Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Coraz powszechniejsze staje się używanie modeli mysich do naśladowania ludzkiej choroby nerek. Takie mysie modele obejmują spontaniczne modele, takie jak szczury z spontanicznym nadciśnieniem tętniczym (SHR)¹, szczury i myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ)² oraz myszy z cukrzycą typu db/db typu II³, modele modyfikowane genetycznie, takie jak modele pierwotnego ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych (FSGS) specyficzne dla podocytów⁴, model nokautu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A) (VEGF-A KO) specyficznego dla podocytów⁵ i modele zespołu Alporta⁶, oraz nabyte modele, takie jak nefrektomia 5/6⁷ i model jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO)⁸. Aby ocenić różne aspekty funkcji kłębuszków nerkowych w tych modelach, dostępnych jest kilka technik. Celem niniejszej pracy metodycznej jest zademonstrowanie kompleksowego badania, które należy przeprowadzić na mysich modelach choroby nerek, aby w pełni ocenić funkcję kłębuszków nerkowych.

Uzasadnieniem dla użycia tej metody jest to, że umożliwia ona pełną ocenę fenotypu kłębuszkowego pod wieloma względami. Obejmuje to ocenę przepuszczalności kłębuszków nerkowych, zarówno dla białka, jak i wody, nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych oraz zmian w ekspresji/splicingu mRNA i białek niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania kłębuszków nerkowych. Korzystając z tej metody, badacz jest w stanie określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Jest to istotna informacja na temat mechanizmu choroby, która jest niezbędna przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach.

W literaturze często występuje się z mysim modelem choroby kłębuszków nerkowych, gdzie fenotyp jest determinowany przez zwiększony poziom albuminy w moczu. Istnieją jednak dowody sugerujące, że pojedyncza metoda określania funkcji kłębuszków nerkowych nie zawsze jest skuteczna; pomiar szybkości wydalania albumin z moczem lub stosunku albuminy kreatyniny w moczu (uACR) dostarcza jedynie informacji o całkowitej funkcji nerek, a nie o poszczególnych kłębuszkach nerkowych. Wcześniejsze badania wykazały, że przepuszczalność może się różnić w różnych kłębuszkach nerkowych z tego samego nerki^5,9,10. Ponadto ocena przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych jest bardziej czułym sposobem oceny funkcji kłębuszków nerkowych; technika pomiaru przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych (L_pA/V_i) okazała się bardziej wrażliwa na zmiany funkcji kłębuszków nerkowych niż pomiar uACR⁹. Ten test jest korzystny w modelach mysich, które są odporne na białkomocz, takich jak te na tle c57BL/6 ¹¹. Zaletą niniejszej pracy metodologicznej jest to, że bada ona zarówno całkowitą przepuszczalność albuminy przez nerki, jak i indywidualną przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla wody.

Badanie nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych jest często oceniane na podstawie szeregu plam, takich jak kwasy okresowe Schiffa (PAS), plamy trichromowe i srebrne. Umożliwiają one przeszkolonemu patologowi nerek ocenę poziomu choroby nerek za pomocą metody punktacji. Chociaż wszystkie są dobrymi metodami, zmiany w makrostrukturze kłębuszków nerkowych nie zawsze są obserwowane w modelach ostrego uszkodzenia nerek¹². W metodzie tej proponuje się, aby oprócz przeprowadzenia opisanych powyżej technik histologicznych nerek, ultrastruktura kłębuszków nerkowych była również oceniana za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). Barwiony kłębuszek nerkowy może wyglądać stosunkowo normalnie pod zwykłym mikroskopem świetlnym; jednak po ocenie za pomocą EM analizowane są niewielkie zmiany szerokości błony podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM), zacierania się procesu stopy podocytów, fenestracji śródbłonka i pokrycia przestrzeni sub-podocytów. Dlatego ważne jest, aby ocenić zarówno ultrastrukturę, jak i mikrostrukturę kłębuszków nerkowych w celu określenia mechanizmu dysfunkcji kłębuszków nerkowych.

Oprócz oceny nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych, zmiany w ekspresji mRNA i białka oraz splicingu, a także aktywacji białek (np. fosforylacja), powinny być badane w celu dalszego wyjaśnienia mechanizmów choroby kłębuszków nerkowych. Patrząc na chorobę kłębuszków nerkowych lub, na przykład, gdy gen jest nadmiernie eksprymowany specyficznie w komórkach kłębuszków nerkowych, takich jak w myszy swoistej dla podocytów myszy VEGF-A VEGF-A class<="xref">5, ważne jest, aby zmiany białka i mRNA były badane tylko w komórkach kłębuszkowych, a nie w całej nerce. Protokół ten opisuje metodę, w której kłębuszki nerkowe są izolowane z kory nerkowej myszy, a następnie izolowane jest białko/RNA. Pozwala to na specyficzną analizę dysregulacji białka/mRNA w kłębuszkach nerkowych modelu choroby.

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych za pomocą jednej myszy. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjskim ustawodawstwem i zgodą lokalnej komisji etycznej. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu w Bristolu.

