Artykuł metodologiczny

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

22.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57774

⸱

25 maja 2018

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall, University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Streszczenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) jest potężną techniką do badania ekspresji genów w pojedynczych komórkach ze względu na jej zdolność do wykrywania i liczenia pojedynczych cząsteczek RNA. Uzupełnienie metod opartych na głębokim sekwencjonowaniu, smFISH dostarcza informacji na temat zmienności liczebności transkryptów między komórkami i lokalizacji subkomórkowej danego RNA. Ostatnio wykorzystaliśmy smFISH do zbadania ekspresji genu NDC80 podczas mejozy u pączkujących drożdży, w których istnieją dwie izoformy transkryptu, a izoforma krótkiego transkryptu ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą. Aby z pewnością zidentyfikować każdą izoformę transkryptu, zoptymalizowaliśmy znane protokoły smFISH i uzyskaliśmy wysoką spójność i jakość danych smFISH dla próbek pobranych podczas pączkowania mejozy drożdży. Tutaj opisujemy ten zoptymalizowany protokół, kryteria, których używamy do określenia, czy uzyskuje się wysoką jakość danych smFISH, oraz kilka wskazówek dotyczących wdrażania tego protokołu w innych szczepach drożdży i warunkach wzrostu.

Wprowadzenie

Dynamiczna regulacja ekspresji genów napędza rozwój organizmu, jak również jego reakcję na stres środowiskowy, infekcje i zmiany w metabolizmie. Badania, które koncentrują się na regulacji transkrypcji, opierają się na technologiach mierzących obfitość RNA. Jedna z takich metod, określana jako hybrydyzacja in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH), jest stosowana do wykrywania pojedynczych cząsteczek RNA w pojedynczych komórkach1,2. Metoda ta umożliwia pomiar zmienności ekspresji genów między komórkami i określenie lokalizacji wewnątrzkomórkowego RNA.

W najczęściej używanej technice smFISH, wykrywanie pojedynczej cząsteczki RNA wymaga wielu krótkich sond DNA (często ~48 sond 20-merowych), które są komplementarne do docelowego RNA i są sprzężone z tym samym barwnikiem fluorescencyjnym. Wiązanie pojedynczej sondy fluorescencyjnej powoduje słaby sygnał, ale sygnał z zestawu wszystkich sond jest solidny. Ta cecha znacznie poprawia stosunek sygnału do szumu, ponieważ nawet jeśli pojedyncza sonda może wykazywać wiązanie poza celem, oczekuje się, że taki sygnał będzie bardzo słaby w porównaniu z docelową cząsteczką RNA3. W ramach błędu detekcji można policzyć i porównać liczbę cząsteczek RNA w różnych warunkach wzrostu i między różnymi mutantami.

Od momentu pierwszego opracowania, smFISH został przystosowany do badania różnych aspektów ekspresji genów4, takich jak wydłużenie transkrypcji1,2, splicing5,6, burstingal transcriptional class7,8,9, wewnątrzkomórkowa ekspresja alleliczna10,11,12, oraz lokalizacja RNA13,14,15. Ostatnio zastosowaliśmy tę metodę do zbadania ekspresji dwóch izoform transkryptowych tego samego genu, w których izoforma krótkiego transkryptu (NDC80ORF) ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą (NDC80luti)16. Aby jednoznacznie zidentyfikować dwie izoformy mRNA, użyliśmy dwóch zestawów sond: jeden zestaw jest specyficzny dla unikalnej sekwencji NDC80 luti, a drugi zestaw, sprzężony z innym barwnikiem fluorescencyjnym, wiąże się ze wspólnym regionem dwóch izoform. NDC80luti RNA jest identyfikowany jako kolokalizowana plamka z obydwoma sygnałami fluorescencyjnymi, podczas gdy NDC80ORF RNA to ten, który zawiera tylko sygnał ze wspólnego zestawu sond. Ponieważ liczba transkryptów NDC80 ORF jest obliczana metodą "odejmowania", wysoka wydajność hybrydyzacji sondy i wysoki stosunek sygnału do szumu są niezbędne do pewnej identyfikacji plam smFISH i zmniejszenia propagacji błędów.

Ten artykuł opisuje zoptymalizowany protokół wykonywania smFISH u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. W tym protokole liczba komórek, czas wiązania, czas trawienia, bufor trawienia, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny użyte w eksperymentach smFISH zostały zoptymalizowane pod kątem tła szczepu SK1 S. cerevisiae poddawanego wzrostowi wegetatywnemu lub mejjozie. Jednak w tym manuskrypcie zwracamy również uwagę: (1) metodę sprawdzania jakości danych smFISH po akwizycji obrazu oraz (2) kroki w protokole, które mogą wymagać dodatkowej optymalizacji dla różnych środowisk szczepów i warunków wzrostu.

Protokół

UWAGA: Wszystkie i nośniki używane w tym protokole są wymienione w Tabeli 1. Informacje o dostawcy odczynników są wymienione w Tabeli materiałów.

Dzień 1/Dzień 1-2:

UWAGA: Dla hodowli wegetatywnej, hoduj komórki do OD600 od 0,4 do 0,6 w preferowanym podłożu. W przypadku hodowli mejotycznej należy skłonić komórki do poddania się mejozie przy użyciu preferowanej metody (zwykle hodowla w OD600 1,85).

