TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

Summary

TreadWheel wykorzystuje ruch obrotowy, aby delikatnie wywołać ćwiczenia u dorosłych Drosophila melanogaster, wykorzystując wrodzoną, negatywną geotaksję much. Pozwala na analizę interakcji między ćwiczeniami a czynnikami, takimi jak genotyp, płeć i dieta, oraz ich wpływu na testy fizjologiczne i molekularne w celu oceny zdrowia metabolicznego.

Abstract

Częstość występowania złożonych chorób metabolicznych wzrosła w wyniku powszechnego przejścia na styl życia o zwiększonym spożyciu kalorii i obniżonym poziomie aktywności. Te wieloczynnikowe choroby wynikają z połączenia czynników genetycznych, środowiskowych i behawioralnych. Jedną z takich złożonych chorób jest zespół metaboliczny (MetS), który jest zbiorem zaburzeń metabolicznych, w tym nadciśnieniem, hiperglikemią i otyłością brzuszną. Ćwiczenia i interwencja dietetyczna są podstawowymi metodami leczenia zalecanymi przez lekarzy w celu złagodzenia otyłości i jej późniejszych chorób metabolicznych. Interwencja ruchowa, w szczególności aerobowy trening interwałowy, stymuluje korzystne zmiany w powszechnych czynnikach ryzyka cukrzycy typu 2 (T2DM), chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i innych schorzeń. Wraz z napływem dowodów opisujących terapeutyczny wpływ ćwiczeń na zdrowie metaboliczne, ustanowienie systemu, który modeluje ćwiczenia w kontrolowanych warunkach, stanowi cenne narzędzie do oceny efektów ćwiczeń w kontekście eksperymentalnym. Drosophila melanogaster jest doskonałym narzędziem do badania zmian fizjologicznych i molekularnych, które wynikają z interwencji ruchowej. Muchy mają krótką żywotność i podobne mechanizmy metabolizowania składników odżywczych w porównaniu z ludźmi. Aby skłonić muchę do ćwiczeń, opracowaliśmy maszynę o nazwie TreadWheel, która wykorzystuje wrodzoną, negatywną tendencję muchy do geotaksji, aby delikatnie skłonić ją do wspinaczki. Umożliwia to naukowcom przeprowadzanie eksperymentów na dużych kohortach genetycznie zróżnicowanych muszek, aby lepiej zrozumieć interakcje między genotypem a środowiskiem, leżące u podstaw wpływu ćwiczeń na zdrowie metaboliczne.

Introduction

Otyłość u dzieci i dorosłych to coraz częstsze epidemie w kulturach, które spożywają wysokokaloryczne diety i pozostają bezczynne przez dłuższy czas, co może prowadzić do poważnych długoterminowych konsekwencji, w tym insulinooporności, przewlekłego stanu zapalnego i choroby zwyrodnieniowej stawów1^,2,3,4. Częstość występowania tych zaburzeń stale rośnie z powodu rosnącej nierównowagi w spożyciu i wydatkach kalorycznych przypisywanej zwiększonemu spożyciu tłuszczów i cukrów oraz głównie siedzącemu trybowi życia⁵. W związku z tym ta nierównowaga energetyczna doprowadziła do wzrostu liczby przypadków cukrzycy typu 2 (T2DM) i chorób sercowo-naczyniowych (CVD)⁵. Osoby są bardziej narażone na rozwój obu zaburzeń, jeśli zdiagnozowano u nich zaburzenie Zespół Metaboliczny (MetS), którego objawy obejmują otyłość brzuszną i dyslipidemię². MetS jest kształtowany przez złożone interakcje między genotypem a różnymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak dieta i ćwiczenia⁶. Dlatego, aby w pełni zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tej złożonej choroby, należy wziąć pod uwagę wszystkie te czynniki.

Jeśli chodzi o zwalczanie MetS, lekarze najpierw zalecają przejście na zmiany stylu życia, które obejmują zdrową, dobrze zbilansowaną dietę i aktywność fizyczną^2,7,8. Ponieważ skuteczne leki są ograniczone, a operacja pomostowania żołądka jest kosztowna i wymaga monitorowania medycznego przez całe życie, interwencja farmakologiczna i chirurgiczna jest zalecana tylko w ciężkich przypadkach i tylko w połączeniu z tymi zmianami stylu życia^3,7,8. Podczas gdy interwencje związane ze stylem życia, takie jak ćwiczenia i dieta, mogą przynieść i utrzymać długoterminowe cele związane z utratą wagi, to, czy te środki naprawcze mogą w pełni złagodzić negatywne skutki związane z MetS, wymaga dalszych badań^7,8.

Modele mysie od lat są wykorzystywane do badania wpływu ćwiczeń na choroby metaboliczne; jednak wprowadzenie ćwiczeń do badań nad lotami na MetS jest stosunkowo nowym przedsięwzięciem9^,10,11,12. Muchy stanowią idealne narzędzie do badania ćwiczeń w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, ponieważ łatwo nimi manipulować, mają krótką żywotność, są niedrogie w utrzymaniu, a szlaki metaboliczne związane z energią są wysoce konserwatywne między Drosophila a ludźmi¹³. Genomy D. melanogaster są dobrze scharakteryzowane, a istnieje wiele narzędzi genetycznych dostępnych do wykorzystania u Drosophila, które mogą dostarczyć wglądu w różne genotypy i interakcje genotyp w zależności od środowiska, które mogą modulować wpływ ćwiczeń na zdrowie organizmu¹⁴.