1. Stosunek kreatyniny albuminy w moczu (uACR)

UWAGA: uACR służy do oceny przepuszczalności GFB dla albuminy. Obecność albuminy w moczu wskazuje na zwiększoną przepuszczalność przez GFB, który jest znormalizowany do kreatyniny w celu kontrolowania zmian w szybkości przepływu moczu. Albuminuria jest częstym markerem przewlekłej choroby nerek.

1. Pobierać mocz na początku doświadczenia i w regularnych odstępach czasu (raz w tygodniu do raz w miesiącu) aż do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego.
2. Ustaw klatki metaboliczne myszy z wodą i dietą wzbogacającą. Umieść myszy (samce, w wieku 6 - 8 tygodni) w indywidualnych klatkach na 6 godzin w cichym pomieszczeniu.
3. Umieść myszy z powrotem w zwykłym pomieszczeniu i zbierz mocz z pustych klatek. Wymagane jest minimum 50 μl.
   UWAGA: Jeśli mysz nie oddaje moczu w podanym czasie, powtórz to innego dnia w cieplejszym pomieszczeniu.
4. Odwirować mocz o stężeniu 500 x g przez 10 min. Zebrać mocz i zatrzymać osad, aby ocenić utratę podocytów. W tym momencie należy przechowywać mocz w temperaturze -20 °C w krótkim czasie.
5. Rozcieńczyć mocz w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS pH 7,5) w rozcieńczeniu 1:500 do 1:10000, w zależności od nasilenia albuminurii.
   UWAGA: Objętość końcowa powinna wynosić >400 μl. Zoptymalizuj, aby określić właściwe rozcieńczenie w każdym punkcie czasowym.
6. Określ ilościowo stężenie albuminy w moczu za pomocą testu immunoenzymatycznego połączonego z albuminą myszy (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Krótko mówiąc, pokryj płytkę ELISA, która jest zoptymalizowana pod kątem wiązania białek, 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko albuminie myszy (10 μg/ml w 0,5 M węglanowo-wodorowęglanowym pH 9,6) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Nadmiar przeciwciał wypłukać ze studzienek pięciokrotnie 1x TBS plus 0,05% Tween (pH 8,0) i dodać 200 μl roztworu blokującego (1x TBS z 1% BSA pH 8,0) przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Umyć płytkę pięciokrotnie i dodać 100 μl wzorców (rozcieńczenie seryjne: 2000 μg/ml do 15,63 μg/ml w 1x TBS z 1% BSA, pH 8,0), ślepą próbę i rozcieńczone próbki w trzech powtórzeniach. Pozostaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umyj talerz pięć razy.
   1. Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego HRP do każdej studzienki (10 ng / ml w 1xTBS z 1% BSA, pH 8,0) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Umyj płytkę pięć razy i dodaj 100 μl roztworu substratu enzymatycznego do każdej studzienki. Pozostawić płytkę w ciemności do rozwinięcia na 15 minut i zatrzymać reakcję, dodając 100 μl 0,18 M kwasu siarkowego (_H2SO4).
      UWAGA: H₂SO₄ jest.
8. Oznaczyć stężenie albuminy w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 450 nm. Użyj krzywej standardowej, aby określić ilościowo albuminę obecną w każdej próbce. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.
9. Alternatywnie oceń stężenie albuminy w moczu za pomocą elektroforezy. Dodać 5 μl 4x buforu ładującego próbkę białka do 15 μl moczu. Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 10 minut, a następnie załadować je do 4-12% żelu prefabrykowanego Tris.
   1. Uruchom żel pod napięciem 100 V i zabarwij przez noc na niebiesko Coomassie zgodnie z protokołem producenta.
   2. Po zobrazowaniu żelu należy użyć densytometrii, aby ocenić stężenie albuminy zmiany fałdowania w stosunku do kontroli.
      UWAGA: Jeśli w oczekiwanym czasie nie zaobserwuje się żadnych prążków albuminy, należy ocenić stężenie białka w moczu i dostosować objętość moczu dodawanego do żelu.
10. Rozcieńczyć surową próbkę moczu w dH₂O w stosunku 1:1, 1:5 i 1:10,
    UWAGA: Objętość końcowa powinna wynosić >70 μl. Zoptymalizuj, aby określić właściwe rozcieńczenie każdej próbki.
11. Określ ilościowo stężenie kreatyniny w moczu za pomocą testu chemicznego zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu. Krótko mówiąc, załaduj 20 μl wzorców kreatyniny, ślepą próbę lub rozcieńczony mocz na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach.
12. Oznaczyć stężenie kreatyniny w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 490 nm przed i po dodaniu roztworu kwasu (UWAGA,; unikać kontaktu ze skórą).
    UWAGA: Różnica między wartościami absorbancji jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny w każdej próbce. Krzywa standardowa jest generowana na podstawie standardów. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.
13. Wygeneruj uACR (μg/mg). Znormalizuj dane do wartości bazowej każdej myszy w celu reprezentacji graficznej.

2. Pobieranie tkanek i krwi

UWAGA: Tkanka nerkowa i kłębuszkowa może być wykorzystana do oceny strukturalnych, białkowych i ekspresyjnych markerów mRNA choroby nerek. Krew może być wykorzystana do oceny markerów czynności nerek, takich jak kreatynina, która może być regulowana w górę w chorobie nerek, co wskazuje na zmniejszenie zdolności filtracji kłębuszków nerkowych.

