Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Podsumowanie

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Streszczenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) jest potężną techniką do badania ekspresji genów w pojedynczych komórkach ze względu na jej zdolność do wykrywania i liczenia pojedynczych cząsteczek RNA. Uzupełnienie metod opartych na głębokim sekwencjonowaniu, smFISH dostarcza informacji na temat zmienności liczebności transkryptów między komórkami i lokalizacji subkomórkowej danego RNA. Ostatnio wykorzystaliśmy smFISH do zbadania ekspresji genu NDC80 podczas mejozy u pączkujących drożdży, w których istnieją dwie izoformy transkryptu, a izoforma krótkiego transkryptu ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą. Aby z pewnością zidentyfikować każdą izoformę transkryptu, zoptymalizowaliśmy znane protokoły smFISH i uzyskaliśmy wysoką spójność i jakość danych smFISH dla próbek pobranych podczas pączkowania mejozy drożdży. Tutaj opisujemy ten zoptymalizowany protokół, kryteria, których używamy do określenia, czy uzyskuje się wysoką jakość danych smFISH, oraz kilka wskazówek dotyczących wdrażania tego protokołu w innych szczepach drożdży i warunkach wzrostu.

Wprowadzenie

Dynamiczna regulacja ekspresji genów napędza rozwój organizmu, jak również jego reakcję na stres środowiskowy, infekcje i zmiany w metabolizmie. Badania, które koncentrują się na regulacji transkrypcji, opierają się na technologiach mierzących obfitość RNA. Jedna z takich metod, określana jako hybrydyzacja in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH), jest stosowana do wykrywania pojedynczych cząsteczek RNA w pojedynczych komórkach^1,2. Metoda ta umożliwia pomiar zmienności ekspresji genów między komórkami i określenie lokalizacji wewnątrzkomórkowego RNA.

W najczęściej używanej technice smFISH, wykrywanie pojedynczej cząsteczki RNA wymaga wielu krótkich sond DNA (często ~48 sond 20-merowych), które są komplementarne do docelowego RNA i są sprzężone z tym samym barwnikiem fluorescencyjnym. Wiązanie pojedynczej sondy fluorescencyjnej powoduje słaby sygnał, ale sygnał z zestawu wszystkich sond jest solidny. Ta cecha znacznie poprawia stosunek sygnału do szumu, ponieważ nawet jeśli pojedyncza sonda może wykazywać wiązanie poza celem, oczekuje się, że taki sygnał będzie bardzo słaby w porównaniu z docelową cząsteczką RNA³. W ramach błędu detekcji można policzyć i porównać liczbę cząsteczek RNA w różnych warunkach wzrostu i między różnymi mutantami.

Od momentu pierwszego opracowania, smFISH został przystosowany do badania różnych aspektów ekspresji genów⁴, takich jak wydłużenie transkrypcji1^,2, splicing^5,6, burstingal transcriptional class^7,8,9, wewnątrzkomórkowa ekspresja alleliczna^10,11,12, oraz lokalizacja RNA^13,14,15. Ostatnio zastosowaliśmy tę metodę do zbadania ekspresji dwóch izoform transkryptowych tego samego genu, w których izoforma krótkiego transkryptu (NDC80^ORF) ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą (NDC80^luti)¹⁶. Aby jednoznacznie zidentyfikować dwie izoformy mRNA, użyliśmy dwóch zestawów sond: jeden zestaw jest specyficzny dla unikalnej sekwencji ^{NDC80 luti}, a drugi zestaw, sprzężony z innym barwnikiem fluorescencyjnym, wiąże się ze wspólnym regionem dwóch izoform. NDC80^luti RNA jest identyfikowany jako kolokalizowana plamka z obydwoma sygnałami fluorescencyjnymi, podczas gdy NDC80^ORF RNA to ten, który zawiera tylko sygnał ze wspólnego zestawu sond. Ponieważ liczba transkryptów ^{NDC80 ORF} jest obliczana metodą "odejmowania", wysoka wydajność hybrydyzacji sondy i wysoki stosunek sygnału do szumu są niezbędne do pewnej identyfikacji plam smFISH i zmniejszenia propagacji błędów.

Ten artykuł opisuje zoptymalizowany protokół wykonywania smFISH u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. W tym protokole liczba komórek, czas wiązania, czas trawienia, bufor trawienia, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny użyte w eksperymentach smFISH zostały zoptymalizowane pod kątem tła szczepu SK1 S. cerevisiae poddawanego wzrostowi wegetatywnemu lub mejjozie. Jednak w tym manuskrypcie zwracamy również uwagę: (1) metodę sprawdzania jakości danych smFISH po akwizycji obrazu oraz (2) kroki w protokole, które mogą wymagać dodatkowej optymalizacji dla różnych środowisk szczepów i warunków wzrostu.

Protokół

UWAGA: Wszystkie i nośniki używane w tym protokole są wymienione w Tabeli 1. Informacje o dostawcy odczynników są wymienione w Tabeli materiałów.

Dzień 1/Dzień 1-2:

UWAGA: Dla hodowli wegetatywnej, hoduj komórki do OD₆₀₀ od 0,4 do 0,6 w preferowanym podłożu. W przypadku hodowli mejotycznej należy skłonić komórki do poddania się mejozie przy użyciu preferowanej metody (zwykle hodowla w OD₆₀₀ 1,85).

