Artykuł metodologiczny

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

DOI:

10.3791/57780

⸱

26 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytokiny odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych. W związku z tym pomiar poziomu cytokin był przedmiotem wielu badań mających na celu zrozumienie dokładnych mechanizmów, które prowadzą do załamania samotolerancji i późniejszej autoimmunizacji. Dotychczasowe podejścia opierały się na badaniu jednego konkretnego aspektu układu odpornościowego (pojedynczego lub kilku typów komórek lub cytokin) i nie oferują globalnej oceny złożonej choroby autoimmunologicznej. Chociaż badania oparte na surowicach odpornościowych na pacjentach dostarczyły ważnych informacji na temat autoimmunizacji, nie dostarczają one specyficznego źródła komórkowego wykrytych rozregulowanych cytokin. Opisano tutaj kompleksowe podejście jednokomórkowe do oceny produkcji cytokin w wielu podzbiorach komórek odpornościowych, w kontekście "wewnętrznych" specyficznych dla pacjenta czynników krążących w osoczu. Takie podejście umożliwia monitorowanie specyficznego dla pacjenta fenotypu immunologicznego (markerów powierzchniowych) i funkcji (cytokin), zarówno w jego natywnym "wewnętrznym patogennym" stanie chorobowym, jak i w obecności środków terapeutycznych (in vivo lub ex vivo).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby autoimmunologiczne są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, dotykając 3-8% populacji. W Stanach Zjednoczonych choroby autoimmunologiczne są jedną z głównych przyczyn zgonów wśród kobiet w młodym i średnim wieku (w wieku <65 lat)1,2. Choroby autoimmunologiczne charakteryzują się niejednorodnym obrazem klinicznym i zróżnicowanymi procesami immunologicznymi. Spektrum heterogeniczności jest dobrze reprezentowane w różnych zaburzeniach, takich jak wspólne zajęcie reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) i choroba neurologiczna w stwardnieniu rozsianym (SM). Jednak ten poziom heterogeniczności jest również zilustrowany w pojedynczym zaburzeniu, takim jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE): niektórzy pacjenci mogą wykazywać patologię nerek, podczas gdy inni cierpią na zajęcie hematologiczne lub stawowe3.

Immunopatogeneza leżąca u podstaw zaburzeń autoimmunologicznych odzwierciedla kliniczną heterogeniczność, obejmującą auto- i hiperaktywację wielu wrodzonych i adaptacyjnych podzbiorów komórek odpornościowych oraz jednoczesną rozregulowaną produkcję cytokin. Chociaż cytokiny odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych, zrozumienie ich specyficznej roli w mechanizmie choroby okazało się wyzwaniem. Cytokiny charakteryzują się plejotropią (jedna cytokina może mieć wiele skutków dla różnych typów komórek), redundancją (wiele cytokin może mieć ten sam efekt), dualnością (jedna cytokina może mieć działanie pro- lub przeciwzapalne w różnych warunkach) i plastycznością (cytokiny mogą być formowane w inną rolę niż jej "pierwotna" rola, w zależności od środowiska)4, 5,6. W związku z tym metody na poziomie populacji nie są w stanie rozróżnić heterogenicznych odpowiedzi komórkowych na to samo "środowisko cytokinowe". Podobnie, projekty badań, które koncentrują się na jednym konkretnym aspekcie układu odpornościowego (pojedynczy typ komórek lub cytokina), nie oferują globalnej oceny wszystkich elementów zaangażowanych w złożoną chorobę autoimmunologiczną. Chociaż badania oparte na surowicach odpornościowych na pacjentach dostarczyły ważnych informacji na temat autoimmunizacji, nie dostarczają one specyficznego źródła komórkowego wykrytych rozregulowanych cytokin.