1. Utrwalanie i trawienie próbki

  1. Utrwal w sumie ~3,5 OD600 komórek w 3% formaldehydzie.
    1. W przypadku hodowli wegetatywnej dodaj 5,52 ml kultury do 480 μl 37% formaldehydu w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
    2. W przypadku hodowli mejotycznej dodaj 1840 μl kultury do 160 μl 37% formaldehydu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Odwróć ~5 razy, aby wymieszać.
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  2. Umieść rurki na bębnie rolkowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. W przypadku próbek mejotycznych, po utrwaleniu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, obracając.
    UWAGA: Utrwalanie przez noc zwiększa odtwarzalność i jakość danych smFISH uzyskanych dla próbek mejotycznych. Czas mocowania powinien być zoptymalizowany.
  3. Podczas utrwalania próbek rozmrozić 200 mM kompleksów rybonukleozydów wanadylu (VRC) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut.
  4. Przygotować główną mieszankę mineralizacyjną w probówce o pojemności 15 ml: dla 1 próbki zmieszać 425 μl buforu B z 40 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C); dla 5 próbek zmieszać 2125 μl buforu B z 200 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C). Wirować ~5 s, aby całkowicie zawiesić VRC przed dodaniem do mieszanki głównej, która po dodaniu VRC stanie się jasnobrązowo-zielona.
    UWAGA: Dodanie VRC podczas trawienia poprawia spójność wyników smFISH, potencjalnie poprzez hamowanie zanieczyszczenia nukleazą wprowadzanego przez mieszaninę zymoliazy, która jest oczyszczana z surowego ekstraktu. Ilość VRC wymagana na tym etapie powinna być zoptymalizowana.
  5. W przypadku próbek wegetatywnych należy odwirować probówki o sile ~1057 x g przez 3 minuty. W przypadku próbek mejotycznych (po utrwaleniu przez noc) odwirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Zdekantować lub odessać supernatant do odpadów formaldehydu.
    UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze pokojowej.
  6. Zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B, pipetując w górę i w dół lub odwracając probówki i przesuwając w celu wymieszania. Przenieść próbki wegetatywne do probówek o pojemności 2 ml po ponownym zamieszaniu.
  7. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B.
  9. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.
  10. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 minuty. Całkowicie odessać ciecz za pomocą próżni lub pipetowania.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 425 μl głównej mieszanki trawienia i krótko zawirować, aby ponownie zawiesić. Dodać 5 μl 100T 10 mg/ml zymoliazy do każdej probówki.
    UWAGA: Wiruj zymoliazę za każdym razem przed dodaniem do probówek. Dodaj zymoliazę do każdej probówki z osobna, zamiast dodawać do mieszanki głównej. Oba etapy pomagają utrzymać spójność trawienia między rurkami, ponieważ zymoliaza szybko się wytrąca.
  12. Wiruj 2-3 s do mieszania. Umieścić probówki na bębnie rolkowym i trawić w temperaturze 30 °C przez 15-30 minut. W przypadku komórek wegetatywnych i wczesnych stadiów mejotycznych trwa to zwykle ~15 min, a w przypadku profazy mejotycznej i podziałów mejotycznych trwa to zwykle ~30 min.
    UWAGA: Sprawdzaj pod mikroskopem co 5 minut po 15 minutach i przerwij trawienie, gdy ~80% komórek wydaje się nieprzezroczystych i niezałamujących. Od tego momentu komórki są bardzo delikatne. Z komórkami należy obchodzić się delikatnie i unikać zasysania próżniowego lub wirowania.
  13. Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć płyn za pomocą pipetowania.
  14. Delikatnie ponownie zawiesić komórki z 1 ml buforu B, pipetując w górę i w dół 1-2 razy, aby wymieszać.
  15. Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć płyn z buforu B przez pipetowanie. Delikatnie zawieś komórki w 1 ml 70% etanolu (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).
  16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3,5-4 godziny.

2. Hybrydyzacja

  1. Doprowadź formamid do temperatury pokojowej (dla 50 ml porcji zajmuje ~30 minut w łaźni wodnej).
    UWAGA: Nie otwieraj butelki z formamidem, dopóki butelka nie osiągnie temperatury pokojowej, aby uniknąć utleniania formamidu.
    UWAGA: Formamid jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  2. Przygotować 10% bufor do przemywania formamidu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować probówki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć 500 μl 70% etanolu przez pipetowanie. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić pozostałe komórki, a następnie przenieść komórki do probówek o niskiej przyczepności.
    UWAGA: Stosowanie rurek o niskiej przyczepności znacznie zmniejsza utratę komórek podczas kolejnych prań.
  4. Ponownie odwirować probówki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć cały etanol za pomocą pipetowania.
  5. Dodać 1 ml 10% buforu do płukania formamidu i delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy, aby ponownie zawiesić komórki.
  6. Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na ~ 20 minut, przygotowując roztwór hybrydyzacyjny. Dla 1 próbki zmieszać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 5 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 1 μl każdej sondy (200 nM final). Dla 5 próbek wymieszaj 250 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 25 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 5 μl każdej sondy (200 nM final).
    1. Rozmrozić bufor hybrydyzacyjny (zamrożony w temperaturze -20 °C) do temperatury pokojowej przed otwarciem probówki, aby zapobiec utlenianiu formamidu.
    2. Po dodaniu 200 mM VRC, wiruj przez 5-10 s przed dodaniem sond, które są projektowane i kupowane komercyjnie, a następnie odtwarzane zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Jeśli dwie sondy są inkubowane jednocześnie, dodać 1 μl roztworu sondy #1 w stosunku 1:10, a także 1 μl roztworu sondy #2 w stosunku 1:10, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie ~1:500 dla każdej sondy. Stężenie potrzebne do uzyskania najlepszego stosunku sygnału do szumu musi być zoptymalizowane (szczegółowe informacje można znaleźć w dyskusji).
  7. Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.
  8. Dodać co najmniej 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego do każdej probówki. Przesuń rurki, aby wymieszać.
  9. Inkubować w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym przez co najmniej 16 godzin w ciemności.