1. Utrwalanie i trawienie próbki

1. Utrwal w sumie ~3,5 OD₆₀₀ komórek w 3% formaldehydzie.
   1. W przypadku hodowli wegetatywnej dodaj 5,52 ml kultury do 480 μl 37% formaldehydu w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
   2. W przypadku hodowli mejotycznej dodaj 1840 μl kultury do 160 μl 37% formaldehydu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Odwróć ~5 razy, aby wymieszać.
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
2. Umieść rurki na bębnie rolkowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. W przypadku próbek mejotycznych, po utrwaleniu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, obracając.
   UWAGA: Utrwalanie przez noc zwiększa odtwarzalność i jakość danych smFISH uzyskanych dla próbek mejotycznych. Czas mocowania powinien być zoptymalizowany.
3. Podczas utrwalania próbek rozmrozić 200 mM kompleksów rybonukleozydów wanadylu (VRC) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut.
4. Przygotować główną mieszankę mineralizacyjną w probówce o pojemności 15 ml: dla 1 próbki zmieszać 425 μl buforu B z 40 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C); dla 5 próbek zmieszać 2125 μl buforu B z 200 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C). Wirować ~5 s, aby całkowicie zawiesić VRC przed dodaniem do mieszanki głównej, która po dodaniu VRC stanie się jasnobrązowo-zielona.
   UWAGA: Dodanie VRC podczas trawienia poprawia spójność wyników smFISH, potencjalnie poprzez hamowanie zanieczyszczenia nukleazą wprowadzanego przez mieszaninę zymoliazy, która jest oczyszczana z surowego ekstraktu. Ilość VRC wymagana na tym etapie powinna być zoptymalizowana.
5. W przypadku próbek wegetatywnych należy odwirować probówki o sile ~1057 x g przez 3 minuty. W przypadku próbek mejotycznych (po utrwaleniu przez noc) odwirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Zdekantować lub odessać supernatant do odpadów formaldehydu.
   UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze pokojowej.
6. Zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B, pipetując w górę i w dół lub odwracając probówki i przesuwając w celu wymieszania. Przenieść próbki wegetatywne do probówek o pojemności 2 ml po ponownym zamieszaniu.
7. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.
8. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B.
9. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.
10. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 minuty. Całkowicie odessać ciecz za pomocą próżni lub pipetowania.
11. Ponownie zawiesić komórki w 425 μl głównej mieszanki trawienia i krótko zawirować, aby ponownie zawiesić. Dodać 5 μl 100T 10 mg/ml zymoliazy do każdej probówki.
    UWAGA: Wiruj zymoliazę za każdym razem przed dodaniem do probówek. Dodaj zymoliazę do każdej probówki z osobna, zamiast dodawać do mieszanki głównej. Oba etapy pomagają utrzymać spójność trawienia między rurkami, ponieważ zymoliaza szybko się wytrąca.
12. Wiruj 2-3 s do mieszania. Umieścić probówki na bębnie rolkowym i trawić w temperaturze 30 °C przez 15-30 minut. W przypadku komórek wegetatywnych i wczesnych stadiów mejotycznych trwa to zwykle ~15 min, a w przypadku profazy mejotycznej i podziałów mejotycznych trwa to zwykle ~30 min.
    UWAGA: Sprawdzaj pod mikroskopem co 5 minut po 15 minutach i przerwij trawienie, gdy ~80% komórek wydaje się nieprzezroczystych i niezałamujących. Od tego momentu komórki są bardzo delikatne. Z komórkami należy obchodzić się delikatnie i unikać zasysania próżniowego lub wirowania.
13. Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć płyn za pomocą pipetowania.
14. Delikatnie ponownie zawiesić komórki z 1 ml buforu B, pipetując w górę i w dół 1-2 razy, aby wymieszać.
15. Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć płyn z buforu B przez pipetowanie. Delikatnie zawieś komórki w 1 ml 70% etanolu (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).
16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3,5-4 godziny.

2. Hybrydyzacja

1. Doprowadź formamid do temperatury pokojowej (dla 50 ml porcji zajmuje ~30 minut w łaźni wodnej).
   UWAGA: Nie otwieraj butelki z formamidem, dopóki butelka nie osiągnie temperatury pokojowej, aby uniknąć utleniania formamidu.
   UWAGA: Formamid jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
2. Przygotować 10% bufor do przemywania formamidu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
3. Odwirować probówki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć 500 μl 70% etanolu przez pipetowanie. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić pozostałe komórki, a następnie przenieść komórki do probówek o niskiej przyczepności.
   UWAGA: Stosowanie rurek o niskiej przyczepności znacznie zmniejsza utratę komórek podczas kolejnych prań.
4. Ponownie odwirować probówki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć cały etanol za pomocą pipetowania.
5. Dodać 1 ml 10% buforu do płukania formamidu i delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy, aby ponownie zawiesić komórki.
6. Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na ~ 20 minut, przygotowując roztwór hybrydyzacyjny. Dla 1 próbki zmieszać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 5 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 1 μl każdej sondy (200 nM final). Dla 5 próbek wymieszaj 250 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 25 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 5 μl każdej sondy (200 nM final).
   1. Rozmrozić bufor hybrydyzacyjny (zamrożony w temperaturze -20 °C) do temperatury pokojowej przed otwarciem probówki, aby zapobiec utlenianiu formamidu.
   2. Po dodaniu 200 mM VRC, wiruj przez 5-10 s przed dodaniem sond, które są projektowane i kupowane komercyjnie, a następnie odtwarzane zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Jeśli dwie sondy są inkubowane jednocześnie, dodać 1 μl roztworu sondy #1 w stosunku 1:10, a także 1 μl roztworu sondy #2 w stosunku 1:10, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie ~1:500 dla każdej sondy. Stężenie potrzebne do uzyskania najlepszego stosunku sygnału do szumu musi być zoptymalizowane (szczegółowe informacje można znaleźć w dyskusji).
7. Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.
8. Dodać co najmniej 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego do każdej probówki. Przesuń rurki, aby wymieszać.
9. Inkubować w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym przez co najmniej 16 godzin w ciemności.