Ostatnio opracowaliśmy proteomiczne podejście do pojedynczej komórki, aby jednocześnie oceniać wiele typów komórek odpornościowych i wykrywać ich różne zaburzenia cytokin w środowisku specyficznych dla pacjenta "patogennych" czynników krążących w osoczu krwi obwodowej. Opisany tutaj przepływ pracy charakteryzuje się wykorzystaniem nienaruszonych obwodowych próbek krwi pełnej, w przeciwieństwie do izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Pełna krew obwodowa stanowi najbardziej fizjologicznie istotny nośnik do badania ogólnoustrojowej choroby o podłożu immunologicznym, w tym 1) niejednojądrzastych komórek krwi często zaangażowanych w chorobę autoimmunologiczną (tj. neutrofile, płytki krwi) oraz 2) czynników krążących w osoczu, takich jak kwasy nukleinowe, kompleksy immunologiczne i cytokiny, które pełnią role aktywujące układ odpornościowy. W celu wychwycenia "wewnętrznie patogennej" rozregulowanej produkcji cytokin, próbki krwi obwodowej są przetwarzane natychmiast po pobraniu krwi (T0, czas zero) i po 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C (fizjologiczna temperatura ciała) z inhibitorem transportu białek przy braku jakiegokolwiek egzogennego stanu stymulującego (T6, czas 6 h), w celu wykrycia produkcji cytokin (akumulacja, T6-T0), który odzwierciedlałby "wewnętrzny" stan choroby (Rysunek 1). W celu zbadania rozregulowanych procesów, które odzwierciedlają nadmierną lub niedostateczną aktywację szlaków sygnałowych zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne istotne dla choroby, próbki krwi obwodowej są traktowane (6 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C z inhibitorem transportu białka) egzogennym stanem stymulującym, który odzwierciedla patogenezę choroby, takim jak agoniści receptora Toll-Like (TLR) w przypadku TRU (T6 + R848, Czas 6 godzin z 1 μg/ml R848), w celu wykrycia produkcji cytokin, która odzwierciedlałaby odpowiedź na kwasy nukleinowe (porównując T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Rysunek 1). W celu zbadania immunomodulacyjnego działania dostępnych środków terapeutycznych ex vivo, ponieważ odnoszą się one do precyzyjnych procesów rozregulowania układu odpornościowego u określonych pacjentów, próbki krwi obwodowej poddaje się działaniu inhibitora JAK o odpowiednim stężeniu terapeutycznym (tutaj, 5 μM ruksolitynibu; T6 + 5R, czas 6 godzin z ruksolitynibem 5 μM), w celu wykrycia zmian w "wewnętrznym" stanie choroby w odpowiedzi na lek (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Ryc. 1). Do tego badania wybrano inhibitor JAK, ponieważ wykazano, że inhibitory JAK są skuteczne w leczeniu zaburzeń autoimmunologicznych, takich jak RZS.

Aby jednocześnie ocenić opisane powyżej procesy rozregulowania w wielu podzbiorach komórek odpornościowych, próbki krwi obwodowej od pacjentów z TRU i zdrowych osób z grupy kontrolnej zostały przetworzone zgodnie z powyższym opisem i przeanalizowane za pomocą cytometrii masowej. Cytometria masowa, znana również jako cytometria-czas przelotu, oferuje analizę pojedynczych komórek ponad 40 parametrów bez problemów z nakładaniem się widm7,8,9. Technika ta wykorzystuje izotopy metali ziem rzadkich w postaci rozpuszczalnych jonów metali jako znaczniki związane z przeciwciałami, zamiast fluoroforów10. Dodatkowe szczegóły dotyczące platformy technologicznej cytometrii masowej (tj. strojenie i kalibracja, pobieranie próbek) można znaleźć w Leipold i wsp. oraz McCarthy i wsp.11,12 Wysokowymiarowość cytometrii masowej umożliwia jednoczesny pomiar wielu cytokin w podzbiorach wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych o ziarnistości pojedynczej komórki (Tabela materiałów).

Obecne konwencjonalne parametry kliniczne i laboratoryjne często nie są wystarczająco czułe lub specyficzne do wykrywania trwającej aktywności choroby lub odpowiedzi na specyficzne immunomodulatory13, odzwierciedlając potrzebę lepszego nakreślenia podstawowych zmian immunologicznych, które powodują zaostrzenia. Biorąc pod uwagę wszechobecność rozregulowania cytokin w chorobach autoimmunologicznych, ostatnio pojawiło się mnóstwo podejść do leczenia, które wykorzystują przeciwciała lub małocząsteczkowe inhibitory ukierunkowane na cytokiny lub białka sygnałowe zaangażowane w regulację produkcji cytokin. W swojej podstawowej formie, opisane tutaj podejście analityczne krwi obwodowej stanowi platformę do identyfikacji specyficznych dla pacjenta rozregulowanych podzbiorów komórek i ich nieprawidłowej produkcji cytokin w chorobie autoimmunologicznej z objawami ogólnoustrojowymi. Metodologia ta pozwala na personalizację wyborów terapeutycznych, ponieważ można zidentyfikować określone rozregulowane cytokiny, a określone opcje leczenia mogą być testowane ex vivo w celu oceny ich zdolności do immunomodulacji specyficznego dla pacjenta procesu chorobowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB) Uniwersytetu Kolorado. Wszystkie opisane poniżej procedury powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, chyba że zaznaczono inaczej, z przefiltrowanymi końcówkami pipet i przefiltrowanymi wszystkimi odczynnikami.

