Artykuł metodologiczny

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

21.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57764

⸱

30 czerwca 2018

 , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, University of Exeter, 2School of Physiology, Pharmacology and Neurosciences, University of Bristol, 3Bristol Renal, School of Clinical Sciences, University of Bristol

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Streszczenie

Coraz powszechniejsze staje się używanie modeli mysich do naśladowania ludzkiej choroby nerek. Nasze badania koncentrują się na ocenie funkcji kłębuszków nerkowych u myszy z nefropatią cukrzycową i myszami z nokautem VEGF-A specyficznymi dla podocytów; Dlatego ten protokół opisuje pełne badanie nerek stosowane w naszym laboratorium do oceny tych mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych od jednej myszy. W porównaniu z alternatywnymi metodami oceny funkcji kłębuszków nerkowych przedstawionymi w literaturze, zastosowanie metody opisanej w niniejszej pracy umożliwia pełną ocenę fenotypu kłębuszków nerkowych pod wieloma względami. Korzystając z tej metody, badacz może określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Te istotne informacje na temat mechanizmu choroby są niezbędne przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach. Metody te pozwalają na szczegółową ocenę funkcjonalną bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez pomiar stosunku albuminy kreatyniny w moczu oraz przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych, a także badanie strukturalne i ultrastrukturalne z wykorzystaniem mikroskopii barwnikowej i elektronowej Schiffa z zastosowaniem kwasu okresowego Schiffa. Ponadto analiza genów rozregulowanych na poziomie mRNA i białka umożliwia mechanistyczną analizę funkcji kłębuszków nerkowych. Protokół ten przedstawia ogólne, ale możliwe do dostosowania metody, które można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Wprowadzenie

Coraz powszechniejsze staje się używanie modeli mysich do naśladowania ludzkiej choroby nerek. Takie mysie modele obejmują spontaniczne modele, takie jak szczury z spontanicznym nadciśnieniem tętniczym (SHR)1, szczury i myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ)2 oraz myszy z cukrzycą typu db/db typu II3, modele modyfikowane genetycznie, takie jak modele pierwotnego ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych (FSGS) specyficzne dla podocytów4, model nokautu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A) (VEGF-A KO) specyficznego dla podocytów5 i modele zespołu Alporta6, oraz nabyte modele, takie jak nefrektomia 5/67 i model jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO)8. Aby ocenić różne aspekty funkcji kłębuszków nerkowych w tych modelach, dostępnych jest kilka technik. Celem niniejszej pracy metodycznej jest zademonstrowanie kompleksowego badania, które należy przeprowadzić na mysich modelach choroby nerek, aby w pełni ocenić funkcję kłębuszków nerkowych.

Uzasadnieniem dla użycia tej metody jest to, że umożliwia ona pełną ocenę fenotypu kłębuszkowego pod wieloma względami. Obejmuje to ocenę przepuszczalności kłębuszków nerkowych, zarówno dla białka, jak i wody, nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych oraz zmian w ekspresji/splicingu mRNA i białek niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania kłębuszków nerkowych. Korzystając z tej metody, badacz jest w stanie określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Jest to istotna informacja na temat mechanizmu choroby, która jest niezbędna przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach.

W literaturze często występuje się z mysim modelem choroby kłębuszków nerkowych, gdzie fenotyp jest determinowany przez zwiększony poziom albuminy w moczu. Istnieją jednak dowody sugerujące, że pojedyncza metoda określania funkcji kłębuszków nerkowych nie zawsze jest skuteczna; pomiar szybkości wydalania albumin z moczem lub stosunku albuminy kreatyniny w moczu (uACR) dostarcza jedynie informacji o całkowitej funkcji nerek, a nie o poszczególnych kłębuszkach nerkowych. Wcześniejsze badania wykazały, że przepuszczalność może się różnić w różnych kłębuszkach nerkowych z tego samego nerki5,9,10. Ponadto ocena przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych jest bardziej czułym sposobem oceny funkcji kłębuszków nerkowych; technika pomiaru przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych (LpA/Vi) okazała się bardziej wrażliwa na zmiany funkcji kłębuszków nerkowych niż pomiar uACR9. Ten test jest korzystny w modelach mysich, które są odporne na białkomocz, takich jak te na tle c57BL/6 11. Zaletą niniejszej pracy metodologicznej jest to, że bada ona zarówno całkowitą przepuszczalność albuminy przez nerki, jak i indywidualną przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla wody.

Badanie nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych jest często oceniane na podstawie szeregu plam, takich jak kwasy okresowe Schiffa (PAS), plamy trichromowe i srebrne. Umożliwiają one przeszkolonemu patologowi nerek ocenę poziomu choroby nerek za pomocą metody punktacji. Chociaż wszystkie są dobrymi metodami, zmiany w makrostrukturze kłębuszków nerkowych nie zawsze są obserwowane w modelach ostrego uszkodzenia nerek12. W metodzie tej proponuje się, aby oprócz przeprowadzenia opisanych powyżej technik histologicznych nerek, ultrastruktura kłębuszków nerkowych była również oceniana za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). Barwiony kłębuszek nerkowy może wyglądać stosunkowo normalnie pod zwykłym mikroskopem świetlnym; jednak po ocenie za pomocą EM analizowane są niewielkie zmiany szerokości błony podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM), zacierania się procesu stopy podocytów, fenestracji śródbłonka i pokrycia przestrzeni sub-podocytów. Dlatego ważne jest, aby ocenić zarówno ultrastrukturę, jak i mikrostrukturę kłębuszków nerkowych w celu określenia mechanizmu dysfunkcji kłębuszków nerkowych.

Oprócz oceny nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych, zmiany w ekspresji mRNA i białka oraz splicingu, a także aktywacji białek (np. fosforylacja), powinny być badane w celu dalszego wyjaśnienia mechanizmów choroby kłębuszków nerkowych. Patrząc na chorobę kłębuszków nerkowych lub, na przykład, gdy gen jest nadmiernie eksprymowany specyficznie w komórkach kłębuszków nerkowych, takich jak w myszy swoistej dla podocytów myszy VEGF-A VEGF-A class<="xref">5, ważne jest, aby zmiany białka i mRNA były badane tylko w komórkach kłębuszkowych, a nie w całej nerce. Protokół ten opisuje metodę, w której kłębuszki nerkowe są izolowane z kory nerkowej myszy, a następnie izolowane jest białko/RNA. Pozwala to na specyficzną analizę dysregulacji białka/mRNA w kłębuszkach nerkowych modelu choroby.

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych za pomocą jednej myszy. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjskim ustawodawstwem i zgodą lokalnej komisji etycznej. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu w Bristolu.

