Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zdrowe plastry mózgowo-przysadkowe do badań elektrofizjologicznych komórek przysadki mózgowej u ryb teleost

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 sierpnia 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia żywotnych wycinków tkanki mózgowo-przysadkowej, przy użyciu teleost fish medaka (Oryzias latipes), a następnie elektrofizjologiczne zapisy komórek przysadki mózgowej przy użyciu techniki patch-clamp z konfiguracją perforowanej łatki.

Streszczenie

Badania elektrofizjologiczne komórek przysadki mózgowej przeprowadzono u wielu gatunków kręgowców, ale bardzo niewiele u ryb teleost. Spośród nich zdecydowana większość została wykonana na zdysocjowanych komórkach pierwotnych. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki przysadki mózgowej zachowują się w bardziej biologicznie istotnym środowisku, protokół ten pokazuje, jak przygotować żywotne wycinki mózgowo-przysadkowe przy użyciu małych ryb słodkowodnych medaka (Oryzias latipes). Tworząc plastry mózgowo-przysadkowe, pH i osmolalność wszystkich roztworów dostosowano do wartości występujących w płynach ustrojowych ryb słodkowodnych żyjących w temperaturze od 25 do 28 °C. Po przygotowaniu plastrów protokół pokazuje, w jaki sposób przeprowadzać zapisy elektrofizjologiczne przy użyciu techniki perforowanego zacisku krosowego całej komórki. Technika patch-clamp jest potężnym narzędziem o niespotykanej rozdzielczości czasowej i czułości, umożliwiającym badanie właściwości elektrycznych od nienaruszonych całych komórek do pojedynczych kanałów jonowych. Perforowana łatka jest wyjątkowa, ponieważ utrzymuje środowisko wewnątrzkomórkowe w stanie nienaruszonym, zapobiegając rozcieńczaniu elementów regulatorowych cytozolu przez roztwór elektrody do pipetowania plastrów. W przeciwieństwie do tego, podczas wykonywania tradycyjnych zapisów całych komórek, zaobserwowano, że komórki przysadki mózgowej medaka szybko tracą zdolność do wystrzeliwania potencjałów czynnościowych. Wśród różnych dostępnych technik perforacji, protokół ten pokazuje, jak osiągnąć perforację załatanej błony za pomocą fungicydu Amfoterycyna B.

Wprowadzenie

Przysadka mózgowa jest kluczowym organem endokrynnym u kręgowców położonym poniżej podwzgórza i za skrzyżowaniem wzrokowym. Produkuje i wydziela od sześciu do ośmiu hormonów z określonych typów komórek. Hormony przysadki mózgowej stanowią półprodukt między mózgiem a narządami obwodowymi i napędzają szeroki zakres podstawowych procesów fizjologicznych, w tym wzrost, reprodukcję i regulację homeostazy. Podobnie jak neurony, komórki endokrynne przysadki mózgowej są elektrycznie pobudliwe i mają zdolność do spontanicznego wystrzeliwania potencjałów czynnościowych 1. Rola tych potencjałów czynnościowych jest zależna od komórki. W kilku typach komórek przysadki mózgowej ssaków potencjały czynnościowe mogą wystarczająco podnieść wewnątrzkomórkowy Ca2 + do długotrwałego uwalniania hormonu 2. Ponadto przysadka mózgowa otrzymuje zarówno stymulujące, jak i hamujące informacje, które wpływają na potencjał błonowy komórek 3,4,5,6. Zazwyczaj bodźce stymulujące zwiększają pobudliwość i często wiążą się z uwalnianiem Ca2+ z zapasów wewnątrzkomórkowych, a także zwiększoną częstotliwością wypalania 7. Zrozumienie, w jaki sposób komórka wykorzystuje skład kanału jonowego i dostosowuje się do tych sygnałów wejściowych z mózgu, jest kluczem do zrozumienia syntezy i uwalniania hormonów.

