Method Article

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

DOI:

10.3791/57784

⸱

August 25th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne ludzkie keratynocyty izolowane ze świeżych tkanek skóry i ich ekspansja in vitro były szeroko stosowane do badań laboratoryjnych i zastosowań klinicznych. Konwencjonalna metoda izolacji ludzkich keratynocytów obejmuje dwuetapową sekwencyjną procedurę trawienia enzymatycznego, która, jak udowodniono, jest nieefektywna w generowaniu komórek pierwotnych z dorosłych tkanek ze względu na niski wskaźnik odzysku komórek i zmniejszoną żywotność komórek. Niedawno informowaliśmy o zaawansowanej metodzie izolowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych naskórka z tkanek skóry, która wykorzystuje inhibitor kinazy Rho Y-27632 w pożywce. W porównaniu z tradycyjnym protokołem, ta nowa metoda jest prostsza, łatwiejsza i mniej czasochłonna, a także zwiększa wydajność nabłonkowych komórek macierzystych i poprawia ich charakterystykę komórek macierzystych. Co więcej, nowa metodologia nie wymaga oddzielania naskórka od skóry właściwej, a zatem nadaje się do izolowania komórek z różnych typów dorosłych tkanek. Ta nowa metoda izolacji przezwycięża główne wady metod konwencjonalnych i jest bardziej odpowiednia do wytwarzania dużej liczby komórek naskórka o dużej mocy, zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nową metodę.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem było opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów (HKC) z tkanek dorosłych, szczególnie do zastosowań klinicznych. Komórki macierzyste naskórka skóry, zlokalizowane w warstwie podstawnej skóry, mają wysoki potencjał do namnażania się i różnicowania oraz dostarczania keratynocytów w celu utrzymania funkcji skóry1,2,3,4. HKC wyizolowane z tkanek skóry są szeroko stosowane do celów inżynierii i regeneracji tkanek skóry, zwłaszcza w naprawie uszkodzonej skóry oraz w terapii genowej do zastosowa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie tkanki użyte w tym protokole zostały potraktowane zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach (NO.2015120401, data: 12 maja 2015).

1. Przygotowania

  1. Zbierz świeże dorosłe tkanki skóry brzucha wyrzucone po operacji plastycznej w szpitalu w probówce o pojemności 50 ml z 10 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin bez znaczącego wpływu na żywotność komórek.
  2. Przygotować odczynniki i pożywkę hodowlaną zgodnie z poniższym opisem.
    1. Dodać 1 ml penicyliny (100 j./ml) i streptomycyny (100 mg/l) d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematy ideowe nowej metody (Rysunek 1A) i metody konwencjonalnej (Rysunek 1B) są przedstawione w Rysunek 1. Konwencjonalną metodą jest dwuetapowe trawienie, które wymaga 2-dniowej procedury. Natomiast nowa metoda to jednoetapowe trawienie, które trwa około 3 godzin. Co ważne, jednoetapowa nowa metoda pozwala na uzyskanie dwóch populacji (komórek naskórka i skóry właściwej) w tym samym czasie, co za.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowlane pierwotne HKC są szeroko stosowane w leczeniu ran w klinikach od ponad trzech dekad i od tego czasu zawsze ważne było skuteczne uzyskanie wystarczającej liczby komórek do zastosowań klinicznych w odpowiednim czasie. Dlatego w praktyce konwencjonalna metoda izolacji, która wymaga oddzielenia naskórka od skóry właściwej, utrudnia sprostanie tym wymaganiom, ze względu na niską wydajność komórek i niską zdolność do pasażu komórek dorosłych. W tym miejscu opisujemy nową, prostą metodę, którą opracowaliśmy w celu sku.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2017YFA0104604), Program Ogólny Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, 81772093), Program Rozwoju Nauki i Technologii w Suzhou (ZXL2015128), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20161241) oraz Nagrodę Naukową Shandong Taishan (tshw201502065).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Automatyczny licznik komórek CountessInvitrogen Inc. C10227Automatyczne zliczanie komórek 
Inkubator CO2Thermo Scientific 51026333Do inkubacji komórek
Wirówka Sorvall ST 16RThermo Scientific75004380Wirówka komórkowa
Wytrząsarka o stałej temperaturzeShanghai Boxun150036Do kąpieli wodnej
Waga elektronicznaHarbin Zhonghui1171193Do ważenia tkanek
Naczynie do hodowli komórkowychEppendorf30702115Do hodowli komórkowych
50 ml Probówka wirówkowaKIRGEN171003Do wirówki komórkowej
Sitko komórkoweCorning wbudowane431792Filtracja komórkowa
Roztwór buforowany fosforanamiSolarbio Nauki przyrodnicze P1020-500Roztwór myjący
DMEMThermo ScientificC11995500Składnik pożywki neutralizującej
Defined K-SFMLife Technologies10785-012Pożywka do hodowli komórek naskórka
Penicylina StreptomycynaThermo Scientific15140-122Antybiotyki
Surowica bydlęcaPrzemysł biologiczny04-001-1AC5Składnik pożywki neutralizującej
0,05% TrypsinLife Technologies25300-062Do dysocjacji HKC
0,25% Trypsyna Beijing Solarbio Nauka & TechnologiaT1350-100Do dysocjacji HKC
Zestaw matryc powłokowychLife TechnologiesR-011-KDo matrycy powłokowej
DyspazaGibco17105-041Do izolacji HKC
Kolagenaza typu ILife Technologies17100-017Do izolacji HKC
Deoksyrybonukleaza ISigma9003-98-9Do izolacji HKC
F12 Mieszanka składników odżywczych, HamsLife Technologies31765035Składnik G-medium
B27Suplement Life Technologies17504044Czynnik wzrostu w G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Czynnik wzrostu w G-medium
Y-27632Sigma-AldrichY0503Inhibitor ROCK
FungizoneGibco15290026Preparat do G-medium
EGF Rekombinowanego białka ludzkiegoGibcoPHG0311czynnika wzrostu w G-medium
Cell Counting Kit-8Thermo ScientificNC9864731proliferacji komórek i testów cytotoksyczności
Mysia anty-ludzka cytokeratyna5Hewlett-Packard Development CompanyMA-20142Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC
Królik Anti-Human LoricrinCovancePRB-145pDo barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC
Mysza technologia sygnalizacji komórkowej anty-ludzkiej wimentyny3390Do barwienia immunofluorescencyjnego fibroblastów skóry
Integryna i alfa; 6(GOH3)Santa Cruz SC-19622analiza cytometrii przepływowej HKCs
Rat IgG2a FITCSanta Cruz SC-2831przeciwciało kontroli ujemnej &alfa; 6-integryna  w analizie cytometrii przepływowej 
płodu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Human KeratinocytesSkin Tissue IsolationEnzymatic DigestionROCK Inhibitor Y 27632Epidermal Progenitor CellsCell Culture ExpansionK5 Marker AnalysisLoricrin DifferentiationVimentin Contamination CheckNeutralization Medium Wash

Related Articles