Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Summary

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Abstract

Pierwotne ludzkie keratynocyty izolowane ze świeżych tkanek skóry i ich ekspansja in vitro były szeroko stosowane do badań laboratoryjnych i zastosowań klinicznych. Konwencjonalna metoda izolacji ludzkich keratynocytów obejmuje dwuetapową sekwencyjną procedurę trawienia enzymatycznego, która, jak udowodniono, jest nieefektywna w generowaniu komórek pierwotnych z dorosłych tkanek ze względu na niski wskaźnik odzysku komórek i zmniejszoną żywotność komórek. Niedawno informowaliśmy o zaawansowanej metodzie izolowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych naskórka z tkanek skóry, która wykorzystuje inhibitor kinazy Rho Y-27632 w pożywce. W porównaniu z tradycyjnym protokołem, ta nowa metoda jest prostsza, łatwiejsza i mniej czasochłonna, a także zwiększa wydajność nabłonkowych komórek macierzystych i poprawia ich charakterystykę komórek macierzystych. Co więcej, nowa metodologia nie wymaga oddzielania naskórka od skóry właściwej, a zatem nadaje się do izolowania komórek z różnych typów dorosłych tkanek. Ta nowa metoda izolacji przezwycięża główne wady metod konwencjonalnych i jest bardziej odpowiednia do wytwarzania dużej liczby komórek naskórka o dużej mocy, zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nową metodę.

Introduction

Celem było opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów (HKC) z tkanek dorosłych, szczególnie do zastosowań klinicznych. Komórki macierzyste naskórka skóry, zlokalizowane w warstwie podstawnej skóry, mają wysoki potencjał do namnażania się i różnicowania oraz dostarczania keratynocytów w celu utrzymania funkcji skóry^1,2,3,4. HKC wyizolowane z tkanek skóry są szeroko stosowane do celów inżynierii i regeneracji tkanek skóry, zwłaszcza w naprawie uszkodzonej skóry oraz w terapii genowej do zastosowań klinicznych^5,6. Kluczowym zagadnieniem dla aplikacji opartych na HKC jest efektywne izolowanie i namnażanie dużej liczby HKC o wysokim potencjale in vitro^7,8. Chociaż różne grupy badawcze opracowały metody produkcji kultur HKC podobnych do łodyg, metody te są czasami czasochłonne i skomplikowane do wykonania oraz mają inne ograniczenia, takie jak niska wydajność komórek i ograniczenie rodzajem użytej próbki skóry⁹. Na przykład tradycyjna metoda izolowania HKC z tkanek skóry obejmuje dwuetapowe trawienie enzymatyczne z oddzieleniem naskórka od skóry właściwej⁶. Ta metoda zwykle działa dobrze w przypadku tkanek noworodków, ale staje się bardzo trudna, gdy jest stosowana do izolowania komórek z tkanek dorosłych.

Y-27632, inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK), znacznie zwiększa skuteczność izolacji komórek macierzystych naskórka i wzrostu kolonii^10,11,12. W poprzednim badaniu odkryliśmy, że Y-27632 ułatwia klonalny wzrost komórek naskórka, ale zmniejsza wydajność komórek skóry właściwej poprzez różnicową kontrolę ekspresji cząsteczek adhezyjnych¹³. Opracowaliśmy również nową kondycjonowaną pożywkę do inokulacji, zwaną G-pożywką, która wspomaga wzrost i wydajność pierwotnych komórek naskórka. Łącząc G-medium z Y-27632, ta nowatorska metoda może spontanicznie oddzielić komórki naskórka i skóry właściwej po trawieniu enzymatycznym, usuwając w ten sposób etap separacji naskórka i skóry właściwej^13,14. Opierając się na poprzednich raportach, opisujemy teraz szczegółową procedurę tej nowej metody izolowania HKC z dorosłej tkanki skórnej.

Protocol

Ludzkie tkanki użyte w tym protokole zostały potraktowane zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach (NO.2015120401, data: 12 maja 2015).