Dzień 2/Dzień 3

3. Mycie i obrazowanie

1. Doprowadzić formamid do temperatury pokojowej.
2. Przygotować 10% formamidowy bufor do przemywania (FWB) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
3. Wyjmij rurki z bębna rolkowego i umieść je w pudełku pokrytym folią, aby chronić je przed światłem.
4. Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.
5. Zawiesić ponownie w 1 ml 10% FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
6. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.
7. Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania i pozostawić ~50 μl.
8. W międzyczasie przygotuj DAPI/FWB w stożkowej probówce o pojemności 15 ml: Dla 1 próbki wymieszaj 1000 μl 10% buforu do płukania formamidu z 1 μl 5 mg/ml DAPI. W przypadku 10 próbek zmieszać 10 ml 10% buforu do przemywania formamidu z 10 μl 5 mg/ml DAPI. Zawiesić w 1 ml DAPI/FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
9. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.
10. Rozmrozić odczynniki przeciwwybielające na lodzie.
11. Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. W razie potrzeby ponownie odwirować w celu usunięcia całego supernatantu.
12. W przypadku próbek, które nie są obrazowane natychmiast, należy ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu GLOX bez enzymów. Pipetować w górę i w dół 3-4 razy, aby wymieszać.
    1. Przechowywać wszystkie nieobrazowane próbki w pudełku pokrytym folią w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do obrazowania. Gdy próbka będzie gotowa do obrazowania, odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 2 minuty i całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. Zawiesić w GLOX z enzymami, jak poniżej.
13. W przypadku próbek poddawanych natychmiastowemu obrazowaniu należy dodać 15-20 μl buforu GLOX z enzymami. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    UWAGA: Dodawana objętość może się różnić w zależności od wielkości osadu komórkowego. Zalecamy ponowne zaparcie osadu w 15 μl buforu GLOX z enzymami i sprawdzenie gęstości komórek pod mikroskopem. Jeśli komórki są zbyt gęste (komórki zlepiają się jedna na drugiej), dodaj dodatkowy bufor GLOX z enzymami. Jeśli komórki są zbyt rzadkie, odwirować próbkę i usunąć ~5 μl buforu.
14. Odpipetować 5 μl na szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm, nr 1) i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.
15. Umieść chusteczkę laboratoryjną na szkiełku, w którym umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Delikatnie naciśnij chusteczkę laboratoryjną, aby ustawić szkiełko (powinien być widoczny płyn spływający ze wszystkich czterech krawędzi szkiełka nakrywkowego).
16. Przenieś szkiełko do pomieszczenia mikroskopu w pudełku pokrytym folią aluminiową.
17. Obraz za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego o dużym powiększeniu (60-100X) i dużej aperturze numerycznej.
    UWAGA: Aby zebrać maksymalną liczbę fotonów emitowanych przez sondy smFISH, nie zaleca się stosowania mikroskopów konfokalnych, ponieważ znacznie ograniczają one ilość zbieranego światła. W tym przypadku dane zostały zebrane na mikroskopie wyposażonym w obiektyw 100X, 1,4 NA, przy użyciu filtrów CY5 (EX632/22, EM679/34) zobrazowanych z prędkością 1,3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100% T; i DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32%-50% T. Należy również uzyskać obraz referencyjny w jasnym polu. Uzyskaj 15-25 wycinków o wielkości kroku 0,1-0,2 μm, od całkowicie poniżej ostrości pola widzenia do całkowicie powyżej, aby upewnić się, że wszystkie plamki RNA są uwzględnione.

4. Analiza obrazu

1. Analizuj dane smFISH za pomocą opublikowanych narzędzi analitycznych smFISH, takich jak FISH-quant¹⁷ i StarSearch², lub za pomocą niestandardowych programów, w zależności od dokładnych wymagań eksperymentu.
   UWAGA: Dobry potok analizy powinien pozwolić użytkownikom na określenie progu oddzielania prawdziwych plamek RNA od tła i wyprowadzanie statystyk, takich jak współrzędne X, Y i Z (opcjonalnie) oraz intensywność każdej plamki, liczba plamek w każdej komórce i ewentualnie dopasowanie parametrów jako sposób na odfiltrowanie fałszywych detekcji.

Wyniki

Aby ocenić, jak dobrze działa protokół smFISH (opisany w Rysunek 1), zaprojektowaliśmy zestaw 54 sond, które kafelkują otwartą ramkę odczytu genu NDC80 (Rysunek 2A, góra). Sonda znajdująca się na końcu co najwyżej 5' jest określana jako sonda 1; następna, Sonda 2; i trzecia, Sonda 3 itd. 27 sond o liczbie nieparzystej (Sonda 1, 3, 5...) jest sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym CAL Fluor 590 (CF590); oraz 27 sond o parzystej liczbie (sonda 2, 4, 6...), sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym Quasar 670 (Q670). W związku z tym te naprzemienne zestawy sond są często określane jako sondy "parzyste/nieparzyste". Po hybrydyzacji oba zestawy sond powinny oznaczać ten sam transkrypt.

Po wykryciu miejsca użyliśmy kilku pomiarów, aby ocenić jakość zestawu danych smFISH. Pierwszym z nich był stopień i jakość kolokalizacji dla sond parzystych/nieparzystych. W naszym przypadku 88% wszystkich plamek smFISH było kolokalizowanych (Rysunek 2A i 2B), przy czym więcej niż 95% plamek zostało sparowanych w odległości 2 pikseli od siebie (Rysunek 2C, sparowany), co mieści się w oczekiwanej wartości, biorąc pod uwagę jakąkolwiek aberrację chromatyczną i detekcyjną między dwoma kanałami fluorescencyjnymi. Dla porównania, mniej niż 10% niesparowanych plamek miało odległość od najbliższego sąsiada mniejszą niż 2 piksele, co pokazuje, że prawdopodobieństwo błędnej identyfikacji pary plamek jest niskie (Rysunek 2C). 12% niesparowanych spotów było równo podzielonych między dwa kanały (Rysunek 2B, porównaj tylko CF590 z tylko Q670); i w ten sposób doszliśmy do wniosku, że dla tego genu 2,4 kB o zakresie ekspresji od zera do 45 transkryptów na komórkę, ~94% cząsteczek RNA zostało dokładnie wykrytych w każdym kanale fluorescencyjnym. Gdyby protokół smFISH był nieoptymalny, można by zaobserwować (1) większą część plamek smFISH z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych (niekolokalizowanych) i/lub (2) komórki o bardzo niskim stosunku sygnału do szumu lub bez sygnału.