1. Przygotowanie odczynników do obwodowego przetwarzania krwi pełnej

  1. Przygotować podstawowe porcje ruksolitynibu (10–15 μl/fiolkę do jednorazowego użytku) w temperaturze 10 mM, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta (przechowywać w temperaturze -80 °C). Utrzymuj stężenia DMSO we wszystkich testach, w tym w niestymulowanych kontrolach, poniżej 0,2% (vol/vol).
  2. Przygotować podstawowe porcje R848 (resikwimod) (10–15 μl/fiolkę do jednorazowego użytku) w stężeniu 1 μg/μl, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w sterylnej wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Przygotować podstawowe porcje lipopolisacharydów (LPS) (5 μl na fiolkę tylko do jednorazowego użytku) w stężeniu 1 μg/μl, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w sterylnej wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Przygotuj pożywkę do barwienia komórek (CSM) przy użyciu PBS, 0,5% BSA i 0,02% NaN3.
  5. Zaopatrz się w koktajl inhibitorów transportu białek (PTI) i przygotuj go (tabela materiałów).
  6. Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową ruksolitynibu (10 mM) w stosunku 1:10 w sterylnym PBS (1 mM). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.
  7. Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową R848 (1 μg/μL) w stosunku 1:10 w sterylnym PBS (0,1 μg/μL). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.
  8. Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową LPS (1 μg/μl) w stosunku 1:100 w sterylnym PBS (0,01 μg/μl). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.
  9. Wstępnie podgrzej sterylny RPMI (bez L-glutaminy) w standardowej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (przez co najmniej 10 minut).
  10. Rozcieńczyć bufor lizy/utrwalający w stosunku 1:5 w przefiltrowanym ddH2O (stężenie robocze) na stole (nie musi być sterylny).
    Uwaga: 1 ml krwi pełnej wymaga 20 ml stężenia roboczego buforu lizy/fix.
    1. Przygotuj bufor lizujący/utrwalający dla 5 warunków po 1 ml krwi pełnej każdy (co najmniej 100 ml). Porcję 20 ml stężenia roboczego buforu liza/fix rozmieścić w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml na mililitr krwi pełnej (roztwór lizy/utrwalania przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny). Oznaczyć warunki na stożkowych probówkach zawierających bufor lizy/utrwalający w następujący sposób: T0 (czas zerowy), T6 + 5R (czas 6 h z 5 μM ruksolitynibem), T6 + R848 (czas 6 godzin z 1 μg/ml R848), T6 + LPS (czas 6 godzin z 0,1 μg/ml LPS), T6 (czas 6 godzin).
  11. Sterylne probówki polistyrenowe z okrągłym dnem z nakrętkami i probówki do mikrowirówek o pojemności 1 ml należy oznaczyć tą samą nomenklaturą, co w kroku 1.10.