1. Przygotowania

1. Zbierz świeże dorosłe tkanki skóry brzucha wyrzucone po operacji plastycznej w szpitalu w probówce o pojemności 50 ml z 10 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin bez znaczącego wpływu na żywotność komórek.
2. Przygotować odczynniki i pożywkę hodowlaną zgodnie z poniższym opisem.
   1. Dodać 1 ml penicyliny (100 j./ml) i streptomycyny (100 mg/l) do 50 ml roztworu buforowanego fosforanem (PBS) w celu przygotowania roztworu do mycia.
   2. Przygotować dwa zestawy roztworów do wytrawiania enzymatycznego: (1) przygotować 50 ml dypazy (2,5 mg/ml w DMEM) i 50 ml kolagenazy typu I (2,5 mg/ml w DMEM) oddzielnie dla metody konwencjonalnej; oraz (2) przygotować 50 ml mieszaniny dypazy i kolagenazy typu I (rozpuścić 125 mg proszku dispazy i 125 mg kolagenazy typu I w 50 ml DMEM) dla nowej metody><. UWAGA: Wszystkie roztwory enzymów należy przefiltrować za pomocą sitka o wielkości 0,22 μm i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotuj roztwory wytrawiające dla obu metod: 0,05% trypsyny i 0,25% trypsyny zostały zakupione na rynku. Przygotować roztwór DNazy I o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając 50 mg proszku DNazy I w 5 ml PBS, przefiltrować go sitkiem o stężeniu 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Przygotuj 500 ml pożywki, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne: pożywka DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
   5. Przygotuj 500 ml pożywki inokulacyjnej (pożywki zawierającej czynnik wzrostu, zwanej pożywką G): pożywki DMEM/F12 (3:1) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny, 40 μg/ml fungizonu, 40 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 2% suplementu B27.
   6. Na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych należy potraktować 2 ml matrycy powlekającej zawierającej kolagen typu I przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

2. Metoda konwencjonalna

1. Wstępna obróbka tkanki skórnej
   1. Weź 1,5^cm2 tkanki skórnej i umyj ją 1x 10 ml PBS, następnie przepłucz 10 ml 70% etanolu przez 30 s i inkubuj 2x z 10 ml roztworu myjącego (PBS zawierający 2% penicyliny i streptomycyny), po 5 minut.
      UWAGA: Wszystkie mycia wykonywane są w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli komórkowych wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
   2. Przyciąć tkankę sterylnymi nożyczkami, aby usunąć podskórną warstwę tłuszczu w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych, a następnie zważyć tkankę skórną (waga w tym protokole wynosi 1 g).
      UWAGA: Odpowiednie przycinanie jest bardzo ważne dla skutecznego oddzielenia naskórka od skóry właściwej. Żółtawą warstwę tłuszczu można łatwo odróżnić wizualnie.
   3. Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia o średnicy 100 mm stroną ze skórą właściwą do dołu, a następnie pokrój tkankę skórną na paski o szerokości od 3 do 4 mm za pomocą ostrza skalpela.
      UWAGA: Strona skóry właściwej z warstwą tłuszczu jest łatwo rozpoznawalna wizualnie.
   4. Dodać 10 ml roztworu dyspazy o stężeniu 2,5 mg/ml do tkanek skóry w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym, a następnie inkubować szalkę przez noc w temperaturze 4 °C (nie dłużej niż 20 godzin).
      UWAGA: Ilość roztworu dypazy można obliczyć, używając 10 ml roztworu dypazy do trawienia każdego grama tkanki.
2. Oddzielenie naskórka od tkanki skórnej
   1. Drugiego dnia złuść naskórek ze skóry właściwej za pomocą cienkiej pęsety.
      UWAGA: Jeśli złuszczanie naskórka jest trudne, trawienie w dyspazie nie było wystarczające, co zwykle wynika z niedostatecznego przycięcia tkanki. W takim przypadku tkanka potrzebuje dłuższego czasu inkubacji.
   2. Zmielić obrany naskórek z 500 μl pożywki do hodowli komórkowych na zawiesinę tkankową za pomocą ostrzy skalpela, a następnie ponownie zawiesić go z 10 ml 0,25% trypsyny w probówce o pojemności 50 ml i inkubować przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
3. Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych
   1. Zneutralizować aktywność trypsyny, dodając równą objętość roztworu neutralizującego (10 ml w tym protokole).
   2. Oddziel komórki naskórka, pipetując roztwór w górę iw dół 20-krotnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przepuść roztwór komórkowy przez sitko do komórek o średnicy 100 μm, aby usunąć wszelkie resztki tkanki.
   3. Odwirować roztwór komórkowy przy 200 x g przez 5 minut po filtracji; ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce neutralizacyjnej do przemycia, a następnie ponownie odwirować go przy 200 x g w celu uzyskania osadu komórkowego.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml niskowapniowego, bezsurowicowego podłoża keratynocytowego (SFM). Weź 10 μl tego roztworu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek, a następnie rozłóż około 2 x 10⁶ komórek z 10 ml SFM na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych wstępnie potraktowanych matrycą powlekającą (zawierającą kolagen typu I).
      UWAGA: Powlekanie jest niezbędnym krokiem w przypadku metody konwencjonalnej.
   5. Zmieniaj pożywkę co 2 d.
      UWAGA: Sprawdź adhezję komórek pod mikroskopem przed i po zmianie pożywki hodowlanej.
   6. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 80% konfluencji.
      UWAGA: Wszystkie szalki hodowlane są wstępnie traktowane matrycą powlekającą.