Następnie zapytaliśmy, czy detekcja sygnału smFISH była obciążona w stosunku do całkowitej liczby cząsteczek RNA na komórkę. W populacji całkowita liczba określonego RNA w każdej komórce zależy od rozkładu, przy czym niektóre komórki zawierają więcej cząsteczek RNA niż inne. Dobry protokół smFISH powinien niezawodnie wykrywać RNA niezależnie od tego, czy w każdej komórce znajduje się duża czy mała liczba cząsteczek RNA. Aby to przetestować, dla każdej komórki obliczyliśmy frakcję plamek smFISH z kolokalizowanymi sygnałami i frakcję z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych. Po zgrupowaniu komórek, które miały taką samą całkowitą liczbę plamek na komórkę, obliczyliśmy średni ułamek kolokalizowanych (sparowanych) lub niekolokalizowanych (tylko CF590 lub tylko Q670) plamek w danej grupie i przedstawiliśmy tę średnią na wykresie jako funkcję całkowitej liczby plamek na komórkę (Rysunek 3). Dla każdej kategorii plamek frakcje były podobne w całym zakresie całkowitej liczby plamek na komórkę. Na przykład, porównując komórki z łącznie 20 fluorescencyjnymi plamkami na komórkę z tymi z łączną liczbą 30 plamek, średnie frakcje kolokalizowanych plamek były podobne. Wynik ten sugerował, że nasz protokół może wykryć szereg cząsteczek RNA w komórce (do co najmniej ~40 cząsteczek na komórkę). Jeśli protokół działał nieoptymalnie, można zaobserwować stronniczość. Na przykład odsetek plamek z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych może rosnąć wraz ze wzrostem całkowitej liczby plamek na komórkę.

Korzystając z tego zoptymalizowanego protokołu, zbadaliśmy ekspresję genu NDC80, który koduje białko kinetochorowe, w różnych warunkach wzrostu. Gen NDC80 wyraża dwie izoformy mRNA: długa niezdekodowana izoforma transkryptu, NDC80^luti, ma rozszerzenie ~ 400 par zasad na końcu 5' w porównaniu do krótkiej izoformy ^{NDC80 ORF}, ale oba transkrypty dzielą region kodujący genu NDC80 (patrz schemat w Figura 4A). Zaprojektowaliśmy dwa zestawy sond: zestaw CF 590 wiąże się z unikalnym obszarem 5' ^{NDC80 luti}; a zestaw Q 670 wiąże się ze wspólnym regionem NDC80^luti i NDC80^ORF. Transkrypty ^{NDC80 luti} zostały wykryte jako punkty smFISH, w których sygnały z obu zestawów sond kolokalizowały się, podczas gdy transkrypty ^{NDC80 ORF} były tymi, które zawierały sygnał tylko z Q 670. Ze względu na rozmiar unikalnego segmentu ^{NDC80 luti}, mogliśmy umieścić w tym regionie tylko 20 sond oligonukleotydowych, czyli mniej niż zalecane 30 do 48 sond. Dlatego najpierw ustaliliśmy, czy ten zestaw sond może niezawodnie wykrywać RNA w naszym zoptymalizowanym protokole. Dla każdego kanału fluorescencyjnego sporządziliśmy wykres stosunku sygnału do szumu (SNR, zdefiniowany jako wariancja pikseli otaczających plamkę w stosunku do intensywności plamki) w stosunku do sygnału wykrytego dla każdej plamki smFISH i wygenerowaliśmy wykres rozrzutu dla wszystkich punktów zidentyfikowanych w całym polu widzenia (przykładowe obrazy w Rysunek 4A i wykresy w Rysunek 4B). Dwie odrębne populacje zostały wyraźnie zidentyfikowane zarówno dla zestawów sond Q 670, jak i CF 590 (zoptymalizowane, Rysunek 4B), co sugeruje, że prawdziwe plamki smFISH (wewnątrz szarego obszaru) można oddzielić od sygnału tła. Zauważ, że w warunkach nieoptymalnych taka separacja była mniej oczywista (Suboptimal, Rysunek 4B).

Użyliśmy tych dwóch zestawów sond do zbadania ekspresji NDC80^luti i NDC80^ORFpodczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. W komórkach wegetatywnych wykryto silny sygnał z zestawu sond Q 670, ale nie z zestawu sond CF 590 (Rysunek 5A, wegetatywny), zgadzając się z obserwacją przez northern blot, że tylko krótka izoforma uległa ekspresji podczas wzrostu wegetatywnego¹⁶. Wynik ten sugeruje również, że zestaw sond CF 590 jest specyficzny, dając niskie tło w naszym zoptymalizowanym protokole smFISH. W przeciwieństwie do tego, silny sygnał z obu zestawów sond został wykryty w profazie mejotycznej, a większość plamek miała kolokalizowany sygnał (Rysunek 5A, profaza mejotyczna). Wraz z analizą northern blot (Rysunek 5B), obserwacja ta potwierdziła, że długa izoforma NDC80^luti była wyrażana specyficznie w mejozie. Te dwa typy mRNA wykryto w cytoplazmie (poza regionem DAPI), co sugeruje, że oba zostały wyeksportowane z jądra, zgodnie z danymi profilowania rybosomów¹⁸.

Aby ustalić, czy zebrano wystarczającą ilość danych, aby dokładnie uwzględnić biologiczną zmienność nieodłącznie związaną z naszym zestawem danych, przeprowadziliśmy analizę bootstrap, korzystając ze statystyk każdej komórki, które obejmowały (1) frakcję kolokalizowanych plam na komórkę i (2) frakcję plam z jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych (tylko CF 590 i tylko Q 670). W tej analizie, Program losowo wybrał jedną komórkę z 437 komórek oznaczonych ilościowo przez 500 iteracji. Następnie obliczono średnią i wariancję odpowiednich statystyk związanych z tymi 500 wybranymi komórkami. Proces ten został następnie powtórzony w celu losowego wybrania dwóch komórek ze wszystkich komórek, bez zastępowania; a następnie do losowego wyboru trzech komórek itp. aż do osiągnięcia połowy całkowitego rozmiaru zestawu danych. Wariancja w zbiorze danych ustabilizowała się po ~40 komórkach, co sugeruje, że po tym punkcie większość zmian średniej jest nieodłączna od danych, a nie artefaktem niedostatecznego próbkowania (Rysunek 6, wstawka). Efekt ten stał się bardziej oczywisty, gdy przedstawiliśmy na wykresie wariancję próby podzieloną przez średnią z próby, jako funkcję liczby komórek próbkowanych w każdym cyklu iteracyjnym (Rysunek 6). Po przedstawieniu danych zmiana wariancji stała się coraz mniejsza po ~60 komórkach. Liczba komórek określona ilościowo w doświadczeniu smFISH powinna przekraczać minimalną liczbę komórek wymaganą do osiągnięcia stabilnej średniej i plateau wariancji. W naszym przypadku określiliśmy ilościowo ponad 95 komórek na próbkę, na replikę. Całkowita liczba komórek (> 400 komórek) znacznie przekroczyła minimalną liczbę komórek (~60 komórek) wymaganą do odzwierciedlenia średniej populacji.