Technika patch-clamp została opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych przez Sakmanna i Nehera 8,9,10 i dalej ulepszona przez Hamilla 11, i umożliwia szczegółowe badania właściwości elektrofizjologicznych komórek aż do pojedynczych kanałów jonowych. Co więcej, technika ta może być wykorzystywana do badania zarówno prądu, jak i napięcia. Obecnie zaciskanie łatowe jest złotym standardem w pomiarze właściwości elektrofizjologicznych ogniwa. Opracowano cztery główne konfiguracje techniki zacisku szczelnego 11; Komórka przyczepiona, wywrócona na zewnątrz, zewnętrzna na zewnątrz i łata całej komórki. Trzy pierwsze konfiguracje są zwykle używane do badań pojedynczych kanałów jonowych. W przypadku czwartego, zgodnie z konfiguracją przyłączoną do komórki, tworzy się otwór w błonie komórkowej za pomocą ciśnienia podatmosferycznego. Taka konfiguracja pozwala również na badanie składu kanałów jonowych całej komórki 12. Jednak jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że cząsteczki cytoplazmatyczne są rozcieńczane roztworem pipety z plastrem 13 (Rysunek 1A), wpływając w ten sposób na reakcje elektryczne i fizjologiczne badanych komórek. Rzeczywiście, niektóre z tych cząsteczek mogą odgrywać ważną rolę w transdukcji sygnału lub w regulacji różnych kanałów jonowych. Aby tego uniknąć, Lindau i Fernandez 14 opracowali metodę, w której do pipety z plastrem dodaje się związek tworzący pory. Po konfiguracji przyłączonej do komórki, związek włączy się w błonę plazmatyczną pod plastrem i powoli perforuje błonę, tworząc kontakt elektryczny z cytozolem (Rysunek 1B). Można stosować kilka różnych leków przeciwgrzybiczych, takich jak nystatyna 15 i amfoterycyna B 16, lub środki powierzchniowo czynne, takie jak saponina beta-escyna 17,18. Związki te tworzą pory wystarczająco duże, aby umożliwić jednowartościową dyfuzję kationów i Cl- między cytozolem a pipetą plastrową, zachowując jednocześnie cytozolowe poziomy makrocząsteczek i większych jonów, takich jak Ca2+ 15,16.

Wyzwaniem związanym z użyciem perforowanej łaty jest potencjalnie wysoka odporność serii. Rezystancjaszeregowa (R s) lub rezystancja dostępowa to łączny opór nad pipetą krosową w stosunku do podłoża. Podczas nagrań patch-clamp Rs będzie równoległy do rezystancji membrany (Rm). R, m i Rs pracują równolegle jako dzielnik napięcia. Przy wysokim R s napięcie spadnie powyżej Rs, powodując błędy w nagraniach. Błąd będzie się nasilał wraz z rejestrowaniem większych prądów. Ponadto dzielnik napięcia jest również zależny od częstotliwości, tworząc filtr dolnoprzepustowy, wpływając w ten sposób na rozdzielczość czasową. W efekcie, perforowana łata może nie zawsze pozwalać na zapisy dużych i szybkich prądów, takich jak prądy Na+ bramkowane napięciem (szczegółowe odczyty patrz odniesienie 19). Ponadto Rs może się zmieniać podczas nagrań patch-clamp, co ponownie prowadzi do zmian w rejestrowanym prądzie. W związku z tym wyniki fałszywie dodatnie mogą wystąpić w sytuacjach, w których Rs zmienia się podczas stosowania leku.

Elektrofizjologia na pociętej tkance została po raz pierwszy wprowadzona przez laboratorium Andersena do badania cech elektrofizjologicznych neuronów w mózgu 20. Technika ta utorowała drogę do szczegółowych badań pojedynczych komórek, a także komunikacji między komórkami i obwodów komórkowych w bardziej nienaruszonym środowisku. Podobna technika robienia plastrów przysadki została wprowadzona w 1998 roku przez Guérineau et al. 21. Jednak dopiero w 2005 roku preparat wycinka mózgowo-przysadkowego został z powodzeniem zastosowany do badań nad zaciskiem punktowym w teleost 22. W tym badaniu autorzy poinformowali również o zastosowaniu perforowanych nagrań patch-clamp. Jednak do tej pory większość badań elektrofizjologicznych komórek przysadki mózgowej przeprowadzono u ssaków i tylko u garstki innych kręgowców, w tym ryb teleost 1,2,22,23. W przypadku teleostów prawie wszystkie badania przeprowadzono na pierwotnych komórkach dysocjacyjnych 24,25,26,27,28,29,30.