Dzień 2/Dzień 3

3. Mycie i obrazowanie

  1. Doprowadzić formamid do temperatury pokojowej.
  2. Przygotować 10% formamidowy bufor do przemywania (FWB) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Wyjmij rurki z bębna rolkowego i umieść je w pudełku pokrytym folią, aby chronić je przed światłem.
  4. Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.
  5. Zawiesić ponownie w 1 ml 10% FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
  6. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.
  7. Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania i pozostawić ~50 μl.
  8. W międzyczasie przygotuj DAPI/FWB w stożkowej probówce o pojemności 15 ml: Dla 1 próbki wymieszaj 1000 μl 10% buforu do płukania formamidu z 1 μl 5 mg/ml DAPI. W przypadku 10 próbek zmieszać 10 ml 10% buforu do przemywania formamidu z 10 μl 5 mg/ml DAPI. Zawiesić w 1 ml DAPI/FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
  9. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.
  10. Rozmrozić odczynniki przeciwwybielające na lodzie.
  11. Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. W razie potrzeby ponownie odwirować w celu usunięcia całego supernatantu.
  12. W przypadku próbek, które nie są obrazowane natychmiast, należy ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu GLOX bez enzymów. Pipetować w górę i w dół 3-4 razy, aby wymieszać.
    1. Przechowywać wszystkie nieobrazowane próbki w pudełku pokrytym folią w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do obrazowania. Gdy próbka będzie gotowa do obrazowania, odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 2 minuty i całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. Zawiesić w GLOX z enzymami, jak poniżej.
  13. W przypadku próbek poddawanych natychmiastowemu obrazowaniu należy dodać 15-20 μl buforu GLOX z enzymami. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    UWAGA: Dodawana objętość może się różnić w zależności od wielkości osadu komórkowego. Zalecamy ponowne zaparcie osadu w 15 μl buforu GLOX z enzymami i sprawdzenie gęstości komórek pod mikroskopem. Jeśli komórki są zbyt gęste (komórki zlepiają się jedna na drugiej), dodaj dodatkowy bufor GLOX z enzymami. Jeśli komórki są zbyt rzadkie, odwirować próbkę i usunąć ~5 μl buforu.
  14. Odpipetować 5 μl na szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm, nr 1) i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.
  15. Umieść chusteczkę laboratoryjną na szkiełku, w którym umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Delikatnie naciśnij chusteczkę laboratoryjną, aby ustawić szkiełko (powinien być widoczny płyn spływający ze wszystkich czterech krawędzi szkiełka nakrywkowego).
  16. Przenieś szkiełko do pomieszczenia mikroskopu w pudełku pokrytym folią aluminiową.
  17. Obraz za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego o dużym powiększeniu (60-100X) i dużej aperturze numerycznej.
    UWAGA: Aby zebrać maksymalną liczbę fotonów emitowanych przez sondy smFISH, nie zaleca się stosowania mikroskopów konfokalnych, ponieważ znacznie ograniczają one ilość zbieranego światła. W tym przypadku dane zostały zebrane na mikroskopie wyposażonym w obiektyw 100X, 1,4 NA, przy użyciu filtrów CY5 (EX632/22, EM679/34) zobrazowanych z prędkością 1,3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100% T; i DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32%-50% T. Należy również uzyskać obraz referencyjny w jasnym polu. Uzyskaj 15-25 wycinków o wielkości kroku 0,1-0,2 μm, od całkowicie poniżej ostrości pola widzenia do całkowicie powyżej, aby upewnić się, że wszystkie plamki RNA są uwzględnione.

4. Analiza obrazu

  1. Analizuj dane smFISH za pomocą opublikowanych narzędzi analitycznych smFISH, takich jak FISH-quant17 i StarSearch2, lub za pomocą niestandardowych programów, w zależności od dokładnych wymagań eksperymentu.
    UWAGA: Dobry potok analizy powinien pozwolić użytkownikom na określenie progu oddzielania prawdziwych plamek RNA od tła i wyprowadzanie statystyk, takich jak współrzędne X, Y i Z (opcjonalnie) oraz intensywność każdej plamki, liczba plamek w każdej komórce i ewentualnie dopasowanie parametrów jako sposób na odfiltrowanie fałszywych detekcji.

Wyniki

Aby ocenić skuteczność protokołu smFISH (przedstawionego na Rysunku 1), zaprojektowaliśmy zestaw 54 sond pokrywających ramkę odczytu genu NDC80 (Rysunek 2A, góra). Sonda zlokalizowana na najbardziej 5'-końcu została oznaczona jako Sonda 1, kolejna jako Sonda 2, a trzecia jako Sonda 3, itp. 27 sond oznaczonych numerami nieparzystymi (Sonda 1, 3, 5…) jest sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym CAL Fluor 590 (CF590), natomiast 27 sond oznaczonych numerami parzystymi (Sonda 2, 4, 6…) ze sprzężeniem z barwnikiem fluorescencyjnym Quasar 670 (Q670). Z tego względu te naprzemienne zestawy sond są często określane jako sondy „nieparzyste/parzyste”. Po hybrydyzacji oba zestawy sond powinny znakować ten sam transkrypty.

Po detekcji punktów wykorzystaliśmy kilka pomiarów do oceny jakości zestawu danych smFISH. Pierwszym z nich był stopień i jakość kolokalizacji sond nieparzystych i parzystych. W naszym przypadku 88% wszystkich punktów smFISH uległo kolokalizacji (Rycyna 2A i 2B), przy czym ponad 95% punktów zostało sparowanych w odległości mniejszej niż 2 piksele od siebie (Rycyna 2C, paired), co mieści się w wartości oczekiwanej, biorąc pod uwagę wszelkie aberracje chromatyczne i detekcyjne między dwoma kanałami fluorescencyjnymi. Dla porównania, mniej niż 10% niesparowanych punktów miało odległość do najbliższego sąsiada mniejszą niż 2 piksele, co pokazuje, że prawdopodobieństwo błędnej identyfikacji pary punktów jest niskie (Rycyna 2C). Pozostałe 12% niesparowanych punktów rozłożyło się równomiernie między dwa kanały (Rycyna 2B, porównać CF590-only z Q670-only); w związku z tym wyciągnęliśmy wniosek, że dla tego genu o długości 2.4 kb, z zakresem ekspresji od zera do 45 transkryptów na komórkę, ~94% cząsteczek RNA zostało dokładnie wykrytych w każdym kanale fluorescencyjnym. Gdyby protokół smFISH był suboptymalny, zaobserwowano by (1) większą frakcję punktów smFISH z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych (brak kolokalizacji) i/lub (2) komórki z bardzo niskim stosunkiem sygnału do szumu lub całkowitym brakiem sygnału.

Następnie zbadaliśmy, czy detekcja sygnału smFISH była obciążona w stosunku do całkowitej liczby cząsteczek RNA na komórkę. W populacji całkowita liczba danej cząsteczki RNA w każdej komórce mieści się w pewnym rozkładzie, przy czym niektóre komórki zawierają więcej cząsteczek RNA niż inne. Dobry protokół smFISH powinien stabilnie wykrywać RNA niezależnie od tego, czy w każdej komórce obecna jest wysoka, czy niska liczba cząsteczek RNA. Aby to sprawdzić, dla każdej komórki obliczyliśmy frakcję punktów smFISH z sygnałami kolokalizującymi oraz frakcję z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych. Po pogrupowaniu komórek, które miały taką samą całkowitą liczbę punktów na komórkę, obliczyliśmy średnią frakcję punktów kolokalizujących (sparowanych) lub niekolokalizujących (tylko CF590 lub tylko Q670) w danej grupie, a następnie przedstawiliśmy tę średnią jako funkcję całkowitej liczby punktów na komórkę (Rysunek 3). Dla każdej kategorii punktów frakcje były podobne w całym zakresie całkowitej liczby punktów na komórkę. Na przykład, porównując komórki z łączną liczbą 20 punktów fluorescencyjnych na komórkę z tymi, które miały łącznie 30 punktów, średnie frakcje punktów kolokalizujących były podobne. Wynik ten sugeruje, że nasz protokół może wykrywać różną liczbę cząsteczek RNA w komórce (co najmniej do ~40 cząsteczek na komórkę). Gdyby protokół działał suboptymalnie, można by zaobserwować obciążenie. Na przykład frakcja punktów z tylko jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych mogłaby wzrastać wraz ze wzrostem całkowitej liczby punktów na komórkę.