Za pomocą niestandardowego programu Matlab¹⁶, stwierdzono, że komórki wegetatywne mają medianę 5 transkryptów ^{NDC80 ORF} na komórkę, podczas gdy w mejotycznych komórkach profazowych mediana znacznie spadła do 4 transkryptów na komórkę (dwustronny test sumy rang Wilcoxona, p = 0,026) (Rysunek 7). Mediana liczby transkryptów NDC80^luti na komórkę wynosiła 21 transkryptów, a 100% komórek wyrażało transkrypty ^{NDC80 luti}. Przedstawiliśmy na wykresie frakcję komórek z daną liczbą transkryptów jako krokowy, względny histogram częstotliwości, ponieważ liczba cząsteczek mRNA jest wielkością dyskretną. Największy kosz na każdym histogramie został znormalizowany do tej samej wysokości.

Rysunek 1: Schemat blokowy dla protokołu smFISH. Komórki utrwala się formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 20 minut lub w temperaturze 4 °C przez noc, odpowiednio dla próbek wzrostu wegetatywnego i próbek mejotycznych. Po trzykrotnym przemyciu w Bufor B, komórki są trawione przez zymoliazę do momentu trawienia ~70% - 90% komórek. Strawione próbki są następnie przemywane jednorazowo buforem B w celu usunięcia zymolyazy, a następnie permeabilizowane w 70% etanolu (EtOH) przez ~3,5 godziny. Aby przygotować się do hybrydyzacji, próbki są najpierw inkubowane w 10% buforze do płukania formamidu (FWB) przez ~20 minut. Następnie próbki są ponownie zawieszane w ~50 μl roztworu hybrydyzacyjnego, który zawiera sondy fluorescencyjne, do nocnej inkubacji w ciemności w temperaturze 30 °C. Po hybrydyzacji próbki inkubuje się w 10% FWB przez 30 minut w celu zmycia nadmiaru sond, a następnie inkubuje w 10% FWB z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) w celu wybarwienia DNA. W przypadku próbki zobrazowanej bezpośrednio po inkubacji FWB/DAPI, próbka jest ponownie zawieszana w buforze GLOX uzupełnionym katalazą, Troloxem i oksydazą glukozową (GLOX + enz); natomiast pozostałe próbki są ponownie zawieszane w buforze GLOX bez enzymów i przechowywane w temperaturze 4 °C do ~3 godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ocena jakości smFISH za pomocą sond parzystych/nieparzystych. (A) Góra: Schemat zestawów sond parzystych/nieparzystych. Zaprojektowano pięćdziesiąt cztery sondy oligonukleotydowe identyfikujące gen NDC80. Sondy o numerach nieparzystych zostały oznaczone jednym fluoroforem (CF590, pokazanym w kolorze magenta), a sondy o numerach parzystych innym fluoroforem (Q670, pokazanym na zielono). U dołu: Reprezentatywne obrazy smFISH mejotycznych komórek profazowych uzyskanych przy użyciu parzystych/nieparzystych zestawów sond. Próbki pobrano 6 godzin po przeniesieniu komórek (UB8144) do pożywki zarodnikowej, w czasie, gdy komórki te zostały zatrzymane w profazie mejotycznej. DNA zostało wybarwione za pomocą DAPI (pokazane na niebiesko). Obrazy są wyświetlane jako projekcje o maksymalnej intensywności stosów z. Podziałka: 5 μm. (B) Procent sparowanych lub niesparowanych plamek smFISH uzyskanych przy użyciu parzystych/nieparzystych zestawów sond. W sumie przeanalizowano 428 mejotycznych komórek profazowych, pochodzących z dwóch niezależnych eksperymentów. Ten rysunek jest zmodyfikowany z Rysunek 2-figurowy suplement 4 Chen et al.¹⁶ (C) Funkcja skumulowanej gęstości (CDF) odległości między każdą parą sparowanych punktów oraz odległości między najbliższym sąsiadem niesparowanego punktu. Dla każdego wykrytego punktu w jednym kanale fluorescencyjnym zastosowano algorytm "k najbliższego sąsiada" w celu zidentyfikowania najbliższego wykrytego punktu - i odległości do tego miejsca - w kanale uzupełniającym. Lokalizacje, które były wzajemnymi najbliższymi sąsiadami, zostały uznane za sparowane i wygenerowano nową listę rejestrującą wykrycia sparowane, tylko CF590 i Q670. Dla każdej kategorii detekcji, histogram CDF odległości został wykreślony w Matlabie, potwierdzając, że prawidłowo sparowane punkty rzeczywiście znajdowały się znacznie bliżej niż te, które nie miały odpowiadającego im miejsca w drugim kanale. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Frakcje sparowanych i niesparowanych plamek w funkcji całkowitej liczby RNA na komórkę. Aby sprawdzić, czy wykrywanie i parowanie plamek smFISH było obciążone na różnych poziomach ekspresji, poszczególne komórki pogrupowano według całkowitej ekspresji RNA. Średnie frakcje wykryć sparowanych, tylko CF590 i tylko Q670 obliczono dla każdej grupy komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ocena jakości danych smFISH wygenerowanych za pomocą sond przeznaczonych do mRNA NDC80^luti i NDC80^ORF. Sondy Q 670 (pokazane na zielono) hybrydyzują do wspólnego regionu wspólnego dla mRNA NDC80^luti i NDC80^ORF, podczas gdy sondy CF 590 (pokazane w kolorze magenta) hybrydyzują do unikalnego regionu 5' ^{NDC80 luti}. (A) Reprezentatywne obrazy smFISH NDC80^luti i NDC80^ORF w profazie mejotycznej, uzyskane w optymalnych i nieoptymalnych warunkach. Szczepy UB8144 (stan zoptymalizowany) i UB1337 (stan nieoptymalny) zostały wywołane do poddania mejozie i utrwalone podczas profazy mejotycznej. Te dwa szczepy posiadają różne systemy synchronizacji w celu wywołania mejozy, ale użycie któregokolwiek z nich nie wpływa na jakość smFISH (dane nie pokazane). W nieoptymalnych warunkach komórki utrwalono w temperaturze pokojowej przez 20 minut (bez utrwalenia przez noc), trawiono zymoliazą bez suplementu VRC i hybrydyzowano w niższym stężeniu VRC. Obrazy są wyświetlane jako projekcje o maksymalnej intensywności stosów z. DNA zostało wybarwione za pomocą DAPI (pokazane na niebiesko). Podziałka: 5 μm. (B) Wykresy rozrzutu przedstawiające stosunek sygnału do szumu (SNR) oraz sygnał każdej plamki smFISH wykrytej w polu widzenia przedstawionym w Rysunek 4A, dla kanału fluorescencyjnego, jak również dla warunków zoptymalizowanych lub nieoptymalnych. W optymalizowanych warunkach obecne były dwie populacje plamek smFISH. Prawdziwe plamy smFISH znajdowały się wewnątrz szarej strefy, oddzielając się od sygnału tła. W nieoptymalnych warunkach poszczególne mRNA były trudne do odróżnienia gołym okiem, a separacja między prawdziwymi plamkami a tłem po uruchomieniu oprogramowania do wykrywania plamek była mniej oczywista. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Ekspresja transkryptów ^{NDC80 luti} i NDC80^ORF jest kontrolowana czasowo. (A) Reprezentatywne obrazy smFISH NDC80^luti i NDC80^ORF podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. Próbki wegetatywne pobrano, gdy komórki (UB8144) rosły wykładniczo w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Próbki profazy mejotycznej pobrano 6 godzin po przeniesieniu komórek (UB8144) na pożywkę zarodnikową, w czasie, gdy komórki te zostały zatrzymane w profazie mejotycznej. Sondy Q 670 (pokazane na zielono) hybrydyzują do wspólnego regionu wspólnego dla mRNA NDC80^luti i NDC80^ORF, podczas gdy sondy CF 590 (pokazane w kolorze magenta) hybrydyzują do unikalnego regionu 5' ^{NDC80 luti}. DNA zostało wybarwione za pomocą DAPI (pokazane na niebiesko). Każda komórka została zainscenizowana przez sygnał Zip1-GFP, marker profazy mejotycznej. Nasz protokół smFISH zachowuje silny sygnał GFP bez dalszych modyfikacji. Wzrost wegetatywny: ujemny Zip1-GFP. Profaza mejotyczna: dodatnia Zip1-GFP. Obrazy są wyświetlane jako projekcje o maksymalnej intensywności stosów z. Podziałka: 5 μm. Ten rysunek jest zmodyfikowany z Rysunek 2C Chen et al.¹⁶. (B) Poziom NDC80^ORF, NDC80^luti i białka Ndc80 (Ndc80p) podczas mejozy (UB4074). Poziomy NDC80^luti i NDC80^ORF oznaczono za pomocą northern blot, a poziom Ndc80p oznaczono za pomocą immunoblot anty-V5 we wskazanych punktach czasowych. Hxk1p, kontrola obciążenia dla immunoblot. Jako szczep UB8144, szczep ten zawiera również system synchronizacji pGAL-NDT80 GAL4-ER^19,20. Komórki przeniesiono do pożywki zarodnikowej po 0 godzinie i uwolniono od zatrzymania pachytenu przez dodanie β-estradiolu 6 godzin później. Transkrypt NDC80^luti został solidnie wykryty w profazie S / mejotycznej, podczas gdy transkrypty ^{NDC80 ORF} były głównie obecne przed wejściem mejotycznym (0 godzin) i podczas podziałów mejotycznych (7-9 godzin). Ten rysunek jest zmodyfikowany z Rysunek 6J Chen et al.¹⁶ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza bootstrap przeprowadzona dla próbek profazy mejotycznej pokazanych na rysunku Rysunek 5. Wszystkie komórki oznaczone ilościowo zostały połączone, a podana liczba (n) komórek została losowo pobrana 500 razy. Średnią i 95% przedział ufności obliczono dla frakcji sparowanego i niesparowanego mRNA na komórkę. Dane te zostały wykreślone dla każdego wyboru liczby n (Wstawka). Plateau wariancji zwizualizowano poprzez wykreślenie wariancji próby podzielonej przez średnią w funkcji liczby komórek (n) pobranych próbek. Całkowita liczba zmierzonych komórek (437 komórek) znacznie przekroczyła liczbę, przy której błąd ustabilizował się (~60 komórek), co wskazuje, że dodatkowe dane nie poprawią zaufania do pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Kwantyfikacja danych smFISH pokazanych w Rysunek 5, przedstawiony na wykresie jako histogramy względnej częstości komórek o podanej liczbie transkryptów NDC80^luti i NDC80^ORF na komórkę, przy użyciu danych zebranych z trzech niezależnych eksperymentów. Linia przerywana wskazuje medianę liczby transkryptów NDC80^luti i NDC80^ORF na komórkę. Każdy histogram został znormalizowany tak, aby maksymalna wysokość pojemnika była taka sama na wszystkich histogramach. Łączną liczbę 637 komórek przeanalizowano pod kątem wzrostu wegetatywnego i 437 pod kątem profazy mejotycznej. Dwustronny test Wilcoxona Rank Sum przeprowadzono odpowiednio dla NDC80^luti i NDC80^ORF, porównując wegetatywne i mejotyczne próbki profazy. Ten rysunek jest zmodyfikowany z Rysunek 2D Chen et al.¹⁶ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział pkt. szt. szt. ) Rozdział