2. Stymulacja i przetwarzanie pełnej krwi obwodowej (Rysunek 1)

  1. Umieść oznaczone okrągłe rurki styropianowe z kroku 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) na stojaku.
    Uwaga: Wszystkie poniższe czynności są wykonywane w tym typie rury, chyba że określono inaczej. Zakryj probówki podczas przenoszenia między kapturem do hodowli tkanek a inkubatorem, aby zachować sterylność.
  2. Dodaj 1 ml 37 °C RPMI (bez L-glutaminy) do każdej z probówek (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Kilkakrotnie odwróć probówkę do pobierania krwi, dodaj 1 ml krwi pełnej do każdej probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać z RPMI (rozcieńczenie RPMI zapobiega zbrylaniu się krwi podczas 6-godzinnego okresu inkubacji).
  3. Dodać 10 μl ruksolitynibu w proporcji 1:10 do T6 + 5R. Dokładnie wymieszać pipetą P1000. Umieścić stojak z probówkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i rozpocząć odmierzanie czasu inkubacji (T = 0).
  4. Przetwarzaj próbkę T0 w następujący sposób.
    1. Odpipetować całą zawartość probówki T0 do oznakowanej stożkowej probówki zawierającej 20 ml buforu do lizy/utrwalenia o stężeniu roboczym 37 °C. Aby zoptymalizować regenerację komórek, przepłucz probówkę buforem lizy/fix o stężeniu roboczym. Wymieszaj, odwracając stożkową rurkę.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić lizę i utrwalenie. Po utrwaleniu wykonaj wszystkie kolejne kroki na blacie. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zdekantować supernatant. Ponownie zawieś komórki w 1 ml lodowatego PBS, aby rozbić osad, a następnie wypełnij stożek do objętości 15 ml PBS.
    4. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant. Powtórzyć pranie PBS (kroki 2.4.3–2.4.4), jeśli granulki są czerwone. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml CSM, aby rozbić osad, a następnie przenieść do znakowanej probówki mikrowirówkowej (krok 1.11) w celu barwienia przeciwciał. Pobrać próbkę o objętości 10 μl, aby zliczyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
      Uwaga: Ponieważ wszystkie komórki są utrwalone w tym momencie, nie jest konieczne dołączanie plamy żywotności.
    5. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, pozostawiając osad w ~60 μl resztkowej objętości. Przechowywać te granulki na lodzie do czasu zakończenia przetwarzania próbek z innych warunków.
  5. W T = 30 min przesunąć stojak na probówki (krok 2.3) do kaptura do hodowli tkankowych i wykonać następujące czynności.
    1. Dodać 10 μl 0,1 μg/μl R848 do T6 + R848. Dokładnie wymieszać pipetą P1000.
    2. Dodaj 10 μl 0,01 μg/μL LPS do T6 + LPS. Dokładnie wymieszać pipetą P1000.
    3. Dodać 4 μl inhibitora transportu białek (zapas przy 500X) do T6, T6 + 5R i T6 + LPS (ale NIE do T6 + R848) i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze do T = 6 h. Dokładnie mieszać pipetą P1000 co 2 h.
      Uwaga: R848 jest endoplazmatycznym agonistą TLR i dlatego wymaga czasowego opóźnienia w dodawaniu inhibitora transportu białka, aby umożliwić dostęp do docelowego receptora.
  6. Przy T = 2 h dodać 4 μl koktajlu inhibitora transportu białek (zapas o wartości 500X) do probówki T6 + R848. Wymieszać wszystkie próbki za pomocą pipety P1000 i umieścić stojak z powrotem w inkubatorze do T = 6 godzin.
  7. Wymieszać próbki z P1000 jeszcze raz w temperaturze T = 4 h.
  8. W T = 6 h przetworzyć probówki z próbkami krwi T6, T6 + LPS, T6 + R848 i T6 + 5R zgodnie z opisem w kroku 2.4 dla próbki T0.
  9. Przechowywać granulki komórek w resztkowej objętości CSM w temperaturze -80 °C do przetworzenia w przyszłości. Alternatywnie przejdź do kodowania kreskowego i barwienia przeciwciał bez przechowywania.