1. Stosunek kreatyniny albuminy w moczu (uACR)

UWAGA: uACR służy do oceny przepuszczalności GFB dla albuminy. Obecność albuminy w moczu wskazuje na zwiększoną przepuszczalność przez GFB, który jest znormalizowany do kreatyniny w celu kontrolowania zmian w szybkości przepływu moczu. Albuminuria jest częstym markerem przewlekłej choroby nerek.

  1. Pobierać mocz na początku doświadczenia i w regularnych odstępach czasu (raz w tygodniu do raz w miesiącu) aż do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego.
  2. Ustaw klatki metaboliczne myszy z wodą i dietą wzbogacającą. Umieść myszy (samce, w wieku 6 - 8 tygodni) w indywidualnych klatkach na 6 godzin w cichym pomieszczeniu.
  3. Umieść myszy z powrotem w zwykłym pomieszczeniu i zbierz mocz z pustych klatek. Wymagane jest minimum 50 μl.
    UWAGA: Jeśli mysz nie oddaje moczu w podanym czasie, powtórz to innego dnia w cieplejszym pomieszczeniu.
  4. Odwirować mocz o stężeniu 500 x g przez 10 min. Zebrać mocz i zatrzymać osad, aby ocenić utratę podocytów. W tym momencie należy przechowywać mocz w temperaturze -20 °C w krótkim czasie.
  5. Rozcieńczyć mocz w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS pH 7,5) w rozcieńczeniu 1:500 do 1:10000, w zależności od nasilenia albuminurii.
    UWAGA: Objętość końcowa powinna wynosić >400 μl. Zoptymalizuj, aby określić właściwe rozcieńczenie w każdym punkcie czasowym.
  6. Określ ilościowo stężenie albuminy w moczu za pomocą testu immunoenzymatycznego połączonego z albuminą myszy (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Krótko mówiąc, pokryj płytkę ELISA, która jest zoptymalizowana pod kątem wiązania białek, 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko albuminie myszy (10 μg/ml w 0,5 M węglanowo-wodorowęglanowym pH 9,6) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Nadmiar przeciwciał wypłukać ze studzienek pięciokrotnie 1x TBS plus 0,05% Tween (pH 8,0) i dodać 200 μl roztworu blokującego (1x TBS z 1% BSA pH 8,0) przez noc w temperaturze pokojowej.
  7. Umyć płytkę pięciokrotnie i dodać 100 μl wzorców (rozcieńczenie seryjne: 2000 μg/ml do 15,63 μg/ml w 1x TBS z 1% BSA, pH 8,0), ślepą próbę i rozcieńczone próbki w trzech powtórzeniach. Pozostaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umyj talerz pięć razy.
    1. Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego HRP do każdej studzienki (10 ng / ml w 1xTBS z 1% BSA, pH 8,0) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Umyj płytkę pięć razy i dodaj 100 μl roztworu substratu enzymatycznego do każdej studzienki. Pozostawić płytkę w ciemności do rozwinięcia na 15 minut i zatrzymać reakcję, dodając 100 μl 0,18 M kwasu siarkowego (H2SO4).
      UWAGA: H2SO4 jest.
  8. Oznaczyć stężenie albuminy w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 450 nm. Użyj krzywej standardowej, aby określić ilościowo albuminę obecną w każdej próbce. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.
  9. Alternatywnie oceń stężenie albuminy w moczu za pomocą elektroforezy. Dodać 5 μl 4x buforu ładującego próbkę białka do 15 μl moczu. Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 10 minut, a następnie załadować je do 4-12% żelu prefabrykowanego Tris.
    1. Uruchom żel pod napięciem 100 V i zabarwij przez noc na niebiesko Coomassie zgodnie z protokołem producenta.
    2. Po zobrazowaniu żelu należy użyć densytometrii, aby ocenić stężenie albuminy zmiany fałdowania w stosunku do kontroli.
      UWAGA: Jeśli w oczekiwanym czasie nie zaobserwuje się żadnych prążków albuminy, należy ocenić stężenie białka w moczu i dostosować objętość moczu dodawanego do żelu.
  10. Rozcieńczyć surową próbkę moczu w dH2O w stosunku 1:1, 1:5 i 1:10,
    UWAGA: Objętość końcowa powinna wynosić >70 μl. Zoptymalizuj, aby określić właściwe rozcieńczenie każdej próbki.
  11. Określ ilościowo stężenie kreatyniny w moczu za pomocą testu chemicznego zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu. Krótko mówiąc, załaduj 20 μl wzorców kreatyniny, ślepą próbę lub rozcieńczony mocz na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach.
  12. Oznaczyć stężenie kreatyniny w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 490 nm przed i po dodaniu roztworu kwasu (UWAGA,; unikać kontaktu ze skórą).
    UWAGA: Różnica między wartościami absorbancji jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny w każdej próbce. Krzywa standardowa jest generowana na podstawie standardów. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.
  13. Wygeneruj uACR (μg/mg). Znormalizuj dane do wartości bazowej każdej myszy w celu reprezentacji graficznej.

2. Pobieranie tkanek i krwi

UWAGA: Tkanka nerkowa i kłębuszkowa może być wykorzystana do oceny strukturalnych, białkowych i ekspresyjnych markerów mRNA choroby nerek. Krew może być wykorzystana do oceny markerów czynności nerek, takich jak kreatynina, która może być regulowana w górę w chorobie nerek, co wskazuje na zmniejszenie zdolności filtracji kłębuszków nerkowych.