3. Nowa metoda

1. Wstępna obróbka tkanki skórnej
   1. Pobrać tkankę w sposób opisany powyżej (krok 2.1) dla metody konwencjonalnej.
   2. Umyj tkankę skóry 1x 10 ml PBS, a następnie zważ ją w sterylnym plastikowym pojemniku za pomocą wagi elektronicznej (waga w tym protokole wynosi około 1 g).
      UWAGA: Minimalna waga tkanki potrzebna do tego protokołu wynosi 0,1 g, ponieważ trudno jest uzyskać wystarczającą liczbę komórek, jeśli użyta próbka tkanki jest zbyt mała. W tym protokole nie ma maksymalnej wagi tkanki, która ostatecznie zależy od zdolności operatora do obsługi.
   3. Za pomocą kleszczy przepłucz tkankę skórną 10 ml 70% etanolu przez 30 sekund.
   4. Inkubować tkankę 2x z 10 ml roztworu myjącego (przygotowanego w kroku 2.1.1), za każdym razem przez 5 minut.
      UWAGA: Wszystkie wymienione powyżej etapy mycia są wykonywane w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli komórkowych wewnątrz okapu z przepływem laminarnym (kaptur do hodowli tkankowych).
   5. Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm.
   6. Za pomocą ostrzy skalpela dokładnie zmiel tkankę na zawiesinę tkanki.
   7. Dodawaj 200 μl PBS co 5 minut, aby chusteczki były mokre.
      UWAGA: Kroki 3.1.5 - 3.1.7 zajmują około 15 minut. Wszystkie powyższe kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
2. Trawienie tkanki skórnej
   1. Przenieść homogenizowany roztwór tkankowy do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml mieszaniny enzymów na każdy 1 g tkanki skórnej. Enzymy dokładnie wymieszać z homogenizowanymi tkankami.
   2. Inkubować mieszaninę, wytrząsając w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   3. Dodaj 1/5 objętości 0,25% trypsyny (2,5 ml w tym protokole) do mieszaniny wytrawiającej przez kolejne 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   4. Dodać roztwór DNazy I do mieszaniny enzymów w stosunku 1:100 (v/v) (250 μl w tym protokole) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych
   1. Zatrzymaj proces trawienia, dodając 12,5 ml pożywki neutralizacyjnej w stosunku 1:1. Pipetować roztwór w górę iw dół przez około 20 razy, używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu dysocjacji komórek.
   2. Przefiltruj zdysocjowane komórki przez sitko do komórek o średnicy 100 μm, aby usunąć resztki tkanek. Odwirować supernatant przy 200 x g przez 5 minut. Obserwuj granulki na dnie tuby.
   3. Odrzucić supernatant i przemyć osad komórkowy 10 ml pożywki neutralizującej, a następnie ponownie odwirować przy 200 x g przez 5 minut w celu zebrania komórek.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do inokulacji (pożywka G z kroku 1.2.5) z 10 μM Y-27632.
   5. Weź 10 μl roztworu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek, a następnie rozłóż około 2 x 10⁶ komórek z 10 ml pożywki G w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.
      UWAGA: W przypadku nowej metody etap wstępnego powlekania nie jest konieczny, nie jest też wymagane usuwanie warstwy skórnej.
   6. Po 3 dniach zastąp pożywkę inokulacyjną pożywką SFM o niskiej zawartości wapnia. Zmieniaj pożywkę co 2 d.
      UWAGA: Sprawdź przyczepność komórek przed i po zmianie podłoża.
   7. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 80% konfluencji.
      UWAGA: Jeśli to konieczne, potraktuj komórki 0,05% trypsyny przez 2 minuty i umyj komórki PBS, aby usunąć zanieczyszczające komórki skóry właściwej przed trypsynizacją komórek naskórka.