1. Przygotować następujące roztwory: świeży 2,5% aldehyd glutarowy w 0,1 M kakodylanu sodu (pH 7,3), 4% paraformaldehyd w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), roztwór Ringera ssaków (115 mM chlorek sodu (NaCl), 10 mM octan sodu (CH₃COONa), 1,2 mM fosforan sodu (Na₂HPO₄), 25 MM wodorowęglan sodu (NaHCO₃), 1,2 mM siarczan magnezu (_MgSO4), 1 mM chlorek wapnia (CaCl₂), 5,5 mM D(+)glukozy, pH 7,4) z 1% BSA i 1x PBS.
   UWAGA: 2,5% aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Używaj w komorze wyciągowej. 0,1 M kakodylan sodu: toksyczny, stosować w komorze wyciągowej. 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
2. Przygotuj następujące materiały: izofluran, małe probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), igły 23 - 25 G, strzykawki powlekane EDTA 5 ml, szklane fiolki 10 ml, plastikowe fiolki 10 ml, plastikowe probówki 0,5 ml, jednorazowe formy do tkanek, suchy lód, płynny N₂, mysie narzędzia chirurgiczne i optymalne medium do cięcia (OCT).
3. Umieść mysz w głębokim znieczuleniu, które jest weryfikowane przez to, że mysz nie reaguje na ukłucie igłą w opuszkę stopy, przy użyciu komory izofluranowej lub równoważnych dróg znieczulenia końcowego, takich jak środki znieczulające do wstrzykiwań (pentobarbital, 50 mg/kg dootrzewnowo [IP]; avertyna, 240 mg/kg IP) lub narażenie na dwutlenek węgla (CO₂) (75% CO₂ / 25% O₂).
4. Usuń mysz przez nakłucie serca do lewej komory i zbierz jak najwięcej krwi. Przenieść do probówki z krwią pokrytej EDTA na okres do 4 godzin. Jeśli jest to preferowane, myszy można usunąć przez zwichnięcie szyjki macicy, uważając, aby nie pękła żyła szyjna.
5. Wypreparuj nerki przez jamę brzuszną i umyj w lodowatym chłodzie 1x PBS.
6. Aby zbadać kłębuszki korowe, usuń jeden biegun kory nerkowej i pokrój na 1 mm³ kawałki. Aby zbadać głębokie kłębuszki krępkowe juxta-mecury, powtórz tę samą technikę z tkanką z rdzenia. Umieścić w 5 ml 2,5% roztworu aldehydu glutarowego w szklanej fiolce EM. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: 2,5% roztwór aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Zastosowanie w dygestorio
   UWAGA: Przetwórz w ciągu 1 miesiąca, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
7. W przypadku badania histologicznego należy usunąć górną trzecią część nerki, aby upewnić się, że obecne będą zarówno kłębuszki korowe, jak i kłębuszki szpikowe, a następnie utrwalić w 5 ml 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przenieść do 5 ml 70% EtOH na 24 godziny przed zatopieniem w parafinie.
   UWAGA: 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
8. W celu immunofluorescencji umieść jedną trzecią nerki, aby upewnić się, że zarówno kłębuszki korowe, jak i rdzeniste będą obecne, w pleśni tkankowej i pokryciu w OCT. Umieść na suchym lodzie do zamrożenia i przechowuj w temperaturze -80 °C.
9. W przypadku białka i RNA umieść 3 x 2 mm³ kawałki kory nerkowej w plastikowych probówkach o pojemności 0,5 ml i zamroź błyskawicznie w płynie N₂. Przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania tkanki RNA należy umieścić tkankę w 5 objętościach roztworu stabilizującego RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
10. W celu wyizolowania kłębuszków nerkowych należy pokroić pozostałą tkankę nerkową i umieścić w 5 ml roztworu Ringera u ssaków z 1% BSA na lodzie. Przygotuj się do natychmiastowego przesiania kłębuszków nerkowych.

3. Kreatynina w osoczu

UWAGA: Stężenie kreatyniny w osoczu może być regulowane w górę w chorobach nerek, co wskazuje na zmniejszenie zdolności filtracji kłębuszków nerkowych. Można również ocenić poziom azotu mocznikowego (BUN) we krwi, chociaż protokół nie jest tutaj opisany.

1. Odwirować próbkę krwi o masie 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
2. Pobrać osocze, które w tym momencie może być przechowywane w temperaturze -20 °C w krótkim okresie.
3. Określ ilościowo stężenie kreatyniny w osoczu za pomocą chemicznego testu kreatyniny zgodnie z powyższymi instrukcjami dla kreatyniny w moczu w protokole 1.11.
4. Oznaczyć stężenie kreatyniny w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 490 nm przed i po dodaniu roztworu kwasu.
   UWAGA: Różnica między tymi wartościami absorbancji jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny w każdej próbce. Krzywa standardowa jest generowana na podstawie standardów. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.