3. Kod kreskowy zlizowanych/utrwalonych komórek krwi

  1. Próbki komórek zlizowanych/utrwalonych z magazynu w temperaturze -80 °C należy powoli rozmrażać na lodzie; maksymalnie 20 próbek można oznaczyć unikalnymi kodami kreskowymi i połączyć za pomocą tego systemu. Rozcieńczyć 10-krotny bufor trwałej ondulacji kodów kreskowych w stosunku 1:10 za pomocą PBS; zrobić wystarczającą ilość buforu dla ~ 3 ml na próbkę.
  2. Napełnij jedno niesterylne koryto CSM, a drugie buforem perm 1X do kodów kreskowych. Dodać 1 ml lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszać pipetą i przenieść do odpowiednich wstępnie znakowanych probówek klastrowych z polipropylenu.
  3. Pobrać próbkę o objętości 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Normalizuj liczbę komórek do 1,5–2 x 106 komórek na próbkę w każdej probówce zbiorczej: usuń i wyrzuć objętość nadmiaru komórek powyżej 2 x 106 komórek.
  4. Odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
  5. Ułóż probówki zbiorcze na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodać 800 μl 1X bufor do trwałej ondulacji z kodowaniem kreskowym za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych bez dotykania osadu komórkowego końcówkami pipet (bez mieszania), aby zmniejszyć utratę komórek. Odłóż na bok stojak z rurkami klastrowymi.
  6. Usuń paski probówek 20-plex Pd Barcoding Kit z -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 μl bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 μl zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych.
  7. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodem kreskowym. Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki.
  8. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml CSM.
  9. Odwirować i ponownie zawiesić w CSM, jak w kroku 3.8.
    Uwaga: Każda próbka jest teraz oznaczona unikalnym kodem kreskowym, a próbki są gotowe do puli.
  10. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek w ~70–80 μl resztkowej objętości do jednej rurki polistyrenowej. NIE wysuwaj końcówki pipety; Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką.
  11. Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj ~100 μl CSM do każdej oryginalnej probówki aparatu udojowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek. Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w ~100 μl pozostałej objętości do tej samej probówki z polistyrenu.
  12. Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę z polistyrenu (~ 3 ml). Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Przystąp do barwienia próbek oznaczonych kodami kreskowymi tego samego dnia.
    Uwaga: Normalne jest oczekiwanie ~20–30% utraty komórek w procesie kodowania kreskowego.

4. Barwienie zlosowanych/utrwalonych komórek krwi z kodami kreskowymi i przygotowanie do analizy na przyrządzie do cytometrii masowej

Uwaga: Każdy 1X miano przeciwciała barwiącego (1 μL przeciwciała na 100 μL reakcji barwienia), może zwykle zabarwić 3-4 x 106 komórek. Dlatego, gdy wszystkie próbki z kodami kreskowymi zostaną zebrane w jednej probówce, ilość przeciwciał musi zostać zwiększona w górę. Jeśli 20 próbek z kodem kreskowym wynosi 30 x 106 komórek, a każde miano 1X może zabarwić 3-4 x 106 komórek, próbka oznaczona kodem kreskowym wymaga tylko 10-krotnego miana, w przeciwieństwie do barwienia każdej próbki indywidualnie, co wymagałoby 20-krotnej ilości przeciwciała (1X na pojedynczą probówkę). Stężenie przeciwciała do liczby komórek powinno być starannie miareczkowane dla każdego pojedynczego koktajlu przeciwciał (nie omówione tutaj).