  1. Przygotować następujące roztwory: świeży 2,5% aldehyd glutarowy w 0,1 M kakodylanu sodu (pH 7,3), 4% paraformaldehyd w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), roztwór Ringera ssaków (115 mM chlorek sodu (NaCl), 10 mM octan sodu (CH3COONa), 1,2 mM fosforan sodu (Na2HPO4), 25 MM wodorowęglan sodu (NaHCO3), 1,2 mM siarczan magnezu (MgSO4), 1 mM chlorek wapnia (CaCl2), 5,5 mM D(+)glukozy, pH 7,4) z 1% BSA i 1x PBS.
    UWAGA: 2,5% aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Używaj w komorze wyciągowej. 0,1 M kakodylan sodu: toksyczny, stosować w komorze wyciągowej. 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
  2. Przygotuj następujące materiały: izofluran, małe probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), igły 23 - 25 G, strzykawki powlekane EDTA 5 ml, szklane fiolki 10 ml, plastikowe fiolki 10 ml, plastikowe probówki 0,5 ml, jednorazowe formy do tkanek, suchy lód, płynny N2, mysie narzędzia chirurgiczne i optymalne medium do cięcia (OCT).
  3. Umieść mysz w głębokim znieczuleniu, które jest weryfikowane przez to, że mysz nie reaguje na ukłucie igłą w opuszkę stopy, przy użyciu komory izofluranowej lub równoważnych dróg znieczulenia końcowego, takich jak środki znieczulające do wstrzykiwań (pentobarbital, 50 mg/kg dootrzewnowo [IP]; avertyna, 240 mg/kg IP) lub narażenie na dwutlenek węgla (CO2) (75% CO2 / 25% O2).
  4. Usuń mysz przez nakłucie serca do lewej komory i zbierz jak najwięcej krwi. Przenieść do probówki z krwią pokrytej EDTA na okres do 4 godzin. Jeśli jest to preferowane, myszy można usunąć przez zwichnięcie szyjki macicy, uważając, aby nie pękła żyła szyjna.
  5. Wypreparuj nerki przez jamę brzuszną i umyj w lodowatym chłodzie 1x PBS.
  6. Aby zbadać kłębuszki korowe, usuń jeden biegun kory nerkowej i pokrój na 1 mm3 kawałki. Aby zbadać głębokie kłębuszki krępkowe juxta-mecury, powtórz tę samą technikę z tkanką z rdzenia. Umieścić w 5 ml 2,5% roztworu aldehydu glutarowego w szklanej fiolce EM. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: 2,5% roztwór aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Zastosowanie w dygestorio
    UWAGA: Przetwórz w ciągu 1 miesiąca, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
  7. W przypadku badania histologicznego należy usunąć górną trzecią część nerki, aby upewnić się, że obecne będą zarówno kłębuszki korowe, jak i kłębuszki szpikowe, a następnie utrwalić w 5 ml 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przenieść do 5 ml 70% EtOH na 24 godziny przed zatopieniem w parafinie.
    UWAGA: 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
  8. W celu immunofluorescencji umieść jedną trzecią nerki, aby upewnić się, że zarówno kłębuszki korowe, jak i rdzeniste będą obecne, w pleśni tkankowej i pokryciu w OCT. Umieść na suchym lodzie do zamrożenia i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  9. W przypadku białka i RNA umieść 3 x 2 mm3 kawałki kory nerkowej w plastikowych probówkach o pojemności 0,5 ml i zamroź błyskawicznie w płynie N2. Przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania tkanki RNA należy umieścić tkankę w 5 objętościach roztworu stabilizującego RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  10. W celu wyizolowania kłębuszków nerkowych należy pokroić pozostałą tkankę nerkową i umieścić w 5 ml roztworu Ringera u ssaków z 1% BSA na lodzie. Przygotuj się do natychmiastowego przesiania kłębuszków nerkowych.

3. Kreatynina w osoczu

UWAGA: Stężenie kreatyniny w osoczu może być regulowane w górę w chorobach nerek, co wskazuje na zmniejszenie zdolności filtracji kłębuszków nerkowych. Można również ocenić poziom azotu mocznikowego (BUN) we krwi, chociaż protokół nie jest tutaj opisany.

  1. Odwirować próbkę krwi o masie 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Pobrać osocze, które w tym momencie może być przechowywane w temperaturze -20 °C w krótkim okresie.
  3. Określ ilościowo stężenie kreatyniny w osoczu za pomocą chemicznego testu kreatyniny zgodnie z powyższymi instrukcjami dla kreatyniny w moczu w protokole 1.11.
  4. Oznaczyć stężenie kreatyniny w każdej próbce, odczytując płytkę przy absorbancji 490 nm przed i po dodaniu roztworu kwasu.
    UWAGA: Różnica między tymi wartościami absorbancji jest wprost proporcjonalna do stężenia kreatyniny w każdej próbce. Krzywa standardowa jest generowana na podstawie standardów. Jeżeli powtórzenia techniczne mają wartość CV większą niż 5 %, należy powtórzyć test dla tych próbek.

4. Izolacja kłębuszków nerkowych

UWAGA: Kłębuszki nerkowe mogą być izolowane w celu oceny przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych ex vivo, jak również ekspresji specyficznych markerów białkowych i mRNA choroby kłębuszków nerkowych.

  1. Pobrać tkankę nerkową umieszczoną w roztworze Ringera ssaków z 1% BSA i rozciąć kłębuszki nerkowe przy użyciu standardowej techniki przesiewania13. Krótko mówiąc, ułóż sita o średnicy 70 μm (na dole), 100 μm, 125 μm, 175 μm, 250 μm i 425 μm (na górze) na szklanej zlewce.
  2. Rozgnieć nerkę za pomocą tłoka strzykawki na sito 425 μm i przepchnąć za pomocą lodowatego roztworu Ringera ssaków z 1% BSA. Gdy kawałki nerki zostaną przepchnięte, usuń górne sito i przystąp do zrobienia tego samego na następnym. Powtarzać tę czynność, aż pozostaną tylko sita 100 μm i 70 μm.
  3. Przenieść plon kłębuszków nerkowych zatrzymany przez sita 100 μm i 70 μm do 10 ml świeżego roztworu Ringera u ssaków z 1% BSA, na lodzie.
    UWAGA: Jeśli liczba kłębuszków nerkowych na ml roztworu Ringera jest niewielka, należy zmniejszyć objętość roztworu Ringera użytego do zebrania kłębuszków nerkowych z dwóch ostatnich sit.
  4. Pobrać 5 ml roztworu zawierającego kłębuszki nerkowe do dwóch oddzielnych probówek (po 2,5 ml każda) i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i błyskawicznie zamrozić kłębuszki nerkowe w płynieN2 przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji białka i RNA w późniejszym terminie.
  5. Umieścić pozostały roztwór zawierający kłębuszki nerkowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu zmierzenia kłębuszków nerkowych LpA/Vi ex vivo. Zakończyć w ciągu 3 godzin od usunięcia nerki.

5. Przepuszczalność wody kłębuszkowej (LpA/Vi)

UWAGA: Test kłębuszkowy LpA/Vi umożliwia pomiar ex vivo przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych w szybki i powtarzalny sposób. Wzrost kłębuszkowego LpA/Vi wskazuje na zaburzenie GFB, co sugeruje chorobę nerek.

