Artykuł metodologiczny

TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57788

⸱

8 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

TreadWheel wykorzystuje ruch obrotowy, aby delikatnie wywołać ćwiczenia u dorosłych Drosophila melanogaster, wykorzystując wrodzoną, negatywną geotaksję much. Pozwala na analizę interakcji między ćwiczeniami a czynnikami, takimi jak genotyp, płeć i dieta, oraz ich wpływu na testy fizjologiczne i molekularne w celu oceny zdrowia metabolicznego.

Streszczenie

Częstość występowania złożonych chorób metabolicznych wzrosła w wyniku powszechnego przejścia na styl życia o zwiększonym spożyciu kalorii i obniżonym poziomie aktywności. Te wieloczynnikowe choroby wynikają z połączenia czynników genetycznych, środowiskowych i behawioralnych. Jedną z takich złożonych chorób jest zespół metaboliczny (MetS), który jest zbiorem zaburzeń metabolicznych, w tym nadciśnieniem, hiperglikemią i otyłością brzuszną. Ćwiczenia i interwencja dietetyczna są podstawowymi metodami leczenia zalecanymi przez lekarzy w celu złagodzenia otyłości i jej późniejszych chorób metabolicznych. Interwencja ruchowa, w szczególności aerobowy trening interwałowy, stymuluje korzystne zmiany w powszechnych czynnikach ryzyka cukrzycy typu 2 (T2DM), chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i innych schorzeń. Wraz z napływem dowodów opisujących terapeutyczny wpływ ćwiczeń na zdrowie metaboliczne, ustanowienie systemu, który modeluje ćwiczenia w kontrolowanych warunkach, stanowi cenne narzędzie do oceny efektów ćwiczeń w kontekście eksperymentalnym. Drosophila melanogaster jest doskonałym narzędziem do badania zmian fizjologicznych i molekularnych, które wynikają z interwencji ruchowej. Muchy mają krótką żywotność i podobne mechanizmy metabolizowania składników odżywczych w porównaniu z ludźmi. Aby skłonić muchę do ćwiczeń, opracowaliśmy maszynę o nazwie TreadWheel, która wykorzystuje wrodzoną, negatywną tendencję muchy do geotaksji, aby delikatnie skłonić ją do wspinaczki. Umożliwia to naukowcom przeprowadzanie eksperymentów na dużych kohortach genetycznie zróżnicowanych muszek, aby lepiej zrozumieć interakcje między genotypem a środowiskiem, leżące u podstaw wpływu ćwiczeń na zdrowie metaboliczne.

Wprowadzenie

Otyłość u dzieci i dorosłych to coraz częstsze epidemie w kulturach, które spożywają wysokokaloryczne diety i pozostają bezczynne przez dłuższy czas, co może prowadzić do poważnych długoterminowych konsekwencji, w tym insulinooporności, przewlekłego stanu zapalnego i choroby zwyrodnieniowej stawów1,2,3,4. Częstość występowania tych zaburzeń stale rośnie z powodu rosnącej nierównowagi w spożyciu i wydatkach kalorycznych przypisywanej zwiększonemu spożyciu tłuszczów i cukrów oraz głównie siedzącemu trybowi życia5. W związku z tym ta nierównowaga energetyczna doprowadziła do wzrostu liczby przypadków cukrzycy typu 2 (T2DM) i chorób sercowo-naczyniowych (CVD)5. Osoby są bardziej narażone na rozwój obu zaburzeń, jeśli zdiagnozowano u nich zaburzenie Zespół Metaboliczny (MetS), którego objawy obejmują otyłość brzuszną i dyslipidemię2. MetS jest kształtowany przez złożone interakcje między genotypem a różnymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak dieta i ćwiczenia6. Dlatego, aby w pełni zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tej złożonej choroby, należy wziąć pod uwagę wszystkie te czynniki.

Jeśli chodzi o zwalczanie MetS, lekarze najpierw zalecają przejście na zmiany stylu życia, które obejmują zdrową, dobrze zbilansowaną dietę i aktywność fizyczną2,7,8. Ponieważ skuteczne leki są ograniczone, a operacja pomostowania żołądka jest kosztowna i wymaga monitorowania medycznego przez całe życie, interwencja farmakologiczna i chirurgiczna jest zalecana tylko w ciężkich przypadkach i tylko w połączeniu z tymi zmianami stylu życia3,7,8. Podczas gdy interwencje związane ze stylem życia, takie jak ćwiczenia i dieta, mogą przynieść i utrzymać długoterminowe cele związane z utratą wagi, to, czy te środki naprawcze mogą w pełni złagodzić negatywne skutki związane z MetS, wymaga dalszych badań7,8.

Modele mysie od lat są wykorzystywane do badania wpływu ćwiczeń na choroby metaboliczne; jednak wprowadzenie ćwiczeń do badań nad lotami na MetS jest stosunkowo nowym przedsięwzięciem9,10,11,12. Muchy stanowią idealne narzędzie do badania ćwiczeń w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, ponieważ łatwo nimi manipulować, mają krótką żywotność, są niedrogie w utrzymaniu, a szlaki metaboliczne związane z energią są wysoce konserwatywne między Drosophila a ludźmi13. Genomy D. melanogaster są dobrze scharakteryzowane, a istnieje wiele narzędzi genetycznych dostępnych do wykorzystania u Drosophila, które mogą dostarczyć wglądu w różne genotypy i interakcje genotyp w zależności od środowiska, które mogą modulować wpływ ćwiczeń na zdrowie organizmu14.

Obecne metody treningu Drosophila wywołują wrodzoną, negatywną skłonność muchy do geotaksji, instynkt behawioralny do wspinania się w górę, aby stymulować wspinanie się u dorosłych w ich zagrodach11,12,15. Power Tower, jedna z metod stymulowania ćwiczeń u much, systematycznie podnosi obudowy much w pionie, a następnie upuszcza je z powrotem na powierzchnię ławki, skutecznie powalając muchy na dno fiolki, wywołując w ten sposób ich instynktowną negatywną geotaksję12,16. Eksperymenty przeprowadzone przy użyciu tej maszyny wykazały, że ćwiczenia są silnym czynnikiem ochronnym przed wieloma chorobami związanymi z wiekiem, w tym CVD i T2DM, oraz promują zdrowe starzenie się12,17,18. W szczególności wykazali, że ćwiczenia mogą zmniejszyć wystąpienie związanego z wiekiem spadku mobilności u much i poprawić wiele objawów związanych z wiekiem, takich jak wydolność serca i reakcja na stres17,18. Jednak muchy kontrolne, które nigdy nie zostały umieszczone na wieży, wykazywały wyższe wyniki wspinaczki niż te, które doświadczyły maszyny, co sugeruje, że siła powtarzających się spadków może ranić muchy i wpływać na mobilność12. Sugeruje to, że alternatywna metoda wywoływania ćwiczeń, która jest mniej forsowna i unika powodowania urazów fizycznych, byłaby użyteczną, uzupełniającą metodą protokołu Power Tower16.