Obecne metody treningu Drosophila wywołują wrodzoną, negatywną skłonność muchy do geotaksji, instynkt behawioralny do wspinania się w górę, aby stymulować wspinanie się u dorosłych w ich zagrodach^11,12,15. Power Tower, jedna z metod stymulowania ćwiczeń u much, systematycznie podnosi obudowy much w pionie, a następnie upuszcza je z powrotem na powierzchnię ławki, skutecznie powalając muchy na dno fiolki, wywołując w ten sposób ich instynktowną negatywną geotaksję^12,16. Eksperymenty przeprowadzone przy użyciu tej maszyny wykazały, że ćwiczenia są silnym czynnikiem ochronnym przed wieloma chorobami związanymi z wiekiem, w tym CVD i T2DM, oraz promują zdrowe starzenie się^12,17,18. W szczególności wykazali, że ćwiczenia mogą zmniejszyć wystąpienie związanego z wiekiem spadku mobilności u much i poprawić wiele objawów związanych z wiekiem, takich jak wydolność serca i reakcja na stres^17,18. Jednak muchy kontrolne, które nigdy nie zostały umieszczone na wieży, wykazywały wyższe wyniki wspinaczki niż te, które doświadczyły maszyny, co sugeruje, że siła powtarzających się spadków może ranić muchy i wpływać na mobilność¹². Sugeruje to, że alternatywna metoda wywoływania ćwiczeń, która jest mniej forsowna i unika powodowania urazów fizycznych, byłaby użyteczną, uzupełniającą metodą protokołu Power Tower¹⁶.

Aby delikatnie zachęcić do ćwiczeń u Drosophila, opracowaliśmy maszynę do ćwiczeń o nazwie TreadWheel (Rysunek 1). Ruch obrotowy TreadWheel (odtąd w skrócie TW) wyzwala wrodzoną, negatywną tendencję muchówek do geotaksji poprzez ciągłe redefiniowanie grawitacyjnej górnej części fiolek, co z kolei stymuluje wspinanie się much. W przeciwieństwie do innych metod, ruch obrotowy TW jest z natury łagodny, co minimalizuje liczbę dodatkowych stresorów, które mogą wystąpić i wpłynąć na wyniki. W ten sposób maszyna zapewnia środki do wywoływania ćwiczeń u dużej liczby much bez wywoływania stresu, co umożliwi naukowcom badanie wpływu ćwiczeń na zdrowie metaboliczne (Rysunek 2), starzenie się, sen i wiele innych tematów¹¹.

Nasza metoda opiera się na odwrotnym piramidalnym, interwałowym protokole treningowym, który w dużej mierze łączy aspekty aerobowego treningu interwałowego (AIT) z treningiem wytrzymałościowym. Standardowy reżim AIT został zmieniony w tym protokole, aby stopniowo wydłużać czas trwania każdego interwału w okresie pięciu dni, aby promować wytrzymałość. AIT okazał się szczególnie przydatny w zapobieganiu MetS w porównaniu z innymi metodami interwencji i był bardziej skuteczny w odwracaniu typowych czynników ryzyka zespołu metabolicznego niż ciągłe umiarkowane ćwiczenia^19,20. Jednak wadą TW w stosunku do Power Tower jest to, że muchy szybciej przyzwyczajają się do ruchu obrotowego, więc różnice we wrodzonej tendencji do przyzwyczajania się wśród much mogą komplikować interpretację korzyści płynących z ćwiczeń. ¹¹ Eleganckie rozwiązanie tego ograniczenia jest opisane przez Watanabe i Riddle¹⁵ oraz ich uzupełniający artykuł²¹.

Protocol

1. Konfiguracja i obsługa TreadWheel

UWAGA: Zobacz Rysunek Uzupełniający 1, aby zapoznać się ze schematami budowy maszyn do ćwiczeń TW. Wymagane części są wymienione w Tabeli materiałów. Wyrażenia "TW", "TreadWheel", "maszyna do ćwiczeń" i "maszyna" są używane zamiennie w całym protokole.

1. Skalibruj silnik za pomocą wyłącznika zasilania tak, aby pełny okres obrotu wynosił 15 s (4 obr./min). Skalibruj prędkość obrotową maszyny przed umieszczeniem fiolek muchowych w zabezpieczonych zaciskach przymocowanych do obracających się ramion.
   1. Dostosuj prędkość za pomocą standardowego stopera i nieruchomego przedmiotu tymczasowo przymocowanego do maszyny, takiego jak mały pędzel przyklejony do pokrywy silnika, tak aby szczotka dotykała tylko jednego z obracających się wsporników. Zmierz czas liczby obrotów w ciągu jednej minuty, używając nieruchomego obiektu jako punktu odniesienia i dostosuj prędkość, aby osiągnąć okres obrotu 15 s (4 obr./min).