Bufor B (1 l zapasu: 1,2 M sorbitolu; 0,1 M buforu fosforanu potasu, pH 7,5)	1x
Woda wolna od nukleaz	500 ml
sorbitol	218,6 gr
KH2PO4	2,18 gr
K2HPO4	14,62 gr
Woda wolna od nukleaz	Doprowadzić do 1 l końcowej objętości
*Przechowywać w temperaturze 4 °C w 50 ml porcji po sterylizacji filtra
Zymoliaza 100T (10 mg / ml)
*Przechowywać w temperaturze -20 °C w porcjach
Rozpuścić 10 mg zymoliazy w proszku w 1 ml wody MilliQ
tRNA E. coli (10 mg/ml)
*Przechowywać w temperaturze -20 °C w porcjach
Rozpuścić 10 mg tRNA w proszku w 1 ml wody MilliQ
70% etanol (50 ml)	1x (ml)
Czysty etanol	35
Woda wolna od nukleaz	15
*Przechowywać w temperaturze pokojowej
Bufor hybrydyzacyjny (10 ml)	1x (ml)
50% siarczan dekstranu	cyfra arabska
tRNA E. coli (10 mg/ml)	1
200 mM kompleks rybonukleozydów wanadylu (VRC)	0,1
BSA, 50 mg/ml	0,04
20x SSC	1
Formamid	1
Woda wolna od nukleaz	Norma 4,86
*Przechowywać w temperaturze -20 °C w porcjach 250 μl lub 500 μl
10% formamidowy bufor do przemywania (10 ml)	1x (ml)
Formamid w temperaturze pokojowej	1
20x SSC	1
Woda wolna od nukleaz	8
* Zrób świeże, wiruj przez 20-30 sekund, aby wymieszać
10% roztwór glukozy
*Przechowywać w temperaturze 4 °C w podwielokrotnościach po sterylizacji filtra
Rozpuścić 1 g glukozy w 10 ml wody wolnej od nukleaz
Oksydaza glukozowa
*Przechowywać w temperaturze -20 °C w porcjach
Rozpuścić 3,7 mg oksydazy glukozowej w 1 ml 50 mM NaOAc, pH 5
Bufor przeciw wybielaniu (GLOX), bez enzymów (1 ml)	1x (μL)
10% glukozy w wodzie wolnej od nukleaz	Rozdział 40
1 M Tris, pH 8,0	10
20x SSC	100
Woda wolna od nukleaz	850
*zrobić świeże, można również przechowywać porcje w temperaturze 4 °C
Bufor przeciw wybielaniu (GLOX) z enzymami (50 μL)	1x (μL)
Katalaza (wiruje łagodnie, łatwo się uspokaja	0,5
Oksydaza glukozowa	0,5
100 mM Trolox (rozpuszczony w etanolu)	1
Bufor GLOX	50
*za każdym razem przygotuj świeże, przygotuj na lodzie, można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny

Tabela 1. i nośniki

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół wywodzi się z innych opublikowanych protokołów smFISH 2,3,21,22,23 i jest specjalnie zoptymalizowany dla tła szczepu drożdży SK1. Zoptymalizowane parametry obejmowały liczbę komórek, czas utrwalania, prędkość i czas trwania wirowania, czas trwania trawienia, bufor trawienny, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny. Inne parametry, takie jak temperatura i czas trwania hybrydyzacji, nie zostały zoptymalizowane. W tej sekcji dzielimy się kilkoma uwagami, które pomogłyby dostosować ten protokół do dowolnego tła szczepu drożdży i interesujących warunków wzrostu.

Ściana komórkowa pączkujących drożdży jest jednym z głównych wyzwań związanych z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów smFISH w pączkujących drożdżach, ponieważ ściana komórkowa zapobiega penetracji sondy. Niepełne trawienie ściany komórkowej przez zymoliazę prowadzi do nieefektywnej hybrydyzacji sond i dużej zmienności sygnału między komórkami. Jednak nadmierne trawienie może sprawić, że komórki staną się zbyt kruche, co prowadzi do znacznej utraty komórek podczas etapów płukania i pękania komórek podczas przygotowywania szkiełek do obrazowania. Dlatego optymalizacja czasu trawienia ma kluczowe znaczenie. Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu smFISH poprzez trawienie tej samej próbki przez różny czas. W naszym przypadku uzyskaliśmy najlepsze dane smFISH, jeśli zatrzymaliśmy trawienie, gdy ~80% komórek stało się nierefrakcyjnych. Zazwyczaj, w tych samych warunkach wzrostu, różne zmutowane szczepy genetyczne mogą być trawione w podobnym czasie. Jednak czas trawienia różni się w porównaniu z różnymi warunkami wzrostu i różnymi etapami mejozy u pączkujących drożdży. Po ustaleniu czasu jakość smFISH jest powtarzalna. Należy pamiętać, że w przypadku zmutowanych szczepów z wadliwą syntezą i/lub składem ściany komórkowej trawienie może zakończyć się w czasie krótszym niż 15 minut. Stosowanie różnych partii zymoliazy może również nieznacznie zmienić czas trawienia.

Optymalne stężenie sondy jest potrzebne do osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu. Nasze sondy smFISH zaprojektowaliśmy i zakupiliśmy komercyjnie. Dobre sondy (często 20-merowe) powinny mieć procent GC w zakresie od 35% do 45%, minimalny odstęp 2 par zasad między sondami i niską reaktywność krzyżową. Użyliśmy internetowego projektanta sond od producenta, aby wygenerować listę sond, a jeśli byłoby wystarczająco dużo sond do wyboru, użylibyśmy algorytmu BLAST w bazie danych genomu Saccharomyces, aby wyeliminować sondy z więcej niż 17 parami zasad nakładającymi się na inne regiony genomu. Wybraliśmy bardziej fotostabilny barwnik fluorescencyjny (CAL Fluor 590) do zestawu sond, który wyżarza się do unikalnego obszaru ^{NDC80 luti} (CF 590), ponieważ w tym zestawie liczba sond spełniających wszystkie powyższe kryteria (20 sond) była mniejsza niż minimalna liczba zalecana przez producenta (~25 sond). Po rozpuszczeniu roztworu sondy zgodnie z instrukcjami producenta, dokonaliśmy rozcieńczenia roztworu podstawowego w stosunku 1:10 i przechowywaliśmy rozcieńczony roztwór w podwielokrotnościach 5 μl w temperaturze -20 °C. Każda podwielokrotność została użyta tylko jeden raz. W celu optymalizacji należy wykonać seryjne rozcieńczenia z roztworu rozcieńczonego w stosunku 1:10 i sprawdzić, które stężenie daje najlepszy stosunek sygnału do szumu. Zalecamy wykonanie serii rozcieńczeń 1:250, 1:500, 1:1000 i 1:2000 z oryginalnego wywaru. W naszym przypadku współczynnik rozcieńczenia 1:500 dał najlepszy stosunek sygnału do szumu, zarówno dla zestawów sond CF 590, jak i Q 670.

