Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Victoria Messerschmidt; Zachary Bailey; Kyung In Baek; Yichen Ding; Jeffrey J. Hsu; Richard Bryant; Rongsong Li; Tzung K. Hsiai; Juhyun Lee

doi:10.3791/57763

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 sierpnia 2018

Victoria Messerschmidt^*¹ , Zachary Bailey^*¹ , Kyung In Baek² , Yichen Ding² , Jeffrey J. Hsu² , Richard Bryant¹ , Rongsong Li³ , Tzung K. Hsiai² , Juhyun Lee¹

¹Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, ²Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, ³College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Streszczenie

Siły hemodynamiczne doświadczane przez serce wpływają na rozwój serca, szczególnie na trabekulację, która tworzy sieć rozgałęziających się wyrostków z mięśnia sercowego. Wady genetyczne programu w kaskadzie sygnalizacyjnej Notch są zaangażowane w wady komór, takie jak kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory lub zespół hipoplazji lewego serca. Korzystając z tego protokołu, można określić, że trabekulacja sterowana naprężeniem ścinającym i sygnalizacja Notch są ze sobą powiązane. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi możliwa była wizualizacja rozwijającego się serca danio pręgowanego. W niniejszej pracy oceniono, czy siły hemodynamiczne modulują inicjację trabekulacji poprzez sygnalizację Notch, a tym samym zachodzi wpływ funkcji kurczliwości. W celu jakościowej i ilościowej analizy naprężeń ścinających uzyskano obrazy 4D (3-D + czas) podczas morfogenezy serca danio pręgowanego, a zintegrowana mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego z synchronizacją 4D uchwyciła ruch komór. Lepkość krwi została zmniejszona poprzez mikroiniekcję GATA1a-morfolinooligonukleotydów (MO) w celu zmniejszenia naprężeń ścinających, a tym samym regulacji w dół sygnalizacji Notch i tłumienia trabekulacji. Jednoczesne wstrzyknięcie mRNA Nrg1 z gata1a MO uratowało geny związane z Notch, aby przywrócić trabekulację. Aby potwierdzić, że sygnalizacja Notch napędzana naprężeniem ścinającym wpływa na trabekulację, skurcz kardiomiocytów został dodatkowo zatrzymany przez tnnt2a-MO w celu zmniejszenia sił hemodynamicznych, a tym samym obniżenia docelowych genów Notch w celu rozwoju niebelekulatowanego mięśnia sercowego. Wreszcie, potwierdzenie wzorców ekspresji genów Notch reagujących na stres ścinający przeprowadzono poprzez poddanie komórek śródbłonka przepływowi pulsacyjnemu. W ten sposób mikroskopia świetlna 4D ujawniła siły hemodynamiczne leżące u podstaw sygnalizacji Notch i trabekulacji, co ma znaczenie kliniczne dla kardiomiopatii bez zagęszczenia.

Wprowadzenie

Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenia ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W odpowiedzi na hemodynamiczne siły ścinające, grzbiety i rowki mięśnia sercowego rozwijają się w falistej sieci beleczkowej zgodnie z kierunkiem naprężenia ścinającego w poprzek zastawki przedsionkowo-komorowej (AV)¹. Trabekulacja serca jest niezbędna do zwiększenia funkcji skurczowej i masy mięśnia sercowego². Mutacje w szlakach sygnałowych Notch powodują wrodzone wady serca u ludzi i innych kręgowców³. Na przykład wykazano, że gata1a⁴ i tnnt2a⁵ oligonukleotydy morfolino (MO) zmniejszają erytropoezę, podczas gdy mRNA erytropoetyny (EPO)⁶ i Isoproterenol (ISO)⁷ zwiększają odpowiednio czerwone krwinki i częstość akcji serca, a tym samym naprężenie ścinające ścianę (WSS). Co więcej, sygnalizacja ErbB2, za Notch, promuje proliferację i różnicowanie kardiomiocytów w celu wytworzenia siły skurczowej, która z kolei aktywuje sygnalizację Notch⁸^,⁹. Sugeruje się, że naprężenie ścinające rządzi trabekulacją sterowaną sygnalizacją Notch dla rozwoju komór. Obecnie istnieje wiele badań, które próbują lepiej zrozumieć zdarzenia związane z programowaniem genetycznym prowadzące do wrodzonych wad serca (CHD)¹⁰^,¹¹^,¹², ale bardzo niewiele z nich bada, jak siły mechaniczne wpływają na formujące się serce.

