.1
E3 pożywkaDo hodowli zarodków
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-inhibitor sekretazy
1.3.2
Agaroza Sigma-Aldrich A9539Służy do montażu zarodków
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Cyfrowa kamera CMOSHamamatsu PhotonicsC11440-42USłuży do przechwytywania obrazów
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareNie dotyczyWizualizacja i analiza obrazów w 3D i 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate Sigma-Aldrich 886-86-2Służy do humanitarnego uspokojenia lub uśmiercenia embrionów
3.1.1
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad1708890syntetyzuje cDNA
3.1.2
Mikrowirówka Eppendorf 5424Eppendorf05-400-005Mikrowirówka
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5Inhibitor ADAM10
4.1.2, 4.1.3 
Chlorowodorek izoprenalinySigma-Aldrich I5627Izoproterenol zwiększa WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AAnaliza mechaniki serca
+

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Tagi

TrabeculationNotch Signaling4D ImagingGata1a MorpholinoNrg1 mRNATnnt2a MorpholinoHemodynamic Forces

Powiązane artykuły