Optymalny czas wiązania ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia smFISH w pączkujących drożdżach. Odkryliśmy, że utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, zamiast utrwalania w temperaturze pokojowej przez 20 minut, znacznie poprawiło spójność i jakość wyników smFISH dla próbek mejotycznych. Chociaż nie testowaliśmy, jak utrwalanie przez noc może wpływać na próbki wegetatywne, fiksacja w temperaturze pokojowej działała dobrze w tych warunkach wzrostu. Dlatego, aby zoptymalizować protokół smFISH dla nowych szczepów lub warunków wzrostu, zalecamy rozpoczęcie od krótkiego czasu utrwalenia w temperaturze pokojowej i wydłużenie czasu utrwalenia w przypadku napotkania dużej zmienności sygnału.

W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami ^3,22,23, nasz protokół wykorzystuje inhibitor RNazy VRC podczas trawienia i wyższe stężenie VRC podczas hybrydyzacji. Dodanie VRC w tych dwóch etapach poprawiło spójność wyników smFISH, prawdopodobnie poprzez lepszą ochronę cząsteczek RNA przed aktywnością nukleazy, która może być wprowadzana przez mieszaninę zymoliazy (enzym jest oczyszczany z surowych ekstraktów i może zawierać zanieczyszczenia RNazą). Dlatego zalecamy stosowanie ilości VRC podanej w naszym protokole lub nawet wyższych stężeń VRC w celu optymalizacji.

Znaczna część komórek może zostać utracona podczas etapów płukania zarówno w buforze B, jak i w buforze do przemywania formamidem. Aby zmniejszyć utratę komórek, można zwiększyć prędkość wirowania. W naszym przypadku użycie dużej prędkości (21 000 x g) do granulowania naszych próbek podczas mycia buforem B znacznie zmniejszyło utratę komórek. Jednak po trawieniu zymoliazą komórki stają się bardzo kruche, dlatego zmiana prędkości wirowania nie jest zalecana. Zamiast tego sugerujemy użycie rurek o niskiej przyczepności firmy USA Scientific, które znacznie pomagają w granulowaniu komórek podczas mycia w buforze do płukania formamidu. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół może konsekwentnie generować monowarstwę komórek wystarczająco gęstą, aby zapewnić wydajne obrazowanie. Zazwyczaj 7 pól widzenia powinno dać >130 komórek nadających się do kwantyfikacji.

Na koniec ważne jest, aby określić optymalne parametry i potrzebne wyniki analizy obrazu. Aby wykryć plamy smFISH, opublikowane programy analityczne zwykle filtrują surowe obrazy za pomocą jądra Gaussa w celu usunięcia sygnału tła i proszą użytkowników o określenie stosunku sygnału do szumu, który ma być używany dla każdego zestawu obrazów ^2,17. Niestety, obecnie nie ma jednego standardu, według którego określa się odpowiednie parametry, dlatego konieczne jest przeprowadzenie pewnych empirycznych testów tych różnych ustawień. Aby ustawić parametry potrzebne dla każdego z tych kroków, należy iteracyjnie wprowadzać różne zestawy parametrów i sprawdzać, jak dobrze wyniki uzyskane z każdego zestawu pasują do wyników z ręcznego liczenia w kilku reprezentatywnych komórkach. Po znalezieniu jednego zestawu parametrów, można go użyć do większości obrazów uzyskanych pomimo różnych warunków wzrostu i tła genetycznego.

Ponadto można sprawdzić, czy projekcja obrazów smFISH o maksymalnej intensywności może być wykonana przed kwantyfikacją²². Ten krok upraszcza algorytm wykrywania plamek i znacznie skraca czas obrazowania, choć kosztem niektórych potencjalnie użytecznych informacji o poszczególnych miejscach, takich jak ich lokalizacja subkomórkowa. W naszym przypadku liczba cząsteczek mRNA wytwarzanych przez gen NDC80 była na tyle niska, że plamki były dobrze oddzielone po tym przetwarzaniu (co nie jest rzadkością w przypadku transkryptów u pączkujących drożdży ^3,7). W przypadkach, gdy analiza kolokalizacji ma kluczowe znaczenie, potok analizy musi określić lokalizację każdego miejsca smFISH w każdym kanale, aby ocenić kolokalizację. W zależności od konkretnych zadawanych pytań, inne informacje, takie jak intensywność każdego miejsca, mogą być również konieczne pobranie z rurociągu w celu dalszej analizy. Optymalizacja kluczowych kroków w protokole i potoku analizy obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych smFISH w celu zbadania interesującego pytania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSA, bez RNaz (50 mg/ml)	Ambion	AM2616	Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
Catalase	Sigma	C3515	Sklep pod adresem 4 ° C jak krótkoterminowe. Wirować przed użyciem.
DAPI	Sigma	D9564	Sklep pod adresem -20 ° C po rozpuszczeniu w wodzie. Chronić przed światłem.
50% siarczan dekstranu	Milli Pore	S4030	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Bardzo lepka ciecz. Obchodź się z cierpliwością.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	Przechowywać w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.
Etanol (100%, 200 proof)	różne		łatwopalne.
37% Formaldehyd	Fisher	F79-500	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie.
Formamid	Ambion	AM9342	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Otworzyć po osiągnięciu temperatury zbliżonej do temperatury pokojowej, aby zapobiec utlenianiu. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie.
Glukoza	różne		Przechowywać w 4 & stopni; C po rozpuszczeniu w wodzie wolnej od nukleaz.
Oksydaza glukozowa	Sigma	G2133	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w 50 mM NaOAc, pH 5.
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9932	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Fosforan potasu (jednozasadowy i dwuzasadowy)	Przechowywać		w temperaturze pokojowej.
Biblioteka sond, rozcieńczona w TE, pH 8,0	Sklep z technologiami		na -20 ° C w podwielokrotnościach (5 &mikro; L) po rozpuszczeniu w TE pH 8,0, zgodnie z instrukcją producenta. Chronić przed światłem.
Sorbitol	różne		Przechowywać w temperaturze pokojowej.
20X SSC	Ambion	AM9763	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
TE, pH 8,0	Ambion	AM9849	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
1 M Tris, pH 8,0	Ambion	AM9856	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Trolox	Sigma	238813	Sklep w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach.
200 mM kompleks rybonukleozydów wanadylu (VRC)	NEB	S1402S	Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu, zgodnie z instrukcją producenta.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	Sklep w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.
Rurki o niskiej przyczepności	USA Scientific	1415-2600	Przechowywać w temperaturze pokojowej.