Aby zbadać siły mechaniczne działające na wsierdzie, należy przeprowadzić ścisłą obserwację w okresie rozwoju. Jednak uzyskanie dobrej jakości obrazów próbek in vivo jest trudne ze względu na nieodłączność tradycyjnej mikroskopii¹³. Aby zaobserwować rozwój w czasie w próbce, konieczne jest zatem fizyczne przecięcie i barwienie¹³^,¹⁴^,¹⁵. Chociaż mikroskopia konfokalna jest szeroko stosowana do obrazowania trójwymiarowej struktury próbek¹⁴^,¹⁶, akwizycja tych systemów obrazowania jest nadal ograniczona przez niskie prędkości skanowania.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym (LSFM) to unikalna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację dynamicznych zdarzeń in vivo przy dużej odległości roboczej¹³. Technika ta wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem świetlnym do optycznego przekroju próbki¹⁷. Ze względu na oświetlenie tylko cienkiego arkusza światła na próbce, następuje zmniejszenie fotowybielania i fototoksyczności¹³^,¹⁸. Duże pole widzenia i duża odległość robocza pozwalają na to, aby duże próbki pozostały nienaruszone podczas ich obrazowania¹³^,¹⁴^,¹⁷. Małe powiększenie pozwala na obrazowanie większego obszaru, podczas gdy duża odległość robocza pozwala na obrazowanie grubszych próbek bez uszczerbku dla stosunku sygnału do szumu. Wiele grup używało LSFM do obrazowania całych embrionów¹⁷, brains¹⁴^,¹⁸, muscle and hearts¹⁹ wśród innych tkanek, pokazując różne rodzaje próbek, które można obrazować.

Chociaż poprzednie badania wykazały zmniejszenie hemodynamicznej siły ścinającej poprzez zasłanianie ścieżek dopływu lub odpływu serca danio pręgowanego, informacje są wyłącznie jakościowe. Powoduje to nieprawidłową trzecią komorę, zmniejszone zapętlenie serca i upośledzone tworzenie zastawek²⁰. Obrazy 4D LSFM dają nową perspektywę na sposób, w jaki hemodynamiczne siły ścinające wpływają na rozwój tkanki serca. Te siły mechaniczne mogą aktywować wrażliwe na siłę cząsteczki sygnałowe i indukować tworzenie grzbietów beleczkowych. Ze względu na dodatkowy aspekt czasowy obrazowania 4D, można śledzić zmiany w rozwoju w czasie rzeczywistym, co może prowadzić do nowych odkryć, które wcześniej pozostały niezauważone. Danio pręgowany jest idealnym modelem do obrazowania, ponieważ naukowcy mogą obserwować całe zwierzę kręgowe, a nie tylko interakcje komórka-komórka. Tlen może również dyfundować przez cały zarodek, co pozwala na rozwój bez zależności od układu naczyniowego, w przeciwieństwie do rozwoju ssaków. Mimo że serce danio pręgowanego nie ma narządów płucnych, które wymagają czterokomorowego serca, istnieje duża liczba genów sercowych, które są zachowane między danio pręgowanym a ludźmi²¹.

W tym manuskrypcie opisujemy, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza do obrazowania rozwijających się beleczek w sercach danio pręgowanego w różnych okolicznościach. Po pierwsze, w celu obniżenia lepkości krwi, a tym samym WSS, użyto wstrzyknięcia gata1a⁴ lub tnnt2a5 MO. Następnie zarejestrowano morfologię serca. W osobnej grupie ryb zwiększyliśmy WSS, podając mRNA^EPO="xref">6 lub isoproterenol⁷ i obserwowaliśmy wyniki. Przeprowadziliśmy również badanie komórek o różnych natężeniach przepływu pulsacyjnego lub oscylacyjnego. Po zobrazowaniu każdej grupy stwierdziliśmy, że WSS wyczuwany przez wsierdzie za pośrednictwem sygnalizacji Notch inicjuje trabekulację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższe metody zostały wykonane zgodnie z protokołami IACUC uczelni UTA i UCLA. Wykorzystano następujące grupy eksperymentalne z transgenicznymi liniami Tg(cmlc2:gfp), mutantami wea (weak atrium) lub clo (cloche): (a) kontrola typu dzikiego (WT), (b) iniekcje MO gata1a oraz (c) iniekcje MO tnnt2a (Tabela 1).