  1. Wybarwić komórki za pomocą przeciwciał (tabela materiałów) do barwienia powierzchni i indukcji cytokin.
    1. Przygotuj koktajl barwienia powierzchniowego, obliczając ilość do dodania i uwzględniając błąd pipetowania (tj. w przypadku barwienia 20 próbek z kodami kreskowymi po 2 x 106 komórek w każdej próbce, wymagane jest 10-krotne barwienie mianem; w przypadku ostatecznych obliczeń objętości należy skompensować błąd pipetowania, sporządzając 10,5-krotny końcowy roztwór barwiący).
    2. Dodaj 10-krotnie większą objętość barwienia powierzchni do osadu komórek z kodem kreskowym. Aby zmniejszyć utratę komórek, za pomocą tej samej końcówki wymieszaj i zmierz objętość barwników powierzchniowych i osadów komórkowych.
    3. W oparciu o objętość komórek i koktajl barwiący dodać CSM do końcowej objętości barwienia wynoszącej 50 μl na liczbę próbek komórek (tj. w przypadku zestawu 20 próbek 50 μl X 20 = 1 ml). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.
    4. Podczas inkubacji barwienia powierzchniowego przygotować bufor do trwałej ondulacji/płukania (tabela materiałów), rozcieńczając w stosunku 1:10 przefiltrowanym ddH2O. Przygotować objętości 2 ml do przepuszczania i 5 ml do przemywania . Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    5. Uzupełnić probówkę do barwienia powierzchni CSM i odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić próbkę oznaczoną kodem kreskowym w 2 ml buforu Perm/Wash o temperaturze 4 °C i rozcieńczeniu 1:10. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20–30 minut, aby w pełni przepuszczalność komórek.
    6. Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.
    7. W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego postępuj zgodnie z podobnymi etapami barwienia (jak w przypadku barwienia powierzchni). Należy jednak użyć buforu do trwałej ondulacji/płukania w rozcieńczeniu 4 °C, 1:10 zamiast CSM, aby uzyskać całkowitą objętość barwienia, tak aby komórki pozostały w środowisku przepuszczalnym przez cały czas barwienia wewnątrzkomórkowego.
    8. Dodać wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał do barwionego powierzchniowo i przepuszczalnego osadu komórkowego (kroki 4.1.2–4.1.17). Doprowadzić całkowitą objętość barwienia do 50 μl na liczbę próbek komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.
    9. Podczas barwienia wewnątrzkomórkowego należy przygotować roztwór interkalatora: 900 μL przefiltrowanego PBS + 100 μL przefiltrowanego 16% PFA (końcowe stężenie 1,6% PFA) + 0,2 μL 500 uM barwnika interkalatorowego (Tabela materiałów).
    10. Uzupełnij granulat komórkowy + wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał zimnym buforem 1:10 Perm/Wash.
    11. Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Uzupełnij rurkę do barwienia CSM. Policz i zapisz numer komórki. Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml roztworu interkalatora z kroku 4.9. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej w celu pełnej interkalacji lub przez noc w temperaturze 4 °C (próbki w roztworze interkalatora mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed badaniem ich na przyrządzie do cytometrii masowej).
  2. Przygotuj komórki do przyrządu do cytometrii masowej.
    1. Uzupełnić probówkę 3 ml przefiltrowanego ddH2O i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml przefiltrowanego ddH2O. Przepuścić tę zawiesinę przez filtr 100 μm w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń lub zagięć, które mogłyby potencjalnie zatkać przyrząd do cytometrii masowej.
    2. Policz i zapisz liczbę komórek po filtracji. Wirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C
  3. Przygotować roztwór kulki kalibracyjnej (tabela materiałów), rozcieńczając go w stosunku 1:10 w przefiltrowanym ddH2O.
  4. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w wymaganej objętości rozcieńczonego roztworu kulek kalibracyjnych w stosunku 1:10, aby uzyskać stężenie komórek ~1 x 106 komórek/ml.
    Uwaga: Dla CyTOF1 przy 45 μl/min zalecane optimum to 5 x 105 komórek/ml; dla Heliosa w dawce 30 μl/min, 7,5 x 105 komórek/ml.