W niniejszym artykule przedstawiamy zoptymalizowany protokół przygotowania zdrowych wycinków mózgowo-przysadkowych z modelowej ryby medaka. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z pierwotnymi zdysocjowanymi hodowlami komórkowymi. Po pierwsze, komórki są rejestrowane w stosunkowo zachowanym środowisku w porównaniu z warunkami zdysocjowanej hodowli komórek. Po drugie, preparaty warstwowe pozwalają nam badać pośrednie szlaki, w których pośredniczy komunikacja komórka-komórka 22, co nie jest możliwe w warunkach zdysocjowanej hodowli komórkowej. Ponadto pokazujemy, jak przeprowadzać zapisy elektrofizjologiczne na otrzymanych wycinkach tkanek przy użyciu techniki perforowanego całokomórkowego patch-clamp z amfoterycyną B jako czynnikiem tworzącym pory.

Medaka to mała ryba słodkowodna pochodząca z Azji, występująca głównie w Japonii. Fizjologia, embriologia i genetyka medaka są intensywnie badane od ponad 100 lat 31 i jest to powszechnie stosowany model badawczy w wielu laboratoriach. Szczególne znaczenie dla tej pracy ma wyraźna organizacja morfologiczna kompleksu podwzgórze-przysadka u ryb teleost: Podczas gdy u ssaków i ptaków neurony podwzgórza uwalniają swoje neurohormony regulujące komórki endokrynne przysadki do układu wrotnego wzniesienia środkowego, u ryb teleost występuje bezpośrednia projekcja nerwowa neuronów podwzgórza na komórki endokrynne przysadki mózgowej 32. W związku z tym starannie przeprowadzone cięcie mózgowo-przysadkowe ma szczególne znaczenie u ryb, co pozwala nam zbadać elektrofizjologiczne cechy komórek przysadki mózgowej w dobrze zachowanej sieci mózg-przysadka, a w szczególności, w jaki sposób komórki przysadki kontrolują swoją pobudliwość, a tym samym homeostazęCa2+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie czynności związane ze zwierzętami były wykonywane zgodnie z zaleceniami dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt badawczych na Norweskim Uniwersytecie Nauk Przyrodniczych oraz pod nadzorem uprawnionych badaczy.

1. Przygotowanie instrumentów i roztworów

UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być sterylne. Należy zwrócić szczególną uwagę na pH i osmolalność (osmol/kg wody) wszystkich roztworów, które powinny być starannie dostosowane do środowiska zewnątrzkomórkowego badanych gatunków. pH i osmolalność należy regulować za pomocą precyzyjnego sprzętu elektronicznego, takiego jak odpowiednio pH-metr i osmometr do punktu zamarzania.