Aby delikatnie zachęcić do ćwiczeń u Drosophila, opracowaliśmy maszynę do ćwiczeń o nazwie TreadWheel (Rysunek 1). Ruch obrotowy TreadWheel (odtąd w skrócie TW) wyzwala wrodzoną, negatywną tendencję muchówek do geotaksji poprzez ciągłe redefiniowanie grawitacyjnej górnej części fiolek, co z kolei stymuluje wspinanie się much. W przeciwieństwie do innych metod, ruch obrotowy TW jest z natury łagodny, co minimalizuje liczbę dodatkowych stresorów, które mogą wystąpić i wpłynąć na wyniki. W ten sposób maszyna zapewnia środki do wywoływania ćwiczeń u dużej liczby much bez wywoływania stresu, co umożliwi naukowcom badanie wpływu ćwiczeń na zdrowie metaboliczne (Rysunek 2), starzenie się, sen i wiele innych tematów11.

Nasza metoda opiera się na odwrotnym piramidalnym, interwałowym protokole treningowym, który w dużej mierze łączy aspekty aerobowego treningu interwałowego (AIT) z treningiem wytrzymałościowym. Standardowy reżim AIT został zmieniony w tym protokole, aby stopniowo wydłużać czas trwania każdego interwału w okresie pięciu dni, aby promować wytrzymałość. AIT okazał się szczególnie przydatny w zapobieganiu MetS w porównaniu z innymi metodami interwencji i był bardziej skuteczny w odwracaniu typowych czynników ryzyka zespołu metabolicznego niż ciągłe umiarkowane ćwiczenia19,20. Jednak wadą TW w stosunku do Power Tower jest to, że muchy szybciej przyzwyczajają się do ruchu obrotowego, więc różnice we wrodzonej tendencji do przyzwyczajania się wśród much mogą komplikować interpretację korzyści płynących z ćwiczeń. 11 Eleganckie rozwiązanie tego ograniczenia jest opisane przez Watanabe i Riddle15 oraz ich uzupełniający artykuł21.

Protokół

1. Konfiguracja i obsługa TreadWheel

UWAGA: Zobacz Rysunek Uzupełniający 1, aby zapoznać się ze schematami budowy maszyn do ćwiczeń TW. Wymagane części są wymienione w Tabeli materiałów. Wyrażenia "TW", "TreadWheel", "maszyna do ćwiczeń" i "maszyna" są używane zamiennie w całym protokole.

  1. Skalibruj silnik za pomocą wyłącznika zasilania tak, aby pełny okres obrotu wynosił 15 s (4 obr./min). Skalibruj prędkość obrotową maszyny przed umieszczeniem fiolek muchowych w zabezpieczonych zaciskach przymocowanych do obracających się ramion.
    1. Dostosuj prędkość za pomocą standardowego stopera i nieruchomego przedmiotu tymczasowo przymocowanego do maszyny, takiego jak mały pędzel przyklejony do pokrywy silnika, tak aby szczotka dotykała tylko jednego z obracających się wsporników. Zmierz czas liczby obrotów w ciągu jednej minuty, używając nieruchomego obiektu jako punktu odniesienia i dostosuj prędkość, aby osiągnąć okres obrotu 15 s (4 obr./min).

2. Zbieranie i konserwacja much

UWAGA: Wszystkie muchy są trzymane w inkubatorze o temperaturze 25 °C z wilgotnością 50% i 12-godzinnym cyklem światło/ciemność pomiędzy manipulacjami na stole opisanymi poniżej. Muchy są karmione standardową dietą laboratoryjną z mąki kukurydzianej i melasy, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotuj komory niosek dla każdego interesującego Cię genotypu, używając płytek agarowych z sokiem jabłkowym, kropli pasty drożdżowej na talerz i 6 uncji plastikowych butelek do zbierania jaj, z których wyklują się larwy.
    1. Aby przygotować talerze agarowe z sokiem jabłkowym, wypełnij szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm w 3/4 objętości 3% agarem rozpuszczonym w kupionym w sklepie soku jabłkowym. Zestalone talerze przechowuj w lodówce do czasu użycia.
    2. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml połącz kupione w sklepie aktywne suche drożdże z wodą destylowaną w proporcji 2 ml wody na każdy gram drożdży. Wymieszaj drożdże z wodą, aby uzyskać pastę o konsystencji ketchupu za pomocą szklanego pręta do mieszania. W razie potrzeby dostosuj proporcje drożdży i wody, aby uzyskać pożądaną konsystencję.
    3. Przechowuj pastę drożdżową w lodówce między użyciami. Trzymaj nasadkę rurki luźno, aby umożliwić odgazowanie.
    4. Użyj ostrej igły lub noża, aby wybić małe otwory w butelkach o kwadratowym dnie o pojemności 6 uncji (polipropylen) jako otwory wentylacyjne dla komór do układania.
    5. Nałóż małą plamkę pasty drożdżowej (o średnicy ~3 mm) na każdy talerz agarowy z sokiem jabłkowym.
  2. Umieść dorosłe muchy o pożądanym genotypie w butelce o pojemności 6 uncji i butelce z nakrętką z płytką agarową z sokiem jabłkowym. Przymocuj talerz do butelki za pomocą gumek. Odwróć i umieść w inkubatorze, aby umożliwić dorosłym osobom składanie jaj.
  3. Zmieniaj talerze agarowe z sokiem jabłkowym w komorze do układania dwa razy dziennie (rano i wieczorem). Pozostaw zużyte płytki w inkubatorze na kolejne 12–24 godziny, aby umożliwić wyklucie się pierwszych larw w stadium rozwojowym.
  4. Zbierz pierwsze larwy w stadium rozwojowym za pomocą cienkiego pędzla lub szpikulca (elastyczna cienka igła przymocowana do uchwytu). Umieść 50 larw pierwszego stadium rozwojowego o określonym genotypie na fiolce z pokarmem o pożądanym eksperymentalnym typie pokarmu, aby rozwinąć i zakończyć metamorfozę podczas trzymania w inkubatorze (Rysunek 2A).
  5. Zbierz dorosłych na zabieg fizyczny (Rysunek 2A).
    1. Po przepoczwarzeniu należy zebrać poczwarki małym, wilgotnym pędzlem i umieścić w pustych fiolkach przed eklozją, aby zapobiec narażeniu dorosłych much na pokarm larwalny.
    2. Przenieś dorosłe muchy do fiolek z jedzeniem standardowej diety laboratoryjnej, gdy się zamykają. Od jednego do pięciu dni po ekleksji oddzielne muchy na podstawie płci.
  6. Wyznacz po połowie zebranych dorosłych do grupy eksperymentalnej i kontrolnej. Utrzymuj muchy w fiolkach standardowej diety laboratoryjnej w stężeniu 50 much na fiolkę.
  7. Przenoś dorosłe osoby do fiolek ze świeżą żywnością co dwa dni, aby zapobiec utknięciu podczas ćwiczeń. Dodaj kilka ziaren dodatkowych żywych drożdży do nowego pokarmu bezpośrednio przed wprowadzeniem much.
    UWAGA: Chociaż możliwe jest utrzymanie much bez suplementu żywych drożdży, odkryliśmy, że dorosłe muchy najlepiej radzą sobie z suplementacją. Suplementacja żywymi drożdżami jest zmienną, którą można zmodyfikować w celu dopasowania do celów eksperymentalnych badacza.