  1. Ustaw zestaw kłębuszkowy LpA/Vi zgodnie z opisem w Salmon et al10. Proszę zapoznać się z Rysunek 1, aby uzyskać szczegółowy schemat konfiguracji.
  2. Przygotować następujące roztwory: roztwór Ringera dla ssaków z 1% BSA (pH 7,4) i roztwór Ringera dla ssaków z 8% BSA (pH 7,4). Podgrzać oba do 37 °C.
  3. Wyciągnąć mikropipety ze szklanych kapilar (gęstość optyczna: 1,2 mm). Wygeneruj końcówkę o aperturze 5 - 8 μm, przecinając mikropipetę pod mikroskopem.
  4. Użyj zestawu kłębuszkowego LpA/Vi, aby złapać nienaruszone pojedyncze kłębuszki nerkowe, które są wolne od kapsułki Bowmana i fragmentów rurkowych, na mikropipetę za pomocą odsysania. Szczegółowe podsumowanie testu onkometrycznego znajduje się w Salmon et al10. Krótko mówiąc, gdy kłębuszek nerkowy zostanie złapany i zabezpieczony na mikropipecie ssącej, zacznij nagrywać wideo kłębuszków nerkowych pod mikroskopem.
  5. Po pierwsze, należy zrównoważyć kłębuszki nerkowe w 1% roztworze Ringera BSA przez 30 s, a następnie zmienić peryfuzat na stężony 8% roztwór Ringera BSA na 10 s. Następnie przełącz peryfuzat z powrotem na 1% roztwór BSA Ringera i zatrzymaj nagrywanie.
  6. Zmyj kłębuszki nerkowe i powtórz proces dla 10 - 15 kłębuszków na mysz. Upewnij się, że natężenia przepływu peryfuzatu są identyczne i nie są zbyt szybkie (10 ml/min), aby nie zniekształcić struktury kłębuszków nerkowych.
  7. Zmierzyć początkową szybkość skurczu kłębuszków nerkowych, aby obliczyć przepuszczalność wody w kłębuszkach nerkowych (LpA) znormalizowaną do objętości kłębuszków nerkowych (Vi). Szczegółowe informacje na temat analizy można znaleźć w Salmon et al10.

6. Plama Schiffa spowodowana kwasem okresowym (PAS)

UWAGA: Plama PAS uwydatni błony podstawne pętli kapilarnych kłębuszków nerkowych i nabłonek rurkowy. Umożliwia szczegółową wizualizację komórek kłębuszków nerkowych, macierzy mezangialnej i ekspansji potencjału oraz potencjalnych zmian GBM (tj. zgrubień i nierówności).

  1. Przeciąć zatopioną w parafinie, utrwaloną w PFA korę nerkową za pomocą mikrotomu o grubości 5 μm na szkiełka pokryte poli-L-lizyną. Suszyć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Upewnij się, że sekcja nie zawiera żadnych fałd ani otworów, które mogą zniekształcić morfologię pod mikroskopem.
  2. Deparafinizować szkiełka poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorio) przez 3 minuty każde, dwa razy w 100% EtOH przez 3 minuty każde, a następnie raz w 95%, 70% i 50% EtOH przez 3 minuty każde, wszystko w temperaturze pokojowej. Ponownie nawodnić szkiełka w dH2O.
  3. Inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorium) (1 g/dl) przez 5 minut, a następnie płukać szkiełka w kilku zmianachdH2O. Użyć pojemnika ze 100 ml dH2O w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: roztwór kwasu okresowego: drażniący; Użyj w komorze wyciągowej
  4. Inkubować szkiełka w odczynniku Schiffa (chlorowodorek parasoaniliny 6 g/l i pirosiarczyn sodu 4% w HCl 0,25 mol/l) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
  5. Przeciwbarwienie hematoksyliną przez 3 sekundy przed dokładnym spłukaniem szkiełek pod bieżącą wodą z kranu przez 15 min.
    UWAGA: Może być wymagana pewna optymalizacja w celu określenia optymalnego czasu barwienia hematoksyliny.
  6. Odwadnianie szkiełek przy użyciu odwrotności protokołu deparafiniowania w kroku 6.2. Na koniec posyp ksylenem.
  7. Suche na powietrzu prowadnice i montaż za pomocą nośników montażowych na bazie ksylenu.
  8. Obraz pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 400x w celu oceny struktur kłębuszkowych. Oceń następujące elementy: pogrubienie i nieprawidłowości GBM, zapadanie się pętli naczyń włosowatych, tkanka zwłóknieniowa, stwardnienie rozsiane, proliferacja komórkowa (śródbłonek, podocyty i mezangia lub komórki zapalne naciekające kępkę).
    UWAGA: W celu kompleksowej oceny patofizjologii kłębuszków nerkowych należy ocenić zmiany chorobowe w innych częściach nerek, na przykład w kanalikach.

7. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

UWAGA: TEM pozwala na badanie ultrastrukturalnych nieprawidłowości w nerkach, takich jak GBM, wyrostki stopy podocytów i fenestracje śródbłonka, które nie są widoczne za pomocą mikroskopu świetlnego. Jest to ważne w modelach, w których uszkodzenie nerek nie jest tak wyraźne (tj. brak albuminurii i poważnych nieprawidłowości strukturalnych).

  1. Weź 2,5% pokrojoną w kostkę nerkę gluteraldehdye i po utrwaleniu w 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę. Przemyj 50 ml 0,1 M buforu kakodylowego (pH 7,3), a następnie 50 ml dH2O (3 x 15 min zmiany).
    UWAGA: 2,5% aldehydu glutarowego: toksyczny, uczulający, drażniący; Używaj w komorze wyciągowej. 0,1 M kakodylan sodu: toksyczny, stosować w komorze wyciągowej
  2. Odwodnić za pomocą EtOH i zatopić w żywicy Araldite.
  3. Wyciąć odcinki o grubości 50 - 100 nm i zabarwić 3% (wodnym) octanem uranylu i roztworem cytrynianu ołowiu Reynoldsa.
  4. Wykonaj cyfrowe mikrofotografie kilku obszarów kłębuszków nerkowych przy 940X, 1250X i 6200X, aby upewnić się, że podocyty, GEnC, GBM i mesangium można zidentyfikować.
  5. Użyj ImageJ, aby przeanalizować zaślepione kłębuszki nerkowe. Ustaw skalę dla każdego mikrografu 6200x, rysując linię między dwoma punktami o znanej odległości, takimi jak linijka. Przejdź do analizy, a następnie ustaw skalę, gdzie długość linii będzie wyświetlana w pikselach. Wpisz znaną odległość i jednostki miary. Do pomiaru każdego parametru należy użyć protokołów wymienionych poniżej.
    UWAGA: Ta analiza wymaga około 1 dnia na mysz. Aby uzyskać odpowiednią moc statystyczną, użyj średnich pomiarów z 3 kłębuszków nerkowych z 3 myszy.
    1. W przypadku GBM włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X i zmierz grubość GBM w punkcie, w którym linie siatki przecinają GBM. Zmierz od błony komórkowej śródbłonka podstawy do błony komórkowej podstawy stopy podocytów w prostopadłej stycznej do błony komórkowej śródbłonka za pomocą narzędzia do linii prostej. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
    2. Aby uzyskać numer okienka śródbłonka, zmierz długość GBM obecnego na mikrofotografii 6200X i policz liczbę okien śródbłonka na jednostkę długości GBM. Weź średnią z co najmniej 4 mikrofotografii na kłębuszek nerkowy.
    3. Aby uzyskać szerokość stopy podocytów, włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X. Zmierz szerokość wyrostków stopy podocytów, które przecinają linie siatki. Zmierz szerokość w najszerszej części wyrostka stopy, w miejscu, w którym styka się z GBM; Upewnij się, że linia jest prostopadła do stycznej błony podstawnej podocytów. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
    4. Aby uzyskać szerokość szczeliny podocytów, włóż stałą siatkę cyfrową (10 x 10) na mikrofotografię 6200X. Zmierz szerokość membran szczelinowych podocytów, które przecinają linie siatki. Jest to punkt, w którym wyrostki stopy są najbliżej siebie, w najszerszej części każdego wyrostka stopy, od błony podocytów do błony. Upewnij się, że pomiar jest prostopadły do stycznej błony podstawnej podocytów. Określ średni pomiar dla każdego kłębuszka nerkowego z 10 indywidualnych pomiarów.
    5. Aby uzyskać liczbę wyrostków stopy podocytów, zmierz długość GBM obecnego na mikrofotografii 6200X i policz liczbę wyrostków stopy podocytów na jednostkę długości GBM. Weź średnią z co najmniej 4 mikrofotografii na kłębuszek nerkowy.
    6. Aby uzyskać informacje na temat pokrycia przestrzeni sub-podocytów, zobacz szczegółową metodę w Neal et al. 14.
  6. Korzystając z mikrofotografii 940X, zbadaj kłębuszki nerkowe pod kątem obecności nieprawidłowej struktury, złogów i nacieków przez oko.