  1. Przygotować 500 ml roztworu zewnątrzkomórkowego bez Ca2+ (Ca2+ wolne EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukozy, 10 mM Hepes.
    1. Rozpuścić 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg glukozy i 1,19 g HEPES w 450 ml ultraczystego (0,055 uS/cm w temperaturze 25 °C, rezystywność 18,2 MOhm) H2O w szklanej zlewce za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Dostosuj pH do 7,75 za pomocą NaOH.
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml. Napełnić kolbę miarową ultraczystymH2O do objętości 500 ml.
    4. Dobrze wymieszaj roztwór przed pomiarem osmolalności. Dostosować do 290–300 mOsm z mannitolem. Filtr sterylizuje roztwór za pomocą wodnego systemu próżniowego i filtra 0,2 μm.
  2. Przygotować 500 ml roztworu zewnątrzkomórkowego (EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukozy, 10 mM Hepes.
    1. Rozpuścić 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg glukozy i 1,19 g HEPES w 450 ml ultraczystego H2O w szklanej zlewce za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Dostosuj pH do 7,75 za pomocą NaOH.
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml. Napełnić kolbę miarową ultraczystymH2O do objętości 500 ml.
    4. Dobrze wymieszaj roztwór przed pomiarem osmolalności. Dostosować do 290–300 mOsm z mannitolem. Filtr sterylizuje roztwór za pomocą wodnego systemu próżniowego i filtra 0,2 μm.
  3. Przygotować 500 ml roztworu zewnątrzkomórkowego z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (EC z BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukozy, 10 mM Hepes.
    1. Rozpuścić 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg glukozy i 1,19 g HEPES w 450 ml ultraczystego H2O w szklanej zlewce za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Dostosuj pH do 7,75 za pomocą NaOH.
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml. Napełnić kolbę miarową ultraczystymH2O do objętości 500 ml.
    4. Dobrze wymieszaj roztwór przed pomiarem osmolalności. Dostosować do 290–300 mOsm z mannitolem. Filtr sterylizuje roztwór za pomocą wodnego systemu próżniowego i filtra 0,2 μm. Dodać 50 mg BSA.
  4. Przygotować 250 ml roztworu wewnątrzkomórkowego (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sacharozy.
    1. Rozpuścić 1,54 g KOH, 327,75 mg KCl, 595,75 mg HEPES i 1,712 g sacharozy w 450 ml ultraczystegoH2Ow szklanej zlewce za pomocą mieszadła magnetycznego.
    2. Doprowadzić pH do 7,2 za pomocą kwasu (N-morfolino) etanosulfonowego (MES).
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Napełnić kolbę miarową ultraczystymH2O do uzyskania objętości 250 ml.
    4. Dobrze wymieszaj roztwór przed pomiarem osmolalności. Dostosować do 280–290 mOsm (10 mOsm poniżej EC) za pomocą sacharozy. Filtr sterylizuje roztwór za pomocą wodnego systemu próżniowego i filtra 0,2 μm.
  5. Przygotować 100 ml 2% niskotopliwego roztworu agarozy w EC wolnym od Ca2+ i BSA (2 g niskotopliwej agarozy w 100 ml EC wolnego od Ca2+). Rozpuścić w kuchence mikrofalowej i umieścić stopioną agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. Pozostaw do ostygnięcia, aż osiągnie temperaturę 40 °C przed użyciem na chusteczkach.
    UWAGA: EC wolne od Ca2+ EC można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, jeśli są sterylne, a roztwory IC w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Agaroza może być przechowywana przez tydzień w temperaturze 4 °C i może być ponownie użyta 3-5 razy poprzez krótkie podgrzewanie w kuchence mikrofalowej. Nadmierne ponowne użycie doprowadzi do parowania i zmiany stężenia i jakości agarozy i soli.
  6. Zrób mostek agarowy:
    1. Podgrzej kapilary ze szkła borokrzemianowego o długości 7,5 mm o średnicy zewnętrznej (OD) 2 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 1,16 mm za pomocą palnika Bunsena w punkcie centralnym około 1/3 od jednego końca, aż szkło zacznie się wyginać. Zdejmij szklankę z płomienia i pozwól jej zgiąć się pod kątem około 120 stopni (Rysunek 2A).
    2. Rozpuść 2% agar w normalnym EC bez glukozy za pomocą kuchenki mikrofalowej, a gdy agaroza jest płynna, napełnij wcześniej przygotowaną szklaną kapilarnę za pomocą sił kapilarnych, wkładając jeden z końców szklanki do płynu i czekając kilka minut. Mostki przechowywać do czasu użycia w temperaturze 4 °C w EC bez glukozy.
  7. Przygotować szkło borokrzemianowe z pipetami z włóknem szklanym za pomocą odpowiedniego ściągacza do pipet. Zapoznaj się z instrukcją ściągacza do pipet, aby uzyskać żądaną rezystancję elektrody.
    UWAGA: Stożek pipety powinien być jak najkrótszy. Krótkie stożek pipety uzyskuje się dzięki zastosowaniu 4–6 kroków ciągnięcia. Rezystancja elektrody powinna wynosić od 2 do 6 MΩ w zależności od wielkości ogniwa.
  8. Aby uniknąć przemieszczania się tkanki podczas eksperymentów z patch-clamp, należy pokryć powierzchnię komory rejestracyjnej 0,1% polietylenininą (PEI) w buforze boranowym.
    1. Przygotować 500 ml buforu boranowego (25 mM):
      1. Rozpuścić 4,768 g Na2B4O7/10H2O w 450 ml ultraczystegoH2Ow szklanej zlewce za pomocą mieszadła magnetycznego.
      2. Dostosuj pH do 8,4 za pomocą HCl.
      3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml. Napełnić kolbę miarową ultraczystymH2O, aż do uzyskania 500 ml i filtra 0,2 μm, wysterylizować roztwór za pomocą wodnego systemu próżniowego.
    2. Przygotować 1% roztwór podstawowy PEI (1 ml 50% PEI do 49 ml 25 mM buforu boranowego) i 0,1% rozcieńczenie PEI, rozcieńczając 10 μl 1% roztworu podstawowego w 100 μl buforu boranowego do użytku końcowego.
    3. Dodaj 2 ml 0,1% PEI na szkło uchwytu na plastry i pozwól powłoce inkubować przez 1 minutę. Następnie krótko umyj szklankę dwukrotnie 5 ml ultraczystegoH2Oi pozostaw do wyschnięcia na powietrzu do czasu użycia.
  9. Przygotować roztwory amfoterycyny B.
    1. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 60 mg/ml, rozpuszczając 3 mg proszku amfoterycyny B w 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) w probówce o pojemności 1 ml zabezpieczonej przed światłem. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 s i sonikować przez 15 minut w celu homogenizacji. Przechowywać podwielokrotności w 3–5 probówkach w temperaturze -20 °C i stosować jedną porcję dziennie.
      UWAGA: Jeśli roztwór podstawowy amfoterycyny B nie jest przezroczysty i ma żółty kolor, ale mleczny (nadal żółty), po 15-20 minutach sonikacji należy przygotować nowy roztwór podstawowy.
    2. Przygotować roztwór IC z amfoterycyną B, pipetując 2 ml IC do czystej szklanej zlewki o pojemności większej niż 10 ml. Dodać 8 μl roztworu podstawowego amfoterycyny B do roztworu pipet i wymieszać pipetując. Owinąć zlewkę folią aluminiową i umieścić na lodzie do czasu użycia i odnawiać co 3 godziny.