4. Izolacja kłębuszków nerkowych

UWAGA: Kłębuszki nerkowe mogą być izolowane w celu oceny przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych ex vivo, jak również ekspresji specyficznych markerów białkowych i mRNA choroby kłębuszków nerkowych.

1. Pobrać tkankę nerkową umieszczoną w roztworze Ringera ssaków z 1% BSA i rozciąć kłębuszki nerkowe przy użyciu standardowej techniki przesiewania¹³. Krótko mówiąc, ułóż sita o średnicy 70 μm (na dole), 100 μm, 125 μm, 175 μm, 250 μm i 425 μm (na górze) na szklanej zlewce.
2. Rozgnieć nerkę za pomocą tłoka strzykawki na sito 425 μm i przepchnąć za pomocą lodowatego roztworu Ringera ssaków z 1% BSA. Gdy kawałki nerki zostaną przepchnięte, usuń górne sito i przystąp do zrobienia tego samego na następnym. Powtarzać tę czynność, aż pozostaną tylko sita 100 μm i 70 μm.
3. Przenieść plon kłębuszków nerkowych zatrzymany przez sita 100 μm i 70 μm do 10 ml świeżego roztworu Ringera u ssaków z 1% BSA, na lodzie.
   UWAGA: Jeśli liczba kłębuszków nerkowych na ml roztworu Ringera jest niewielka, należy zmniejszyć objętość roztworu Ringera użytego do zebrania kłębuszków nerkowych z dwóch ostatnich sit.
4. Pobrać 5 ml roztworu zawierającego kłębuszki nerkowe do dwóch oddzielnych probówek (po 2,5 ml każda) i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i błyskawicznie zamrozić kłębuszki nerkowe w płynie_N2 przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji białka i RNA w późniejszym terminie.
5. Umieścić pozostały roztwór zawierający kłębuszki nerkowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu zmierzenia kłębuszków nerkowych L_pA/V_i ex vivo. Zakończyć w ciągu 3 godzin od usunięcia nerki.

5. Przepuszczalność wody kłębuszkowej (L_pA/V_i)

UWAGA: Test kłębuszkowy L_pA/V_i umożliwia pomiar ex vivo przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych w szybki i powtarzalny sposób. Wzrost kłębuszkowego L_pA/V_i wskazuje na zaburzenie GFB, co sugeruje chorobę nerek.

1. Ustaw zestaw kłębuszkowy L_pA/V_i zgodnie z opisem w Salmon et al¹⁰. Proszę zapoznać się z Rysunek 1, aby uzyskać szczegółowy schemat konfiguracji.
2. Przygotować następujące roztwory: roztwór Ringera dla ssaków z 1% BSA (pH 7,4) i roztwór Ringera dla ssaków z 8% BSA (pH 7,4). Podgrzać oba do 37 °C.
3. Wyciągnąć mikropipety ze szklanych kapilar (gęstość optyczna: 1,2 mm). Wygeneruj końcówkę o aperturze 5 - 8 μm, przecinając mikropipetę pod mikroskopem.
4. Użyj zestawu kłębuszkowego L_pA/V_i, aby złapać nienaruszone pojedyncze kłębuszki nerkowe, które są wolne od kapsułki Bowmana i fragmentów rurkowych, na mikropipetę za pomocą odsysania. Szczegółowe podsumowanie testu onkometrycznego znajduje się w Salmon et al¹⁰. Krótko mówiąc, gdy kłębuszek nerkowy zostanie złapany i zabezpieczony na mikropipecie ssącej, zacznij nagrywać wideo kłębuszków nerkowych pod mikroskopem.
5. Po pierwsze, należy zrównoważyć kłębuszki nerkowe w 1% roztworze Ringera BSA przez 30 s, a następnie zmienić peryfuzat na stężony 8% roztwór Ringera BSA na 10 s. Następnie przełącz peryfuzat z powrotem na 1% roztwór BSA Ringera i zatrzymaj nagrywanie.
6. Zmyj kłębuszki nerkowe i powtórz proces dla 10 - 15 kłębuszków na mysz. Upewnij się, że natężenia przepływu peryfuzatu są identyczne i nie są zbyt szybkie (10 ml/min), aby nie zniekształcić struktury kłębuszków nerkowych.
7. Zmierzyć początkową szybkość skurczu kłębuszków nerkowych, aby obliczyć przepuszczalność wody w kłębuszkach nerkowych (L_pA) znormalizowaną do objętości kłębuszków nerkowych (V_i). Szczegółowe informacje na temat analizy można znaleźć w Salmon et al¹⁰.

6. Plama Schiffa spowodowana kwasem okresowym (PAS)

UWAGA: Plama PAS uwydatni błony podstawne pętli kapilarnych kłębuszków nerkowych i nabłonek rurkowy. Umożliwia szczegółową wizualizację komórek kłębuszków nerkowych, macierzy mezangialnej i ekspansji potencjału oraz potencjalnych zmian GBM (tj. zgrubień i nierówności).