Korzystając z tego zoptymalizowanego protokołu, zbadaliśmy ekspresję genu NDC80, który koduje białko kinetochoru, w różnych warunkach wzrostu. Gen NDC80 wykazuje ekspresję dwóch izoform mRNA: długa, niekodująca izoforma transkryptu, NDC80luti, posiada wydłużenie o około 400 par zasad na końcu 5' w porównaniu do krótkiej izoformy NDC80ORF, jednak oba transkrypty dzielą region kodujący genu NDC80 (patrz schemat na Rysunku 4A). Zaprojektowaliśmy dwa zestawy sond: zestaw CF 590 wiąże się z unikalnym regionem 5' NDC80luti, a zestaw Q 670 wiąże się z regionem wspólnym dla NDC80luti oraz NDC80ORF. Transkrypty NDC80luti wykryto jako punkty smFISH, w których sygnały z obu zestawów sond kolokalizowały, natomiast transkrypty NDC80ORF były tymi, w których występował sygnał wyłącznie z Q 670. Ze względu na rozmiar unikalnego segmentu NDC80luti, mogliśmy rozmieścić w tym regionie jedynie 20 sond oligonukleotydowych, co jest liczbą mniejszą niż zalecane 30 do 48 sond. W związku z tym najpierw określiliśmy, czy ten zestaw sond może skutecznie wykrywać RNA w naszym zoptymalizowanym protokole. Dla każdego kanału fluorescencyjnego wykreśliliśmy stosunek sygnału do szumu (SNR, zdefiniowany jako wariancja pikseli otaczających punkt w stosunku do intensywności punktu) w funkcji sygnału wykrytego dla każdego punktu smFISH i wygenerowaliśmy wykres rozrzutu dla wszystkich punktów zidentyfikowanych w całym polu widzenia (przykładowe obrazy na Rysunku 4A oraz wykresy na Rysunku 4B). Dla obu zestawów sond, Q 670 i CF 590, wyraźnie zidentyfikowano dwie odrębne populacje (zoptymalizowane, Rysunek 4B), co sugeruje, że rzeczywiste punkty smFISH (wewnątrz szarego obszaru) można oddzielić od sygnału tła. Należy zauważyć, że w warunkach nieoptymalnych taka separacja była mniej oczywista (nieoptymalne, Rysunek 4B).

Wykorzystaliśmy te dwa zestawy sond do badania ekspresji NDC80luti oraz NDC80ORF podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. W komórkach wegetatywnych wykryto silny sygnał z zestawu sond Q 670, ale nie z zestawu sond CF 590 (Rysunek 5A, vegetative), co jest zgodne z obserwacjami z analizy northern blotting, według których podczas wzrostu wegetatywnego eksponowana była wyłącznie krótka izoforma16. Wynik ten sugerował również, że zestaw sond CF 590 jest specyficzny, dając niskie tło w naszym zoptymalizowanym protokole smFISH. W przeciwieństwie do tego, w profazie mejozy wykryto silny sygnał z obu zestawów sond, a większość punktów wykazywała sygnał kolokalizacyjny (Rysunek 5A, meiotic prophase). Wraz z analizą northern blot (Rysunek 5B), obserwacja ta potwierdziła, że długa izoforma NDC80luti była eksponowana specyficznie w mejozie. Oba typy mRNA wykryto w cytoplazmie (poza obszarem barwionym DAPI), co sugeruje, że oba zostały wyeksportowane z jądra, zgodnie z danymi z profilowania rybosomów18.

Aby ustalić, czy zebrano wystarczającą ilość danych do dokładnego uwzględnienia zmienności biologicznej właściwej dla naszego zestawu danych, przeprowadziliśmy analizę bootstrapową z wykorzystaniem statystyk dla każdej komórki, które obejmowały (1) frakcję kolokalizowanych plamek na komórkę oraz (2) frakcję plamek z jednym z dwóch sygnałów fluorescencyjnych (tylko CF 590 i tylko Q 670). W tej analizie program losowo wybierał jedną komórkę z 437 skwantyfikowanych komórek przez 500 iteracji. Następnie obliczono średnią i wariancję odpowiednich statystyk powiązanych z tymi 500 wybranymi komórkami. Proces ten powtórzono, losowo wybierając dwie komórki ze wszystkich komórek, bez zwracania, a następnie losując trzy komórki, itp., aż do osiągnięcia połowy całkowitej wielkości zestawu danych. Wariancja w zestawie danych ustabilizowała się po około 40 komórkach, co sugeruje, że po tym punkcie większość zmienności średniej jest właściwa dla danych, a nie jest artefaktem wynikającym z niedostatecznej liczby próbek (Rysunek 6, wstawka). Efekt ten stał się bardziej oczywisty po przedstawieniu na wykresie wariancji próbki podzielonej przez średnią próbki jako funkcji liczby komórek pobranych w każdym cyklu iteracji (Rysunek 6). Przy przedstawionych danych zmiana wariancji stała się minimalna po około 60 komórkach. Liczba komórek skwantyfikowanych w eksperymencie smFISH powinna przekraczać minimalną liczbę komórek wymaganą do uzyskania stabilnej średniej i plateau wariancji. W naszym przypadku skwantyfikowaliśmy ponad 95 komórek na próbkę, na powtórzenie. Całkowita liczba komórek (> 400 komórek) znacznie przekroczyła minimalną liczbę komórek (~60 komórek) wymaganą do odzwierciedlenia średniej populacyjnej.

Za pomocą specjalnie przygotowanego programu Matlab16 ustalono, że w komórkach wegetatywnych mediana wynosiła 5 transkryptów NDC80ORF na komórkę, natomiast w komórkach w profazie mejozy mediana ta znacząco spadła do 4 transkryptów na komórkę (dwustronny test sum rang Wilcoxona, p = 0,026) (Rycina 7). Mediana liczby transkryptów NDC80luti na komórkę wynosiła 21 transkryptów, a 100% komórek wykazywało ekspresję transkryptów NDC80luti. Przedstawiliśmy frakcję komórek z określoną liczbą transkryptów w formie schodkowego histogramu częstotliwości względnych, ponieważ liczba cząsteczek mRNA jest wartością dyskretną. Najwyższy słupek każdego histogramu został znormalizowany do tej samej wysokości.