2. Zbieranie i konserwacja much

UWAGA: Wszystkie muchy są trzymane w inkubatorze o temperaturze 25 °C z wilgotnością 50% i 12-godzinnym cyklem światło/ciemność pomiędzy manipulacjami na stole opisanymi poniżej. Muchy są karmione standardową dietą laboratoryjną z mąki kukurydzianej i melasy, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotuj komory niosek dla każdego interesującego Cię genotypu, używając płytek agarowych z sokiem jabłkowym, kropli pasty drożdżowej na talerz i 6 uncji plastikowych butelek do zbierania jaj, z których wyklują się larwy.
   1. Aby przygotować talerze agarowe z sokiem jabłkowym, wypełnij szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm w 3/4 objętości 3% agarem rozpuszczonym w kupionym w sklepie soku jabłkowym. Zestalone talerze przechowuj w lodówce do czasu użycia.
   2. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml połącz kupione w sklepie aktywne suche drożdże z wodą destylowaną w proporcji 2 ml wody na każdy gram drożdży. Wymieszaj drożdże z wodą, aby uzyskać pastę o konsystencji ketchupu za pomocą szklanego pręta do mieszania. W razie potrzeby dostosuj proporcje drożdży i wody, aby uzyskać pożądaną konsystencję.
   3. Przechowuj pastę drożdżową w lodówce między użyciami. Trzymaj nasadkę rurki luźno, aby umożliwić odgazowanie.
   4. Użyj ostrej igły lub noża, aby wybić małe otwory w butelkach o kwadratowym dnie o pojemności 6 uncji (polipropylen) jako otwory wentylacyjne dla komór do układania.
   5. Nałóż małą plamkę pasty drożdżowej (o średnicy ~3 mm) na każdy talerz agarowy z sokiem jabłkowym.
2. Umieść dorosłe muchy o pożądanym genotypie w butelce o pojemności 6 uncji i butelce z nakrętką z płytką agarową z sokiem jabłkowym. Przymocuj talerz do butelki za pomocą gumek. Odwróć i umieść w inkubatorze, aby umożliwić dorosłym osobom składanie jaj.
3. Zmieniaj talerze agarowe z sokiem jabłkowym w komorze do układania dwa razy dziennie (rano i wieczorem). Pozostaw zużyte płytki w inkubatorze na kolejne 12–24 godziny, aby umożliwić wyklucie się pierwszych larw w stadium rozwojowym.
4. Zbierz pierwsze larwy w stadium rozwojowym za pomocą cienkiego pędzla lub szpikulca (elastyczna cienka igła przymocowana do uchwytu). Umieść 50 larw pierwszego stadium rozwojowego o określonym genotypie na fiolce z pokarmem o pożądanym eksperymentalnym typie pokarmu, aby rozwinąć i zakończyć metamorfozę podczas trzymania w inkubatorze (Rysunek 2A).
5. Zbierz dorosłych na zabieg fizyczny (Rysunek 2A).
   1. Po przepoczwarzeniu należy zebrać poczwarki małym, wilgotnym pędzlem i umieścić w pustych fiolkach przed eklozją, aby zapobiec narażeniu dorosłych much na pokarm larwalny.
   2. Przenieś dorosłe muchy do fiolek z jedzeniem standardowej diety laboratoryjnej, gdy się zamykają. Od jednego do pięciu dni po ekleksji oddzielne muchy na podstawie płci.
6. Wyznacz po połowie zebranych dorosłych do grupy eksperymentalnej i kontrolnej. Utrzymuj muchy w fiolkach standardowej diety laboratoryjnej w stężeniu 50 much na fiolkę.
7. Przenoś dorosłe osoby do fiolek ze świeżą żywnością co dwa dni, aby zapobiec utknięciu podczas ćwiczeń. Dodaj kilka ziaren dodatkowych żywych drożdży do nowego pokarmu bezpośrednio przed wprowadzeniem much.
   UWAGA: Chociaż możliwe jest utrzymanie much bez suplementu żywych drożdży, odkryliśmy, że dorosłe muchy najlepiej radzą sobie z suplementacją. Suplementacja żywymi drożdżami jest zmienną, którą można zmodyfikować w celu dopasowania do celów eksperymentalnych badacza.

3. Protokół ćwiczeń

1. W pierwszym dniu ćwiczeń (Dzień 1) wciśnij zatyczki fiolek, aby pozostawić 1 cm wolnej przestrzeni w fiolkach kontrolnych i 6 cm przestrzeni między jedzeniem a fiolkami z wkładem do ćwiczeń (Ryc. 1C).
   UWAGA: Fiolki kontrolne będą miały ograniczoną przestrzeń dla much do poruszania się na maszynie do ćwiczeń, a zatem muchy będą się angażować w znacznie mniejszy ruch niż w fiolkach do ćwiczeń.
2. Umieść fiolki w zaciskach, a następnie daj muchom 10 minut na aklimatyzację na maszynie (Rysunek 1B).
   UWAGA: Alternatywnym sterowaniem jest utrzymanie niećwiczonych much na blacie przylegającym do maszyny do ćwiczeń z 6 cm wolnej przestrzeni (w fiolce), aby mogły się normalnie poruszać. Znaleziono podobne wyniki ćwiczeń w odniesieniu zarówno do kontrolek "1 cm na TreadWheel", jak i "6 cm na blacie"¹¹.
3. Traktuj zarówno muchy kontrolne, jak i ćwiczeniowe do rotacji na maszynie w stałej temperaturze pokojowej przez 5 kolejnych dni w tygodniu z naprzemiennymi napadami rotacji i odpoczynku (Rysunek 1D).
   UWAGA: Potrzebna jest stała temperatura, aby uniknąć mylącego wpływu temperatury na poziom aktywności. W przypadku badań nad manipulacją temperaturą, umieść TW w inkubatorze, aby zmodyfikować leczenie temperaturą podczas treningu fizycznego.
   1. Uruchom maszynę na cztery 15-minutowe ćwiczenia w dniu 1. Przeplataj te walki z 5-minutowymi okresami odpoczynku.
   2. Każdego z kolejnych dni dodaj 5 minut ćwiczeń do jednego z istniejących wcześniej ćwiczeń. Na przykład w dniu 2 wykonaj pierwsze ćwiczenie o długości 20 minut, ale pozostałe ćwiczenia utrzymuj na poziomie 15 minut.
   3. W dniu 3 ćwiczenia trwają 20 minut podczas pierwszych dwóch ataków i 15 minut podczas kolejnych dwóch walk.
   4. W dniu 4 stosuj 20-minutowe ataki ćwiczeń we wszystkich przypadkach z wyjątkiem finałowej, która powinna trwać tylko 15 minut.
   5. W dniu 5 utrzymuj wszystkie ćwiczenia trwające 20 minut.
      UWAGA: W okresach odpoczynku fiolki zawierające muchy powinny pozostać bezpiecznie zaciśnięte na TW. Orientacja fiolek w tych okresach nie ma znaczenia, ponieważ siła grawitacji doświadczana przez wszystkie muchy będzie pochodzić z tego samego kierunku.
4. Po zakończeniu zabiegu wysiłkowego w danym dniu, należy przywrócić korki fiolek z pokarmem do ich normalnych pozycji i odesłać muchy do inkubatorów do następnego dnia.
5. Po zakończeniu pełnego reżimu ćwiczeń znieczulenie much przy użyciu standardowych metod znieczulenia muchami CO₂ . Następnie przenieś muchy do nowych fiolek z żywnością lub probówek do mikrowirówek w celu oceny interesujących cech fenotypowych.
   UWAGA: Przykładowe fenotypy obejmują zdolność wspinania się (fiolka z żywnością), magazynowanie trójglicerydów (probówka do mikrowirówki) lub ekspresję genów (probówka do mikrowirówki). W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki są odpowiednio przechowywane w zależności od ocen, które mają zostać przeprowadzone. Testy z udziałem żywych much będą musiały zostać przeprowadzone niezwłocznie, zgodnie ze szczegółowymi celami testu fenotypowego.