2. Sekcja i krojenie za pomocą wibratomu

  1. Przed sekcją przygotuj narzędzia do preparowania, w tym jeden ostry i jeden mocny kleszcz nożyczkami. Wyczyść narzędzia (uchwyt na chusteczki, szczotkę, kleszcze) etanolem i upewnij się, że są używane wyłącznie do celów preparacyjnych i nigdy nie mają kontaktu z utrwalonymi tkankami. Przechowuj je w osobnym pudełku, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Poddaj rybę eutanazji w zimnej, lodowatej wodzie przez 1 minutę.
  3. Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami, aby szybko wypreparować mózg i przysadkę medaka za pomocą ostrych kleszczy (użyj nie więcej niż 3 minuty).
    1. Trzymając rybę silnymi kleszczami, naciągnij nożyczkami lub ostrymi kleszczami dwa nerwy wzrokowe za oczami.
    2. Otwórz grzbietową część czaszki od tylnej do przedniej strony, łamiąc krok po kroku kości czaszki silnymi kleszczami.
    3. Oderwij czaszkę z jednej strony mocnymi kleszczami.
    4. Ciężki rdzeń kręgowy nożyczkami lub ostrymi kleszczami.
    5. Delikatnie chwyć rdzeń kręgowy kleszczami, obróć mózg z tyłu do przodu i umieść go w naczyniu z lodowatym EC wolnym od Ca2 +.
  4. Napełnij metalową foremkę o długości 1,5–2 cm3 płynną agarozą i umieść ją na lodzie.
  5. Tuż przed zastygnięciem agarozy (w temperaturze około 25–30 °C) delikatnie chwyć kleszczami mózg za rdzeń kręgowy, osusz kleszcze kawałkiem drobnego papieru i włóż tkankę do agarozy. Szybko wymieszaj agarozę, aby rozcieńczyć ślady EC pozostawione wokół tkanki i zorientuj tkankę i pozostaw pleśń na lodzie na kilka sekund, aż agaroza stwardnieje.
    UWAGA: Ważne jest, aby ten krok był szybki. Agaroza szybko krzepnie, gdy metalowa forma jest schładzana przez lód.
  6. Przytnij kwadratowy blok agarozy zawierający tkankę za pomocą ostrza skalpela i przyklej go do uchwytu na próbkę wibratomu za pomocą kleju chirurgicznego (nietoksycznego).
  7. Napełnij kuwetę wibratomu, do którego trafia próbka (mózg-przysadka) lodowato zimnym EC wolnym od Ca2+.
  8. Umieść uchwyt próbki w wibratomie i odetnij blok agarozy, aby uzyskać przekroje przystrzałkowe o wielkości 150 μm, używając wysokiej częstotliwości i niskiej prędkości do cięcia. Zbierz wybrane skrawki i umieść je w komorze zapisu z zaciskiem krosowym z 3 ml lodowatego EC wolnego od Ca2+
    9. .
  9. Umieść harfę siatkową (Rysunek 2B) na sekcji tkanki.
    UWAGA: Harfa wraz z powłoką ustabilizuje tkankę i zapobiegnie jej przesuwaniu się podczas nagrań patch-clamp.
  10. Po umieszczeniu harfy na miejscu, zmień podłoże EC wolne od Ca2+ na normalne EC z Ca2+ i BSA. Pozostaw tkankę na 10 minut.