Schemat przygotowania komórek drożdży: fiksacja formaldehydem, trawienie zymolazą, proces hybrydyzacji FISH.
Rycina 1: Schemat blokowy protokołu smFISH. Komórki są fiksowane formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 20 min lub w 4 ˚C przez noc, odpowiednio dla próbek w fazie wzrostu wegetatywnego i próbek meiotycznych. Po trzykrotnym przemyciu Buforem B, komórki są trawione zymolazą aż do strawienia ~70% - 90% komórek. Przetrawione próbki są następnie przemywane raz Buforem B w celu usunięcia zymolazy, a następnie permeabilizowane w 70% etanolu (EtOH) przez ~3,5 godziny. W ramach przygotowania do hybrydyzacji, próbki są najpierw inkubowane w 10% buforze do przemywania z formamidem (FWB) przez ~20 min. Następnie próbki są resuspensowane w ~50 µL Roztworu do Hybrydyzacji, zawierającego sondy fluorescencyjne, i inkubowane przez noc w ciemności w 30 ˚C. Po hybrydyzacji próbki są inkubowane w 10% FWB przez 30 min w celu wypłukania nadmiaru sond, a następnie inkubowane w 10% FWB z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w celu barwienia DNA. W przypadku próbki obrazowanej bezpośrednio po inkubacji w FWB/DAPI, jest ona resuspensowana w buforze GLOX uzupełnionym o katalazę, Trolox i oksydazę glukozową (GLOX + enz); natomiast pozostałe próbki są resuspensowane w buforze GLOX bez enzymów i przechowywane w 4 ˚C do ~3 godzin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Hybrydyzacja in situ fluorescencyjna; sondy genu NDC80; schemat, obrazy mikroskopowe, analiza wykresu danych.
Rycina 2: Ocena jakości smFISH z użyciem sond nieparzystych/parzystych. (A) Góra: Schemat zestawów sond nieparzystych/parzystych. Zaprojektowano pięćdziesiąt cztery sondy oligonukleotydowe pokrywające gen NDC80. Sondy o numerach nieparzystych znakowano jednym fluorophorem (CF590, kolor magenta), a sondy o numerach parzystych innym fluorophorem (Q670, kolor zielony). Dół: Reprezentatywne obrazy smFISH komórek w profazie mejozy uzyskane przy użyciu zestawów sond nieparzystych/parzystych. Próbki pobrano 6 h po przeniesieniu komórek (UB8144) do podłoża sporulacyjnego, w czasie, gdy komórki te znajdowały się w stanie zatrzymania w profazie mejozy. DNA barwiono DAPI (kolor niebieski). Obrazy przedstawiono jako projekcje maksymalnej intensywności stosów z (z-stacks). Pasek skali: 5 µm. (B) Procent sparowanych lub niesparowanych plamek smFISH uzyskanych przy użyciu zestawów sond nieparzystych/parzystych. Przeanalizowano łącznie 428 komórek w profazie mejozy, łącząc dane z dwóch niezależnych eksperymentów. Rycina ta została zmodyfikowana z Ryciny 2-suplementu do ryciny 4 pracy Chen et al.16 (C) Funkcja gęstości skumulowanej (CDF) odległości między każdą parą sparowanych plamek oraz odległości między najbliższym sąsiadem niesparowanej plamki. Dla każdej wykrytej plamki w jednym kanale fluorescencyjnym zastosowano algorytm „k najbliższych sąsiadów”, aby zidentyfikować najbliższą wykrytą plamkę — oraz odległość do tej plamki — w kanale komplementarnym. Lokalizacje, które były wzajemnie najbliższymi sąsiadami, uznano za sparowane, a następnie wygenerowano nową listę rejestrującą detekcje sparowane, tylko CF590 oraz tylko Q670. Dla każdej kategorii detekcji w programie Matlab wykreślono histogram CDF odległości, co potwierdziło, że prawidłowo sparowane plamki znajdowały się rzeczywiście znacznie bliżej siebie niż te bez odpowiadającej im plamki w drugim kanale. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji NDC80, wykres danych smFISH, plamki CF590/Q670, stosunki plamek sparowanych/nesparowanych.
Rycina 3: Udziały plamek sparowanych i nesparowanych w funkcji całkowitej liczby cząsteczek RNA na komórkę. Aby sprawdzić, czy detekcja i parowanie sygnałów smFISH były obarczone błędem przy różnych poziomach ekspresji, poszczególne komórki pogrupowano według całkowitej ekspresji RNA. Dla każdej grupy komórek obliczono średnie udziały detekcji sparowanych, wyłącznie CF590 oraz wyłącznie Q670. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki edycji genu NDC80; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy stosunku sygnału do szumu; warunki zoptymalizowane i suboptymalne.
Rycina 4: Ocena jakości danych smFISH uzyskanych przy użyciu sond zaprojektowanych dla mRNA NDC80luti i NDC80ORF. Sondy Q 670 (zaznaczone na zielono) hybrydyzują z regionem wspólnym dla mRNA NDC80luti i NDC80ORF, natomiast sondy CF 590 (zaznaczone na magenta) hybrydyzują z unikalnym regionem 5' NDC80luti. (A) Reprezentatywne obrazy smFISH dla NDC80luti i NDC80ORF w profazie mejozy, pozyskane w warunkach zoptymalizowanych i suboptymalnych. Szczepy UB8144 (warunki zoptymalizowane) i UB1337 (warunki suboptymalne) zostały indukowane do wejścia w mejozę i utrwalone w profazie mejozy. Oba szczepy posiadają różne systemy synchronizacji służące do indukcji mejozy, jednak użycie każdego z nich nie wpływa na jakość smFISH (dane nie pokazano). W warunkach suboptymalnych komórki utrwalano w temperaturze pokojowej przez 20 min (bez utrwalania przez noc), trawiono zymolazą bez dodatku VRC i hybrydyzowano w niższym stężeniu VRC. Obrazy przedstawiono jako projekcje maksymalnej intensywności stosów z (z-stacks). DNA zabarwiono DAPI (zaznaczone na niebiesko). Pasek skali: 5 µm. (B) Wykresy rozrzutu przedstawiające stosunek sygnału do szumu (SNR) oraz sygnał każdej plamki smFISH wykrytej w polu widzenia zaprezentowanym na Rycini 4A, dla każdego kanału fluorescencyjnego, a także dla warunków zoptymalizowanych i suboptymalnych. W warunkach zoptymalizowanych obecne były dwie populacje plamek smFISH. Prawdziwe plamki smFISH znajdowały się wewnątrz szarego obszaru, oddzielone od sygnału tła. W warunkach suboptymalnych pojedyncze cząsteczki mRNA były trudne do rozróżnienia gołym okiem, a separacja między prawdziwymi plamkami a tłem po uruchomieniu oprogramowania do detekcji plamek była mniej wyraźna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ekspresja genu NDC80 podczas mejozy; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej i analizy żelowej białek.