1. Przeciąć zatopioną w parafinie, utrwaloną w PFA korę nerkową za pomocą mikrotomu o grubości 5 μm na szkiełka pokryte poli-L-lizyną. Suszyć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Upewnij się, że sekcja nie zawiera żadnych fałd ani otworów, które mogą zniekształcić morfologię pod mikroskopem.
2. Deparafinizować szkiełka poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorio) przez 3 minuty każde, dwa razy w 100% EtOH przez 3 minuty każde, a następnie raz w 95%, 70% i 50% EtOH przez 3 minuty każde, wszystko w temperaturze pokojowej. Ponownie nawodnić szkiełka w dH₂O.
3. Inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorium) (1 g/dl) przez 5 minut, a następnie płukać szkiełka w kilku zmianach_dH2O. Użyć pojemnika ze 100 ml dH₂O w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: roztwór kwasu okresowego: drażniący; Użyj w komorze wyciągowej
4. Inkubować szkiełka w odczynniku Schiffa (chlorowodorek parasoaniliny 6 g/l i pirosiarczyn sodu 4% w HCl 0,25 mol/l) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
5. Przeciwbarwienie hematoksyliną przez 3 sekundy przed dokładnym spłukaniem szkiełek pod bieżącą wodą z kranu przez 15 min.
   UWAGA: Może być wymagana pewna optymalizacja w celu określenia optymalnego czasu barwienia hematoksyliny.
6. Odwadnianie szkiełek przy użyciu odwrotności protokołu deparafiniowania w kroku 6.2. Na koniec posyp ksylenem.
7. Suche na powietrzu prowadnice i montaż za pomocą nośników montażowych na bazie ksylenu.
8. Obraz pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 400x w celu oceny struktur kłębuszkowych. Oceń następujące elementy: pogrubienie i nieprawidłowości GBM, zapadanie się pętli naczyń włosowatych, tkanka zwłóknieniowa, stwardnienie rozsiane, proliferacja komórkowa (śródbłonek, podocyty i mezangia lub komórki zapalne naciekające kępkę).
   UWAGA: W celu kompleksowej oceny patofizjologii kłębuszków nerkowych należy ocenić zmiany chorobowe w innych częściach nerek, na przykład w kanalikach.

7. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

UWAGA: TEM pozwala na badanie ultrastrukturalnych nieprawidłowości w nerkach, takich jak GBM, wyrostki stopy podocytów i fenestracje śródbłonka, które nie są widoczne za pomocą mikroskopu świetlnego. Jest to ważne w modelach, w których uszkodzenie nerek nie jest tak wyraźne (tj. brak albuminurii i poważnych nieprawidłowości strukturalnych).

1. Weź 2,5% pokrojoną w kostkę nerkę gluteraldehdye i po utrwaleniu w 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę. Przemyj 50 ml 0,1 M buforu kakodylowego (pH 7,3), a następnie 50 ml dH₂O (3 x 15 min zmiany).
   UWAGA: 2,5% aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Używaj w komorze wyciągowej. 0,1 M kakodylan sodu: toksyczny, stosować w komorze wyciągowej
2. Odwodnić za pomocą EtOH i zatopić w żywicy Araldite.
3. Wyciąć odcinki o grubości 50 - 100 nm i zabarwić 3% (wodnym) octanem uranylu i roztworem cytrynianu ołowiu Reynoldsa.
4. Wykonaj cyfrowe mikrofotografie kilku obszarów kłębuszków nerkowych przy 940X, 1250X i 6200X, aby upewnić się, że podocyty, GEnC, GBM i mesangium można zidentyfikować.
5. Użyj ImageJ, aby przeanalizować zaślepione kłębuszki nerkowe. Ustaw skalę dla każdego mikrografu 6200x, rysując linię między dwoma punktami o znanej odległości, takimi jak linijka. Przejdź do analizy, a następnie ustaw skalę, gdzie długość linii będzie wyświetlana w pikselach. Wpisz znaną odległość i jednostki miary. Do pomiaru każdego parametru należy użyć protokołów wymienionych poniżej.
   UWAGA: Ta analiza wymaga około 1 dnia na mysz. Aby uzyskać odpowiednią moc statystyczną, użyj średnich pomiarów z 3 kłębuszków nerkowych z 3 myszy.
   1. W przypadku GBM włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X i zmierz grubość GBM w punkcie, w którym linie siatki przecinają GBM. Zmierz od błony komórkowej śródbłonka podstawy do błony komórkowej podstawy stopy podocytów w prostopadłej stycznej do błony komórkowej śródbłonka za pomocą narzędzia do linii prostej. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
   2. Aby uzyskać numer okienka śródbłonka, zmierz długość GBM obecnego na mikrofotografii 6200X i policz liczbę okien śródbłonka na jednostkę długości GBM. Weź średnią z co najmniej 4 mikrofotografii na kłębuszek nerkowy.
   3. Aby uzyskać szerokość stopy podocytów, włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X. Zmierz szerokość wyrostków stopy podocytów, które przecinają linie siatki. Zmierz szerokość w najszerszej części wyrostka stopy, w miejscu, w którym styka się z GBM; Upewnij się, że linia jest prostopadła do stycznej błony podstawnej podocytów. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
   4. Aby uzyskać szerokość szczeliny podocytów, włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X. Zmierz szerokość membran szczelinowych podocytów, które przecinają linie siatki. Jest to punkt, w którym wyrostki stopy są najbliżej siebie, w najszerszej części każdego wyrostka stopy, od błony podocytów do błony. Upewnij się, że pomiar jest prostopadły do stycznej błony podstawnej podocytów. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
   5. Aby uzyskać liczbę wyrostków stopy podocytów, zmierz długość GBM obecnego na mikrofotografii 6200X i policz liczbę wyrostków stopy podocytów na jednostkę długości GBM. Weź średnią z co najmniej 4 mikrofotografii na kłębuszek nerkowy.
   6. Aby uzyskać informacje na temat pokrycia przestrzeni sub-podocytów, zobacz szczegółową metodę w Neal et al. ¹⁴.
6. Korzystając z mikrofotografii 940X, zbadaj kłębuszki nerkowe pod kątem obecności nieprawidłowej struktury, złogów i nacieków przez oko.