3. Perforowany zacisk krosowy i zapisy elektrofizjologiczne

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy chlorkować elektrody z drutu srebrnego, wykonując następujące czynności: Najpierw użyj drobnego papieru ściernego (p180), aby wyczyścić elektrody z drutu srebrnego. Po drugie, spłucz 2 ml 70% etanolu. Po trzecie, zanurz druty w 2 ml 2-5% chloru na 10 minut. Na koniec spłucz 2 ml ultraczystegoH2O.
  2. Umieść komorę rejestracyjną z wycinkiem mózgowo-przysadkowym w stoliku mikroskopowym i zlokalizuj obszar docelowy (przysadkę) za pomocą obiektywu 10X i sprawdź komórki za pomocą obiektywu 40X.
    UWAGA: Jeśli preparat się powiedzie, powinno być widocznych bardzo niewiele okrągłych komórek. Te okrągłe komórki są zwykle uszkodzonymi komórkami, które odrywają się od tkanki.
  3. Umieścić elektrodę uziemiającą przez 2% mostek agarowy w łaźni EC.
  4. Zlokalizuj zdrową komórkę za pomocą obiektywu 40X.
    UWAGA: Zdrowa komórka powinna być mocno przymocowana do wycinka tkanki, a nie zaokrąglona i oderwana od plasterka.
  5. Ustaw wzmacniacz w napięciu-clampie (VC; Rysunek 4A punkt 1) tryb. Otwórz okienko testowe uszczelki i naciśnij konfigurację wanny (Rysunek 4B punkt 1 i 2. Do monitorowania rezystancji pipet należy użyć impulsu 5 mV (Rysunek 4B punkt 3).
  6. Napełnij końcówkę pipety z plastrem roztworem IC wolnym od środków przeciwgrzybiczych przed dodaniem roztworu IC z amfoterycyną B za pomocą strzykawki z mikronapełniaczem (patrz Rysunek 3).
  7. Dodać lekko dodatnie ciśnienie powietrza do pipety z plastrem za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Powoduje to wypływ niewielkiej ilości cieczy z pipety z plastrem, co pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcówki.
  8. Po wejściu do kąpieli oceń rezystancję pipety z plastrem i upewnij się, że żadne cząstki nie są przyczepione do końcówki pipety (Rysunek 4C).
    UWAGA: Do monitora przymocowany jest mały kawałek taśmy, który wyświetla nagranie wideo z pola widzenia. Ułatwia to ustawienie pipety z plastrem względem komórki, gdy obiektyw nie skupia się na kucie.
  9. Skierować pipetę z plastrem do kuwety za pomocą mikromanipulatorów.
    UWAGA: Upewnij się, że pipeta jest czysta, szukając małych cząstek, które mogły przyczepić się do końcówki pipety. Nagłe zmiany oporu mogą być również wynikiem zakleszczenia się cząstek w końcówce pipety.
  10. Ponownie wyreguluj pipetę, gdy znajdzie się kilka mikronów nad celą, tak aby końcówka pipety dotykała komórki 1/3 od środka komórki, jak pokazano na Rysunek 5. Dotykając ogniwa, zwolnij nacisk i zastosuj delikatne ssanie, aby uzyskać uszczelnienie.
    UWAGA: Czas od wprowadzenia pipety z plastrem do kąpieli do pomyślnego uszczelnienia powinien być jak najkrótszy. Nie więcej niż 1–1,5 minuty, aby amfoterycyna B nie dostała się do końcówki pipety i nie przeciekła do kąpieli.
  11. Natychmiast przełącz się na okno krosowe w oprogramowaniu patch-clamp (Rysunek 4D punkt 1) i miej potencjał podtrzymania między -50 a -60 mV (Rysunek 4D punkt 2). Wyzeruj szybką pojemność składającą się ze szklanej pipety (Rysunek 4D, punkt 3).
  12. Przełącz się na okno komórki w oprogramowaniu patch-clamp (Rysunek 4E punkt 1 i 2) i rozpocznij monitorowanie rezystancji dostępu, Ra, wyświetlanej w oknie. Wyzeruj pojemność membrany w oprogramowaniu wzmacniacza (Rysunek 4E punkt 3) po wystarczającym dostępie.
    UWAGA: Wystarczający dostęp może zająć od 10 do 30 minut (Rysunek 4E punkt 2). Dobry dostęp do nagrań cęgowych prądu powinien znajdować się poniżej 20 M.
  13. Przełącz na cęgi prądowe, IC, w oknie oprogramowania wzmacniacza (Rysunek 4F punkt 1). Dostosuj szybkie prądy pojemnościowe w oknie I-clamp oprogramowania wzmacniacza (Rysunek 4F punkt 2 i 3) na tę samą wartość, co w 3.12. Sprawdź potencjał membrany (Rysunek 4F punkt 1).
    UWAGA: Co ważne, jeśli potencjał błonowy jest płytki (typowo powyżej -35 mV), ogniwo może ulec uszkodzeniu. Anuluj nagrywanie i znajdź nową komórkę.
  14. Po znalezieniu zdrowej komórki (mocno przyczepionej do tkanki o potencjale błonowym poniżej -40 mV) rozpocznij zapisy eksperymentalne zgodnie z opisem w protokole producenta 33,34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę uzyskiwania wiarygodnych zapisów elektrofizjologicznych z komórek przysadki (gonadotropów), z wykorzystaniem transgenicznej linii medaka [Tg(lhb-hrGfpII)], w której komórki docelowe (gonadotropy produkujące Lh) są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP).