4. Przekazywanie komórek

1. Usuń pożywkę, umyj komórki PBS, a następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny (na każde naczynie o średnicy 100 mm).
2. Inkubować komórki w inkubatorze (37 °C z 5% CO_{2 )} przez 5 minut.
3. Sprawdź komórki za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie komórki odłączyły się od naczynia hodowlanego.
4. Dodaj 8 ml DMEM z 10% FBS, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną, a następnie zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml.
5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
6. Powoli usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml pożywki SFM i policzyć liczbę komórek.
7. Płytka 1 x 10⁶ komórek z 10 ml SFM do każdej 100-milimetrowej płytki na komórki.
8. Zmieniaj podłoże co 2 d.

Results

Schematy ideowe nowej metody (Rysunek 1A) i metody konwencjonalnej (Rysunek 1B) są przedstawione w Rysunek 1. Konwencjonalną metodą jest dwuetapowe trawienie, które wymaga 2-dniowej procedury. Natomiast nowa metoda to jednoetapowe trawienie, które trwa około 3 godzin. Co ważne, jednoetapowa nowa metoda pozwala na uzyskanie dwóch populacji (komórek naskórka i skóry właściwej) w tym samym czasie, co za...

Discussion

Hodowlane pierwotne HKC są szeroko stosowane w leczeniu ran w klinikach od ponad trzech dekad i od tego czasu zawsze ważne było skuteczne uzyskanie wystarczającej liczby komórek do zastosowań klinicznych w odpowiednim czasie. Dlatego w praktyce konwencjonalna metoda izolacji, która wymaga oddzielenia naskórka od skóry właściwej, utrudnia sprostanie tym wymaganiom, ze względu na niską wydajność komórek i niską zdolność do pasażu komórek dorosłych. W tym miejscu opisujemy nową, prostą metodę, którą opracowaliśmy w celu sku...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatyczny licznik komórek Countess	Invitrogen Inc.	C10227	Automatyczne zliczanie komórek
Inkubator CO2	Thermo Scientific 51026333		Do inkubacji komórek
Wirówka Sorvall ST 16R	Thermo Scientific	75004380	Wirówka komórkowa
Wytrząsarka o stałej temperaturze	Shanghai Boxun	150036	Do kąpieli wodnej
Waga elektroniczna	Harbin Zhonghui	1171193	Do ważenia tkanek
Naczynie do hodowli komórkowych	Eppendorf	30702115	Do hodowli komórkowych
50 ml Probówka wirówkowa	KIRGEN	171003	Do wirówki komórkowej
Sitko komórkowe	Corning wbudowane	431792	Filtracja komórkowa
Roztwór buforowany fosforanami	Solarbio Nauki przyrodnicze	P1020-500	Roztwór myjący
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Składnik pożywki neutralizującej
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Pożywka do hodowli komórek naskórka
Penicylina Streptomycyna	Thermo Scientific	15140-122	Antybiotyki
Surowica bydlęca	Przemysł biologiczny	04-001-1AC5	Składnik pożywki neutralizującej
0,05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	Do dysocjacji HKC
0,25% Trypsyna	Beijing Solarbio Nauka & Technologia	T1350-100	Do dysocjacji HKC
Zestaw matryc powłokowych	Life Technologies	R-011-K	Do matrycy powłokowej
Dyspaza	Gibco	17105-041	Do izolacji HKC
Kolagenaza typu I	Life Technologies	17100-017	Do izolacji HKC
Deoksyrybonukleaza I	Sigma	9003-98-9	Do izolacji HKC
F12 Mieszanka składników odżywczych, Hams	Life Technologies	31765035	Składnik G-medium
B27	Suplement Life Technologies	17504044	Czynnik wzrostu w G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Czynnik wzrostu w G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Inhibitor ROCK
Fungizone	Gibco	15290026	Preparat do G-medium
EGF Rekombinowanego białka ludzkiego	Gibco	PHG0311	czynnika wzrostu w G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	proliferacji komórek i testów cytotoksyczności
Mysia anty-ludzka cytokeratyna5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC
Królik Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC
Mysza technologia sygnalizacji komórkowej anty-ludzkiej wimentyny		3390	Do barwienia immunofluorescencyjnego fibroblastów skóry
Integryna i alfa; 6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	analiza cytometrii przepływowej HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	przeciwciało kontroli ujemnej &alfa; 6-integryna  w analizie cytometrii przepływowej