Model	Nazwa	Zmodyfikowane geny	Fenotyp	Bibliografia
Kontrola	Typ dziki	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego, nie mam czego tłumaczyć. Proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.
	Tg(cmlc2:gfp)	Lekki łańcuch miozyny sercowej	Zielona fluorescencja wykazująca specyficzną ekspresję w mięśniu sercowym	34
Zmniejszone naprężenie ścinania przyścianowe	Słabe przedsionki (wyciąg z tkanek) mutant	ciężki łańcuch miozyny specyficzny dla przedsionków	Przedsionek nie może się kurczyć, zwarty komora, gruba ściana mięśnia sercowego, wąskie światło, rozszerzony przedsionek,	37
	Klosz (clomutant	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.	Całkowity zanik wsierdzia, nienaturalnie powiększone przedsionki przy małej komorze, brak poduszek serca	41
	gata1a MO	gata1a	Anemia wynikająca z niedoboru erytrocytów	4
	tnnt2a MO	tnnt2a		39
Zwiększone naprężenie ścinające przy ścianie	EPO mRNA	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Ciężka wielokrwistość, wzrost liczby krążących komórek krwi, zwiększona lepkość	6
Zwiększone naprężenie ścinające przy ścianie	Izoproterenol	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Zwiększona częstotliwość pracy serca	7

Tabela 1: Opisy rybek zebrafish. Definicje i opisy rybek zebrafish wykorzystanych w eksperymentach.

1. Konfiguracja badania

Przygotuj Nrg1 i EPO mRNA do ratowania procesu trabekulacji.
1. Pozyskanie materiału ludzkiego Nrg1 cDNA i amplifikować z plazmidu donorowego.
  Uwaga: Człowiek Nrg1 cDNA został przekazany przez Williama Talbota z Uniwersytetu Stanforda.
  1. Wyjmij niezbędne odczynniki i materiały, a mianowicie mastermix do PCR (przechowywany w temp. -20 °C), startery (Patrz Tabela 2) (przechowywane w -20 °C), płytkę PCR (przechowywaną w temperaturze pokojowej) oraz 20 μL pipeta (przechowywana w temperaturze pokojowej). Patrz Tabela materiałów na przykład produkty.
    