Rycina 5: Ekspresja transkryptów NDC80luti i NDC80ORF jest kontrolowana czasowo. (A) Reprezentatywne obrazy smFISH dla NDC80luti i NDC80ORF podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. Próbki wegetatywne pobrano, gdy komórki (UB8144) rosły wykładniczo w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Próbki z profazy mejozy pobrano 6 godzin po przeniesieniu komórek (UB8144) do pożywki sporulacyjnej, w czasie, gdy komórki te znajdowały się w fazie zatrzymania w profazie mejozy. Sondy Q 670 (kolor zielony) hybrydyzują do wspólnego regionu dzielonego przez mRNA NDC80luti i NDC80ORF, natomiast sondy CF 590 (kolor magenta) hybrydyzują do unikalnego regionu 5' NDC80luti. DNA barwiono DAPI (kolor niebieski). Stadium każdej komórki określono na podstawie sygnału Zip1-GFP, który jest markerem profazy mejozy. Zastosowany protokół smFISH zachowuje silny sygnał GFP bez dodatkowych modyfikacji. Wzrost wegetatywny: brak sygnału Zip1-GFP. Profaza mejozy: obecność sygnału Zip1-GFP. Obrazy przedstawiono jako projekcje maksymalnej intensywności stosów z-stack. Pasek skali: 5 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Ryciny 2C z pracy Chen et al.16. (B) Poziom NDC80ORF, NDC80luti oraz białka Ndc80 (Ndc80p) podczas mejozy (UB4074). Poziomy NDC80luti i NDC80ORF określono za pomocą techniki northern blot, a poziom Ndc80p za pomocą immunoblotingu z przeciwciałem anty-V5 w indicated punktach czasowych. Hxk1p służył jako kontrola załadunku dla immunoblotingu. Podobnie jak szczep UB8144, szczep ten posiada system synchronizacji pGAL-NDT80 GAL4-ER19,20. Komórki przeniesiono do pożywki sporulacyjnej w 0 godzinie i uwolniono z zatrzymania w pachitenie poprzez dodanie β-estradiolu 6 godzin później. Transkrypty NDC80luti były wyraźnie wykrywalne w fazie S/profazie mejozy, podczas gdy transkrypty NDC80ORF występowały głównie przed wejściem w mejozę (0 godzina) oraz podczas podziałów meiotycznych (7-9 godzin). Rycina została zmodyfikowana na podstawie Ryciny 6J z pracy Chen et al.16 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wariancji/średniej analizy smFISH; wyniki dla kolokalizowanych, CF 590 i Q 670; pobieranie próbek komórek.
Rycina 6: Analiza bootstrap przeprowadzona dla próbek profazy mejozy przedstawionych na Rycini 5. Wszystkie ilościowo określone komórki zostały połączone w jedną grupę, a określona liczba (n) komórek była losowo pobierana 500 razy. Obliczono średnią oraz 95% przedział ufności dla frakcji sparowanych i niesparowanych mRNA na komórkę. Dane te przedstawiono dla każdego wybranego n (Wstawka). Plateau wariancji zwizualizowano poprzez wykreślenie wariancji próbki podzielonej przez średnią jako funkcji liczby pobranych komórek (n). Całkowita liczba zmierzonych komórek (437 komórek) znacznie przekroczyła liczbę, przy której błąd osiągnął plateau (~60 komórek), co wskazuje, że dodatkowe dane nie poprawiłyby ufności pomiarów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład transkryptów NDC80; wykres słupkowy; wzrost wegetatywny, profaza mejozy; analiza statystyczna
Rycina 7: Ilościowe zestawienie danych smFISH przedstawionych na Rycynie 5, przedstawione w formie histogramów częstotliwości względnej komórek z określoną liczbą transkryptów NDC80luti i NDC80ORF na komórkę, z wykorzystaniem danych z trzech niezależnych eksperymentów. Linia przerywana oznacza medianę liczby transkryptów NDC80luti i NDC80ORF na komórkę. Każdy histogram został znormalizowany tak, aby maksymalna wysokość słupka była taka sama dla wszystkich histogramów. Łącznie przeanalizowano 637 komórek dla wzrostu wegetatywnego oraz 437 dla profazy mejozy. Przeprowadzono dwustronny test sum rang Wilcoxona odpowiednio dla NDC80luti i NDC80ORF, porównując próbki z fazy wegetatywnej i profazy mejozy. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Ryciny 2D z pracy Chen et al.16 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bufor B (roztwór zapasowy 1 l: 1,2 M sorbitolu; 0,1 M bufor fosforan potasu, pH 7,5)1x
Woda wolna od nukleaz500 mL
Sorbitol218,6 g
KH2PO4 2,18 g
K2HPO (optymalizacja hiperparametrów)414,62 g
Woda wolna od nukleazDopełnić do objętości końcowej 1 L
Przechowywać w temperaturze 4 ˚C w alikwotach po 50 ml po sterylizacji filtracyjnej
Zymolyaza 100T (10 mg/ml)
Przechowywać w temperaturze -20 ˚C w alikwotach
Rozpuścić 10 mg proszku zymolyazy w 1 ml wody MilliQ
E. coli tRNA (10 mg/ml)
Przechowywać w temperaturze -20 ˚C w alikwotach
Rozpuścić 10 mg proszku tRNA w 1 ml wody MilliQ
70% etanol (50 ml)1x (ml)
Czysty etanol35
Woda wolna od nukleaz15
*Przechowywać w temperaturze pokojowej
Bufor do hybrydyzacji (10 ml)1x (ml)
50% siarczan dekstranu2
E. coli tRNA (10 mg/ml)1
200 mM kompleks wanadylu z rybonukleozydem (VRC) 0.1
BSA, 50 mg/mL0.04
20x SSC1
Formamid 1
Woda wolna od nukleaz4.86
Przechowywać w temperaturze -20 ˚C w 250-µL lub 500-µL alikwoty
bufor płuczący z 10% formamidem (10 ml)1x (ml)
Formamid w temperaturze temperatura pokojowa 1
20x SSC1
Woda wolna od nukleaz8
przygotować świeżą porcję, wymieszać za pomocą wibratora w czasie od 20 do 30 s
10% roztwór glukozy
Przechowywać w temperaturze 4 ˚C w alikwotach po sterylizacji filtracyjnej
Rozpuścić 1 g glukozy w 10 ml wody wolnej od nukleaz
Oksydaza glukozowa
Przechowywać w temperaturze -20 ˚C w alikwotach
Rozpuścić 3,7 mg oksydazy glukozowej w 1 ml 50 mM NaOAc, pH 5
Bufor przeciwwyblakaniowy (GLOX), bez enzymów (1 ml)1x (µL)
10% glukozy w wodzie wolnej od nukleaz40
1 M Tris, pH 8,010
20x SSC100
Woda wolna od nukleaz850
przygotować bezpośrednio przed użyciem; dopuszczalne jest również przechowywanie aliquotów w temperaturze 4 ˚C
Bufor przeciwwyblakaniowy (GLOX) z enzymami (50 µL)1x (µL)
Katalaza (mieszać delikatnie w vortexie, łatwo osiada)0.5
Oksydaza glukozowa0.5
100 mM Trolox (rozpuszczony w etanolu)1
bufor GLOX50
*przygotowywać świeżo przed każdym użyciem, przygotowywać w lodzie, można przechowywać w temperaturze 4 ˚C przez 2-3 godziny