3. Protokół ćwiczeń

  1. W pierwszym dniu ćwiczeń (Dzień 1) wciśnij zatyczki fiolek, aby pozostawić 1 cm wolnej przestrzeni w fiolkach kontrolnych i 6 cm przestrzeni między jedzeniem a fiolkami z wkładem do ćwiczeń (Ryc. 1C).
    UWAGA: Fiolki kontrolne będą miały ograniczoną przestrzeń dla much do poruszania się na maszynie do ćwiczeń, a zatem muchy będą się angażować w znacznie mniejszy ruch niż w fiolkach do ćwiczeń.
  2. Umieść fiolki w zaciskach, a następnie daj muchom 10 minut na aklimatyzację na maszynie (Rysunek 1B).
    UWAGA: Alternatywnym sterowaniem jest utrzymanie niećwiczonych much na blacie przylegającym do maszyny do ćwiczeń z 6 cm wolnej przestrzeni (w fiolce), aby mogły się normalnie poruszać. Znaleziono podobne wyniki ćwiczeń w odniesieniu zarówno do kontrolek "1 cm na TreadWheel", jak i "6 cm na blacie"11.
  3. Traktuj zarówno muchy kontrolne, jak i ćwiczeniowe do rotacji na maszynie w stałej temperaturze pokojowej przez 5 kolejnych dni w tygodniu z naprzemiennymi napadami rotacji i odpoczynku (Rysunek 1D).
    UWAGA: Potrzebna jest stała temperatura, aby uniknąć mylącego wpływu temperatury na poziom aktywności. W przypadku badań nad manipulacją temperaturą, umieść TW w inkubatorze, aby zmodyfikować leczenie temperaturą podczas treningu fizycznego.
    1. Uruchom maszynę na cztery 15-minutowe ćwiczenia w dniu 1. Przeplataj te walki z 5-minutowymi okresami odpoczynku.
    2. Każdego z kolejnych dni dodaj 5 minut ćwiczeń do jednego z istniejących wcześniej ćwiczeń. Na przykład w dniu 2 wykonaj pierwsze ćwiczenie o długości 20 minut, ale pozostałe ćwiczenia utrzymuj na poziomie 15 minut.
    3. W dniu 3 ćwiczenia trwają 20 minut podczas pierwszych dwóch ataków i 15 minut podczas kolejnych dwóch walk.
    4. W dniu 4 stosuj 20-minutowe ataki ćwiczeń we wszystkich przypadkach z wyjątkiem finałowej, która powinna trwać tylko 15 minut.
    5. W dniu 5 utrzymuj wszystkie ćwiczenia trwające 20 minut.
      UWAGA: W okresach odpoczynku fiolki zawierające muchy powinny pozostać bezpiecznie zaciśnięte na TW. Orientacja fiolek w tych okresach nie ma znaczenia, ponieważ siła grawitacji doświadczana przez wszystkie muchy będzie pochodzić z tego samego kierunku.
  4. Po zakończeniu zabiegu wysiłkowego w danym dniu, należy przywrócić korki fiolek z pokarmem do ich normalnych pozycji i odesłać muchy do inkubatorów do następnego dnia.
  5. Po zakończeniu pełnego reżimu ćwiczeń znieczulenie much przy użyciu standardowych metod znieczulenia muchami CO2 . Następnie przenieś muchy do nowych fiolek z żywnością lub probówek do mikrowirówek w celu oceny interesujących cech fenotypowych.
    UWAGA: Przykładowe fenotypy obejmują zdolność wspinania się (fiolka z żywnością), magazynowanie trójglicerydów (probówka do mikrowirówki) lub ekspresję genów (probówka do mikrowirówki). W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki są odpowiednio przechowywane w zależności od ocen, które mają zostać przeprowadzone. Testy z udziałem żywych much będą musiały zostać przeprowadzone niezwłocznie, zgodnie ze szczegółowymi celami testu fenotypowego.