    Tabela 2: Startery dla człowieka Nrg1 klonowanie
  2. Przygotować mastermix dla każdego zestawu starterów w trzech powtórzeniach, używając 20 μL pipetka. Dla 1 zestawu próbek w trzech powtórzeniach należy użyć 37.5 μL z mieszaniny mastermix, 3 μL wody wolnej od DNA, 4.5 μL startera. W przypadku większej liczby powtórzeń w triplikatach należy po prostu pomnożyć tę wartość przez liczbę próbek.
  3. Rozcieńczyć roztwór roboczy Human Nrg1 cDNA (20 ng/μg (stężenia) w pasku starterów wodą wolną od DNA, tak aby znajdowała się 10 μL łącznie na studzienkę dla jednej próbki.
    Uwaga: Upewnij się, że każdy roztwór wymieniony w kroku 1.1.1 jest jednorodny. W tym celu wymieszaj każdy roztwór, wielokrotnie pobierając i wydmuchując go pipetą. Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej, używaj jednej końcówki pipety tylko do jednej próbki.
  4. Podziel na alikwoty Nrg1 cDNA z 10 μL pipetą wielokanałową do wybranych studzienek w płytce PCR.
  5. Dodaj 14.5 μL do cDNA w dołkach. Płytkę PCR należy zabezpieczyć odpowiednią pokrywką przylegającą, aby uszczelnić dołki, a następnie umieścić w termocyklerze.
  6. Uruchom termocykler i upewnij się, że cykl osiąga odpowiednie temperatury, zgodnie z zastosowanymi enzymami i starterami.
2. Klonowanie Nrg1 cDNA do plazmidu pCS2⁺ w miejscach cięcia BamHI i EcoRI, stosując nadmiar enzymów BamHI i EcoRI, aby zapewnić ligację cDNA we wszystkich plazmidach.
  1. Wymieszać Nrg1 cDNA z plazmidem donorem pCS2⁺, komercyjnie dostępny roztwór master mix oraz startery (Tabela 2).
    Uwaga: Całkowita objętość reakcji powinna wynosić 50 μL z 25 μL mieszaniny master mix, 3 μL starterów i 1 μL o stężeniu 20 ng/μL plazmid donora z Nrg1 cDNA
  2. Umieść mieszaninę z kroku 1.1.2.1 w termocyklerze i ustaw parametry zgodnie z następującą specyfikacją: 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 5 lub 15 s, a następnie 72 °C przez 5 s/kb.
  3. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania zgodnie z instrukcją producenta. Eluuj produkt do 50 μL buforu elucyjnego.
  4. Przeprowadź trawienie oczyszczonego produktu PCR i 5 μg pCS2⁺ osobno za pomocą BamHI i EcoRI w 37 °C przez 2 h w 200 μL objętość reakcji. Oczyść uzyskany produkt trawienia za pomocą komercyjnego zestawu i eluuj do 20 μL i 100 μL odpowiednio Tris-HCl (pH 8,5).
  5. Ligacja 4 μL z Nrg1 cDNA i 2 μL przetrawionego pCS2⁺ plazmid w 25 μL reakcja z 1 μL katalizatora ligazy w 16 °C na noc.
    Uwaga: Procedurę można w tym miejscu przerwać w celu inkubacji przez noc.
  6. Zastosowanie 2 μL roztworu ligacji z kroku 1.1.2.5 i poddać transformacji do 50 μL z E. coli komórki bakteryjne odpowiednie do klonowania (patrz Tabela materiałów).
3. Potwierdź, że transformacja miała miejsce, poprzez przesiewowe badanie Nrg1 klony cDNA przy użyciu PCR. Wybrać losowo klony i dodać je do roztworu specyficznych starterów, polimerazy oraz odwzorowanych trifosforanów dNTP (dNTPs).
  Uwaga: Kontrolami były wektory (pCS2⁺) z wkładką (ludzkie cDNA) i bez niej. Nie należy wybierać zbyt dużych kolonii, ponieważ nadmiar bakterii może hamować reakcję PCR.
  1. Wybrać 8 kolonii z transformacji i przeprowadzić screening pCS2⁺klony Nrg1 przy użyciu starterów PCR z Tabela 2.