8. Immunofluorescencja markerów podocytów i śródbłonka

UWAGA: Barwienie immunologiczne pozwala na wizualizację wzorców ekspresji białek, takich jak śródbłonkowe pętle naczyń włosowatych, które mogą się załamać w chorobie kłębuszków nerkowych.

  1. Umieścić formę OCT zawierającą zamrożoną nerkę w temperaturze -20 °C na 2 godziny przed sekcją. Upewnij się, że powierzchnia cięcia nerki jest ostrożnie umieszczona na dnie formy OCT, aby umożliwić dobrze zorientowane sekcje tkanki.
  2. Za pomocą kriostatu przeciąć tkankę o grubości 5 μm na szkiełka pokryte poli-L-lizyną.
    UWAGA: Upewnij się, że w sekcji tkanki nie ma fałd ani, które mogą zniekształcić morfologię.
  3. Po wyjęciu z kriostatu utrwalić szkiełka w 4% PFA przez 10 min. Szkiełka myć 3 x 5 min w pojemniku ze 100 ml dH2O.
    UWAGA: 4% PFA: utrwalacz, stosować w dygestorium
  4. Aby zminimalizować ilość użytego przeciwciała, narysuj skrawki za pomocą hydrofobowego pisaka. Nie pozwól, aby sekcje wyschły.
  5. Inkubować w roztworze blokującym (3% BSA i 5% normalnej surowicy w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć roztwór blokujący za pomocą aspiratora i inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem (nefryną, podocyną lub PECAM-1) rozcieńczonym w stosunku 1:250 (3% BSA w 1x PBS). Umieścić szkiełka podstawowe w nawilżonej komorze w temperaturze 4 °C na noc. Jeśli wilgotna komora nie jest dostępna, delikatnie umieść mały pasek parafilmu na szkiełku pokrytym przeciwciałami. Zachowaj ostrożność podczas usuwania następnego dnia, aby nie zakłócić sekcji.
  7. Mycie szkiełek 3 x 5 min w 1x PBS.
  8. Inkubować z odpowiednim fluorescencyjnym rozcieńczeniem przeciwciał drugorzędowych w stosunku 1:1000 (3% BSA w 1x PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Mycie szkiełek 3 x 5 min w 1x PBS. Zamontuj za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych zawierających DAPI.
  10. Obraz jest przesuwany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 400-krotnym powiększeniu, aby zobaczyć kłębuszki nerkowe. Upewnij się, że jest to zaślepione, aby uniknąć stronniczości.
  11. Użyj ImageJ, aby przeanalizować intensywność barwienia, znormalizowaną do obszaru kłębuszków nerkowych, oraz wzór barwienia, tj. liczbę pętli kapilarnych znormalizowanych do obszaru kłębuszkowego, w sposób zaślepiony.

9. Ekstrakcja białka i Western Blotting

UWAGA: Western blotting pozwala nam ocenić ekspresję białek, o których wiadomo, że są rozregulowane w chorobie nerek. Na przykład zmniejszenie ekspresji podocyny i nefryny wskazuje na utratę podocytów.

  1. Ekstrahuj białko z kory nerkowej i przesianych kłębuszków nerkowych; protokół jest taki sam dla każdego z nich, a objętość buforu do lizy jest dostosowana do ilości tkanki.
  2. Rozmrozić nerki/kłębuszki nerkowe/kłębuszki na lodzie przed dodaniem buforu do lizy NP-40 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy. Homogenizować próbkę przez 30 s.
  3. Homogenizowane próbki inkubować na lodzie przez 30 minut, wirując w regularnych odstępach czasu.
  4. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć sklarowany osad do świeżej probówki na lodzie.
    UWAGA: należy spodziewać się odzyskania około 1 mg białka na próbkę.
  6. Denaturacja białek za pomocą standardowego buforu 4x Laemmli. Gotować mieszaninę w temperaturze 95 - 100 °C przez 5 minut.
  7. Ocenić ekspresję białek markerowych komórek kłębuszkowych (nefryna, podocyna, PECAM-1 itp.) oraz fosforylację i ekspresję białek, o których wiadomo/przypuszczalnie są zmienione w nerkach/kłębuszkach nerkowych modelu choroby przy użyciu Western blot (metoda standardowa; Mahmood i Yang15).
    UWAGA: Protokół będzie się różnił w zależności od wielkości i obfitości interesującego nas białka.

10. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

UWAGA: analiza ekspresji mRNA pozwala nam określić, w jaki sposób geny są regulowane w chorobie nerek, takie jak zmiany w ekspresji genów i alternatywne splicing.