4. Ocena wspinaczki

1. Po jednym dniu odpoczynku po zakończeniu protokołu ćwiczeń, przetestuj ogólną wydajność wspinaczki muchowej za pomocą szybkiego iteracyjnego testu wspinaczkowego negatywnej geotaksji podobnej do RING (RING)²².
   1. Umieścić grupy 10 much w pustych fiolkach za pomocą znieczulenia CO₂ (lub bezpośrednio z fiolek z żywnością, jeśli są już posortowane) i uszczelnić folią parafinową, aby zapobiec ucieczce much. Dać muszkom co najmniej 10 minut, aby przyzwyczaiły się do nowej fiolki. Aby zapobiec przewróceniu się fiolek, przyklej do dna fiolki okrąg o średnicy ~5 cm, aby zapewnić dodatkową powierzchnię.
      UWAGA: Nie należy używać zatyczek do fiolek, ponieważ utrudniają one działanie części fiolki służącej do określania wysokości, na jaką się wznoszono.
   2. Umieść fiolki 20 cm przed siatką o wymiarach 1 cm x 1 cm w pełnym widoku zamontowanej, nieruchomej kamery z wbudowanym timerem (dobrze sprawdza się smartfon z aplikacją kamery z timerem).
   3. Delikatnie postukaj fiolkami o blat trzy razy, aby strącić wszystkie muchy na dno fiolki. Po trzecim stuknięciu w fiolkę w dół, natychmiast uruchom 4-sekundowy timer aparatu, aby uchwycić obraz w celu określenia wysokości, na jaką wspina się każda mucha.
      UWAGA: Opukiwanie powinno być wykonywane ze stałą intensywnością i przez tego samego badacza w każdym kontraście ćwiczeniowo-kontrolnym, aby zminimalizować różnice w reakcjach much spowodowane stukaniem.
   4. Powtórzyć krok 4.1.3 dwukrotnie, zachowując co najmniej 1 minutę przerwy między próbami, aby uzyskać w sumie trzy próby na fiolkę.
2. Aby zachować muchy do innych analiz, natychmiast po zakończeniu testu wspinaczkowego, należy je błyskawicznie zamrozić przez zanurzenie w ciekłym azocie.
   1. Użyj płytkiej, otwartej kolby Dewara wypełnionej do głębokości ~5 cm ciekłym azotem.
   2. Przenieś muchy do małych probówek mikrowirówek za pomocą znieczulenia CO₂, a następnie umieść probówki w kolbie Dewara wypełnionej ciekłym azotem. Alternatywnie, jeśli przyszłe analizy wymagają unikania emisji CO_{2 ,} należy zamrozić muchy bezpośrednio w ich fiolkach wspinaczkowych, delikatnie stukając muchy o dno fiolki, podczas gdy dno jest zanurzone w ciekłym azocie, a następnie przenieść zamrożone muchy do probówek mikrowirówkowych za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Ciekły azot jest kriogeniczny i powinien być używany wyłącznie przy odpowiednim sprzęcie ochronnym i wentylacji pomieszczenia.
3. Przetwarzanie obrazów za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego ImageJ²³.
   1. Otwórz obraz do przetworzenia w ImageJ.
   2. Ustaw skalę 1 cm na podstawie papieru w siatkę, aby obliczyć odległość pokonaną przez każdą pojedynczą muchę. Użyj narzędzia "Linia" z paska narzędzi, aby obrysować jedną stronę kwadratu o boku 1^cm2 z papieru w siatkę. Kliknij zakładkę "Analizuj" i wybierz "Ustaw skalę". Ustaw "Znaną odległość" jako "1.00" i "Jednostkę długości" jako "cm", upewnij się, że "Globalny" nie jest zaznaczony i kliknij "OK".
   3. Wybierz ikonę "Zaznaczenie wielopunktowe" na pasku narzędzi i powiększ dolną część fiolki na obrazie. Ustawić pierwszy punkt na samym dole fiolki, klikając na najniższą część fiolki.
   4. Kliknij środek każdej muchy w fiolce, aby oznaczyć ją jako punkt danych. Zwróć uwagę, że w sumie jest 11 punktów na fiolkę, jeden oznaczający dno fiolki i jeden dla każdej muchy.
   5. Kliknij zakładkę "Analizuj" i wybierz "Zmierz", aby wygenerować tabelę zmierzonych wartości. Zapisz tabelę jako plik csv.
   6. Otwórz plik csv w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz dokładną odległość pokonaną przez każdą muchę, odejmując wartości y punktów 2-11 od punktu 1 w tabeli zmierzonych wartości.
   7. Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6 dla każdego obrazu.

5. Test przechowywania trójglicerydów

UWAGA: Próbki, wzorce, roztwór wzorcowy glicerolu i roztwór roboczy triglicerolu używane podczas testu powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas trwania protokołu i powinny być przechowywane w lodówce, gdy nie są używane.