  2. Hodować jeden klon z Nrg1 cDNA do izolacji pCS2⁺-plazmidowy DNA Nrg1. Zaszczepić za pomocą 100 μL z *E. coli* bakterie z pCS2⁺-plazmid Nrg1 do 10 ml pożywki LB i inkubować w wytrząsarce (160–25 obr./min) w temperaturze 37 °C.
4. Transfekt oczyszczony pCS2⁺-Plazmid Nrg1 do komórek HEK-293 w płytce 6-dołkowej przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
5. 24 h po transfekcji liza komórek z wykorzystaniem buforu do lizy, rozdzielenie białek w żelu SDS-PAGE, przeniesienie na membranę, a następnie barwienie przeciwciałem anty-Nrg1 przeciwciało²²Weryfikacja Nrg1 ekspresja białek z wykorzystaniem metody Western Blot.
  Uwaga: Kontrolą jest pusty wektor pCS2⁺ plazmid. Na tym etapie można przerwać pracę, jeśli transfer na membranę żelową odbywa się przez noc.
6. Syntetyzować Nrg1 mRNA przy użyciu produktu komercyjnego podobnego do tego w Tabela materiałów oraz postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  1. Pobierz 5 μL z pCS2⁺-DNA Nrg1 z hodowli izolowanej bakterii i trawienie za pomocą NotI w 200 μL reakcja przez 2 h w temp. 37 °C w celu linearyzacji plazmidu.
  2. Oczyścić zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu komercyjnego i eluować do 20 μL Tris-HCl (pH 8,5).
  3. Przeprowadzić in vitro transkrypcja z zastosowaniem komercyjnego zestawu do izolacji RNA w 20 μL reakcja z użyciem 5 μL zlinearyzowanego plazmidu zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Dodaj in vitro transkrybowany Nrg1 do 350 μL buforu do lizy RNA, a następnie oczyścić go za pomocą zestawu do izolacji RNA. Eluować RNA do 60 μL buforu Tris-HCl (pH 8,5).
  5. Zmierz stężenie RNA i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
7. Postępuj zgodnie z krokami 1.1.6.1 – 1.1.6.5 opisanymi powyżej dla EPO przygotowanie cDNA i mRNA, jednak z klonowaniem cDNA do plazmidu pCS2+ w miejscach EcoRI i XhoI.
Wstrzykiwanie morfolino do rybek danio-ostrogonia
1. Projekt²³ iniekcje MO przy użyciu narzędzia online (Tabela materiałów) przeciwko sekwencji ATG gata1a⁴ (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) oraz tnnt2a⁵ (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
2. Dodaj gata1a i tnnt2a MO oddzielnie do wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 8 ng/nL i 4 ng/nL. Powtórzyć z EPO mRNA o końcowym stężeniu 20 pg/nL. Należy upewnić się, że objętość końcowa wynosi 1 ml.
3. Wstrzyknij 1 nL stężenia 8 ng/nL z gata1a MO oraz 1 nL roztworu o stężeniu 4 ng/nL z tnnt2a Wstrzyknięcie MO do poszczególnych zarodków danio prążkowanego w stadium od 1 do 4 komórek w celu zmniejszenia naprężenia ścinającego ścian prądu (WSS) w komorach²⁴Aby zwiększyć WSS, należy wstrzyknąć 1 nL roztworu o stężeniu 20 pg/nL EPO mRNA⁶ do zarodków danio pręgowanego w stadium od 1 do 4 komórek.
Chemiczna obróbka rybek danio w celu zahamowania trabekulacji
1. Za pomocą pipety 20 ml rozcieńcz AG1478 o stężeniu 10 mg/ml w 1% DMSO w medium E3 do stężenia końcowego wynoszącego 5 μM w 30. godzinie po zapłodnieniu (hpf) do probówki o pojemności 15 ml. W ramach kontroli każdą rybę należy potraktować samym 1% DMSO.
2. Dodaj N-[N-(3,5-difluorofenacetylo)-L-alanilo]-S-fenyloglicynę t-butyl ester (DAPT) w 1% DMSO (100 μM) do medium E3 w probówce 15 ml, aby w podobny sposób zahamować sygnał Notch w 40. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Jako kontrolę zastosować wyłącznie 1% DMSO.