8. Immunofluorescencja markerów podocytów i śródbłonka

UWAGA: Barwienie immunologiczne pozwala na wizualizację wzorców ekspresji białek, takich jak śródbłonkowe pętle naczyń włosowatych, które mogą się załamać w chorobie kłębuszków nerkowych.

1. Umieścić formę OCT zawierającą zamrożoną nerkę w temperaturze -20 °C na 2 godziny przed sekcją. Upewnij się, że powierzchnia cięcia nerki jest ostrożnie umieszczona na dnie formy OCT, aby umożliwić dobrze zorientowane sekcje tkanki.
2. Za pomocą kriostatu przeciąć tkankę o grubości 5 μm na szkiełka pokryte poli-L-lizyną.
   UWAGA: Upewnij się, że w sekcji tkanki nie ma fałd ani, które mogą zniekształcić morfologię.
3. Po wyjęciu z kriostatu utrwalić szkiełka w 4% PFA przez 10 min. Szkiełka myć 3 x 5 min w pojemniku ze 100 ml dH₂O.
   UWAGA: 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
4. Aby zminimalizować ilość użytego przeciwciała, narysuj skrawki za pomocą hydrofobowego pisaka. Nie pozwól, aby sekcje wyschły.
5. Inkubować w roztworze blokującym (3% BSA i 5% normalnej surowicy w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Usunąć roztwór blokujący za pomocą aspiratora i inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem (nefryną, podocyną lub PECAM-1) rozcieńczonym w stosunku 1:250 (3% BSA w 1x PBS). Umieścić szkiełka podstawowe w nawilżonej komorze w temperaturze 4 °C na noc. Jeśli wilgotna komora nie jest dostępna, delikatnie umieść mały pasek parafilmu na szkiełku pokrytym przeciwciałami. Zachowaj ostrożność podczas usuwania następnego dnia, aby nie zakłócić sekcji.
7. Mycie szkiełek 3 x 5 min w 1x PBS.
8. Inkubować z odpowiednim fluorescencyjnym rozcieńczeniem przeciwciał drugorzędowych w stosunku 1:1000 (3% BSA w 1x PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
9. Mycie szkiełek 3 x 5 min w 1x PBS. Zamontuj za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych zawierających DAPI.
10. Obraz jest przesuwany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 400-krotnym powiększeniu, aby zobaczyć kłębuszki nerkowe. Upewnij się, że jest to zaślepione, aby uniknąć stronniczości.
11. Użyj ImageJ, aby przeanalizować intensywność barwienia, znormalizowaną do obszaru kłębuszków nerkowych, oraz wzór barwienia, tj. liczbę pętli kapilarnych znormalizowanych do obszaru kłębuszkowego, w sposób zaślepiony.

9. Ekstrakcja białka i Western Blotting

UWAGA: Western blotting pozwala nam ocenić ekspresję białek, o których wiadomo, że są rozregulowane w chorobie nerek. Na przykład zmniejszenie ekspresji podocyny i nefryny wskazuje na utratę podocytów.

1. Ekstrahuj białko z kory nerkowej i przesianych kłębuszków nerkowych; protokół jest taki sam dla każdego z nich, a objętość buforu do lizy jest dostosowana do ilości tkanki.
2. Rozmrozić nerki/kłębuszki nerkowe/kłębuszki na lodzie przed dodaniem buforu do lizy NP-40 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy. Homogenizować próbkę przez 30 s.
3. Homogenizowane próbki inkubować na lodzie przez 30 minut, wirując w regularnych odstępach czasu.
4. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Usunąć sklarowany osad do świeżej probówki na lodzie.
   UWAGA: należy spodziewać się odzyskania około 1 mg białka na próbkę.
6. Denaturacja białek za pomocą standardowego buforu 4x Laemmli. Gotować mieszaninę w temperaturze 95 - 100 °C przez 5 minut.
7. Ocenić ekspresję białek markerowych komórek kłębuszkowych (nefryna, podocyna, PECAM-1 itp.) oraz fosforylację i ekspresję białek, o których wiadomo/przypuszczalnie są zmienione w nerkach/kłębuszkach nerkowych modelu choroby przy użyciu Western blot (metoda standardowa; Mahmood i Yang¹⁵).
   UWAGA: Protokół będzie się różnił w zależności od wielkości i obfitości interesującego nas białka.

10. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

UWAGA: analiza ekspresji mRNA pozwala nam określić, w jaki sposób geny są regulowane w chorobie nerek, takie jak zmiany w ekspresji genów i alternatywne splicing.

1. Podczas gdy kora nerkowa jest jeszcze zamrożona, dokładnie zmiel 3 ml odczynnika fenolowego za pomocą tłuczka i moździerza. W przypadku stosowania ekstraktów kłębuszkowych dodać 1 ml odczynnika fenolowego i homogenizować próbkę przez 30 s.
   UWAGA: odczynnik TRIzol: drażniący; Użyj w komorze wyciągowej
2. Przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą opisaną przez Chomczyńskiego i Sacchi¹⁶.
   UWAGA: Jako alternatywę dla tej metody dostępne są komercyjne zestawy do ekstrakcji RNA.
3. Oceń ilość i jakość RNA uzyskanego przy użyciu jednej z różnych dostępnych metod. W tym momencie RNA jest podawany i przechowywany w temperaturze -80 °C. Unikaj wielokrotnego rozmrażania przez zamrażanie.
   UWAGA: Jeśli jesteś nowy w tej metodzie, sprawdź jakość RNA przed przejściem do następnego kroku, uruchamiając RNA na żelu agarozowym, aby zapewnić wyraźne pasmo rybosomalne 28S i 18S. Spodziewaj się odzyskania od 2 do 5 μg RNA przy użyciu tej metody.
4. Traktować 1 μg RNA przez DNazę (uzupełnić objętość do 10 μl wodą wolną od RNaz plus 1 μl DNazy i 1 μl buforu DNazy) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję 1 μl roztworu zatrzymującego DNazę w temperaturze 65 °C na 10 min.
5. Dodać 0,5 μl oligo (dT) i losowe startery. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
6. Natychmiast schłodzić na lodzie przez 5 minut.
7. Dodaj następujące elementy; enzym odwrotnej transkryptazy MMLV (400 U; zastąpić DEPC_H2Ow próbce kontrolnej RT), bufor MMLV (1x), mieszanina dNTP (0,5 mM) i inhibitor rybonukleazy (40 U); uzupełnić do 50 μl wodą DEPC.
8. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji enzymu.
   UWAGA: Aby uzyskać wyższą wydajność cDNA, inkubować w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 3 godziny.
9. Oceń ilość i jakość cDNA przy użyciu różnych dostępnych metod.
10. Użyj PCR do oceny ekspresji mRNA i wzorców splicingu genów, co do których istnieje hipoteza, że są rozregulowane w modelu choroby kłębuszków nerkowych. Protokół będzie się różnić w zależności od interesującego genu.

Mocz został zebrany za pomocą klatek metabolicznych z dzikich typów (WT), indukowalnych podocytów specyficznych dla VEGF-A knock out (VEGF-A KO) i VEGF-A KO X Neph-VEGF165b myszy (myszy VEGF-A KO, które nadmiernie eksprymują ludzką izoformę VEGF-A165b w podocytach w sposób konstytutywny). Po pomiarze stosunku kreatyniny albuminy w moczu w tygodniach 0, 4, 10 i 14 po indukcji doksycykliny VEGF-A KO, VEGF-A KO myszy rozwinęły postępującą albuminurię o 10 tygodni w porównaniu z kontrolami z miotu WT. Wartości bezwzględne można zobaczyć w Rysunek 2A, a znormalizowane do linii bazowej wartości każdej myszy w Rysunek 2B. Jednak albuminurii nie zaobserwowano u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 2), co wskazuje, że VEGF-A165b działa ochronnie w modelu albuminurii5.

Kłębuszkowe LpAVi zostało zmierzone w pojedynczych kłębuszkach przesianych z nerek WT, VEGF-A KO i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. Przykład tego, w jaki sposób chwyta się kłębuszki nerkowy i kurczenie się obserwuje się po peryfuzji z 8% BSA, pokazano w Rysunek 3A. Skurcz ten jest następnie wykorzystywany do wyznaczenia kłębuszkowego LpA/Vi dla każdego kłębuszka nerkowego (Rysunek 3B). Myszy VEGF-A KO miały znacznie zwiększone ląbuszkowe LpA / Vi po 14 tygodni po indukcji VEGF-KO w porównaniu z kłębuszkami nerkowymi WT. Chociaż niższy u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, zwiększona kłębuszkowa LpA/ V i nie została zapokojona przez nadmierną ekspresję VEGF-A165b po 14 tygodniach5.

Barwienie PAS odcinków kory nerkowej 14 tygodni po indukcji VEGF-A KO nie wykazało żadnych nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych u myszy VEGF-A KO lub VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 4A). Jednak po analizie ultrastruktury kłębuszków nerkowych za pomocą EM, myszy VEGF-A ko rozwinęły zwiększoną szerokość GBM, zmniejszoną liczbę okien śródbłonka, zmniejszone pokrycie SPS i zwiększoną średnią szerokość szczeliny podocytów (Rysunek 4C-4F). Średnia szerokość wyrostka stopy podocytów i liczba szczelin pozostały niezmienione (Ryc. 3B i 3G). Nadmierna ekspresja VEGF-A165b u myszy VEGF-A KO zapobiegła zmianom GBM i szerokości szczeliny (Rysunek 4C i 4F). Jednak VEGF-A165b nie miał wpływu na zmienioną liczbę okien i pokrycie SPS (Rysunek 4D i 4E)5.