4. Ocena wspinaczki

  1. Po jednym dniu odpoczynku po zakończeniu protokołu ćwiczeń, przetestuj ogólną wydajność wspinaczki muchowej za pomocą szybkiego iteracyjnego testu wspinaczkowego negatywnej geotaksji podobnej do RING (RING)22.
    1. Umieścić grupy 10 much w pustych fiolkach za pomocą znieczulenia CO2 (lub bezpośrednio z fiolek z żywnością, jeśli są już posortowane) i uszczelnić folią parafinową, aby zapobiec ucieczce much. Dać muszkom co najmniej 10 minut, aby przyzwyczaiły się do nowej fiolki. Aby zapobiec przewróceniu się fiolek, przyklej do dna fiolki okrąg o średnicy ~5 cm, aby zapewnić dodatkową powierzchnię.
      UWAGA: Nie należy używać zatyczek do fiolek, ponieważ utrudniają one działanie części fiolki służącej do określania wysokości, na jaką się wznoszono.
    2. Umieść fiolki 20 cm przed siatką o wymiarach 1 cm x 1 cm w pełnym widoku zamontowanej, nieruchomej kamery z wbudowanym timerem (dobrze sprawdza się smartfon z aplikacją kamery z timerem).
    3. Delikatnie postukaj fiolkami o blat trzy razy, aby strącić wszystkie muchy na dno fiolki. Po trzecim stuknięciu w fiolkę w dół, natychmiast uruchom 4-sekundowy timer aparatu, aby uchwycić obraz w celu określenia wysokości, na jaką wspina się każda mucha.
      UWAGA: Opukiwanie powinno być wykonywane ze stałą intensywnością i przez tego samego badacza w każdym kontraście ćwiczeniowo-kontrolnym, aby zminimalizować różnice w reakcjach much spowodowane stukaniem.
    4. Powtórzyć krok 4.1.3 dwukrotnie, zachowując co najmniej 1 minutę przerwy między próbami, aby uzyskać w sumie trzy próby na fiolkę.
  2. Aby zachować muchy do innych analiz, natychmiast po zakończeniu testu wspinaczkowego, należy je błyskawicznie zamrozić przez zanurzenie w ciekłym azocie.
    1. Użyj płytkiej, otwartej kolby Dewara wypełnionej do głębokości ~5 cm ciekłym azotem.
    2. Przenieś muchy do małych probówek mikrowirówek za pomocą znieczulenia CO2, a następnie umieść probówki w kolbie Dewara wypełnionej ciekłym azotem. Alternatywnie, jeśli przyszłe analizy wymagają unikania emisji CO2 , należy zamrozić muchy bezpośrednio w ich fiolkach wspinaczkowych, delikatnie stukając muchy o dno fiolki, podczas gdy dno jest zanurzone w ciekłym azocie, a następnie przenieść zamrożone muchy do probówek mikrowirówkowych za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Ciekły azot jest kriogeniczny i powinien być używany wyłącznie przy odpowiednim sprzęcie ochronnym i wentylacji pomieszczenia.
  3. Przetwarzanie obrazów za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego ImageJ23.
    1. Otwórz obraz do przetworzenia w ImageJ.
    2. Ustaw skalę 1 cm na podstawie papieru w siatkę, aby obliczyć odległość pokonaną przez każdą pojedynczą muchę. Użyj narzędzia "Linia" z paska narzędzi, aby obrysować jedną stronę kwadratu o boku 1cm2 z papieru w siatkę. Kliknij zakładkę "Analizuj" i wybierz "Ustaw skalę". Ustaw "Znaną odległość" jako "1.00" i "Jednostkę długości" jako "cm", upewnij się, że "Globalny" nie jest zaznaczony i kliknij "OK".
    3. Wybierz ikonę "Zaznaczenie wielopunktowe" na pasku narzędzi i powiększ dolną część fiolki na obrazie. Ustawić pierwszy punkt na samym dole fiolki, klikając na najniższą część fiolki.
    4. Kliknij środek każdej muchy w fiolce, aby oznaczyć ją jako punkt danych. Zwróć uwagę, że w sumie jest 11 punktów na fiolkę, jeden oznaczający dno fiolki i jeden dla każdej muchy.
    5. Kliknij zakładkę "Analizuj" i wybierz "Zmierz", aby wygenerować tabelę zmierzonych wartości. Zapisz tabelę jako plik csv.
    6. Otwórz plik csv w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz dokładną odległość pokonaną przez każdą muchę, odejmując wartości y punktów 2-11 od punktu 1 w tabeli zmierzonych wartości.
    7. Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6 dla każdego obrazu.

5. Test przechowywania trójglicerydów

UWAGA: Próbki, wzorce, roztwór wzorcowy glicerolu i roztwór roboczy triglicerolu używane podczas testu powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas trwania protokołu i powinny być przechowywane w lodówce, gdy nie są używane.