2. Techniki obrazowania

Obrazowanie serca w 4D przy użyciu LSFM z algorytmem synchronizacji
1. Należy wykonać dwuwymiarowe obrazy całego zarodka ryby w ciągu wielu cykli skurczów serca, postępując zgodnie z poniższymi krokami (Rysunek 1) . Upewnij się, że grubość arkusza światła wynosi około 5 μmNależy wykonać 50 klatek x-y z czasem ekspozycji 10 ms. Następnie ustawić skanowanie w osi z na 1 μm do bezstratnego próbkowania cyfrowego zgodnie z zasadą próbkowania Nyquista²⁵.
  1. Przygotuj 1% (m/v) żel agarozowy, dodając 1 g agarozy do 10 ml wody i podgrzewając do czasu całkowitego rozpuszczenia agarozy. Wprowadź zarodek oraz agarozę do małej plastikowej probówki za pomocą 20 μL pipetę i zamocuj ją na stole.
  2. Otwórz oprogramowanie do przeglądania obrazów i kliknij Na żywo aby uzyskać podgląd na żywo próbki. Za pomocą pokrętła wyregulować obiektyw tak, aby próbka była w ostrości. W podobny sposób przesunąć stoлик, aby w podglądzie na żywo widoczna była górna część zarodka.
  3. Wykonaj 50 obrazów w odstępach 5 s przy powiększeniu 10X, korzystając z oprogramowania mikroskopu.²⁶.
  4. Przesuń stolik za pomocą silnika do nowej warstwy (1 μm w osi Z) i powtórzyć procedurę obrazowania.
  5. Powtórz powyższe dwa kroki aż do pełnego obrazowania całego serca.
2. W celu zapewnienia spójności danych należy pominąć obrazy z pierwszego i ostatniego cyklu sercowego. Okres cyklu sercowego wyznacza się poprzez dopasowanie obrazów wykonanych w tym samym punkcie cyklu sercowego, lecz w różnych okresach. Do wyznaczenia okresu należy zastosować następujące równanie:
  (1)
  gdzie D jest funkcją kosztu stosowaną do dopasowania hipotezy dotyczącej okresu, I_m przejęty obraz, τ' czas wykonania obrazu, z_k indeks obrazu w kierunku osi z, Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia._m jest wektorem indeksu piksela, a T' jest hipoteza okresowa.
3. Aby wyznaczyć względne przesunięcie między dwoma obrazami na podobnych etapach, należy skorzystać z poniższego równania:
  (2)
  gdzie Q_k',k oznacza funkcję kosztu dla przesunięcia względnego, R jest możliwym sąsiedztwem przestrzennym, L jest całkowitym czasem akwizycji obrazu, Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. jest indeksem piksela, z_k i z_k' są to pierwszy i drugi przekrój w kierunku osi z, t jest czas, i s jest hipoteza względnego przesunięcia.
4. Przelicz przesunięcie względne na przesunięcie bezwzględne względem pierwszego obrazu i rozwiąż równanie liniowe metodą pseudoodwrotności, aby wyznaczyć relację bezwzględną służącą do wyrównania kolejnej sekcji obrazów, zgodnie z wcześniejszym opisem.²⁷.
5. Końcowe obrazy 4-D zostały przetworzone przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu (Tabela materiałów).
  1. Stosowanie obrazów 2D w celu stworzenia obrazu 3D
    1. Otwórz komercyjne oprogramowanie do przetwarzania obrazów.
    2. Kliknij Otwarte dane.
    3. Wybierz wszystkie obrazy do złożenia w model 3D > Kliknij Załaduj.
    4. Zastosowano rozmiar woksela 0,65 x 0,65 x 1 > Kliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia..
    5. Kliknij Widok wielopłaszczyznowy pole do wizualizacji obrazu 3D.
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieski element przekrój_1.tiff pudełko > Wybierz Wyświetlacz > Wybierz Volren.
    7. Kliknij Edytuj > Wybierz Opcje > Wybierz Edytuj mapę kolorów.
    8. Dostosuj kolor, korzystając z pól zaznaczonych na czerwono > Kliknij OK.
  2. Konwersja z 3D na 4D
    1. Kliknij „Plik > Otwórz Dane szeregów czasowych.
    2. Wybierz nowo utworzone pliki tiff 3D > Kliknij Obciążenie.
    3. Wprowadź taką samą wielkość woksela jak poprzednio.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy na niebieski element przekrój_1.tiff pudełko > Wybierz „Wyświetlacz" > Wybierz Volren.
    5. Kliknij Edytuj > Wybierz Opcje > Wybierz Edytuj mapę kolorówDostosuj kolor, korzystając z pól wyboru. > Kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy Kontrola serii czasowej > Kliknij Twórca filmu > Naciśnij Odtwórz przycisk, aby obejrzeć film.
    7. Dodaj nazwę pliku, rozmiar klatki, częstotliwość klatek, jakość równą 1, typ Monoskopowy > Kliknij Zastosuj
    8. Wyeksportuj wideo. Otwórz wideo w odpowiednim oprogramowaniu.

3. Analiza qRT-PCR

Izolacja RNA z serca danio pręgowanego w celu ilościowego oznaczenia ekspresji ligandów, receptorów Notch oraz genów docelowych
1. Uśmierć ryby danio pręgowanego, podając im przedawkę metainianu trikainy²⁸^,²⁹. Zgodnie z wcześniej opisanym protokołem³⁰, wycięto serca ryb i przygotowano je do izolacji RNA.
2. Wyizoluj całkowite RNA, a następnie zsyntetyzuj cDNA, używając zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta.
3. Zaprojektuj primery PCR dla ligandów Notch Jag1, Jag2, Dll4, receptora Notch1b oraz genów związanych z sygnalizacją Nrg1 i ErbB2. Primery wykorzystane w badaniu przedstawiono w tabeli 3.
4. Do płytki PCR dodaj primery z kroku 3.1.3, wyizolowane mRNA z kroku 3.1.2 oraz komercyjny mastermix. Przeprowadź qRT-PCR w temperaturach i czasach odpowiednich dla użytych enzymów. Wyniki znormalizuj względem α-aktyny danio pręgowanego.
  Uwaga: Pozwoli to na obliczenie poziomów ekspresji dla każdego z ligandów, receptorów i genów.