Tabela 1. Bufory i pożywki

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół wywodzi się z innych opublikowanych protokołów smFISH 2,3,21,22,23 i jest specjalnie zoptymalizowany dla tła szczepu drożdży SK1. Zoptymalizowane parametry obejmowały liczbę komórek, czas utrwalania, prędkość i czas trwania wirowania, czas trwania trawienia, bufor trawienny, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny. Inne parametry, takie jak temperatura i czas trwania hybrydyzacji, nie zostały zoptymalizowane. W tej sekcji dzielimy się kilkoma uwagami, które pomogłyby dostosować ten protokół do dowolnego tła szczepu drożdży i interesujących warunków wzrostu.

Ściana komórkowa pączkujących drożdży jest jednym z głównych wyzwań związanych z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów smFISH w pączkujących drożdżach, ponieważ ściana komórkowa zapobiega penetracji sondy. Niepełne trawienie ściany komórkowej przez zymoliazę prowadzi do nieefektywnej hybrydyzacji sond i dużej zmienności sygnału między komórkami. Jednak nadmierne trawienie może sprawić, że komórki staną się zbyt kruche, co prowadzi do znacznej utraty komórek podczas etapów płukania i pękania komórek podczas przygotowywania szkiełek do obrazowania. Dlatego optymalizacja czasu trawienia ma kluczowe znaczenie. Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu smFISH poprzez trawienie tej samej próbki przez różny czas. W naszym przypadku uzyskaliśmy najlepsze dane smFISH, jeśli zatrzymaliśmy trawienie, gdy ~80% komórek stało się nierefrakcyjnych. Zazwyczaj, w tych samych warunkach wzrostu, różne zmutowane szczepy genetyczne mogą być trawione w podobnym czasie. Jednak czas trawienia różni się w porównaniu z różnymi warunkami wzrostu i różnymi etapami mejozy u pączkujących drożdży. Po ustaleniu czasu jakość smFISH jest powtarzalna. Należy pamiętać, że w przypadku zmutowanych szczepów z wadliwą syntezą i/lub składem ściany komórkowej trawienie może zakończyć się w czasie krótszym niż 15 minut. Stosowanie różnych partii zymoliazy może również nieznacznie zmienić czas trawienia.

Optymalne stężenie sondy jest potrzebne do osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu. Nasze sondy smFISH zaprojektowaliśmy i zakupiliśmy komercyjnie. Dobre sondy (często 20-merowe) powinny mieć procent GC w zakresie od 35% do 45%, minimalny odstęp 2 par zasad między sondami i niską reaktywność krzyżową. Użyliśmy internetowego projektanta sond od producenta, aby wygenerować listę sond, a jeśli byłoby wystarczająco dużo sond do wyboru, użylibyśmy algorytmu BLAST w bazie danych genomu Saccharomyces, aby wyeliminować sondy z więcej niż 17 parami zasad nakładającymi się na inne regiony genomu. Wybraliśmy bardziej fotostabilny barwnik fluorescencyjny (CAL Fluor 590) do zestawu sond, który wyżarza się do unikalnego obszaru NDC80 luti (CF 590), ponieważ w tym zestawie liczba sond spełniających wszystkie powyższe kryteria (20 sond) była mniejsza niż minimalna liczba zalecana przez producenta (~25 sond). Po rozpuszczeniu roztworu sondy zgodnie z instrukcjami producenta, dokonaliśmy rozcieńczenia roztworu podstawowego w stosunku 1:10 i przechowywaliśmy rozcieńczony roztwór w podwielokrotnościach 5 μl w temperaturze -20 °C. Każda podwielokrotność została użyta tylko jeden raz. W celu optymalizacji należy wykonać seryjne rozcieńczenia z roztworu rozcieńczonego w stosunku 1:10 i sprawdzić, które stężenie daje najlepszy stosunek sygnału do szumu. Zalecamy wykonanie serii rozcieńczeń 1:250, 1:500, 1:1000 i 1:2000 z oryginalnego wywaru. W naszym przypadku współczynnik rozcieńczenia 1:500 dał najlepszy stosunek sygnału do szumu, zarówno dla zestawów sond CF 590, jak i Q 670.

Optymalny czas wiązania ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia smFISH w pączkujących drożdżach. Odkryliśmy, że utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, zamiast utrwalania w temperaturze pokojowej przez 20 minut, znacznie poprawiło spójność i jakość wyników smFISH dla próbek mejotycznych. Chociaż nie testowaliśmy, jak utrwalanie przez noc może wpływać na próbki wegetatywne, fiksacja w temperaturze pokojowej działała dobrze w tych warunkach wzrostu. Dlatego, aby zoptymalizować protokół smFISH dla nowych szczepów lub warunków wzrostu, zalecamy rozpoczęcie od krótkiego czasu utrwalenia w temperaturze pokojowej i wydłużenie czasu utrwalenia w przypadku napotkania dużej zmienności sygnału.