  5. Kontynuuj badanie próbki na przyrządzie do cytometrii masowej9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje przebieg procesu stymulacji i przetwarzania próbek krwi obwodowej, w tym przydział podwielokrotności próbek krwi, czas dodawania środków stymulujących, koktajl inhibitorów transportu białek oraz czas inkubacji do lizy i utrwalenia czerwonych krwinek (RBC). Wybór środków stymulujących będzie zależał od szlaków sygnalizacyjnych i cytokinowych, które są celem oceny. Na przykład w opisanym tutaj protokole agoniści TLR są wykorzystywani do oceny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy nowatorskie, jednokomórkowe, proteomiczne podejście do jednoczesnej oceny wielu typów komórek odpornościowych i wykrywania ich różnych zaburzeń cytokin w środowisku specyficznych dla pacjenta "patogennych" czynników krążących w osoczu krwi obwodowej. Metoda ta wykorzystuje obwodową krew pełną jako nośnik analityczny oraz cytometrię masową jako narzędzie do oceny nieprawidłowości fenotypowych i funkcjonalnych komórek odpornościowych. Metoda ta jest łatwo stosowana w badaniach na ludziach i myszach<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Aimee Pugh-Bernard za jej intelektualny wkład i pomocne komentarze. Praca ta była wspierana przez Fundację Boettchera Webb-Waring Biomedical Research Award i nagrodę o numerze K23-1K23AR070897 od NIH dla Eleny W.Y. Hsieh. Otrzymała również nagrodę numer K12-HD000850 przyznaną przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver oraz Fundację Lucile Packard na rzecz Zdrowia Dziecka, Stanford CTSA UL1 TR001085 oraz Instytut Badań nad Zdrowiem Dziecka Uniwersytetu Stanforda.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RuxolitinibSanta CruzSC-364729AStężenie magazynowe: 10 mM; Końcowa konc: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5Stężenie magazynowe: 1 i mu; g/μ L; Końcowa konc.: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsStężenie magazynowe: 1 μ g/μ L; Stężenie końcowe: 0,1 μ g/ml
Sterylny PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049Stężenie magazynowe: 5X; Stężenie końcowe: 1X (rozcieńczony w ddH2O)
BD Bufor do trwałej trwałej eksploatacji/płukania BDBiosciences557885Stężenie magazynowe: 10X; Stężenie końcowe: 1:10 (rozcieńczyć w ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Azydek sodu (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Stężenie zapasowe: >99,9%; Stężenie końcowe: 0,0002
Inhibitor transportu białek (PTI)eBiosciences00-4980-93Stężenie magazynowe: 500X; Końcowe stężenie: 1X
Interkalator DNAFluidigm201192BStężenie magazynowe: 500 μ M; Stężenie końcowe: 0,1 μ M
Cell Staining Media (CSM)PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Płyn buforowy 201057zapasów: 10X; Końcowa konc: 1X
20-plex Pd Zestaw kodów kreskowychFluidigmS0014Stan magazynowy: nie dotyczy; Końcowe stężenie: nie dotyczy
korektora TM Czteroelementowe koraliki kalibracyjnePłyn201078Zapas Stężenie: 10X; Stężenie końcowe: 1X
16% roztwór formaldehydu bez MeOHThermo28908Stężenie zapasowe: 16% (w/v); Stężenie końcowe: 1,6% (w/v)
Sterylne rurki z polistyrenu okrągłodennegoVWR60818-496Stężenie magazynowe: nie dotyczy; Końcowe stężenie: nie dotyczy
Rurki klastrowe z polipropylenuLight LabsA-9001Zapas Stężenie: nie dotyczy; Końcowe stwierdzenie: nie dotyczy
przyrządu Helios CyTOFFluidigmHeliosWszystkie roztwory, które mają być użyte w analizie CyTOF, muszą być wolne od zanieczyszczeń metalami. ddH2O jest używany do przygotowania wszelkich roztworów powinien mieć rezystywność co najmniej 18,0 MΩ. ddH2O i wszelkie samodzielnie przygotowane roztwory należy przechowywać w nowych plastikowych lub szklanych butelkach, które nigdy nie były sterylizowane w autoklawie.
NazwaFirmaNumer katalogowy>Uwagi
Przeciwciała stosowane w cytometrii masowej
Markery powierzchniowe
CD1cBiolegendL161Waga: 161
CD3BDUCHT1Masa: 144
CD4BiolegendSK3Masa: 174
CD7BDM-T701Masa: 149
CD8BiolegendSK1Masa: 142
CD11bFluidigmICRF44Masa: 209
CD11cBDB-LY6Masa: 152
CD15BDHI98Masa: 115
CD14BiolegendM5E2Masa: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Masa: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Masa: 163
CD21BiolegendBu32Masa: 141
CD27BDL128Masa: 155
CD38FluidigmHIT2Masa: 172
CD45 całkowitabiomasaHI30Masa: 89
CD45RABiolegendHI100Masa: 153
CD56MiltenyiREA196Masa: 168
CD66BDB1.1/CD66Masa: 113
CD86FluidigmIT2.2Masa: 150
CD123Fluidigm6H6Masa: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AMasa: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Masa: 162
IgDBiolegendIA6-2Masa: 146
IgMBiolegendMHM-88Masa: 151
CXCR5BDRF8B2Masa: 173
HLADRBiolegendL243Masa: 167
cytokiny
IL-1&alfa;Biolegend364-3B3-14Masa: 147
IL-1βLegenda biologiczna H1b-98Masa: 169
IL-1RASanta Cruz AS17Masa: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Masa: 164
IL-8BDE8N1Masa: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Masa: 171
IL-17ABiolegend BL168Waga: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpMasa: 176
MIP1βBDD21-1351Masa: 158
MCP1BD5D3-F7Masa: 170
IFN&alfa;Miltenyi LT27:295Masa: 175
IFNγBiolegend4S. B3Masa: 165
PTENBDA2B1Masa: 159
TNFαBiolegendMab11Masa: 166
Uwaga: Jeśli producent jest podany jako Fluidigm, to przeciwciało zostało zakupione od Fluidigm z metalem wstępnie sprzężonym. Jeśli producent jest określony jako inny niż Fluidigm, przeciwciało to zostało samosprzężone przy użyciu znakowania MaxPar Multi-Metal Labeling  Zestaw (Fluidigm Cat: 201300) zgodnie z protokołem producenta. 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

Powiązane artykuły