1. Przygotować wzorce przy użyciu roztworu wzorca glicerolu.
   1. Wykonać ślepą próbę (B), dodając 1 000 μl buforu homogenizacyjnego do probówki mikrowirówki oznaczonej B.
   2. Przygotować Wzorzec 1 (S1), 2,5 mg/ml na studzienkę, dodając 1000 μl wzorcowego roztworu glicerolu do probówki mikrowirówki oznaczonej S1.
   3. Przygotować Wzorzec 2 (S2), 1,25 mg/ml na studzienkę, dodając 500 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 500 μl diH₂O w probówce do mikrowirówki oznaczonej S2.
   4. Przygotować wzorzec 3 (S3), 0,625 mg / ml na studzienkę, dodając 250 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 750 μl diH₂O w probówce do mikrowirówki oznaczonej S3.
   5. Przygotować Wzorzec 4 (S4), 0,3125 mg / ml na studzienkę, dodając 125 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 875 μl diH20 w probówce mikrowirówki oznaczonej S4.
2. Przygotować roztwór roboczy triglicerolu z zestawu do oznaczania triglicerydów w surowicy.
   1. Dodać 40 ml diH₂O do wolnego odczynnika glicerolu z zestawu i wymieszać przez odwrócenie butelki.
   2. Dodać 10 ml diH₂O do roztworu triglicerydów z zestawu i wymieszać, odwracając butelkę.
   3. Połączyć odczynnik glicerolu i roztwór triglicerydów i wymieszać, odwracając, aby przygotować roztwór roboczy triglicerolu.
      UWAGA: Roztwór roboczy triglicerolu jest dobry przez 60 dni i może wykonać cztery 96-dołkowe testy płytkowe na zestaw przy użyciu poniższego protokołu. Użyte objętości są proporcjonalnie zmniejszone w stosunku do oficjalnego zestawu do oznaczania triglicerydów w surowicy do stosowania w formacie płytki 96-dołkowej.
3. Sprawdzić ślepą próbę i wzorce, ostrożnie pipetując 5 μl każdego wzorca do 96-dołkowej, płaskodennej, przezroczystej mikropłytki w trzech kroplach (lub czterokrotnie w przypadku ślepej próby).
   1. Dodaj dokładnie 125 μl roztworu roboczego triglicerolu do każdej studzienki zawierającej wzorzec. Pozwól roztworom zareagować przez 30 minut.
   2. Umieścić 96-dołkową płytkę w spektrofotometrze i odczytać absorbancję przy 540 nm. Użyj pomiarów absorbancji, aby utworzyć krzywą wzorcową i zweryfikować dokładność wzorców, oceniając wartość R². Jeśli R² dla norm jest mniejsze niż 0,98, należy ponownie przygotować wzorce bardziej ostrożnie.
4. Rozpocznij dzień 1 testu do przechowywania triglicerydów¹⁴ przy użyciu probówek mikrowirówkowych zawierających 10 zamrożonych much każda.
   UWAGA: Na tym etapie nigdy nie należy używać pipety wielokrotnej lub wielokanałowej, ponieważ ilości każdego odczynnika użytego w teście muszą być bardzo dokładne i spójne, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Z naszego doświadczenia wynika, że pipety wielokrotne i wielokanałowe nie mają takiego stopnia dokładności i spójności. Każda porcja z pipety jednokanałowej może zostać wizualnie potwierdzona przez eksperymentatora w celu kontroli jakości, a wszelkie odchylenia specyficzne dla pipet jednokanałowych będą odczuwane przez wszystkie próbki w tym samym stopniu.
   1. Przygotować 200 ml buforu homogenizacyjnego, łącząc 0,272 g KH₂PO₄, 400 μl 0,5 M EDTA i 199,6 ml diH₂O w szklanej butelce.
   2. Dodać dokładnie 100 μl buforu homogenizacyjnego do każdej z 40 probówek do mikrowirówek zawierających 10 dorosłych osobników zamrożonych po teście wspinaczkowym. Następnie odwiruj próbki przez 30 s przy 18 000 g.
   3. Zmiel muchy za pomocą zmotoryzowanego młynka i tłuczka (lub innej formy homogenizacji tkanek), aby przygotować mleczny roztwór. Upewnij się, że do każdej próbki używany jest świeży tłuczek. Następnie odwirować próbki przez 2 minuty przy 18 000 g.
   4. Tylko górne 75 μl cieczy sklarowanej nad osadem z każdej probówki należy pobrać pipetą do nowych probówek do mikrowirówek. Upewnij się, że żadne kawałki muchy z granulki nie zostały przeniesione. Umieść nowe probówki w lodówce na noc.
5. Rozpocznij dzień 2 protokołu trójglicerydowego od wyjęcia próbek z dnia 1 z lodówki.
   UWAGA: Krok 5.5 można wykonać tego samego dnia co 5.4, ale stwierdziliśmy, że sygnał stężenia trójglicerydów jest silniejszy po nocy spędzonej w lodówce. Jednak czas pomiędzy krokami 5.4 i 5.5 nie powinien przekraczać 36 godzin.
   1. (Opcjonalnie) Wirować pierwszą probówkę z płynem supernatantowym przez 10 s i pipetować 5 μl do czystej probówki do mikrowirówki. Dodać 95 μl 0,15 M NaCl do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj te podpróbki w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego oznaczenia białka, jeśli jest to pożądane.
      UWAGA: Te próbki supernatantu z dodatkiem roztworu NaCl można wykorzystać do określenia zawartości białka przy użyciu preferowanego przez badacza testu. Używamy metody Bradforda²⁴. Zawartość białka jest jednym ze sposobów standaryzacji miary zawartości trójglicerydów, ale badacz powinien również zachować ostrożność w interpretacji tych proporcji, ponieważ ćwiczenia i dieta mogą również wpływać na magazynowanie białka.
   2. W przypadku oryginalnych fiolek z supernatantem należy wirować pierwszą probówkę z płynem supernatantowym przez 10 s, a następnie pipetować 5 μl do dwóch oddzielnych dołków 96-dołkowej mikropłytki w celu uzyskania kontrprób technicznych. Pamiętaj, aby zanotować, które studzienki są używane dla każdej próbki. Powtórz ten krok dla pozostałych 39 probówek.
   3. Odpipetować dokładnie 5 μl ślepej próby do czterech dołków mikropłytki, a w przypadku pozostałych dołków odpipetować dokładnie 5 μl każdego wzorca w trzech powtórzeniach.
   4. Do każdego dołka dodać dokładnie 125 μl roztworu roboczego triglicerolu i pozostawić roztwór do reakcji przez 30 minut.
   5. Umieścić 96-dołkową płytkę w spektrofotometrze i odczytać absorbancję przy 540 nm.
   6. Przelicz wartości absorbancji na stężenie (mg/ml) za pomocą krzywej wzorcowej obliczonej na podstawie wzorców.