W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami 3,22,23, nasz protokół wykorzystuje inhibitor RNazy VRC podczas trawienia i wyższe stężenie VRC podczas hybrydyzacji. Dodanie VRC w tych dwóch etapach poprawiło spójność wyników smFISH, prawdopodobnie poprzez lepszą ochronę cząsteczek RNA przed aktywnością nukleazy, która może być wprowadzana przez mieszaninę zymoliazy (enzym jest oczyszczany z surowych ekstraktów i może zawierać zanieczyszczenia RNazą). Dlatego zalecamy stosowanie ilości VRC podanej w naszym protokole lub nawet wyższych stężeń VRC w celu optymalizacji.

Znaczna część komórek może zostać utracona podczas etapów płukania zarówno w buforze B, jak i w buforze do przemywania formamidem. Aby zmniejszyć utratę komórek, można zwiększyć prędkość wirowania. W naszym przypadku użycie dużej prędkości (21 000 x g) do granulowania naszych próbek podczas mycia buforem B znacznie zmniejszyło utratę komórek. Jednak po trawieniu zymoliazą komórki stają się bardzo kruche, dlatego zmiana prędkości wirowania nie jest zalecana. Zamiast tego sugerujemy użycie rurek o niskiej przyczepności firmy USA Scientific, które znacznie pomagają w granulowaniu komórek podczas mycia w buforze do płukania formamidu. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół może konsekwentnie generować monowarstwę komórek wystarczająco gęstą, aby zapewnić wydajne obrazowanie. Zazwyczaj 7 pól widzenia powinno dać >130 komórek nadających się do kwantyfikacji.

Na koniec ważne jest, aby określić optymalne parametry i potrzebne wyniki analizy obrazu. Aby wykryć plamy smFISH, opublikowane programy analityczne zwykle filtrują surowe obrazy za pomocą jądra Gaussa w celu usunięcia sygnału tła i proszą użytkowników o określenie stosunku sygnału do szumu, który ma być używany dla każdego zestawu obrazów 2,17. Niestety, obecnie nie ma jednego standardu, według którego określa się odpowiednie parametry, dlatego konieczne jest przeprowadzenie pewnych empirycznych testów tych różnych ustawień. Aby ustawić parametry potrzebne dla każdego z tych kroków, należy iteracyjnie wprowadzać różne zestawy parametrów i sprawdzać, jak dobrze wyniki uzyskane z każdego zestawu pasują do wyników z ręcznego liczenia w kilku reprezentatywnych komórkach. Po znalezieniu jednego zestawu parametrów, można go użyć do większości obrazów uzyskanych pomimo różnych warunków wzrostu i tła genetycznego.

Ponadto można sprawdzić, czy projekcja obrazów smFISH o maksymalnej intensywności może być wykonana przed kwantyfikacją22. Ten krok upraszcza algorytm wykrywania plamek i znacznie skraca czas obrazowania, choć kosztem niektórych potencjalnie użytecznych informacji o poszczególnych miejscach, takich jak ich lokalizacja subkomórkowa. W naszym przypadku liczba cząsteczek mRNA wytwarzanych przez gen NDC80 była na tyle niska, że plamki były dobrze oddzielone po tym przetwarzaniu (co nie jest rzadkością w przypadku transkryptów u pączkujących drożdży 3,7). W przypadkach, gdy analiza kolokalizacji ma kluczowe znaczenie, potok analizy musi określić lokalizację każdego miejsca smFISH w każdym kanale, aby ocenić kolokalizację. W zależności od konkretnych zadawanych pytań, inne informacje, takie jak intensywność każdego miejsca, mogą być również konieczne pobranie z rurociągu w celu dalszej analizy. Optymalizacja kluczowych kroków w protokole i potoku analizy obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych smFISH w celu zbadania interesującego pytania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Anne Dodson i Stephanie Heinrich za porady, jak zoptymalizować protokół smFISH, Xavierowi Darzacqowi za pomoc z platformą analityczną, Haiyanowi Huangowi za sugestie dotyczące analizy statystycznej. Praca ta była wspierana przez fundusze z March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) i Glenn Foundation dla EÜ oraz grantu NSF Graduate Research Fellowship No. DGE-1106400 do JC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSA, bez RNaz (50 mg/ml)AmbionAM2616Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
CatalaseSigmaC3515Sklep pod adresem 4 ° C jak krótkoterminowe. Wirować przed użyciem.
DAPISigmaD9564Sklep pod adresem -20 ° C po rozpuszczeniu w wodzie. Chronić przed światłem.
50% siarczan dekstranuMilli PoreS4030Przechowywać w temperaturze pokojowej. Bardzo lepka ciecz. Obchodź się z cierpliwością.
E. coli tRNASigmaR4251Przechowywać w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.
Etanol (100%, 200 proof)różnełatwopalne.
37% FormaldehydFisherF79-500Przechowywać w temperaturze pokojowej. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie.
FormamidAmbionAM9342Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Otworzyć po osiągnięciu temperatury zbliżonej do temperatury pokojowej, aby zapobiec utlenianiu. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie. 
GlukozaróżnePrzechowywać w 4 & stopni; C po rozpuszczeniu w wodzie wolnej od nukleaz.
Oksydaza glukozowaSigmaG2133Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w 50 mM NaOAc, pH 5.
Woda wolna od nukleazAmbionAM9932Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Fosforan potasu (jednozasadowy i dwuzasadowy)Przechowywaćw temperaturze pokojowej.
Biblioteka sond, rozcieńczona w TE, pH 8,0 Sklep z technologiamina -20 ° C w podwielokrotnościach (5 &mikro; L) po rozpuszczeniu w TE pH 8,0, zgodnie z instrukcją producenta. Chronić przed światłem. 
SorbitolróżnePrzechowywać w temperaturze pokojowej.
20X SSCAmbionAM9763Przechowywać w temperaturze pokojowej.
TE, pH 8,0AmbionAM9849Przechowywać w temperaturze pokojowej.
1 M Tris, pH 8,0AmbionAM9856Przechowywać w temperaturze pokojowej.
TroloxSigma238813Sklep w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach.
200 mM kompleks rybonukleozydów wanadylu (VRC)NEBS1402SPrzechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu, zgodnie z instrukcją producenta.
Zymolyase 100TMP Biomedicals08320932Sklep w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.
Rurki o niskiej przyczepnościUSA Scientific1415-2600Przechowywać w temperaturze pokojowej.
biosearch

Bibliografia

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506(2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417(2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007(2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

FISH pojedynczych cząsteczekhybrydyzacja in situ RNAanaliza mejozykwantyfikacja ekspresji genówdetekcja izoform transkrypcyjnychsubkomórkowa lokalizacja RNAzmienność międzykomórkowabadanie genu NDC80mikroskopia fluorescencyjna
Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.