RT-PCR przeprowadzony na RNA wyekstrahowanym z przesianych kłębuszków nerkowych ujawnił, że ludzkie mRNA VEGF-A165b jest obecne tylko u myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 5A). Podczas ekstrakcji białka z przesianych kłębuszków nerkowych i oceny poziomów białek za pomocą Western blotting stwierdzono, że ekspresja białka kłębuszkowego VEGFR-2 była zmniejszona u myszy VEGF-A KO, czemu zapobiegła nadmierna ekspresja VEGF-A165b (Rysunek 5B i 5C)5.

Rysunek 1. Schematyczne rozmieszczenie zestawu do pomiaru przepuszczalności kłębuszków nerkowych (LpA). (A) Kłębuszek nerkowy jest zaczepiany o (B) mikropipetę w uchwycie za pomocą ssania, które jest zaciśnięte na uchwycie w celu zapewnienia stabilności. (C) Prostokątny mikroszkiełko. (D) Obiektyw 4X mikroskopu z kamerą wideo. (E) 1% roztwór BSA ogrzany do 37 °C. (F) 8% roztwór BSA ogrzany do 37 °C. (G) Zdalny kran wyposażony w dwie linie zawierające peryfuzat, który umożliwia szybką wymianę peryfuzatu. (H) Droga peryfuzatu w kierunku mikroszkiełka, które następnie kąpie kłębuszki nerkowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Stosunek kreatyniny albuminy w moczu. (A) Wartości uACR w tygodniach 0, 4, 10 i 14 po indukcji VEGF-A KO u myszy WT, VEGF-A KO i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. (B) Te same wartości uACR znormalizowane do wartości wyjściowej (tydzień 0) dla każdej myszy z osobna. UACR znacznie wzrósł u myszy VEGF-A KO w 10 i 14 tygodniu w porównaniu z kontrolami z miotu WT, czemu zapobieżono u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p <0,05; Dwukierunkowa ANOVA, poprawka do porównania między parami; n = 4 - 12 myszy na punkt czasowy; słupki błędów: błąd standardowy średniej [SEM]). Ten rysunek został zmodyfikowany z Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Pomiar przepuszczalności wody kłębuszkowej. (A) Kłębuszki nerkowy wychwytuje się na mikropipecie poprzez odsysanie; peryfuzat jest przełączany z 1% BSA (Ai) na 8% BSA (Aii) i obserwuje się skurcz kłębuszków nerkowych. (B) Pomiary wykonane przed i po zmianie 8% BSA stosuje się do wyznaczenia kłębuszkowego LpA/Vi. (C) Myszy VEGF-A ko rozwijają zwiększone kłębuszkowe LpA/ V i po 14 tygodniach od indukcji VEGF-A KO w porównaniu z kontrolami WT. Nie udało się temu znacząco zapobiec u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p <0,05; Jednokierunkowa poprawka ANOVA, Bonferroni do porównania par; n = 4 - 9 myszy, 15 - 30 kłębuszków nerkowych; słupki błędów: SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Kłębuszkowa analiza strukturalna. (A) Barwienie kory nerkowej PAS nie wykazało żadnych nieprawidłowości strukturalnych w kłębuszkach nerkowych od myszy WT, VEGF-A KO i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ujawnił nieprawidłowości ultrastrukturalne w kłębuszkach nerkowych VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) Średnia FPW nie zmieniła się między grupami. (C) GBM zwiększył się w kłębuszkach nerkowych VEGF-A KO, czemu zapobiegł VEGF-A165b. (D) Liczba okienek uległa zmniejszeniu w kłębuszkach nerkowych VEGF-A KO, które pozostały niezmienione przez VEGF-A165b. E) Zasięg SPS został zmniejszony w kłębuszkach VEGF-A KO, który również pozostał niezmieniony przez VEGF-A165b. (F) Średnia szerokość szczeliny została zwiększona w kłębuszkach VEGF-A KO, czemu zapobiegł VEGF-A165b. (G) Liczba szczeliny pozostała niezmieniona między trzema grupami (*p <0,05; Jednokierunkowa poprawka ANOVA, Bonferroni do porównania par; n = 3 myszy, 9 kłębuszków nerkowych; słupki błędów: SEM). Ten rysunek został zmodyfikowany z Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Ekspresja mRNA i białek markerów. (A) RT-PCR wykazał, że ludzka ekspresja mRNA VEGF-A165b była widoczna tylko w przesianych kłębuszkach nerkowych od myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b. (B) Western blot wykazał, że ekspresja białka VEGFR-2 była obniżona w kłębuszkach nerkowych VEGF-A KO, czemu zapobiegano w kłębuszkach nerkowych VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (*p <0,05; Jednokierunkowa poprawka ANOVA, Bonferroni do porównania par; n = 3-6 myszy; słupki błędów: SEM). Ten rysunek został zmodyfikowany z Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.