  1. Podczas gdy kora nerkowa jest jeszcze zamrożona, dokładnie zmiel 3 ml odczynnika fenolowego za pomocą tłuczka i moździerza. W przypadku stosowania ekstraktów kłębuszkowych dodać 1 ml odczynnika fenolowego i homogenizować próbkę przez 30 s.
    UWAGA: odczynnik TRIzol: drażniący; Użyj w komorze wyciągowej
  2. Przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą opisaną przez Chomczyńskiego i Sacchi16.
    UWAGA: Jako alternatywę dla tej metody dostępne są komercyjne zestawy do ekstrakcji RNA.
  3. Oceń ilość i jakość RNA uzyskanego przy użyciu jednej z różnych dostępnych metod. W tym momencie RNA jest podawany i przechowywany w temperaturze -80 °C. Unikaj wielokrotnego rozmrażania przez zamrażanie.
    UWAGA: Jeśli jesteś nowy w tej metodzie, sprawdź jakość RNA przed przejściem do następnego kroku, uruchamiając RNA na żelu agarozowym, aby zapewnić wyraźne pasmo rybosomalne 28S i 18S. Spodziewaj się odzyskania od 2 do 5 μg RNA przy użyciu tej metody.
  4. Traktować 1 μg RNA przez DNazę (uzupełnić objętość do 10 μl wodą wolną od RNaz plus 1 μl DNazy i 1 μl buforu DNazy) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję 1 μl roztworu zatrzymującego DNazę w temperaturze 65 °C na 10 min.
  5. Dodać 0,5 μl oligo (dT) i losowe startery. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  6. Natychmiast schłodzić na lodzie przez 5 minut.
  7. Dodaj następujące elementy; enzym odwrotnej transkryptazy MMLV (400 U; zastąpić DEPCH2Ow próbce kontrolnej RT), bufor MMLV (1x), mieszanina dNTP (0,5 mM) i inhibitor rybonukleazy (40 U); uzupełnić do 50 μl wodą DEPC.
  8. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji enzymu.
    UWAGA: Aby uzyskać wyższą wydajność cDNA, inkubować w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 3 godziny.
  9. Oceń ilość i jakość cDNA przy użyciu różnych dostępnych metod.
  10. Użyj PCR do oceny ekspresji mRNA i wzorców splicingu genów, co do których istnieje hipoteza, że są rozregulowane w modelu choroby kłębuszków nerkowych. Protokół będzie się różnić w zależności od interesującego genu.

Wyniki

Mocz pobierano za pomocą klatek metabolicznych od myszy typu dzikiego (WT), myszy z indukowalnym, podocytowo-specyficznym wyciszeniem genu VEGF-A (VEGF-A KO) oraz myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF165b (myszy VEGF-A KO z konstytutywną nadekspresją ludzkiej izoformy VEGF-A165b w podocytach). Po pomiarze stosunku albumin do kreatyniny w moczu w 0, 4, 10 i 14 tygodniu po indukcji VEGF-A KO doksycyliną, u myszy VEGF-A KO rozwinęła się postępująca albuminuria do 10 tygodnia w porównaniu z kontrolnymi myszami WT z tego samego miotu. Wartości bezwzględne przedstawiono na Rysunku 2A, a wartości znormalizowane do poziomu wyjściowego dla każdej myszy na Rysunku 2B. Jednakże albuminurii nie zaobserwowano u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 2), co wskazuje, że VEGF-A165b działa ochronnie w modelu albuminurii5.

Kuleczkowy LpAVi mierzono w pojedynczych kłębuszkach odsianych z nerek myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. Przykład uchwycenia kłębuszka oraz skurcz zaobserwowany podczas perfuzji 8% BSA przedstawiono na Rysunku 3A. Skurcz ten służy następnie do wyznaczenia kuleczkowego LpA/Vi dla każdego kłębuszka (Rysunek 3B). Myszy VEGF-A KO wykazywały istotnie zwiększony kuleczkowy LpA/Vi w 14. tygodniu po indukcji VEGF-KO w porównaniu z kłębuszkami kontrolnymi WT. Mimo że wartość ta była niższa u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, nadekspresja VEGF-A165b nie zapobiegła zwiększeniu kuleczkowego LpA/Vi w 14. tygodniu5.

Barwienie PAS przekrojów kory nerek 14 tygodni po indukcji KO VEGF-A nie wykazało żadnych strukturalnych nieprawidłowości kłębuszków u myszy VEGF-A KO lub VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 4A). Jednakże analiza ultrastruktury kłębuszków za pomocą EM wykazała, że u myszy VEGF-A KO rozwinęła się zwiększona szerokość GBM, zmniejszona liczba fenestr śródbłonka, zmniejszone pokrycie SPS oraz zwiększona średnia szerokość szczelin podocytów (Rysunek 4C-4F). Średnia szerokość wypustek stopowych podocytów oraz liczba szczelin pozostały bez zmian (Rysunek 3B i 3G). Nadekspresja VEGF-A165b u myszy VEGF-A KO zapobiegła zmianom w GBM i szerokości szczelin (Rysunek 4C i 4F). Natomiast VEGF-A165b nie wpłynęła na zmienioną liczbę fenestr i pokrycie SPS (Rysunek 4D i 4E)5.

Analiza RT-PCR przeprowadzona na RNA wyizolowanym z przesianych kłębuszków wykazała, że ludzkie mRNA VEGF-A165b występuje wyłącznie u myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 5A). Po wyizolowaniu białek z przesianych kłębuszków i ocenie ich poziomu metodą Western blotting stwierdzono, że ekspresja białkowa VEGFR-2 w kłębuszkach była obniżona u myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte poprzez nadekspresję VEGF-A165b (Rysunek 5B i 5C)5.