Results

Jesteśmy szczególnie zainteresowani identyfikacją czynników, które przyczyniają się do ogólnego zdrowia metabolicznego danej osoby. Wcześniej stwierdzono, że interakcje między genotypem a dietą w znacznym stopniu przyczyniają się do zmienności cech metabolicznych na poziomie populacji¹⁴. Oznacza to, że każdy genotyp reaguje na różnice środowiskowe w unikalny i złożony sposób. Aby rozszerzyć nasze prace nad wpływem genotypu przez środowisko o ćwiczenia fizyczne, opracowaliśmy TreadWheel, który jest w stanie wystawić dużą liczbę genotypów na aerobowy trening interwałowy (AIT) w sposób wysokoprzepustowy.

Aby ustalić, czy ćwiczenia na TW wpływają na cechy metaboliczne, zmierzyliśmy magazynowanie trójglicerydów u muszek Oregon-R (OreR) i y¹w¹, popularnych muchówek typu dzikiego (Rysunek 2B–C), i znormalizowaliśmy te wartości w stosunku do stężenia białka u muszek, jak pierwotnie opisano w Mendez et al.¹¹. Przeanalizowaliśmy dane za pomocą wielowymiarowej analizy wariancji (MANOVA) uwzględniającej genotyp, płeć, leczenie ćwiczeniami (i ich interakcje) oraz eksperymentalne efekty blokowe, takie jak powtórzenia czasowe i fiolka z jedzeniem, i stwierdziliśmy, że istnieje znacząca interakcja genotypu przez ćwiczenie (p = 0,0017) wpływająca na magazynowanie trójglicerydów. Stwierdzono znaczący efekt dymorficzny płciowy między samcami i samicami, przy czym samce magazynowały więcej trójglicerydów niż samice (p < 0,0001). Zaobserwowaliśmy, że u samic ćwiczone muchy miały znacznie niższy poziom trójglicerydów niż ich niećwiczone odpowiedniki (Rysunek 2B, p <0,0001). U samców, podczas gdy spadek magazynowania trójglicerydów obserwowany u muszek ćwiczonych Oregon-R (w porównaniu z kontrolą) nie był statystycznie istotny, istotną różnicę w magazynowaniu trójglicerydów zaobserwowano między dwiema oddzielnymi liniami (Rysunek 2C, p <0,0001). Należy zauważyć, że podczas gdy standaryzacja stężenia trójglicerydów w stosunku do stężenia białka zapewnia wgląd w ogólne proporcje składu ciała muchy, porównanie bezpośredniego stężenia trójglicerydów lub białka między różnymi grupami much może również dostarczyć szczegółowych informacji na temat wpływu ćwiczeń na te fenotypy indywidualnie.

Ponieważ wykazano, że zmienne takie jak ćwiczenia dorosłych, płeć i genotyp wpływają na magazynowanie trójglicerydów, spodziewano się, że czynniki te wpływają również na inne fenotypy i wchodzą w interakcje z dietą. Wyhodowaliśmy larwy z reprezentatywnej linii Drosophila Genetic Reference Panel typu dzikiego (DGRP 153)²⁵ na diecie wysokotłuszczowej lub normalnej i wywołaliśmy ćwiczenia u dorosłych much przez jeden tydzień (Rysunek 2A). Następnie przeprowadziliśmy ujemny test geotaksji podobny do RING, aby zmierzyć zdolność do wspinania się. Zastosowany test wspinaczkowy różnił się od standardowego testu RING; zamiast aparatu RING, do przetrzymywania much podczas testu użyto fiolek z folią parafinową zakrywającą otwory. Inne aspekty oryginalnego testu RING, takie jak czas między stukaniem muszek o dno fiolki a zrobieniem zdjęcia, zostały zachowane²².

Wszystkie zabiegi powtórzono trzy razy, z minimum 59 pojedynczymi muchami na powtórzenie i leczenie. Dane zostały przeanalizowane przez MANOVA z uwzględnieniem diety, genotypu, płci, leczenia ruchowego (i ich interakcji), a także eksperymentalnych efektów blokowych powtórzenia w czasie, fiolki testowej i repliki testu fiolki. Odkryliśmy, że ćwiczące samice wspinały się znacznie wyżej (p <0,005), gdy były hodowane na diecie wysokotłuszczowej niż jakakolwiek inna kuracja żeńska (Rysunek 2D). W przypadku samców zaobserwowano, że ćwiczenia poprawiły wspinaczkę tylko wtedy, gdy mężczyźni byli wychowywani na normalnej diecie, a ci wychowani na diecie wysokotłuszczowej nie wykazywali znaczącej zmiany (Rysunek 2E). Stwierdziliśmy również znaczące efekty dymorficzne płciowo (p <0,0001) we wspinaczce, w której samce wspinają się wyżej niż kobiety. Zaskakujący wynik spadku wydajności wspinaczkowej po wysiłku fizycznym dla kobiet z linii DGRP 153 (Rysunek 2D) dla kobiet spożywających normalną dietę (p <0,0001) jest przykładem tego, że ten rodzaj ćwiczeń może nie być jednolicie pozytywną interwencją dla wszystkich genotypów i może być zależny od innych czynników środowiskowych. W Mendez i wsp.¹¹, samice z czterech innych linii genetycznych testowane pod kątem ich wydajności wspinaczkowej po wychowaniu na normalnej diecie wykazały zwiększoną zdolność wspinania się dzięki treningowi ćwiczeń. Sugeruje to, że odpowiedź zaobserwowana w DGRP 153 jest specyficzna dla genotypu, a nie jest ogólną właściwością leczenia TW wysiłkiem fizycznym. Zmienność odpowiedzi w grupach leczonych płcią, dietą i ćwiczeniami wskazuje, że istnieją znaczące interakcje między płcią a dietą i ćwiczeniami, które wpływają na zdolność wspinania się linii (p <0,0001).