4. Eksperymenty in vitro z ludzkimi komórkami śródbłonka aorty (HAEC)

Model dynamicznego naprężenia ścinającego
1. Hodować komórki HAEC w pożywce do hodowli HAEC. Po osiągnięciu pełnej konfluencji poddać komórki działaniu przepływu laminarnego oraz przepływu pulsacyjnego o wartości 23 x 10^-5 N z częstotliwością 1 Hz przez 24 h.
  1. Podgrzać pożywkę EC/DMEM z 10% FBS w kąpieli wodnej przez 20 min.
  2. Wyjąć komórki HAEC z pojemnika z ciekłym azotem i umieścić fiolkę w kąpieli wodnej do czasu rozmrożenia.
  3. Za pomocą pipety 100 μL przenieść rozmrożone komórki do probówki 15 mL zawierającej 3-5 mL pożywki. Odwirrować zawiesinę komórkową przy 53 x g przez 3 min.
  4. Odssać nadsedyment  i dodać pożywkę do uzyskania całkowitej objętości 10 mL. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej kolby T75, zakręcić kolbę i równomiernie rozprowadzić komórki na dnie naczynia.
  5. Oznaczyć kolbę inicjałami, datą, typem komórek i numerem pasażu. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Pamiętać o wymianie pożywki co 2-3 dni.
  6. Używając komercyjnej pompy, podłączyć przewody do kolby i ustawić parametry wspomniane powyżej w punkcie 4.1.1³¹^,³²^,³.
2. Dodać GI254023X do 50 mL pożywki HAEC do końcowego stężenia 5 μM na 30 min.
3. Z zastosowaniem wstępnie zmieszanego związku GI254023X, będącego inhibitorem ADAM10 tłumiącym sygnalizację Notch, przeprowadzić te same eksperymenty z przepływem laminarnym lub pulsacyjnym, co w punkcie 4.1.1.
4. Ilościowo określić poziom ligandów Notch (Jag1, Jag2 i Dll4) oraz genów docelowych Notch (hairy and enhancer of split [Hes]) za pomocą qRT-PCR dla czterech grup próbek HAEC (przepływ laminarny, przepływ laminarny + GI254023X, przepływ pulsacyjny, przepływ pulsacyjny + GI254023X) opisanych wcześniej³².

5. Przywrócenie i nadekspresja sygnalizacji Notch

Wstrzyknąć 1 nL przygotowanego mRNA Nrg1 o stężeniu 5 pg/nL (z kroku 1.1.6) w stadium od 1 do 4 komórek wraz z MO gata1a, aby nadekspresować geny docelowe Notch²⁴.
W podobny sposób wstrzyknąć 1 nL mRNA Nrg1 do mutantów wea²⁴.
Podwoić stężenie mRNA Nrg1 (10 pg/nL) i wstrzyknąć²⁴ 1 nL do rybek zebrafish, aby zaobserwować morfologię komór.
Wstrzyknąć 1 nL mRNA EPO o stężeniu 20 pg/nL⁶ do zarodków zebrafish w stadium od 1 do 4 komórek w celu wzmocnienia hematopoezy i zwiększenia naprężenia ścinającego ścian (WSS) w komorach, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami²⁴.
Wstrzyknąć 1 nL 50 μM izoproterenolu⁷, który zwiększa szybkość kurczliwości, do pożywki E3 na 24 h podczas hodowli rybek zebrafish, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami²⁴.
Przeprowadzić obrazowanie 4-D LSFM dla każdej grupy. Postępować zgodnie z instrukcjami w krokach 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. Ilościowe określenie skrócenia frakcyjnego i zmiany objętości w czasie