Schemat układu mikrofluidycznego; pułapkowanie komórek, przepływ dwukanałowy, proces enkapsulacji, pompa strzykawkowa.
Rycina 1. Schematyczna budowa zestawu do pomiaru przepuszczalności kłębuszkowej (LpA). (A) Kłębuszek zostaje uchwycony za pomocą (B) mikropipety w uchwycie przy użyciu ssania, który jest przymocowany do podstawy w celu zapewnienia stabilności. (C) Prostokątne mikropreparat. (D) Obiektyw mikroskopu 4X z kamerą wideo. (E) 1% roztwór BSA podgrzany do 37 °C. (F) 8% roztwór BSA podgrzany do 37 °C. (G) Zdalny zawór z dwiema liniami zawierającymi perifuzat, który umożliwia szybką wymianę perifuzatu. (H) Droga perifuzatu w kierunku mikropreparatu, który następnie obmywa kłębuszek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres przedstawiający zmiany uACR w ciągu tygodni w badaniu VEGF-A KO; wyniki analizy statystycznej danych.
Rycina 2. Stosunek albumin do kreatyniny w moczu. (A) Wartości uACR w tygodniach 0, 4, 10 i 14 po indukcji VEGF-A KO u myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. (B) Te same wartości uACR znormalizowane do wartości bazowej (tydzień 0) dla każdej poszczególnej myszy. Wartość uACR istotnie wzrosła u myszy VEGF-A KO w tygodniach 10 i 14 w porównaniu z kontrolnymi myszami WT z tego samego miotu, co zostało zapobiegone u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p <0.05; dwuczynnikowa ANOVA, korekta dla porównań parzystych; n= 4 - 12 myszy na punkt czasowy; słupki błędów: standardowy błąd średniej [SEM]). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Porównanie przepuszczalności naczyń krwionośnych; współczynnik ultrafiltracji; wykresy i mikrofotografia do analizy.
Rysunek 3. Pomiar przepuszczalności kłębuszka dla wody. (A) Kłębuszek zostaje uchwycony mikropipetą za pomocą ssania; perfuzat zostaje zmieniony z 1% BSA (Ai) na 8% BSA (Aii), a następnie obserwuje się obkurczanie kłębuszka. (B) Pomiary wykonane przed i po zmianie na 8% BSA są wykorzystywane do wyznaczenia kłębuszkowego LpA/Vi. (C) U myszy VEGF-A KO stwierdzono zwiększony kłębuszkowy LpA/Vi w 14. tygodniu po indukcji VEGF-A KO w porównaniu z kontrolami WT. Nie zapobieżono temu w sposób znaczący u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p <0.05; jednoczynnikowa ANOVA, korekta Bonferroniego dla porównań parzystych; n = 4 - 9 myszy, 15 - 30 kłębuszków; słupki błędu: SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia nerek i wykres słupkowy przedstawiający porównanie wpływu VEGF-A na strukturę i funkcję naczyń.
Rysunek 4. Analiza strukturalna kłębków nerkowych. (A) Barwienie PAS kory nerek nie wykazało żadnych nieprawidłowości strukturalnych w kłębkach myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ujawniła nieprawidłowości ultrastrukturalne w kłębkach myszy VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) Średnia szerokość ścieżki podopodowej (FPW) nie różniła się między grupami. (C) Grubość błony podstawawnej kłębka (GBM) zwiększyła się w kłębkach myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte przez VEGF-A165b. (D) Liczba fenestr była zmniejszona w kłębkach myszy VEGF-A KO, co nie uległo zmianie pod wpływem VEGF-A165b. (E) Pokrycie przez podocyty (SPS) było zmniejszone w kłębkach myszy VEGF-A KO, co również pozostało niezmienione pod wpływem VEGF-A165b. (F) Średnia szerokość szczelin była zwiększona w kłębkach myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte przez VEGF-A165b. (G) Liczba szczelin nie różniła się między trzema grupami (*p <0.05; jednoczynnikowa ANOVA, poprawka Bonferroniego dla porównań parzystych; n = 3 myszy, 9 kłębków; słupki błędów: SEM). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Elektroforeza PCR i analiza Western blot; wykres słupkowy ekspresji VEGFR2 porównujący WT i VEGF-A KO.
Rycina 5. Ekspresja mRNA i białek markerów. (A) RT-PCR wykazał, że ekspresja mRNA ludzkiego VEGF-A165b była widoczna jedynie w przesianych kłębkach nerkowych myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b. (B) Western blotting wykazał, że ekspresja białka VEGFR-2 była obniżona w kłębkach nerkowych VEGF-A KO, co zostało zapobiegone w kłębkach nerkowych VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (*p <0.05; jednoczynnikowa analiza ANOVA, korekta Bonferroniego dla porównań par; n = 3- 6 myszy; słupki błędów: SEM). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stevens et al5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten opisuje pełne badanie nerek, które powinno zostać przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych od jednej myszy. Krytyczne etapy każdej metody pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, w tym ocenę przepuszczalności nerek jako całości (pomiary uACR i kreatyniny w osoczu), przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych (kłębuszkowe LpA/Vi), badanie zmian strukturalnych (PAS, błękit trichromowy i EM), lokalizacja białka (IF), i ekspresja genów kłębuszków nerkowych (RT-PCR i Western blot). Metody te mają kluczowe znaczenie dla pełnej oceny funkcji kłębuszków nerkowych w mysich modelach choroby nerek.

Oceniając przepuszczalność GFB, w wielu badaniach zdecydowano się na zastosowanie konwencjonalnego uACR lub 24-godzinnej szybkości wydalania albumin jako skutecznego środka17,18. Chociaż techniki te umożliwiają ocenę przepuszczalności GFB jako całości, nie pozwalają na ocenę przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych i ich zmienności. Wcześniejsze badania wykazały, że pomiar kłębuszkowego LpA/Vi jest bardziej czułą miarą zmian przepuszczalności GFB 5,9. Rzeczywiście, w reprezentatywnych wynikach przedstawionych w tym artykule, po 14 tygodniach od indukcji VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b myszy mają znacznie niższy uACR w porównaniu do myszy VEGF-A KO; jednak wynik ten nie znajduje odzwierciedlenia w kłębuszkowych pomiarach LpA/Vi, w których VEGF-A165b nie zapobiegł znacząco wzrostowi przepuszczalności GFB (Figura 1 i Figura 2)5. Pokazuje to, jak ważne jest stosowanie wielu testów do oceny zarówno przepuszczalności nerek, jak i przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych. Ponadto test onkometryczny kłębuszkowy LpA/Vi sugeruje, że przepuszczalność poszczególnych kłębuszków nerkowych z tej samej nerki może się znacznie różnić, zwłaszcza w modelach chorobowych 5,10,19. Jednym z ograniczeń pomiaru kłębuszkowego LpA/Vi jest to, że można go przeprowadzić tylko w eksperymentalnym punkcie końcowym; w związku z tym wymagane są regularne pomiary uACR, aby wskazać eksperymentalny punkt końcowy.

Oprócz oceny fenotypu funkcjonalnego, obecna metoda zachęca również do oceny fenotypu strukturalnego i ultrastrukturalnego. Można to zrobić za pomocą różnych plam, takich jak plamy PAS, trichrom i srebro; każdy z nich w celu oceny różnych aspektów morfologii kłębuszków nerkowych. W ostrych modelach choroby kłębuszków nerkowych, co często ma miejsce w modelach mysich, wykrycie poważnych nieprawidłowości strukturalnych za pomocą tych barwników może być trudne, chyba że jesteś przeszkolonym patologiem nerek. Dlatego sugeruje się przeprowadzenie EM w celu oceny ultrastruktury GFB, co pozwala na ilościowy pomiar parametrów, takich jak GBM, rozmiar i liczba okien śródbłonka oraz charakterystyka podocytów. Takie pomiary wymagają minimalnego przeszkolenia i umożliwiają badaczowi określenie typów/struktur komórek dotkniętych w modelu choroby. W przykładzie pokazanym w reprezentatywnych wynikach stwierdzono, że mysz VEGF-A KO jest łagodnym modelem choroby kłębuszków nerkowych, a zatem nie stwierdzono żadnych poważnych nieprawidłowości strukturalnych w barwieniu PAS. Jednak specyficzny dla podocytów VEGF-A KO indukował zmiany w GBM, podocytach i komórkach śródbłonka podczas badania ultrastruktury kłębuszkównerkowych 5. Niestety, przygotowanie nerki do EM opisane w niniejszej metodzie nie pozwala na wykrycie glikokaliksu śródbłonka, o którym wiadomo również, że ma istotny wpływ na przepuszczalność GFB19. W celu dokładnego zmierzenia głębokości glikokaliksu, nerka powinna być utrwalona perfuzją za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego z 1% błękitu alcian w celu znakowania glikokaliksu śródbłonka, jak opisano w Oltean i wsp. 19.