Podsumowując, wyniki wskazują, że wpływ ćwiczeń na zdrowie metaboliczne dorosłej muchy może być funkcją jej płci, genotypu i diety larwalnej. Zmienność fenotypowa obserwowana w odpowiedzi na genotyp, zmienne środowiskowe (np. dieta i ćwiczenia) oraz płeć została również zaobserwowana w innych badaniach^11,12,14,15. Tak więc TW i Drosophila mogą być potężną strategią wyjaśniania czynników genetycznych i środowiskowych kształtujących zdrowie metaboliczne.

Rysunek 1: Maszyna do ćwiczeń TreadWheel. (A) Maszyna mieści 48 fiolek i posiada funkcję regulacji prędkości. Tutaj eksperymenty prowadzono przy 4 obr./min. (B) Pojedyncze fiolki z żywnością zawierające eksperymentalne muchy zostały zatrzaśnięte w nawiasach przymocowanych do obracającej się osi. (C) Odległość między zatyczką fiolki a jedzeniem wynosiła 6 cm dla fiolek do ćwiczeń i 1 cm dla fiolek kontrolnych. Fiolki zostały następnie umieszczone na maszynie w celu ćwiczeń. (D) 5-dniowy reżim ćwiczeń odwróconej piramidy został wykorzystany do ćwiczenia dorosłych much. Każdego dnia do jednego z ćwiczeń dodawano dodatkowe pięć minut, aby stopniowo zwiększać intensywność ćwiczeń, co modeluje wytrzymałość i trening interwałowy. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Mendez i wsp.¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metody wizualne i reprezentatywne wyniki. (A) Metody testowania wpływu diety larw na aktywność fizyczną dorosłych. Larwy były hodowane na diecie wysokotłuszczowej lub normalnej diecie laboratoryjnej i przestawiane na normalny pokarm po eclosion. Dorosłe muchy zostały oddzielone według płci, umieszczone w grupach eksperymentalnych i ćwiczone przez pięć kolejnych dni. Następnie przeprowadzono podobny do RING-owego negatywny test geotaksji wspinaczkowej, a muchy zamrożono w celu pomiaru trójglicerydów. Reprezentatywne dane dotyczące triglicerydów przedstawiono dla dwóch linii genetycznych, Oregon R i y¹w¹ dla (B) kobiet i (C) mężczyzn. Wszystkie muchy były hodowane na normalnej diecie i ćwiczyły w wieku dorosłym. Poziomy z różnymi literami znacznie się różnią (p <0,05) przy użyciu testu t-hoc Studenta. Rysunek ten zawiera podzbiór danych zgłoszonych w Mendez i wsp.¹¹. Reprezentatywne dane wspinaczkowe są pokazane dla linii DGRP 153 dla (D) kobiet i (E) mężczyzn. Każdy punkt reprezentuje uśrednioną wydajność wspinaczkową 232 lub więcej osób w trzech niezależnych punktach czasowych. Słupki błędów wskazują jeden błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Szczegółowy schemat koła bieżnika. (A) Schemat konstrukcji podwójnego zacisku na fiolkę używanej do mocowania fiolek do urządzenia. (B) Widok wnętrza obrotowego układu napędowego maszyny. (C) Równoległy rzut przedniej powierzchni maszyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik kodu uzupełniającego: TreadWheel.skp Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Wykazano, że opisany tutaj protokół ćwiczeń skutecznie stymuluje łagodne ćwiczenia u Drosophila i może być stosowany do symulacji ćwiczeń wytrzymałościowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych¹¹. Należy zauważyć, że opracowując początkowo koncepcję TreadWheel, braliśmy pod uwagę produkty komercyjne, które mogą zostać zmodyfikowane tak, aby działały podobnie (np. rożen laboratoryjny). Jednak ostatecznie odrzuciliśmy to podejście, decydując się na projekt niestandardowy, ponieważ sprzęt komercyjny nie miał wystarczająco niskiej prędkości obrotowej (4 obr./min) i nie miał wystarczającej pojemności fiolki do generowania próbek o dużej przepustowości.

Sam protokół TW może być dostosowany tak, aby obejmował szeroki zakres tematów badawczych. Na przykład dostosowanie częstotliwości i czasu trwania reżimów ćwiczeń much może zmienić intensywność ćwiczeń, które otrzymują. Rozszerzając protokół na okres dłuższy niż jeden tydzień lub na inne grupy wiekowe, możliwe byłoby zbadanie wpływu ćwiczeń na starzenie się i różne choroby związane z wiekiem. Zalecamy, aby w przypadku wdrożenia rozszerzonego podejścia do ćwiczeń dodać co najmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu, aby umożliwić regenerację. Wykazano, że wydajność i poprawa były większe w reżimach, które obejmowały dzień regeneracji, niż w tych, w których stosowano następujące po sobie codzienne ćwiczenia¹². Ostrzegamy również przed przedłużaniem ćwiczeń powyżej 30 minut, ponieważ przyzwyczajenie się do ruchu rotacyjnego może nastąpić po długich okresach ciągłych ćwiczeń¹¹. Zaobserwowaliśmy również genetyczne różnice w motywacji much do utrzymania poziomu aktywności na TW¹¹. Tak więc, jeśli pożądane są dłuższe ataki, rozważ monitorowanie poziomu aktywności much, jak to przedstawili Watanabe i Riddle^15,21 opisując ich modyfikację koncepcji TW. Inne czynniki, które mogą być zróżnicowane, to temperatura i wzorce snu i czuwania, które, jak wykazano, również wpływają na ruchy much^26,27.

Istnieje mnóstwo dostępnych analiz w trakcie i po zakończeniu protokołu, które dotyczą skutków ćwiczeń na poziomie fizjologicznym, behawioralnym i molekularnym, a także potencjału do rozwikłania epigenetycznych skutków ćwiczeń. Dodatkowe testy metaboliczne (np. glukoza, glikogen i białko), wydolność serca i miary odpowiedzi zapalnej mogą być wykorzystane do dalszego zbadania wpływu ćwiczeń na fizjologię much i skład ciała 12,14,24,28. Różne zmiany behawioralne związane z indukcją ćwiczeń, takie jak zmiany w zachowaniach żywieniowych, aktywności lokomotorycznej i śnie, można również zmierzyć za pomocą narzędzi takich jak test CAFE²⁹ lub urządzenia do monitorowania aktywności 12,15,30. Zmiany w ekspresji genów i oddychaniu komórkowym przypisywane ćwiczeniom można również określić ilościowo za pomocą metod takich jak qRT-PCR¹¹ i respirometria³¹. Wreszcie, Drosophila mają do dyspozycji cenne zasoby genetyczne, takie jak Drosophila Genetics Reference Panel 2 i Drosophila Synthetic Population Resource, które zapewniają naukowcom platformę do przeprowadzania ilościowych badań genetycznych^25,32. Narzędzia te umożliwiają eksperymenty mapowania, takie jak badania asocjacyjne całego genomu i mapowanie loci cech ilościowych, w celu identyfikacji potencjalnych loci związanych z ćwiczeniami i dietą.

Badania przeprowadzone przy użyciu TreadWheel wykazały, że ćwiczenia średnio zmniejszają masę ciała, całkowite magazynowanie trójglicerydów i glikogen, jednocześnie zwiększając zawartość białka^{i wydajność} wspinaczkową. Ponadto stwierdzono różne reakcje na ćwiczenia u różnych płci i genotypów pod względem masy ciała, a także trójglicerydów, białka, glikogenu, glukozy i poziomów aktywności^11,15. Chociaż zmienność reakcji na ćwiczenia i dietę w zależności od genotypów i płci może być trudna do zinterpretowania, a czasami sprzeczna z intuicją, odzwierciedla źródła rzeczywistej zmienności biologicznej obserwowanej w naturalnych populacjach. Ponieważ staramy się zrozumieć różnorodność czynników przyczyniających się do wysokich wskaźników MetS, narzędzia, które ułatwiają rozwikłanie względnej roli różnych czynników przyczyniających się do tego poprzez testowanie tych czynników w organizmach modelowych, będą miały kluczowe znaczenie dla naszej zdolności do opracowania spersonalizowanych interwencji w zakresie profilaktyki i leczenia. Aby w pełni ocenić skuteczność ćwiczeń, każdy z tych czynników i sposób ich interakcji musi być brany pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentów i formułowania wniosków.

TW, podobnie jak większość innych maszyn do ćwiczeń much, ma ograniczoną zdolność do ilościowego określania ruchu muchy. Niedawno Watanabe i Riddle opracowali Rotary Exercise Quantification System (REQS), szkielet TW zmodyfikowany za pomocą jednostki monitorującej aktywność (LAM25H) z serii Drosophila Monitoring System^15,21. Podobnie jak TW, system ten wykorzystuje ruch obrotowy do delikatnego wywoływania ćwiczeń podczas używania ramienia LAM25H do śledzenia i ilościowego określania aktywności much, ale mieści mniejszą liczbę fiolek (32 fiolki) niż TW¹⁵. W przypadku wysokoprzepustowych badań wysiłkowych, jeśli kwantyfikacja aktywności nie jest konieczna lub pożądana, TW pozwala na większą liczbę próby. Konstrukcja TW może być również zmodyfikowana w stosunku do obecnej formy, aby pomieścić większą liczbę fiolek. System ten, wraz z innymi istniejącymi metodami ćwiczeń, pomógł ustalić, że ćwiczenia są nie tylko osiągalne u Drosophila, ale mogą być również badane w celu określenia wpływu aktywności fizycznej na różne reakcje fizjologiczne i molekularne 11,12,15. Tak więc TW, jako sprawdzona metoda wywoływania delikatnych ćwiczeń u much, może być używana do badania wielu różnych pytań biologicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< mocny> Materiały do budowy TreadWheel: < / strong>
Heavy Duty Tłumienie drgań Mocowanie	McMaster-Carr	60855K71	Ilość: 4
Łożysko kulkowe ze stali nierdzewnej	McMaster-Carr	57155K306	Ilość: 8
Transformator napięcia wtykowego (wejście 500MA, 120VAC, wyjście 24 VAC)	McMaster-Carr	70235K16	Ilość: 1
Kompaktowy motoreduktor prądu stałego z kwadratową powierzchnią	McMaster-Carr	6409K23	Ilość: 1
Uchwyt narzędziowy (zaciski)	McMaster-Carr	1723A22	Ilość: 5 (10x)
12L14 Pręt o wąskiej tolerancji ze stali węglowej	McMaster-Carr	5227T24	Ilość: 1
Zestaw kołnierza wału	McMaster-Carr	6432K13	Ilość: 8
Okrągłe koło	pasoweMcMaster-Carr	6284K51	Ilość: 5
Sterowanie strzałkami – 25 Max RPM, Elektryczny silnik prądu stałego	AC McMaster-Carr	13DV 1A	Ilość: 1
Materiały do konserwacji i hodowli much
6 uncji Butelki z kwadratowym dnem (polipropylen)	Genesee Scientific	32-130	Ilość: 1
szalki Petriego 35x10mm	VWR	82050-536	Ilość: 1
Wąskie fiolki Drosophila	Genesee Scientific	32-116	Ilość: 1
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	Ilość: 1
Pistolet pneumatyczny, Mini	Genesee Scientific	54-104	Ilość: 1
Materiały do testu RING-like Oprogramowanie: < / strong>
ImageJ oprogramowanie	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	Ilość: 1
1 cM papier milimetrowy lub siatka ciągniona (co najmniej 20 cM na 30 cm)	Różna		ilość: 1
aparat cyfrowy z timerem lub smartfon z aplikacją do pomiaru czasu aparatu	różne		Ilość: 1
< mocny>Materiały do oznaczania trójglicerydów: < / silny>
Dewar Flask	VWR	14200-960	Ilość: 1
Zestaw do oznaczania trójglicerydów w surowicy	Sigma Aldrich	TRO100	Ilość: 1
Silnik tłuczka akumulatorowego	VWR	47747-370	Ilość: 1
Tłuczek	VWR	47747-358	Ilość: 1