Początkowo badania elektrofizjologiczne prowadzono w konfiguracji whole-cell. Jednak w żadnej z badanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zapisy elektrofizjologiczne wykonywane techniką patch-clamp na wycinkach mózgowo-przysadkowych wymagają starannej optymalizacji. Dobrze zoptymalizowane protokoły prowadzenia badań żywych komórek, szczególnie w teleostach, są ograniczone, a większość publikacji wykorzystuje protokoły oparte na systemach ssaków. W związku z tym ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z faktu, że kilka parametrów fizjologicznych, takich jak pH i osmolaliczność, jest nie tylko zależnych od gatunku, ale także w dużym stopniu zależy od tego, czy d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Dziękujemy Pani LourdesCarreon G Tan za pomoc w utrzymaniu placówki medaka oraz Anthony'emu Peltierowi za ilustrujące ilustracje. Praca ta została sfinansowana przez NMBU i Norweską Radę ds. Badań Naukowych, granty o numerach 244461 (program akwakultury) i 248828 (program Digital Life Norway).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
VibratomeLeicaVT1000 S
Klej chirurgicznyWPIVETBOND3M Vetbond Klej do tkanek
Ostrza ze stali nierdzewnejCampden Instruments752-1-SS
metalowe formySAKURA4122
stalowa harfaWarner instrumenty64-1417
PBSSIGMAD8537
LMP agarozainvitrogen166520-100
Sutter InstrumentBF150-110-10HPborokrzemian z żarnikiem Średnica zewnętrzna: 1,5 mm, średnica wewnętrzna: 1,10 mm
Mikroskop SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Urządzenia molekularne#1-2500-0180oprogramowanie
Digitizer Digidata 1550A1Urządzenia molekularneDD1550
Wzmacniacz Multiclap 700B Headstage CV-7BUrządzenia molekularne1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sól trifluorooctanu 
ściągacz do pipetSutter InstrumentP-1000
amfoterycyna BSIGMAA9528antybiotyk tworzący pory
polietylenimin SIGMAP314350% strzykawka do mikrofilu z roztworem PEI
WPIMF28/g67-5
szkło do mostka agarowegoSutter InstrumentBF200-116-15borokrzemian z włóknem OD: 2,0 mm, ID: 1,16 mm polerowane ogniowo
oprogramowanieOprogramowanie do mikroskopii Open
Source Kamera optiMOS sCMOSQimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
SonicatorElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-GlucoseSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2SiGMAC8106
SacharozaSiGMA84097
D-mannitolSiGMA63565
Kwas MESSIGMAM0895
BSASIGMAA2153
Ultraczyste pipety krosowe Micro-Manager

Bibliografia

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracje elektrofizjologiczneperforowany patch clampperforacja amfoterycyn Bprzysadka ryb kostnoszkieletowychmedaka Oryzias latipessekcjonowanie w wibratomiewhole cell patch clamprejestracja potencja u czynno ciowegoroztw r wolny od wapnia
Zdrowe plastry mózgowo-przysadkowe do badań elektrofizjologicznych komórek przysadki mózgowej u ryb teleost
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.