Po ocenie fenotypu funkcjonalnego i strukturalnego można następnie ocenić wzorce ekspresji/aktywacji różnych genów i szlaków, specyficznie w kłębuszkach nerkowych. Wcześniejsza ocena ultrastrukturalna może dostarczyć pewnych informacji na temat typów komórek/zaangażowanych struktur kłębuszkowych, wskazując, czy należy zbadać geny/szlaki specyficzne dla podocytów lub śródbłonka. Na przykład w reprezentatywnych wynikach z myszy VEGF-A KO zaobserwowano zmniejszenie liczby okien śródbłonka (ryc. 3D); w związku z tym zbadano ekspresję białka kłębuszkowego markera śródbłonka, o którym wiadomo, że jest zaangażowany w szlak VEGF-A; VEGFR-2 (rysunek 4B)5. Oprócz ekspresji białek w kłębuszkach nerkowych, ich lokalizację można również wizualizować za pomocą IF. W badaniu przeprowadzonym przez Zhang i wsp.20 potwierdzono nadekspresję GLUT1 specyficzną dla podocytów w podocytach przez kolokalizację IF zwiększonego GLUT1 z podocyną.

W porównaniu z alternatywnymi metodami oceny funkcji kłębuszków nerkowych przedstawionymi w literaturze, zastosowanie opisanej w tym artykule metody oceny funkcji nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych umożliwia pełną ocenę fenotypu kłębuszkowego pod wieloma względami. Korzystając z tej metody, badacz jest w stanie określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Te istotne informacje na temat mechanizmu choroby są niezbędne przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach. Metoda ta może być z łatwością zastosowana w przyszłych badaniach nad funkcją kłębuszków nerkowych, zarówno w ocenie fenotypów choroby, jak i potencjalnych terapii.

Podsumowując, ten ogólny i adaptowalny protokół opisuje pełne badanie nerek dla mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych za pomocą jednej myszy. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust i MRC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klatki metaboliczneAparat Harvarda52-6731
Sól fizjologiczna buforowana Tris (10x)Sigma-AldrichT5912-1L
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2058
Albumina myszy Zestaw do oznaczania ilościowego ELISABethyl LaboratoriesE90-134
TMB ELISA Roztwór substratuThermoFisher Scientific34028
Kwas siarkowySigma-Aldrich339741
SPECTRstar nanoBMG LabtechSPECTRstar nano lub równoważny
roztwór do stabilizacji RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020
4-15% prefabrykowany żel białkowyBIORAD4568084
4x Laaemmli Bufor do próbekBIORAD161-0747
Komórka Mini Trans-BlotBIORAD1703930
10x Bufor do bieganiaTris BIORAD1610732
Coomassie Brilliant Blue DyeThermoFisher Scientific20278
Creatinine CompanionExocell1012 Płytka
Roztwór aldehydu glutarowegoSigma-AldrichG5882
Kakodylan soduSigma-AldrichC0250
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher ScientificAM9625
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Octan soduSigma-AldrichS2889
Fosforan soduSigma-Aldrich342483
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
Siarczan magnezuSigma-AldrichM2643
Chlorek wapniaSigma-AldrichC5670
D(+)GlukozaSigma-AldrichG8270
Probówki do pobierania krwi EDTABD367835
23-25G IgłaBDPMC0735
EDTASigma-AldrichE9884
10 ml szklana fiolkaThomas Scientific0914X10
Falcon 10 ml probówki polipropylenoweThermoFisher Scientific10110101
0,5 ml ProbówkiThermoFisher Scientific10681894
Jednorazowe formy do tkanekThermoFisher Scientific22-363-553
Zestaw do chirurgicznego rozwarstwiania myszyThermoFisher Scientific13-005-204
Optymalna substancja tnącaThermoFisher Scientific23-730-571
4% paraformaldehyduThermoFisher ScientificAAJ19943K2
Szklane rurki kapilarneAparat HarvardaEC1 64-0770
Wiertnica do przepuszczalności kłębuszkówzbudowana na Uniwersytecie w Bristolu - niedostępna zamiennieCytowanie platformy LpA: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Sita ze stali nierdzewnejCole-ParmerWZ-59984
System barwienia kwasem okresowym-Schiffem (PAS)Sigma-Aldrich395B-1KT
HematoksylinaSigma-AldrichH3136
KsylenMerckMillipore108298
Szkiełka Poly-PrepSigma-AldrichP0425-72EA
Podłoże montażoweThermoFisher Scientific8030
Roztwór tetratlenku osmuSigma-Aldrich75632
Agar z żywicy araditowejScientificCY212
Agar z octanem uranyluScientificAGR1260A
Agar z cytrynianem ołowiuScientificAGR1210
KriostatThermoFisher Scientificnp. 957000H
Hydrofobowy długopisAbcamab2601
Nephrin (1243-1256) PrzeciwciałoAcrisBP5030
Anti-PodocinSigma-AldrichP0372-200UL
Anti-CD31BD Biosciences550274
Alexa Fluor Przeciwciało wtórneThermoFisher ScientificA32732
Vectashield Podłoże montażowe z DAPIVector LabsH-1200
NP40 Bufor do lizy komórekThermoFisher ScientificFNN0021
Halt Inhibitor proteazy i fosfatazyThermoFisher Scientific78437X4
10x Bufor transferowyBIORAD1610734
Membrana PVDFThermoFisher ScientificLC2002
Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z HRPAbcamab6721
Podłoże ECF do Western BlottingFisher10713387
TRIzolThermoFisher Scientific15596018
Dnase INew England BiolabsM0303S
M-MLV Odwrotna transkryptazaNew England BiolabsM053S
Oligo dTThermoFisher Scientific18418012
Losowe podkładyThermoFisher Scientific48190011
dNTPThermoFisher Scientific18427088
Inhibitor rybonukleazyThermoFisher Scientific10777019
DEPC WodaThermoFisher ScientificAM9915G
Miskop światła fluorescencyjnegoLeica Microsystems
Image J Oprogramowanie do analizyImage J
PCR TermocyklerThermoFisher Scientific
TEM MicroscopeBritannica
paskowa nerkowych

Bibliografia

  1. Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
  2. Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
  3. Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
  4. Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
  5. Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
  6. Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
  7. Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
  8. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  9. Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
  10. Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
  11. Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
  12. Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
  13. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  14. Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  17. Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277(2011).
  18. Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
  19. Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
  20. Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wska nik albuminy do kreatyniny w moczuprzepuszczalno k buszkowa dla wodybarwienie Periodic Acid Schiffmikroskopia elektronowaizolacja k buszk wnokaut VEGF Aanaliza RNAanaliza bia ek
Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.