  1. Przygotować wzorce przy użyciu roztworu wzorca glicerolu.
    1. Wykonać ślepą próbę (B), dodając 1 000 μl buforu homogenizacyjnego do probówki mikrowirówki oznaczonej B.
    2. Przygotować Wzorzec 1 (S1), 2,5 mg/ml na studzienkę, dodając 1000 μl wzorcowego roztworu glicerolu do probówki mikrowirówki oznaczonej S1.
    3. Przygotować Wzorzec 2 (S2), 1,25 mg/ml na studzienkę, dodając 500 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 500 μl diH2O w probówce do mikrowirówki oznaczonej S2.
    4. Przygotować wzorzec 3 (S3), 0,625 mg / ml na studzienkę, dodając 250 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 750 μl diH2O w probówce do mikrowirówki oznaczonej S3.
    5. Przygotować Wzorzec 4 (S4), 0,3125 mg / ml na studzienkę, dodając 125 μl roztworu wzorcowego glicerolu do 875 μl diH20 w probówce mikrowirówki oznaczonej S4.
  2. Przygotować roztwór roboczy triglicerolu z zestawu do oznaczania triglicerydów w surowicy.
    1. Dodać 40 ml diH2O do wolnego odczynnika glicerolu z zestawu i wymieszać przez odwrócenie butelki.
    2. Dodać 10 ml diH2O do roztworu triglicerydów z zestawu i wymieszać, odwracając butelkę.
    3. Połączyć odczynnik glicerolu i roztwór triglicerydów i wymieszać, odwracając, aby przygotować roztwór roboczy triglicerolu.
      UWAGA: Roztwór roboczy triglicerolu jest dobry przez 60 dni i może wykonać cztery 96-dołkowe testy płytkowe na zestaw przy użyciu poniższego protokołu. Użyte objętości są proporcjonalnie zmniejszone w stosunku do oficjalnego zestawu do oznaczania triglicerydów w surowicy do stosowania w formacie płytki 96-dołkowej.
  3. Sprawdzić ślepą próbę i wzorce, ostrożnie pipetując 5 μl każdego wzorca do 96-dołkowej, płaskodennej, przezroczystej mikropłytki w trzech kroplach (lub czterokrotnie w przypadku ślepej próby).
    1. Dodaj dokładnie 125 μl roztworu roboczego triglicerolu do każdej studzienki zawierającej wzorzec. Pozwól roztworom zareagować przez 30 minut.
    2. Umieścić 96-dołkową płytkę w spektrofotometrze i odczytać absorbancję przy 540 nm. Użyj pomiarów absorbancji, aby utworzyć krzywą wzorcową i zweryfikować dokładność wzorców, oceniając wartość R2. Jeśli R2 dla norm jest mniejsze niż 0,98, należy ponownie przygotować wzorce bardziej ostrożnie.
  4. Rozpocznij dzień 1 testu do przechowywania triglicerydów14 przy użyciu probówek mikrowirówkowych zawierających 10 zamrożonych much każda.
    UWAGA: Na tym etapie nigdy nie należy używać pipety wielokrotnej lub wielokanałowej, ponieważ ilości każdego odczynnika użytego w teście muszą być bardzo dokładne i spójne, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Z naszego doświadczenia wynika, że pipety wielokrotne i wielokanałowe nie mają takiego stopnia dokładności i spójności. Każda porcja z pipety jednokanałowej może zostać wizualnie potwierdzona przez eksperymentatora w celu kontroli jakości, a wszelkie odchylenia specyficzne dla pipet jednokanałowych będą odczuwane przez wszystkie próbki w tym samym stopniu.
    1. Przygotować 200 ml buforu homogenizacyjnego, łącząc 0,272 g KH2PO4, 400 μl 0,5 M EDTA i 199,6 ml diH2O w szklanej butelce.
    2. Dodać dokładnie 100 μl buforu homogenizacyjnego do każdej z 40 probówek do mikrowirówek zawierających 10 dorosłych osobników zamrożonych po teście wspinaczkowym. Następnie odwiruj próbki przez 30 s przy 18 000 g.
    3. Zmiel muchy za pomocą zmotoryzowanego młynka i tłuczka (lub innej formy homogenizacji tkanek), aby przygotować mleczny roztwór. Upewnij się, że do każdej próbki używany jest świeży tłuczek. Następnie odwirować próbki przez 2 minuty przy 18 000 g.
    4. Tylko górne 75 μl cieczy sklarowanej nad osadem z każdej probówki należy pobrać pipetą do nowych probówek do mikrowirówek. Upewnij się, że żadne kawałki muchy z granulki nie zostały przeniesione. Umieść nowe probówki w lodówce na noc.
  5. Rozpocznij dzień 2 protokołu trójglicerydowego od wyjęcia próbek z dnia 1 z lodówki.
    UWAGA: Krok 5.5 można wykonać tego samego dnia co 5.4, ale stwierdziliśmy, że sygnał stężenia trójglicerydów jest silniejszy po nocy spędzonej w lodówce. Jednak czas pomiędzy krokami 5.4 i 5.5 nie powinien przekraczać 36 godzin.
    1. (Opcjonalnie) Wirować pierwszą probówkę z płynem supernatantowym przez 10 s i pipetować 5 μl do czystej probówki do mikrowirówki. Dodać 95 μl 0,15 M NaCl do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj te podpróbki w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego oznaczenia białka, jeśli jest to pożądane.
      UWAGA: Te próbki supernatantu z dodatkiem roztworu NaCl można wykorzystać do określenia zawartości białka przy użyciu preferowanego przez badacza testu. Używamy metody Bradforda24. Zawartość białka jest jednym ze sposobów standaryzacji miary zawartości trójglicerydów, ale badacz powinien również zachować ostrożność w interpretacji tych proporcji, ponieważ ćwiczenia i dieta mogą również wpływać na magazynowanie białka.
    2. W przypadku oryginalnych fiolek z supernatantem należy wirować pierwszą probówkę z płynem supernatantowym przez 10 s, a następnie pipetować 5 μl do dwóch oddzielnych dołków 96-dołkowej mikropłytki w celu uzyskania kontrprób technicznych. Pamiętaj, aby zanotować, które studzienki są używane dla każdej próbki. Powtórz ten krok dla pozostałych 39 probówek.
    3. Odpipetować dokładnie 5 μl ślepej próby do czterech dołków mikropłytki, a w przypadku pozostałych dołków odpipetować dokładnie 5 μl każdego wzorca w trzech powtórzeniach.
    4. Do każdego dołka dodać dokładnie 125 μl roztworu roboczego triglicerolu i pozostawić roztwór do reakcji przez 30 minut.
    5. Umieścić 96-dołkową płytkę w spektrofotometrze i odczytać absorbancję przy 540 nm.
    6. Przelicz wartości absorbancji na stężenie (mg/ml) za pomocą krzywej wzorcowej obliczonej na podstawie wzorców.

Wyniki

Szczególnie interesuje nas zidentyfikowanie czynników, które przyczyniają się do ogólnego stanu zdrowia metabolicznego jednostki. Wcześniej wykazano, że interakcje między genotypem a dietą w znacznym stopniu przyczyniają się do zmienności cech metabolicznych na poziomie populacyjnym14. Oznacza to, że każdy genotyp reaguje na różnice środowiskowe w sposób unikalny i złożony. Aby rozszerzyć nasze badania nad efektami interakcji genotyp-środowisko o wysiłek fizyczny, opracowaliśmy TreadWheel, który umożliwia poddanie dużej liczby genotypów aerobowemu treningowi interwałowemu (AIT) w sposób wysokoprzepustowy.

Aby ustalić, czy ćwiczenia na bieżni (TW) wpłynęły na cechy metaboliczne, zmierzyliśmy zapasy trójglicerydów u much Oregon-R (OreR) oraz y1w1 muchy, pospolite muchy typu dzikiego (Rysunek 2B–C), a następnie znormalizowano te wartości względem stężenia białka w organizmach much, zgodnie z pierwotnym opisem w pracy Mendeza i wsp.11Dane przeanalizowano za pomocą wielowymiarowej analizy wariancji (MANOVA), uwzględniając genotyp, płeć, trening fizyczny (oraz ich interakcje) oraz efekty bloków eksperymentalnych, takie jak powtórzenia czasowe i fiolki z pożywką; stwierdzono istotną interakcję między genotypem a treningiem fizycznym (p = 0,017) wpływający na magazynowanie trójglicerydów. Odnotowano istotny efekt dymorfizmu płciowego pomiędzy samcami a samicami, przy czym samce magazynowały więcej trójglicerydów niż samice (p < 0,001). Zaobserwowano, że u samic much poddanych ćwiczeniom poziom trójglicerydów był istotnie niższy niż u osobników niećwiczących (Rycina 2B, p <0,001). U samców, choć spadek zapasów triglycerydów zaobserwowany u ćwiczących much z linii Oregon-R (w porównaniu z grupą kontrolną) nie był istotny statystycznie, odnotowano istotną różnicę w zapasach triglycerydów pomiędzy dwiema oddzielnymi liniami (Rycina 2C, p <0,001). Należy zauważyć, że choć standaryzacja stężenia triglicerydów względem stężenia białka pozwala na uzyskanie informacji o ogólnych proporcjach składu ciała much, porównanie bezpośredniego stężenia triglicerydów lub białek między różnymi grupami much może również dostarczyć szczegółowych informacji o wpływie ćwiczeń na te poszczególne fenotypy.