Wykonaj obrazowanie 4-D LSFM dla każdej grupy w 50, 75 i 10 hpf. Postępuj zgodnie z instrukcjami w krokach 2.1.1–2.1.5.2.8. Podziel każdy obraz tak, aby każdy zawierał 60 węzłów w celu replikacji ruchu ścian serca.
Zmierz zmianę średnicy komory podczas rozkurczu i skurczu, stosując następujący wzór:
(3)
Wczytaj obrazy komór w 3D z interwałem 0,1 s do oprogramowania do wizualizacji i zmierz objętość.
Nanieś na wykres zmianę objętości w czasie dla każdej grupy doświadczalnej w 75. i 10. godzinie po zapłodnieniu (hpf).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano LSFM w celu uzyskania dwu- i trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości. Jak pokazano na Rysunku 1A i 1B, soczewka oświetlająca kieruje arkusz światła na próbkę. Ze względu na niewielką grubość arkusza światła, oświetlona zostaje tylko jedna płaszczyzna. Soczewka detekcyjna jest ustawiona prostopadle do soczewki oświetlającej i jest ogniskowana na oświetlonej płaszczyźnie (Rysunek 1B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole wykazaliśmy, że obrazowanie 4D może być wykorzystywane do śledzenia rozwoju sieci beleczkowej w odpowiedzi na zmiany sił biomechanicznych. W szczególności naprężenie ścinające doświadczane przez komórki śródbłonka inicjuje kaskadę sygnalizacyjną Notch, która z kolei sprzyja trabekulacji. W tym manuskrypcie wykazaliśmy, że (1) wstrzyknięcie GATA1a MO zmniejszyło hematopoezę, a zatem zmniejszyło naprężenie ścinające ścianę, (2) wstrzyknięcie TNNTT2a MO hamowało funkcję kurczliwości komór w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność Williamowi Talbotowi z Uniwersytetu Stanforda za dostarczenie stylu Human Nrg1 cDNA oraz Deborah Yelon z UCSD za dostarczenie wea mutantów. Autorzy chcieliby również podziękować Cynthii Chen za pomoc w pozyskiwaniu obrazu. Badanie to było wspierane przez granty NIH HL118650 (dla T.K. Hsiai), HL083015 (dla T.K. Hsiai), HD069305 (dla N.C. Chi i T.K. Hsiai), HL111437 (dla T.K. Hsiai i N.C. Chi), HL129727 (dla T.K. Hsiai), T32HL007895 (dla R.R. Sevag Packard), HL 134613 (dla V. Messerschmidta) oraz finansowanie University of Texas System STARS (dla J. Lee).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Premiks Clontech Hifi PCR	Takara	639298	PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Ludzki Nrg1 cDNA	Prezent od Williama Talbota, Uniwersytet Stanforda, Stanford, Kalifornia, USA	Nie dotyczy	Używany do ratownictwa trabekulacyjnego 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	1855201	Maszyna do PCR 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2	GE Health		Plazmid używany do syntezy mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Zestaw do oczyszczania nukleospiny	Clontech	740609.25	Oczyszczanie DNA 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
Ligaza DNA T4	Clontech	2011A	Roztwór do ligacji PCR 1.1.2.5
Gwiezdne kompetentne komórki	Clontech	636763	E. Komórki coli używane do transformacji 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Odczynnik do transfekcji 1.1.4
Zestaw mMessage SP6	Invitrogen	AM1340	Zestaw do syntezy mRNA 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820	Oczyszcza RNA 1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8	GeneTools	N/A	Oprogramowanie do projektowania starterów 1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA	Creative Biogene	CDFH006026	zwiększa WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478	Sigma-Aldrich	T4182	Inhibitor ErbB 1.3.1
E3 pożywka			Do hodowli zarodków 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942	γ-inhibitor sekretazy 1.3.2
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539	Służy do montażu zarodków 2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Cyfrowa kamera CMOS	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Służy do przechwytywania obrazów 2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software	FEI Software	Nie dotyczy	Wizualizacja i analiza obrazów w 3D i 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate	Sigma-Aldrich	886-86-2	Służy do humanitarnego uspokojenia lub uśmiercenia embrionów 3.1.1
Zestaw do syntezy cDNA iScript	Bio-Rad	1708890	syntetyzuje cDNA 3.1.2
Mikrowirówka Eppendorf 5424	Eppendorf	05-400-005	Mikrowirówka 4.1.1.3
GI254023X	Sigma-Aldrich	260264-93-5	Inhibitor ADAM10 4.1.2, 4.1.3
Chlorowodorek izoprenaliny	Sigma-Aldrich	I5627	Izoproterenol zwiększa WSS 5.1.5
MATLAB	Mathworks	N/A	Analiza mechaniki serca

Bibliografia

Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*¹, Zachary Bailey*¹, Kyung In Baek², Richard Bryant¹, Rongsong Li², Tzung K. Hsiai², Juhyun Lee¹

to:

Victoria Messerschmidt*¹, Zachary Bailey*¹, Kyung In Baek², Yichen Ding², Jeffrey J. Hsu², Richard Bryant¹, Rongsong Li², Tzung K. Hsiai², Juhyun Lee¹

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Tagi

Trabekulacja sygnalizacja Notch obrazowanie 4D morfolino Gata1a mRNA Nrg1 morfolino Tnnt2a si y hemodynamiczne

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego