Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Streszczenie

Podawanie pacjentom enzymatycznych terapii zastępczych (ERT) i innych terapii biologicznych może wywołać przeciwlekową odpowiedź immunologiczną. Charakterystyka tych przeciwciał przeciwlekowych (ADA), zwłaszcza tych, które mogą neutralizować aktywność biologiczną leku, określanych jako przeciwciała neutralizujące (NAbs), ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wpływu tych przeciwciał na profil farmakologiczny leku. Protokół ten opisuje metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach w celu wykrycia czynników, które neutralizują wychwyt komórkowy reprezentatywnego lizosomalnego ERT w ludzkiej matrycy. Protokół składa się z trzech procedur: badania przesiewowego, etapu potwierdzającego i testów miana w celu wykrycia, zidentyfikowania i ustalenia względnego poziomu miana przeciwciał neutralizujących w próbkach badanych.

W tej metodzie, próbki są najpierw mieszane z produktem ERT sprzężonym z fluoroforem, a następnie inkubowane z komórkami [np. ludzkimi limfocytami T (komórki Jurkat)], które wyrażają niezależny od kationów receptor 6-fosforanu mannozy na powierzchni komórki (CI-M6PR), a na końcu analizowane za pomocą cytometru przepływowego. Próbka bez NAbs spowoduje wychwyt sprzężonego z fluoroforem produktu ERT za pośrednictwem CI-M6PR, podczas gdy obecność NAbs zwiąże się z lekiem i zakłóci wiązanie i wychwyt CI-M6PR. Ilość sprzężonego z fluoroforem ERT zinternalizowanego przez komórki Jurkata mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej i ocenia jako procentowe (%) zahamowanie sygnału w porównaniu z odpowiedzią uzyskaną w obecności reprezentatywnej matrycy nieleczonej wcześniej przez lek. Na etapie potwierdzania próbki są wstępnie inkubowane z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z ERT w celu wyczerpania czynników specyficznych dla leku, które wiążą się z lekiem (takich jak NAb) przed inkubacją z komórkami. Próbki, które przeprowadzają badanie przesiewowe i potwierdzają pozytywny wynik testu na obecność specyficznych dla leku NAb, są następnie seryjnie rozcieńczane w celu wytworzenia miana przeciwciał. Półilościowe miana przeciwciał mogą być skorelowane z pomiarami bezpieczeństwa i skuteczności leku.

Wprowadzenie

Ocena immunogenności jest ważną częścią programu monitorowania bezpieczeństwa i skuteczności każdego biologicznego produktu terapeutycznego, w tym ERT. U pacjentów może rozwinąć się odpowiedź immunologiczna, która może bezpośrednio wpływać na bezpieczeństwo leku, skuteczność oraz profile farmakokinetyczny/farmakodynamiczne. Podzbiór tych ADA, zwany NAb, może hamować skuteczność ERT na dwa sposoby: poprzez hamowanie wychwytu ERT do komórki docelowej lub poprzez hamowanie aktywności katalitycznej ERT. Przedstawiona tutaj metoda ma na celu pomiar NAb, które zakłócają wychwyt ERT do komórek. Aby w pełni monitorować bezpieczeństwo i skuteczność terapeutycznego ERT, ciągłe monitorowanie NAb ma kluczowe znaczenie w wyjaśnieniu wszelkich potencjalnych korelacji z wynikami klinicznymi lub efektami farmakodynamicznymi¹.

Platformy do oceny NAb w porównaniu z terapiami białkowymi obejmują testy komórkowe, aktywność enzymatyczną i testy wiązania ligandów¹. Optymalna platforma testowa jest wybierana na podstawie różnych kryteriów: mechanizmu działania produktu terapeutycznego, czułości platformy testowej, selektywności, precyzji i co ważne, jej zdolności do naśladowania hamującego działania NAb in vivo. Testy wiążące ligand mogą być odpowiednie w niektórych przypadkach (np. gdy nie można zidentyfikować odpowiedniej linii komórkowej lub jeśli nie można osiągnąć odpowiedniej czułości w teście komórkowym). Jednak w projekcie wytycznych FDA dla przemysłu z 2016 r. i innych akceptowanych przez branżę białych księgach zaleca się przeprowadzanie testów NAb opartych na komórkach, ponieważ mogą one lepiej odzwierciedlać biologiczny mechanizm działania leku in vivo^1,2,3.

Kluczowe elementy do opracowania testu NAb opartego na cytometrii przepływowej obejmują odpowiednią linię komórkową, która reaguje na stymulację lekową, zastępczą kontrolę pozytywną NAb, która neutralizuje ERT, ERT sprzężoną z fluoroforem oraz matrycę biologiczną badanego gatunku^4,5,6. Wybór linii komórkowej zależy od mechanizmu działania ERT i wiele linii komórkowych powinno być ocenianych podczas opracowywania testu³. W opisanej tutaj metodzie ludzkie limfocyty T Jurkat zostały wybrane ze względu na ich endogenną ekspresję CI-M6PR na powierzchni komórki i brak receptorów fragmentów przeciwciał (FcR), które bezkrytycznie wiążą region Fc większości przeciwciał^7,8. Podczas opracowywania testu ważne jest, aby ustalić kontrolę negatywną dla badań walidacyjnych i badania próbek pobranych od pacjentów, takich jak surowica pobrana od osób, które nie były leczone testem article¹. Linie komórkowe powinny również tolerować odpowiednie matryce różnych gatunków w celu zapewnienia ciągłości na nieklinicznych, klinicznych i pomarketingowych etapach opracowywania leku¹. Kolejnym elementem jest wybór kontroli pozytywnej testu. Kontrola pozytywna do testu wychwytu komórek ERT została wybrana na podstawie jej zdolności do wiązania terapii i neutralizacji wychwytu przez CI-M6PR^9,1. Często trudno jest uzyskać użyteczne lub trwałe ilości neutralizujących surowic odpornościowych od ludzi do wykorzystania jako kontrola testu, szczególnie w populacjach pacjentów z chorobami rzadkimi². Alternatywy obejmują surowice odpornościowe pochodzące od hiperimmunizowanych zwierząt lub oczyszczone z powinowactwa przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne wzbogacone do odpowiedniego testu matrix¹. W przypadku stosowania matrycy specyficznej dla gatunku możliwe jest, że czynniki hamujące inne niż przeciwciała obecne w matrycy mogą hamować wychwyt ERT. Innym krytycznym składnikiem testu jest ERT sprzężony z fluoroforem. Wybór fluoroforu do koniugacji ERT powinien być oceniany dla każdego ERT, w oparciu o zapotrzebowanie testu na jasność, stabilność pH i potencjalne nakładanie się widma na inne kanały cytometru przepływowego.

Test opisany tutaj jest przykładem pomiaru NAb do białka terapeutycznego, takiego jak ERT, które dostaje się do komórki przez CI-M6PR. Kilka ERT, przeznaczonych do leczenia lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych (LSD), wykorzystuje ten szlak do wychwytu komórek i celowania lizosomalnego, w tym elosulfaza alfa w zespole Morquio A, cerliponaza alfa w chorobie Battena CLN2, agalzydaza alfa w chorobie Fabry'ego i alglukozydaza alfa w chorobie Pompego^10,11. Celem tej metody jest pomiar względnych poziomów NAb, które zakłócają wiązanie i internalizację leku poprzez CI-M6PR. Odbywa się to w wielopoziomowych krokach przesiewowych, potwierdzających i mianowych³. Próbki są najpierw badane pod kątem dodatniego wyniku NAb, a następnie potwierdzane dodatnie na etapie potwierdzającym. Na koniec próbki, które przeprowadzają badanie przesiewowe i potwierdzają wynik pozytywny, można seryjnie rozcieńczać w celu wytworzenia miana przeciwciał ¹. Ten test wychwytu leku oparty na cytometrii przepływowej opartej na komórkach zapewnia czułą i mechanistycznie istotną metodę pomiaru NAb specyficznych dla leku, które mogą wpływać na profil farmakologiczny leku. Wcześniej zwalidowaliśmy metodę i przetestowaliśmy próbki kliniczne przy użyciu tej platformy dla leku elosulfaza alfa⁸. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół krok po kroku, który można zastosować do innych białek terapeutycznych lub ERT.

Protokół

Ludzkie matryce zostały zakupione z komercyjnych źródeł za zgodą ich Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB), ale powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Upewnij się, że używane środowisko laboratoryjne utrzymuje kulturę bezpieczeństwa¹².

1. Przed rozpoczęciem testu

1. Przygotuj kulki magnetyczne streptawidyny sprzężone z ERT zgodnie z instrukcjami producenta¹³.
2. Przygotowanie próbek kontroli jakości (QC): zwiększenie przeciwciała kontroli dodatniej (PC) (np. NAb) w matrycy specyficznej dla gatunku (np. zbiorczym płynie mózgowo-rdzeniowym lub surowicy).
   UWAGA: Wytyczne FDA i EMA zalecają przygotowanie wysokiej i niskiej kontroli jakości do walidacji testu i rutynowych testów^1,14.
   1. Na przykład, aby uzyskać kontrolę jakości na poziomie 10 μg/ml, dodać 10 μl podstawowej kontroli dodatniej 1 mg/ml do 990 μl odpowiedniej matrycy (np. CSF) dla całkowitej objętości 1 000 μl.
   2. Podwielokrotnić próbki QC w objętości odpowiedniej do jednorazowego użycia (np. 50 μl) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze od -60 do -80 °C¹.
   3. Podwielokrotność matrycy kontrolnej punktu odcięcia (CC), specyficznej dla gatunku, która nie została poddana działaniu badanego wyrobu (np. płynu mózgowo-rdzeniowego lub surowicy) do jednorazowego użycia (np. 50 μl) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze od -60 do -80 °C¹.
3. Przeprowadź reakcję koniugacji między fluoroforem a ERT za pomocą zestawu do znakowania białek zgodnie z protokołem producenta¹⁵. Podwielokrotność próbki należy podzielić na porcje w objętości nadającej się do jednorazowego użycia (np. 50 μl) i zamrozić podwielokrotności w temperaturze od -60 do -80 °C.

2. Dzień 1: Posiewanie komórek i przygotowanie próbek

1. Przygotowanie płytki komórkowej
   1. Użyj kaptura do hodowli tkankowych i utrzymuj aseptyczne środowisko dla następujących kroków. Spryskaj każdy przedmiot, który zostanie umieszczony w okapie, 70% etanolem i utrzymuj czyste środowisko^16,17,18.
   2. Ogrzej pożywkę do wzrostu komórek (np. RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną) w kąpieli wodnej lub perełkowej w temperaturze 37 °C¹⁹.
   3. Policz ludzkie limfocyty T, komórki Jurkata i płytkę: 100 μl na basenik przy 7,5 x 10⁵ komórek/ml na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek okrągłodennych, odpowiedniej do użycia na cytometrze przepływowym wyposażonym w ładowarkę płytkową.
      1. Na przykład użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki^20,21.
      2. Upewnij się, że komórki mają co najmniej 70% żywotności przed przystąpieniem do eksperymentu (np. oceń żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym)¹⁷.
   4. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wilgotnością 95% przez noc przez 14–20 godzin.
2. Przygotowanie próbek przesiewowych
   1. Rozcieńczyć badanego lub oznaczyć próbki kontrolne za pomocą pożywki bez surowicy (np. RPMI-1640). W przedstawionej tutaj przykładowej metodzie rozcieńczyć próbki w stosunku 1:2,5 w RPMI-1640, dodając 60 μl próbki do 90 μl pożywki bez surowicy. (np. probówki 8-paskowe). Przejść do kroku 3.1 dla procedury oznaczania w celu przygotowania znakowanego fluoroforem ERT.
      Uwaga: Rozcieńczenie 1:2,5 zostało określone doświadczalnie i jest optymalne dla przedstawionej tutaj metody. Optymalne rozcieńczenia próbek powinny być określone dla każdej opracowanej metody.
3. Koralik potwierdzający i przygotowanie próbki
   1. Oblicz liczbę koralików sprzężonych z ERT potrzebnych do próbek potwierdzających.
      1. Na przykład dla 10 próbek należy użyć 10 próbek x 100 μl kulek sprzężonych z ERT na próbkę + 30% więcej, aby skompensować wszelkie straty na etapie mycia = 1 300 μl kulek sprzężonych z ERT.
   2. Dokładnie wymieszaj koraliki. Dodaj obliczoną liczbę koralików do stożkowej probówki o pojemności 15 ml do prania.
   3. Przemyć kulki magnetyczne sprzężone z ERT, dodając 1 300 μl buforu sprzęgającego lub zgodnie z zaleceniami producenta (np. solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,1% polisorbatem 20), postępując zgodnie z poniższymi krokami¹³.
   4. Dokładnie wymieszaj rurkę. Umieść probówkę w magnetycznym stojaku na probówki na 2 minuty. Nie naruszając kulek, ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Roztwór zmieni kolor z ciemnobrązowego na klarowny, gdy koraliki zostaną przyciągnięte do magnesu.
   5. Zawiesić kulki za pomocą 1 300 μl bufora sprzęgającego. Powtórz kroki prania, w sumie cztery prania.
   6. Po ostatnim płukaniu zawiesić kulki w 1 300 μl bufora sprzęgającego (poprzednio obliczonego w kroku 2.3.1.1). Dodać 100 μl na studzienkę do 96-dołkowej, białej, okrągłodennej, niewiążącej płytki polipropylenowej zgodnie z mapą płytki (np. jeden dołek potwierdzający na próbkę lub kontrolę jakości; próbka zostanie podzielona na duplikaty podczas inkubacji z ERT znakowanym fluoroforem).
   7. Umieść płytkę na 96-dołkowym magnesie z bocznymi listwami i pozwól, aby kulki utworzyły granulkę. Ostrożnie odessać klarowny supernatant i wyrzucić go.
      UWAGA: Roztwór zmieni kolor z ciemnobrązowego na klarowny po około 1–2 minutach na magnesie z boczną listwą. Uzyskane koraliki nazywane są koralikami "suchymi".
   8. Jeżeli próbki są dodatnie i są potwierdzane, dodać 100 μl każdej próbki z kulkami sprzężonymi z ERT i bez nich do odpowiedniego/przypisanego dołka. Uszczelnij płytkę folią z tworzywa sztucznego i potrząsaj nią przez co najmniej 60 minut na wytrząsarce obrotowej z prędkością około 800 obr./min w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Na każdej płytce powinny znajdować się wcześniej przygotowane i zamrożone dodatnie i ujemne QC oraz CC.
   9. Po inkubacji umieść płytkę potwierdzającą na 96-dołkowym magnesie z bocznym listwem i pozwól, aby kulki utworzyły osad.
4. Przygotowanie serii rozcieńczeń miana
   1. Aby przygotować serię miana, należy seryjnie rozcieńczyć próbkę w zbiorczej matrycy wystarczającą ilość razy, aby przekroczyć wcześniej określony punkt odcięcia miana¹.
   2. Na przykład zmieszać 30 μl próbki z 60 μl zbiorczej matrycy w serii rozcieńczeń 1:3, co daje łącznie 8 rozcieńczeń (np. probówki z 8 paskami). Przejdź do kroku 3.1 dla procedury testowej w celu przygotowania ERT znakowanego fluoroforem.

3. Dzień 1: Procedura testowa

1. Przygotować znakowany fluoroforem ERT w pożywce bez surowicy (np. 60 μl na dołek lub około 6 ml / płytkę).
   1. Na przykład, aby przygotować 10 ml 1 μg/ml ERT znakowanego fluoroforem, dodaj 10 μl podstawowego 1 mg/ml ERT znakowanego fluoroforem do 9,99 ml pożywki bez surowicy (np. RPMI-1640).
2. Na nowej płytce inkubacyjnej (np. 96-dołkowej, białej, okrągłodennej, niewiążącej płytce polipropylenowej) dodać przygotowane próbki z etapu 2.2, 2.3 lub 2.4 oraz znakowaną fluoroforem ERT do mieszaniny 1:1 w podwójnych studzienkach (np. przenieść 60 μl każdej przygotowanej próbki i dodać 60 μl ERT znakowanej fluoroforem do studzienki).
   UWAGA: Przykładowa mapa płyt doświadczalnych znajduje się na rysunku 1.

Rysunek 1: Przykład układu płytki doświadczalnej. Próbki i znakowany fluoroforem ERT inkubowano przez noc w temperaturze 2–8 °C. Kontrole, takie jak kontrola wysokiej jakości (HQC), kontrola niskiej jakości (LQC) i negatywna kontrola jakości (NQC) były badane przesiewowo i potwierdzane na przeciwległych rogach płytki w celu oceny jednorodności płytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Wymieszać próbki i znakowany fluoroforem ERT, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej. Zawinąć płytki w folię i inkubować je przez noc w temperaturze 2–8 °C przez 14–20 godzin.

4. Dzień 2: Dodawanie przygotowanych próbek do komórek

1. Wyjąć płytkę (płytki) do inkubacji próbki z inkubacji w temperaturze 2–8 °C i ogrzać płytki, umieszczając je w kąpieli perełkowej w temperaturze 37 °C na 10–15 minut.
2. Usunąć komórki z inkubatora CO₂ . Przeprowadź wizualną kontrolę posianych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że komórki wydają się zdrowe i równomiernie rozmieszczone w studzienkach^17,19.
3. Dodać 100 μl wcześniej zmieszanych próbek i znakowanych fluoroforem ERT do płytki komórkowej zgodnie z mapą płytki doświadczalnej.
4. Umieścić płytkę komórkową z dodanymi próbkami z powrotem w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C. Inkubować płytkę przez 3 godziny i ± 15 min.
   UWAGA: Ten czas został ustalony w laboratorium jako optymalny dla odpowiedzi sygnału na szum w teście.
5. Odwirować płytkę komórkową przez 6 minut przy stężeniu 320 x g w wirówce stołowej w temperaturze 14–18 °C. Potwierdzić obecność osadu komórkowego na dnie dołka płytkowego.
6. Trzymaj płytkę pod kątem 30–45°. Ostrożnie usunąć supernatant z każdej studzienki, nie naruszając osadu komórkowego. Dodaj 200 μl 1x DPBS na osad komórkowy w każdym dołku, aby ponownie zawiesić komórki.
7. Powtórz kroki mycia komórek, w sumie 3 prania. Przejdź natychmiast do kroku 5 w celu barwienia żywotności komórek.

5. Dzień 2: Barwienie żywotności komórek

1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl roztworu roboczego 1x żywej/martwej plamy do każdej studzienki, wybranej dla długości fali emisji innej niż długość fali ERT znakowanej fluoroforem i przygotowanej zgodnie z instrukcjami producenta²².
2. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować płytkę przez 6 minut przy 320 x g w wirówce stołowej w temperaturze 14–18 °C.
3. Ostrożnie usunąć supernatant z każdej studzienki, nie naruszając osadu komórkowego. Umyj komórki 1x za pomocą 1x DPBS.

6. Dzień 2: Utrwalanie komórek za pomocą 1% paraformaldehydu

1. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 μl schłodzonego (w temperaturze 2–8 °C) 1% paraformaldehydu (PFA) do każdego dołka.
2. Uszczelnij płytki i delikatnie pulsuj wirem, aby wymieszać. Zawiń płytkę w folię i umieść ją w temperaturze 2–8 °C na co najmniej 10 minut, aby umożliwić utrwalenie.
   UWAGA: Uważaj, aby nie rozprysnąć się na uszczelkę płyty.
3. Dodaj 50 μl 1x DPBS do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety w górę iw dół przed analizą.

7. Cytometria przepływowa

1. Umieść płytki na cytometrze przepływowym za pomocą ładowarki płytek i uruchom je.
2. Pobrać i zapisać zmierzoną medianę intensywności fluorescencji (MFI) za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Patrz rysunek 2 jako example dla ustawień ładowarki. Natężenie przepływu próbki, objętość próbki, objętość mieszania, prędkości mieszania i liczba mieszanek są zoptymalizowane dla tego testu. Kryteria te można dostosować za pomocą przycisków "strzałek w górę" lub "w dół" obok liczb dla każdego kryterium, w zależności od oprogramowania do akwizycji cytometrii przepływowej²³.

Rysunek 2: Przykład ustawień ładowarki cytometru przepływowego. Ustawienia ładowarki powinny być zoptymalizowane dla każdego opracowywanego testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Utwórz analizę cytometryczną/bramki/wykresy, jak pokazano na rysunku 3.
   UWAGA: Tworzenie bramki i aplikacja mogą się różnić w zależności od oprogramowania do cytometrii przepływowej²³.

Rysunek 3: Strategia bramkowania cytometrii przepływowej. Komórki Jurkata oddzielono od wszystkich zdarzeń i zebrano poprzez wykreślenie kanałów rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC) oraz narysowanie bramki wokół populacji docelowej. Pojedyncze komórki oddzielono od dubletów lub większych agregatów komórek za pomocą kanałów obszaru FSC (FSC-A) i wysokości FSC (FSC-H). Żywe komórki wybrano przez bramkowanie na komórkach singletowych ujemnych w celu zabarwienia żywotności. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) została zmierzona w pojedynczych, żywych komórkach Jurkata i jest wykreślona w postaci histogramu. Przedstawiono wartości MFI komórek, w których wychwyt leku jest zablokowany (np. HQC) oraz komórek z kontrolnymi ilościami wychwytu (odpowiednio w kolorze czerwonym i niebieskim). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Wyklucz martwe komórki z analizy i zarejestruj około 10 000 zdarzeń²³.

8. Analiza danych

1. Eksport danych (surowy MIF) do oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: W zależności od potrzebnej analizy, za pomocą oprogramowania analitycznego można przeprowadzić następującą analizę danych.
2. Obliczyć średnią MIF zduplikowanych studzienek (QC i próbek) oraz współczynnik zmienności (%CV) w celu oceny zmienności rozprzestrzeniania się duplikatów na podstawie średniej.
   
   
   
3. W przypadku próbek i kontroli jakości, które zostały poddane badaniom przesiewowym w teście, należy obliczyć procentową inhibicję sygnału (%SI) w stosunku do średniego MFI dla zbiorczej matrycy QC CC.
   
4. W razie potrzeby obliczyć współczynniki odzysku (RR) dla potwierdzonych kontroli jakości i próbek w stosunku do odpowiednich wartości sitowych.
   

Wyniki

Pierwszego dnia metody, zamrożona porcja komórek Jurkat została rozmrożona i pokryta płytką, a próbki testowe zostały przygotowane. Rysunek 1 przedstawia przykładową mapę płyt. Drugiego dnia próbki zmieszano z komórkami Jurkata i inkubowano w temperaturze 37 °C przez około 3 godziny i 15 minut. Komórki zostały następnie umyte, utrwalone za pomocą PFA i przeanalizowane na cytometrze przepływowym. Rysunek 2 pokazuje przykładowe ustawienia cytometru przepływowego.

Strategia bramkowania cytometrii przepływowej została zaprojektowana do pomiaru ilości leku sprzężonego z fluoroforem w żywych, pojedynczych komórkach Jurkata²⁴ (Rysunek 3). Komórki zostały oddzielone od szczątków poprzez narysowanie bramki, która wyklucza szczątki komórkowe [zwykle niskie rozproszenie do przodu (FSC)] i martwe komórki [zwykle wysokie rozproszenie boczne (SSC)], pozostawiając tylko żywe komórki do analizy²⁵. Pojedyncze komórki zostały następnie oddzielone od klastrów komórek poprzez narysowanie bramki, która wyklucza obszar o wysokiej FSC i niską wysokość FSC²⁶. Komórki potraktowano barwnikiem żywotności, który oznaczał wszelkie martwe lub niezdrowe komórki bez nienaruszonej błony, a następnie stworzono dodatkową bramę, aby wykluczyć martwe komórki²². MFI żywych pojedynczych komórek wykorzystano do analizy wychwytu ERT sprzężonego z fluoroforem. Jako przykład potencjalnych wyników testów przesiewowych, matryca wzbogacona dużą ilością zastępczej kontroli pozytywnej przeciwciał przeciwlekowych [np. kontrola wysokiej jakości (HQC)] hamowała wychwyt ERT sprzężonego z fluoroforem, co skutkowało niskim MFI wynoszącym około 300 (Figura 3). W przeciwieństwie do tego, komórki inkubowane z matrycą przy braku przeciwciała kontroli pozytywnej powinny mieć wyższy MFI (MFI = 37 830 w Figura 3), wykazując wychwyt ERT sprzężonego z fluoroforem.

Neutralizujące przeciwciało kontroli dodatniej dla przykładu tutaj zostało wybrane na podstawie mechanizmu działania leku (tj. wychwytu ERT przez CI-M6PR). Panel fluoroforów został również przetestowany i porównany pod kątem optymalnej czułości testu i zakresu dynamiki¹. CypHer 5e został przetestowany ze względu na zwiększoną fluorescencję przy kwaśnym pH, co może być istotne dla niektórych ERT jako dodatkowa miara lizosomalnego celowania leku²⁷. Badano również zielony barwnik fluorescencyjny (np. Alexa Fluor 488) i dalekiej czerwieni barwnik fluorescencyjny (np. Alexa Fluor 647). Przykład tego, jak różne fluorofory mogą działać, jest przedstawiony w Rysunek 4a i 4b. W tym przykładzie Alexa Fluor 647 ERT miała najlepszą wydajność ze względu na doskonałą czułość (np. najwyższy %SI przy najniższym stężeniu komputera) i szeroki zakres dynamiki (~3 rzędy wielkości).

Rysunek 4: Przykładowe wyniki z różnych koniugatów fluorofor-ERT. (A) Podczas opracowywania testu należy ocenić krzywą rozcieńczenia kontroli dodatniej (PC) przy użyciu różnych ERT sprzężonych z fluoroforem. W przedstawionym przykładzie przetestowano dwa ERT sprzężone z fluoroforem (Alexa Fluor 488 i CypHer 5e) przy 6,25 μg/ml oraz jaśniejszy ERT sprzężony z fluoroforem (Alexa Fluor 647) przy 1,56 μg/ml w obecności rosnących stężeń NAb o dodatniej kontroli. (B) Ten panel pokazuje krzywe z panelu A na wykresie, przy użyciu MFI w celu pokazania znacznego wzrostu zakresu dynamicznego przy użyciu ERT sprzężonego z Alexa Fluor 647. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Opisana metoda to wielopoziomowe podejście do wykrywania, potwierdzania i interpolacji quasi-ilościowego poziomu miana NAb³. Aby ustalić, czy test jest gotowy do walidacji, parametry, w tym czułość testu, precyzja, selektywność, swoistość, tolerancja leku, odporność i punkty odcięcia, powinny być oceniane zgodnie z ustalonymi wytycznymi^1,3.

Próbki zostały uznane za potencjalnie pozytywne w tym teście, gdy uzyskano wartości %SI większe niż punkt przecięcia (SCP). SCP został określony statystycznie poprzez przetestowanie próbek niezażywających narkotyków z reprezentatywnej populacji i zmierzenie względnego spadku intensywności sygnału (SI)³. Wytyczne (na przykład FDA) zalecają, aby SCP był ustalany na 95 percentylu zestawu danych o rozkładzie normalnym, a metody obliczania SCP zostały szczegółowo opisane gdzie indziej¹. Każda próbka, która zmniejszyła sygnał testu (mierzony jako wzrost %SI) na poziomie lub powyżej SCP, została uznana za potencjalnie dodatnią, a próbki z wynikami wyższymi niż SCP (bez zmiany lub spadku %SI) są uważane za ujemne.

Próbki, które uzyskały pozytywny wynik (%SI powyżej SCP) zostały przetestowane w teście potwierdzającym w celu określenia specyficzności NAbs dla ERT. Test potwierdzający przeprowadzono poprzez wstępną inkubację próbek z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z ERT w celu usunięcia przeciwciał specyficznych dla leku lub czynników hamujących. Oceniono RR (stosunek potwierdzających MIF do przesiewowych MIF) w celu określenia liczby NAb usuniętych z próby. RR wyższy niż obliczony próg dodatniości [tj. potwierdzający punkt odcięcia (CCP)] wskazywał na obecność antynarkotykowych NAb. Podobnie jak w teście przesiewowym, CCP należy najpierw ustalić, oceniając próbki nieleczone wcześniej z reprezentatywnej populacji w teście potwierdzającym. CCP oparto na statystycznie określonym odsetku wyników fałszywie dodatnich wynoszącym 1% i był to próg oznaczający pozytywnie potwierdzoną próbkę (Rysunek 5)³.

Próbki, które zostały przebadane i potwierdziły wynik pozytywny, były seryjnie rozcieńczane i testowane w teście miana w celu określenia względnego poziomu lub miana NAbs w każdej próbce. Najwyższym rozcieńczeniem, przy którym próbka daje wynik pozytywny, gdy przekroczyła wyznaczony próg [np. punkt odcięcia miana (TCP)], jest miano próbki (Rysunek 5)^1,3.

Rysunek 5: Przykładowe przykładowe wyniki testów. Panele te pokazują przykłady próbek, które dały wynik pozytywny lub negatywny poprzez badanie powyżej lub poniżej SCP wynoszącego 17,51%SI. Próbki dodatnie zostały następnie przetestowane w teście potwierdzającym przy użyciu kulek magnetycznych sprzężonych z lekiem w celu usunięcia przeciwciała specyficznego dla leku z próbek przed badaniem w teście. Próbki, w których współczynnik odzysku (RR) jest większy niż potwierdzający punkt odcięcia (tj. RR = 1,315), uznano za dodatnie. Próbki, które potwierdziły wynik pozytywny, rozcieńczano do momentu, aż sygnał przekroczy punkt odcięcia miana (TCP) w celu ustalenia miana (współczynnika rozcieńczenia), przy którym wynik próbki jest równy punktowi odcięcia miana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Powtarzalność i zmienność testu były testowane przez kilka dni i z więcej niż jednym analitykiem. Kontrolery jakości zostały początkowo przygotowane w jednej partii i podporcjowane do 1x użycia. W ciągu 3 dni dwóch analityków przeprowadziło test z kilkoma zestawami kontroli jakości, aby zademonstrować precyzję testu. W pokazanych przykładowych danych %CV precyzji testu między- i wewnętrznego dla kontroli jakości jest mniejsza niż zalecenie FDA wynoszące %CV < 20% (Rysunek 6)¹.

Rysunek 6: Przykład danych dotyczących precyzji kontroli jakości wygenerowanych w ciągu trzech dni przez dwóch analityków. Dane dotyczące precyzji zostały obliczone na podstawie analizy wariancji (ANOVA) przy użyciu wzoru przedstawionego w DeSilva i wsp.²⁸. Statystyki dotyczące intra-batch (w ramach serii) i międzypartiowych (między serią) są raportowane jako %CV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przeciwciała neutralizujące lub inne czynniki, które uniemożliwiają wychwyt ERT przez CI-M6PR, mogą potencjalnie wpływać na bezpieczeństwo lub skuteczność ERT¹. Dlatego ważne jest, aby ocenić NAb w próbkach badanych przy użyciu solidnego modelu istotnego dla mechanizmu działania leku. My i inni odkryliśmy, że wydajność niektórych formatów testów biologicznych (np. dimeryzacja receptora, ekspresja lucyferazy itp.) nie jest zgodna z zaleceniami władz^{ds. zdrowia} dotyczącymi precyzji, odtwarzalności i czułości testu. W opisanej tutaj metodzie testu biologicznego komórki Jurkat, które wyrażają endogenny CI-M6PR, są wykorzystywane do monitorowania NAb specyficznych dla lizosomalnego wychwytu ERT. W połączeniu z odczytem cytometrii przepływowej, test ten wykorzystuje fizjologiczny model komórki o odpowiedniej precyzji testu, czułości, odtwarzalności i wysokiej przepustowości próbki. Detekcja NAb z odczytem cytometrii przepływowej została zastosowana również w innych wskazaniach. Na przykład opracowano metody wykrywania wcześniej istniejących przeciwciał przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu E i wirusowi związanego z adenowirusem (AAV)^30,31.

Krytyczne kroki w protokole obejmują wybór odpowiedniego fluoroforu, włączenie LQC, który monitoruje czułość testu, zapewnienie wystarczającego poziomu żywotności komórek i utrzymanie ścisłego przestrzegania czasów inkubacji. W przedstawionym przykładzie fluorofory (np. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 i CypHer 5e), sprzężone z lizosomalnym ERT, różniły się znacznie pod względem wydajności. Alexa Fluor 647, który był również najjaśniejszym testowanym fluoroforem³², został wybrany do dalszego rozwoju testu. Zalecamy, aby kilka fluoroforów zostało ocenionych na wczesnym etapie opracowywania testu, aby zapewnić najlepszą czułość i zakres dynamiki. Czułość testu podczas badania próbki powinna być monitorowana poprzez włączenie LQC, która jest na tyle bliska granicy czułości, że zakończy się niepowodzeniem w 1% serii testowych¹. Wraz z HQC, LQC działa również jako system kontroli jakości do monitorowania dryfu testu w czasie³. Optymalna żywotność i wydajność komórek osiąga się poprzez przygotowanie banku komórek jednorazowych podwielokrotności i kwalifikację do nowych banków komórek na podstawie porównywalnych wyników kontroli jakości ^3,18. Czas inkubacji leku sprzężonego z komórkami i fluoroforem ma również kluczowe znaczenie dla spójnej wydajności testu, ponieważ wychwyt leku wzrasta wraz z czasem, w którym lek jest inkubowany z komórkami. Aby zminimalizować codzienną zmienność w przyjmowaniu leku, dane dotyczące próbek można znormalizować do zbiorczych próbek kontrolnych matrycy na każdej płytce (np. próbki kontrolne punktu odcięcia w powyższej metodzie). Innym ważnym czynnikiem w uzyskiwaniu spójnych danych za pomocą tej metody jest monitorowanie jednorodności blachy i minimalizowanie możliwych efektów krawędzi. Początkowy eksperyment może obejmować przeprowadzenie testu przy użyciu pojedynczej kontroli jakości na całej płytce, podczas gdy bardziej szczegółowe eksperymenty można przeprowadzić podczas walidacji testu (np. precyzja i dokładność)¹. Świadczy to o znaczeniu układu mapy tablicowej³³. Jak pokazano na przykładzie mapy płyty, próbki kontroli jakości umieszczone po obu stronach płyty monitorują jednorodność, którą można śledzić w czasie za pomocą wykresów Leveya-Jenningsa³⁴.

Podczas gdy test ten monitoruje NAb i inne czynniki, które mogą hamować wychwyt lizosomalnej ERT, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu potwierdzenia zahamowania wychwytu przez przeciwciała. Jedną z opcji jest traktowanie próbek białkiem A/G/L, które niespecyficznie wiąże immunoglobulinę³⁵. Jeśli próbki nadal dają wynik dodatni po wyczerpaniu białka A/G/L, czynnik hamujący niebędący przeciwciałami może być odpowiedzialny za blokowanie wchłaniania leku. Opisana tutaj metoda została zaprojektowana do pomiaru zahamowania wychwytu za pośrednictwem przeciwciał, a kontrola pozytywna i inne parametry testu powinny być ponownie rozważone, jeśli zostanie znaleziony wysoki odsetek badanych próbek z czynnikami hamującymi niebędącymi przeciwciałami.

Test można również dalej scharakteryzować, aby wykazać transport leków znakowanych fluoroforem do odpowiedniego przedziału komórkowego w oparciu o mechanizm działania leku. W przedstawionym tutaj przykładzie oczekuje się, że ERT zwiąże CI-M6PR na powierzchni komórki i przetransportuje go do lizosomu. Wcześniej informowaliśmy o wynikach kilku eksperymentów wskazujących, że prawie cały sygnał fluorescencyjny obserwowany w metodzie wynika z ERT znakowanego fluoroforem w lizosomie⁸. Odkryliśmy, że znakowany fluoroforem sygnał ERT został wyeliminowany po potraktowaniu komórek cytochalazyną B, która zakłóca internalizację poprzez hamowanie reorganizacji aktyny. Również eksperymenty, w których wygaszano zewnętrzny fluorofor błękitem trypanowym lub spowalniano internalizację poprzez umieszczanie komórek w temperaturze 4 °C, wskazują, że znakowany fluoroforem ERT jest szybko internalizowany i bardzo mała fluorescencja jest spowodowana wiązaniem ERT na powierzchni komórki. Celowanie lizosomalne zostało potwierdzone poprzez wizualizację kolokalizacji barwnika lizotrackera wrażliwego na pH z lekiem sprzężonym z fluoroforem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Swoistość dla wychwytu przez CI-M6PR można również zweryfikować przy użyciu egzogennego M6P, aby konkurować z lekami znakowanymi pod względem wiązania z receptorem. Podobne eksperymenty należy przeprowadzić w celu zweryfikowania kinetyki wychwytu i lokalizacji komórkowej leków sprzężonych z fluoroforem w innych testach.

Ta platforma testowa oparta na komórkach została wykorzystana do badania NAb dla leków terapeutycznych, które wykorzystują endocytozę za pośrednictwem receptora CI-M6PR. Niedawno przedstawiliśmy wyniki przy użyciu tej platformy testowej, które wykazały brak korelacji między rozwojem NAb a skutecznością leku dla elosulfazy alfa^36,37. Aby zwalidować test do badań klinicznych, parametry, w tym czułość testu, precyzja, selektywność, swoistość, tolerancja leku, odporność i punkty odcięcia, należy ocenić zgodnie z ustalonymi wytycznymi ^3,4. Należy również zauważyć, że w przypadku lizosomalnych ERT NAb mogą rozwijać się z potencjałem do zakłócania aktywności leku poprzez wiązanie w pobliżu miejsca katalitycznego enzymu. Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że monitorowanie tego typu NAb ma niższy priorytet, ponieważ ostre kwaśne i proteolityczne środowisko lizosomu nie sprzyja interakcjom przeciwciało-ERT ^2,39,40. Możliwe jest jednak, że istnieją oporne na proteolizy NAb i mogą hamować katalityczną część leku⁴⁰. Test ten monitoruje wychwyt ERT znakowany fluoroforem do lizosomu, a ograniczeniem testu jest niemożność monitorowania opornych na proteolizy NAb. Jeśli podejrzewa się ten typ NAb na podstawie danych dotyczących bezpieczeństwa lub skuteczności, należy opracować test monitorujący aktywność ERT i zastosować go do badania próbek.

Ocena immunogenności jest ważna dla zrozumienia wpływu NAb na bezpieczeństwo i skuteczność leków. Identyfikacja NAb zdolnych do hamowania wychwytu leków in vitro za pomocą CI-M6PR daje możliwość zrozumienia aktywności NAb in vivo. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje ludzką linię komórkową, która wyraża CI-M6PR do pomiaru interferencji lizosomalnego wychwytu komórkowego ERT sprzężonego z fluoroforem. Metoda ta została już wykorzystana do monitorowania NAb dla kilku ERT przeznaczonych do leczenia lizosomalnych chorób spichrzeniowych. Ta platforma testowa może mieć zastosowanie do innych metod badania wpływu NAb na terapie biologiczne, które wymagają internalizacji komórkowej do ich prawidłowego funkcjonowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &mikro; m jednostka filtrująca, 500 ml próżniowe kolby filtracyjne	Corning	CLS430769
Okrągłe dno 96-dołkowe płytki hodowlane	Thermo-Nunclon	163320
Sterylne zbiorniki na odczynniki	VistaLab	3054-1004
96-dołkowa biała płytka do mikropłytek z polistyrenu z okrągłym dnem	Corning	3605
96-dołkowe rurki polipropylenowe, 8-rurkowe paski	Corning	4408
Magnetyczny separator kulek stojak na probówki	V& P Scientific, Inc	VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Magnes	Thermo Fisher Scientific	12321D
DynaMag -96 Magnes z listwą boczną	Thermo Fisher Scientific	12027
BD FACSCanto II Cytometr przepływowy	BD Biosciences
BD Próbnik o wysokiej przepustowości (HTS)	BD Biosciences
Automatyczny licznik komórek BioRad TC20
	VWR	12620-928
Mikrowirówka Galaxy MiniStar	Hodowla tkankowa VWR	C1413
Inkubator CO2	Nuaire	NU-4750
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Labcono	Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line	ATCC	TIB152 i handel;
Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20173
Dynabeads M270 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotyna	Thermo Fisher Scientific	21343
RPMI-1640 1x Technologie średniego	życia	A10491-01-500mL
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ATCC	30-2020
Pen-Strep (100x) płynna	formuła Corning	30-002-CI
1x DPBS bez wapnia i magnezu	Corning	21-031-CV
4% paraformaldehydowa	mikroskopia elektronowa Science	15735-85
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy fioletowych barwników martwych komórek, do wzbudzenia 405 nm	Life Technologies	L34955
Animacja 20	Sigma	P1379-100mL
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	3059
Zbiorcza matryca ludzka (np. ludzka surowica lub płyn mózgowo-rdzeniowy)	Biorekulacja IVT	Poproś o wycenę ze strony internetowej
VWR Poliestrowa folia płytowa	VWR	60941
Uszczelka & Przykładowa folia aluminiowa	Beckman Coulter	538619