Ponieważ wykazano, że takie zmienne jak aktywność fizyczna osobników dorosłych, płeć i genotyp wpływają na gromadzenie triglicerydów, oczekiwano, że czynniki te oddziałują również na inne fenotypy i wchodzą w interakcje z dietą. Larwy reprezentatywnej linii dzikiego typu z Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP 153)25 hodowano na diecie wysokotłuszczowej lub standardowej, a następnie indukowano aktywność fizyczną u dorosłych much przez jeden tydzień (Rysunek 2A). Następnie przeprowadzono test negatywnej geotaksji typu RING w celu pomiaru zdolności wspinaczkowych. Zastosowany test wspinaczkowy różnił się od standardowego testu RING; zamiast aparatury RING, do przetrzymywania much podczas badania użyto fiolek z otworami zakrytymi folią parafinową. Pozostałe aspekty oryginalnego testu RING, takie jak czas pomiędzy opukaniem much na dno fiolki a wykonaniem zdjęcia, zostały zachowane2.

Wszystkie próby powtórzono trzykrotnie, wykorzystując minimum 59 poszczególnych much na każdy powtór czasowy i wariant traktowania. Dane analizowano za pomocą MANOVA, uwzględniając dietę, genotyp, płeć, traktowanie ćwiczeniowe (oraz ich interakcje), a także efekty bloków eksperymentalnych w postaci powtórów czasowych, probówek pomiarowych i powtórzeń pomiaru w probówce. Stwierdzono, że ćwiczące samice wznosiły się znacząco wyżej (p <0.05) w przypadku hodowli na diecie wysokotłuszczowej niż w jakiejkolwiek innej grupie samic (Figure 2D). W przypadku samców zaobserwowano, że ćwiczenia poprawiły zdolność wspinania się tylko wtedy, gdy samce były hodowane na normalnej diecie; u osobników karmionych dietą wysokotłuszczową nie odnotowano istotnych zmian (Figure 2E). Odnotowano również istotne efekty dymorfizmu płciowego (p <0.01) w wspinaniu się, przy czym samce wznosiły się wyżej niż samice. Zaskakujący wynik w postaci spadku sprawności wspinania się po ćwiczeniach u samic z linii DGRP 153 (Figure 2D) przy normalnej diecie (p <0.001) jest przykładem tego, jak ten rodzaj ćwiczeń może nie być jednolicie pozytywną interwencją dla wszystkich genotypów i może zależeć od innych czynników środowiskowych. W pracy Mendez et al.1 samice z czterech innych linii genetycznych, których sprawność wspinania się badano po hodowli na normalnej diecie, wykazały poprawę zdolności wspinania się po treningu. Sugeruje to, że reakcja zaobserwowana w linii DGRP 153 jest specyficzna dla danego genotypu, a nie jest ogólną cechą traktowania ćwiczeniami TW. Zmienność odpowiedzi w zależności od płci, diety i grupy ćwiczeniowej wskazuje na istotne interakcje płeć-dieta-ćwiczenia, które wpływają na zdolność wspinania się danej linii (p <0.01).

Podsumowując, wyniki wskazują, że wpływ ćwiczeń na zdrowie metaboliczne dorosłej muchy może być funkcją jej płci, genotypu i diety larwalnej. Zmienność fenotypowa zaobserwowana w odpowiedzi na genotyp, zmienne środowiskowe (np. dietę i ćwiczenia) oraz płeć była również odnotowana w innych badaniach1,12,14,15. Zatem TW i Drosophila mogą stanowić potężną strategię wyjaśniania czynników genetycznych i środowiskowych kształtujących zdrowie metaboliczne.

Konfiguracja eksperymentu ćwiczeniowego dla Drosophila; aparat rotacyjny, probówki dla muszek, wyniki grupy ćwiczeniowej w porównaniu z grupą kontrolną.
Rycina 1Maszyna do ćwiczeń TreadWheel. (AUrządzenie mieści 48 probówek i posiada funkcję regulacji prędkości. W niniejszych eksperymentach zastosowano prędkość 4 obr./min.B) Poszczególne fiolki z pożywką zawierające muchy doświadczalne wpięto w uchwyty przymocowane do obrotowej osi. (COdległość między korkiem fiolki a pokarmem wynosiła 6 cm w przypadku fiolek ćwiczeniowych i 1 cm w przypadku fiolek kontrolnych. Następnie fiolki umieszczono w urządzeniu w celu przeprowadzenia ćwiczeń.DW celu poddania dorosłych much ćwiczeniom zastosowano 5-dniowy schemat ćwiczeń w formie odwróconej piramidy. Każdego dnia do jednej z sesji ćwiczeń dodawano pięć minut, aby stopniowo zwiększać intensywność wysiłku, co modeluje trening wytrzymałościowy i interwałowy. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Mendeza. i wsp.11. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ diety na linie genetyczne Drosophila; wykresy słupkowe i liniowe poziomu triglicerydów oraz test zdolności wspinania się.
Rysunek 2Metody wizualizacyjne i reprezentatywne wyniki. (A) Metody badania interakcji między dietą larwalną a wysiłkiem fizycznym osobników dorosłych. Larwy hodowano na diecie wysokotłuszczowej lub standardowej diecie laboratoryjnej, a po wykluciu przeniesiono na standardową pożywkę. Dorosłe muchy rozdzielono według płci, przydzielono do grup doświadczalnych i poddano wysiłkowi fizycznemu przez pięć kolejnych dni. Następnie przeprowadzono test wspinaczkowy negatywnej geotaksji (typu RING), a muchy zamrożono w celu pomiaru poziomu triglicerydów. Reprezentatywne dane dotyczące poziomu triglicerydów przedstawiono dla dwóch linii genetycznych: Oregon R oraz y.1w1 dla (B) samic i (C) samce. Wszystkie muchy hodowano na standardowej diecie i poddawano ćwiczeniom w wieku dorosłym. Poziomy oznaczone różnymi literami różnią się istotnie (p <0,05) przy użyciu post hoc Studenta t-test. Rysunek ten zawiera podzbiór danych przedstawionych przez Mendeza i wsp.11Reprezentatywne dane dotyczące wspinania przedstawiono dla linii DGRP 153 dla (D) samice i (E) samców. Każdy punkt reprezentuje średnią wydajność wspinania 232 lub więcej osobników w trzech niezależnych punktach czasowych. Słupki błędów oznaczają jeden błąd standardowy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Układ z obracającym się prętem; schemat komponentów mechanicznych do mieszania laboratoryjnego; silnik, uchwyt na probówki, koła pasowe.
Rycina dodatkowa 1: Szczegółowy schemat kołowrotka (TreadWheel). (A) Schemat konstrukcji podwójnego zacisku do probówek używanego do mocowania probówek do urządzenia. (B) Widok wnętrza układu napędowego rotacyjnego maszyny. (C) Rzut równoległy przedniej ścianki urządzenia. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Plik z dodatkowym kodem: TreadWheel.skp Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wykazano, że opisany tutaj protokół ćwiczeń skutecznie stymuluje łagodne ćwiczenia u Drosophila i może być stosowany do symulacji ćwiczeń wytrzymałościowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych11. Należy zauważyć, że opracowując początkowo koncepcję TreadWheel, braliśmy pod uwagę produkty komercyjne, które mogą zostać zmodyfikowane tak, aby działały podobnie (np. rożen laboratoryjny). Jednak ostatecznie odrzuciliśmy to podejście, decydując się na projekt niestandardowy, ponieważ sprzęt komercyjny nie miał wystarczająco niskiej prędkości obrotowej (4 obr./min) i nie miał wystarczającej pojemności fiolki do generowania próbek o dużej przepustowości.

Sam protokół TW może być dostosowany tak, aby obejmował szeroki zakres tematów badawczych. Na przykład dostosowanie częstotliwości i czasu trwania reżimów ćwiczeń much może zmienić intensywność ćwiczeń, które otrzymują. Rozszerzając protokół na okres dłuższy niż jeden tydzień lub na inne grupy wiekowe, możliwe byłoby zbadanie wpływu ćwiczeń na starzenie się i różne choroby związane z wiekiem. Zalecamy, aby w przypadku wdrożenia rozszerzonego podejścia do ćwiczeń dodać co najmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu, aby umożliwić regenerację. Wykazano, że wydajność i poprawa były większe w reżimach, które obejmowały dzień regeneracji, niż w tych, w których stosowano następujące po sobie codzienne ćwiczenia12. Ostrzegamy również przed przedłużaniem ćwiczeń powyżej 30 minut, ponieważ przyzwyczajenie się do ruchu rotacyjnego może nastąpić po długich okresach ciągłych ćwiczeń11. Zaobserwowaliśmy również genetyczne różnice w motywacji much do utrzymania poziomu aktywności na TW11. Tak więc, jeśli pożądane są dłuższe ataki, rozważ monitorowanie poziomu aktywności much, jak to przedstawili Watanabe i Riddle15,21 opisując ich modyfikację koncepcji TW. Inne czynniki, które mogą być zróżnicowane, to temperatura i wzorce snu i czuwania, które, jak wykazano, również wpływają na ruchy much26,27.

Istnieje mnóstwo dostępnych analiz w trakcie i po zakończeniu protokołu, które dotyczą skutków ćwiczeń na poziomie fizjologicznym, behawioralnym i molekularnym, a także potencjału do rozwikłania epigenetycznych skutków ćwiczeń. Dodatkowe testy metaboliczne (np. glukoza, glikogen i białko), wydolność serca i miary odpowiedzi zapalnej mogą być wykorzystane do dalszego zbadania wpływu ćwiczeń na fizjologię much i skład ciała 12,14,24,28. Różne zmiany behawioralne związane z indukcją ćwiczeń, takie jak zmiany w zachowaniach żywieniowych, aktywności lokomotorycznej i śnie, można również zmierzyć za pomocą narzędzi takich jak test CAFE29 lub urządzenia do monitorowania aktywności 12,15,30. Zmiany w ekspresji genów i oddychaniu komórkowym przypisywane ćwiczeniom można również określić ilościowo za pomocą metod takich jak qRT-PCR11 i respirometria31. Wreszcie, Drosophila mają do dyspozycji cenne zasoby genetyczne, takie jak Drosophila Genetics Reference Panel 2 i Drosophila Synthetic Population Resource, które zapewniają naukowcom platformę do przeprowadzania ilościowych badań genetycznych25,32. Narzędzia te umożliwiają eksperymenty mapowania, takie jak badania asocjacyjne całego genomu i mapowanie loci cech ilościowych, w celu identyfikacji potencjalnych loci związanych z ćwiczeniami i dietą.

Badania przeprowadzone przy użyciu TreadWheel wykazały, że ćwiczenia średnio zmniejszają masę ciała, całkowite magazynowanie trójglicerydów i glikogen, jednocześnie zwiększając zawartość białkai wydajność wspinaczkową. Ponadto stwierdzono różne reakcje na ćwiczenia u różnych płci i genotypów pod względem masy ciała, a także trójglicerydów, białka, glikogenu, glukozy i poziomów aktywności11,15. Chociaż zmienność reakcji na ćwiczenia i dietę w zależności od genotypów i płci może być trudna do zinterpretowania, a czasami sprzeczna z intuicją, odzwierciedla źródła rzeczywistej zmienności biologicznej obserwowanej w naturalnych populacjach. Ponieważ staramy się zrozumieć różnorodność czynników przyczyniających się do wysokich wskaźników MetS, narzędzia, które ułatwiają rozwikłanie względnej roli różnych czynników przyczyniających się do tego poprzez testowanie tych czynników w organizmach modelowych, będą miały kluczowe znaczenie dla naszej zdolności do opracowania spersonalizowanych interwencji w zakresie profilaktyki i leczenia. Aby w pełni ocenić skuteczność ćwiczeń, każdy z tych czynników i sposób ich interakcji musi być brany pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentów i formułowania wniosków.

TW, podobnie jak większość innych maszyn do ćwiczeń much, ma ograniczoną zdolność do ilościowego określania ruchu muchy. Niedawno Watanabe i Riddle opracowali Rotary Exercise Quantification System (REQS), szkielet TW zmodyfikowany za pomocą jednostki monitorującej aktywność (LAM25H) z serii Drosophila Monitoring System15,21. Podobnie jak TW, system ten wykorzystuje ruch obrotowy do delikatnego wywoływania ćwiczeń podczas używania ramienia LAM25H do śledzenia i ilościowego określania aktywności much, ale mieści mniejszą liczbę fiolek (32 fiolki) niż TW15. W przypadku wysokoprzepustowych badań wysiłkowych, jeśli kwantyfikacja aktywności nie jest konieczna lub pożądana, TW pozwala na większą liczbę próby. Konstrukcja TW może być również zmodyfikowana w stosunku do obecnej formy, aby pomieścić większą liczbę fiolek. System ten, wraz z innymi istniejącymi metodami ćwiczeń, pomógł ustalić, że ćwiczenia są nie tylko osiągalne u Drosophila, ale mogą być również badane w celu określenia wpływu aktywności fizycznej na różne reakcje fizjologiczne i molekularne 11,12,15. Tak więc TW, jako sprawdzona metoda wywoływania delikatnych ćwiczeń u much, może być używana do badania wielu różnych pytań biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandonowi Moye, Laurze Mafla, Olivii Fish i reszcie Reed Lab za pomoc w hodowli much i przetwarzaniu obrazów. Sean Mendez zbudował oryginalne koło bieżnika z pomocą warsztatu mechanicznego UAB. Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez NIH-R01 GM 098856 LKR oraz Akademię Kreatywności i Badań Licencjackich na Uniwersytecie Alabama dla KEL i BJW.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< mocny> Materiały do budowy TreadWheel: < / strong>
Heavy Duty Tłumienie drgań MocowanieMcMaster-Carr60855K71Ilość: 4
Łożysko kulkowe ze stali nierdzewnejMcMaster-Carr57155K306Ilość: 8
Transformator napięcia wtykowego (wejście 500MA, 120VAC, wyjście 24 VAC)McMaster-Carr70235K16Ilość: 1
Kompaktowy motoreduktor prądu stałego z kwadratową powierzchniąMcMaster-Carr6409K23Ilość: 1
Uchwyt narzędziowy (zaciski)McMaster-Carr1723A22Ilość: 5 (10x)
12L14 Pręt o wąskiej tolerancji ze stali węglowejMcMaster-Carr5227T24Ilość: 1
Zestaw kołnierza wałuMcMaster-Carr6432K13Ilość: 8
Okrągłe kołopasoweMcMaster-Carr6284K51Ilość: 5
Sterowanie strzałkami – 25 Max RPM, Elektryczny silnik prądu stałegoAC McMaster-Carr13DV 1AIlość: 1
Materiały do konserwacji i hodowli much
6 uncji Butelki z kwadratowym dnem (polipropylen)Genesee Scientific32-130Ilość: 1
szalki Petriego 35x10mmVWR82050-536Ilość: 1
Wąskie fiolki DrosophilaGenesee Scientific32-116Ilość: 1
Flystuff FlypadGenesee Scientific59-114Ilość: 1
Pistolet pneumatyczny, MiniGenesee Scientific54-104Ilość: 1
Materiały do testu RING-like Oprogramowanie: < / strong>
ImageJ oprogramowanieNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Ilość: 1
1 cM papier milimetrowy lub siatka ciągniona (co najmniej 20 cM na 30 cm)Różnailość: 1
aparat cyfrowy z timerem lub smartfon z aplikacją do pomiaru czasu aparaturóżneIlość: 1
< mocny>Materiały do oznaczania trójglicerydów: < / silny>
Dewar FlaskVWR14200-960Ilość: 1
Zestaw do oznaczania trójglicerydów w surowicySigma AldrichTRO100Ilość: 1
Silnik tłuczka akumulatorowegoVWR47747-370Ilość: 1
TłuczekVWR47747-358Ilość: 1

Bibliografia

  1. Yanovski, J. A. Pediatric obesity. An introduction. Appetite. 93, 3-12 (2015).
  2. Alberti, K. G. M. M., Zimmet, P., Shaw, J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabetic Medicine. 23, 469-480 (2006).
  3. American Diabetes Association. 6. Obesity Management for the Treatment of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 39, Suppl 1 47-51 (2016).
  4. Bliddal, H., Leeds, A. R., Christensen, R. Osteoarthritis, obesity and weight loss: evidence, hypotheses and horizons - a scoping review. Obesity Reviews. 15, 578-586 (2014).
  5. Bray, G. A. The epidemic of obesity and changes in food intake: the Fluoride Hypothesis. Physiol. Behav. 82, 115-121 (2004).
  6. O'Rahilly, S., Farooqi, I. S. Genetics of obesity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361, 1095-1105 (2006).
  7. Kenkre, J., Tan, T., Bloom, S. Treating the obese diabetic. Expert Rev Clin Pharmacol. 6, 171-183 (2013).
  8. Fiuza-Luces, C., Garatachea, N., Berger, N. A., Lucia, A. Exercise is the Real Polypill. Physiology. 28, 330-358 (2013).
  9. Matos, A., et al. Acute exercise reverses TRB3 expression in the skeletal muscle and ameliorates whole body insulin sensitivity in diabetic mice. Acta Physiologica. 198, 61-69 (2010).
  10. Mercken, E. M., Carboneau, B. A., Krzysik-Walker, S. M., de Cabo, R. Of mice and men: The benefits of caloric restriction, exercise, and mimetics. Ageing Research Reviews. 11, 390-398 (2012).
  11. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A Novel Apparatus to Measure Genetic Variation in Response to Gently Induced Exercise for Drosophila. PLoS ONE. 11, 0164706(2016).
  12. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, 5886-5911 (2009).
  13. Graham, P., Pick, L. Drosophila as a Model for Diabetes and Diseases of Insulin Resistance. Fly Models of Human Diseases. 121, 397-419 (2017).
  14. Reed, L. K., et al. Genotype-by-Diet Interactions Drive Metabolic Phenotype Variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, 1009-1019 (2010).
  15. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS ONE. 12, 0185090(2017).
  16. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. , (2012).
  17. Tinkerhess, M. J., et al. The Drosophila PGC-1α Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Exercise. PLoS ONE. 7, 31633(2012).
  18. Sujkowski, A., Bazzell, B., Carpenter, K., Arking, R., Wessells, R. J. Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila healthspan by overlapping mechanisms. Aging. 7, 535-552 (2015).
  19. Tjønna, A. E., et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome: A Pilot Study. Circulation. 118, 346-354 (2008).
  20. Ciolac, E. G., et al. Effects of high-intensity aerobic interval training vs. moderate exercise on hemodynamic, metabolic and neuro-humoral abnormalities of young normotensive women at high familial risk for hypertension. Hypertension Research 2010 33:8. 33, 836-843 (2010).
  21. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring exercise levels in Drosophila melanogaster using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J Vis Exp. , (2018).
  22. Gargano, J., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40, 386-395 (2005).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012 9:7. 9, 671-675 (2012).
  24. Hammond, J. B. W., Kruger, N. J. New Protein Techniques. 3, 25-32 (1988).
  25. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).
  26. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1975).
  27. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and Recording Locomotor Activity in a Drosophila melanogaster Model of Alzheimer's Disease. Front Behav Neurosci. 11, 159(2017).
  28. Leng, S. X., et al. ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 63, 879-884 (2008).
  29. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 8253-8256 (2007).
  30. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. , (2010).
  31. MÖlich, A. B., FÖrster, T. D., Lighton, J. R. B. Hyperthermic Overdrive: Oxygen Delivery does Not Limit Thermal Tolerance in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Science. 12, 1-7 (2012).
  32. Long, A. D., Macdonald, S. J., King, E. G. Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource. Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wiczenia na ko owrotkuocena zdrowia metabolicznegoanaliza magazynowania tr jgliceryd wtest negatywnego geotaksissuplementacja ywymi dro d amisilnik o zmiennej pr dko cikonfiguracja projektu eksperymentalnegointerakcja genotyp rodowisko
TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.