Artykuł metodologiczny

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

DOI:

10.3791/57793

⸱

11 sierpnia 2018

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomateriały oferują szeroki zakres opcji dostosowywania kontrolowanego dostarczania pojedynczych i połączonych ładunków molekularnych do zastosowań terapeutycznych i obrazowania. Ta zwiększona specyficzność może mieć znaczące implikacje kliniczne, w tym zmniejszone skutki uboczne i niższe dawki o większej sile działania. Co więcej, celowanie in situ i kontrolowana modulacja określonych podzbiorów komórek może usprawnić badania in vitro i in vivo podstawowych zjawisk biologicznych i funkcji komórek sondujących. Niestety, wymagana wiedza specjalistyczna w dziedzinie nauki, chemii i inżynierii w nanoskali często uniemożliwia laboratoriom nieposiadającym doświadczenia w tych dziedzinach wytwarzanie i dostosowywanie nanomateriałów jako narzędzi do swoich badań lub nośników ich strategii terapeutycznych. W tym miejscu udostępniamy protokoły syntezy i skalowalnego montażu wszechstronnego nietoksycznego systemu kopolimerów blokowych, który można łatwo formować i ładować nośniki w skali nano do zastosowań biomedycznych. Nanoprecypitacja błyskawiczna jest przedstawiana jako metodologia szybkiego wytwarzania różnych nanonośników z kopolimerów poli(glikolu etylenowego)-bl-poli(siarczku propylenu). Protokoły te umożliwią laboratoriom dysponującym szeroką wiedzą specjalistyczną i zasobami łatwe i powtarzalne wytwarzanie zaawansowanych systemów dostarczania nanonośników do swoich zastosowań. Opisano projekt i budowę zautomatyzowanego przyrządu, który wykorzystuje wysokoobrotową pompę strzykawkową w celu ułatwienia procesu nanoprecypitacji błyskawicznej i umożliwienia lepszej kontroli nad jednorodnością, rozmiarem, morfologią i obciążeniem nanonośników polimerowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanonośniki pozwalają na kontrolowane dostarczanie małych i makromolekularnych ładunków, w tym aktywnych jednostek, które, jeśli nie są zamknięte, byłyby albo wysoce degradowalne i/lub zbyt hydrofobowe do podawania in vivo. Spośród regularnie wytwarzanych morfologii nanonośników, pęcherzyki polimerowe analogiczne do liposomów (zwanych również polimeromami) oferują możliwość jednoczesnego ładowania ładunku hydrofilowego i hydrofobowego 1,2. Pomimo obiecujących zalet, polimeromy są nadal rzadkie w zastosowaniach klinicznych, częściowo ze względu na kilka kluczowych wyzwań związanych z ich produkcją. Do użytku klinicznego preparaty polimerowe muszą być wytwarzane w dużych, sterylnych i spójnych partiach.

Do tworzenia polimeromów z kopolimeru diblokowego można użyć wielu technik, takich jak poli(glikol etylenowy)-blok-poli(siarczek propylenu) (PEG-bl-PPS), które zawierają dyspersję rozpuszczalnika3, thin film rehydration1,4, mikrofluidyka 5,6, oraz bezpośrednie uwodnienie7. Dyspersja rozpuszczalnika wiąże się z długim czasem inkubacji w obecności rozpuszczalników organicznych, które mogą denaturować niektóre ładunki bioaktywne, takie jak białka. Rehydratacja cienkowarstwowa nie zapewnia kontroli nad polidyspersyjnością utworzonych polimeromów, często wymagając kosztownych i czasochłonnych technik wytłaczania w celu uzyskania akceptowalnej monodyspersyjności. Co więcej, zarówno mikropłyny, jak i bezpośrednie uwodnienie są trudne do skalowania w przypadku większych wolumenów produkcji. Spośród różnych metod wytwarzania nanonośników, nanoprecypitacja błyskawiczna (FNP) oferuje możliwość tworzenia wielkoskalowych i powtarzalnych preparatów8,9,10. Podczas gdy FNP był wcześniej zarezerwowany do formułowania nanocząstek z rdzeniem stałym, nasze laboratorium niedawno rozszerzyło zastosowanie FNP o konsekwentne tworzenie różnych morfologii nanostruktur PEG-bl-PPS11,12, w tym polimersomes11 i nanosfery biciągłe12. Odkryliśmy, że FNP był zdolny do tworzenia monodyspersyjnych preparatów polimeromów bez konieczności wytłaczania, co skutkowało lepszymi wartościami wskaźnika polidyspersyjności w porównaniu z nieekstrudowanymi polimeromami utworzonymi przez rehydratację cienkowarstwową i dyspersję rozpuszczalnika11. Dwuciągłe nanosfery, z ich dużymi domenami hydrofobowymi, nie były w stanie powstać przez cienkowarstwowe ponowne uwodnienie, pomimo formowania w wielu warunkach rozpuszczalnikowych z FNP12.

Tutaj podajemy szczegółowy opis syntezy kopolimeru diblokowego PEG-bl-PPS używanego do tworzenia polimeromów, mieszalnika CIJ (Limited Impactment Jets) używanego dla FNP, samego protokołu FNP oraz implementacji zautomatyzowanego systemu w celu zmniejszenia zmienności użytkownika. Zamieszczono informacje o tym, jak wysterylizować system w stopniu wystarczającym do wytworzenia preparatów wolnych od endotoksyn do stosowania in vivo, a także reprezentatywne dane dotyczące charakterystyki polimeromów tworzonych przez FNP. Dzięki tym informacjom czytelnicy zainteresowani wykorzystaniem polimerosomów do prac in vitro i in vivo będą mogli wytwarzać własne sterylne, monodyspersyjne preparaty. Czytelnicy z doświadczeniem w formulacjach nanonośników i posiadający wiedzę specjalistyczną w zakresie syntezy polimerów będą mogli szybko przetestować własne systemy polimerowe przy użyciu FNP jako potencjalnej alternatywy dla obecnych technik formulacji. Dodatkowo, opisane w niniejszym dokumencie protokoły mogą być wykorzystywane jako narzędzia edukacyjne do formułowania nanonośników na kursach laboratoryjnych nanotechnologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza poli(glikolu etylenowego)-bloku-poli(siarczku propylenu)-tiolu

  1. Zsyntetyzować mesylan metoksy-poli(glikolu etylenowego) (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, I).
    1. Rozpuścić 10 g MeO-PEG17-OH w 200 ml 100% toluenu w kolbie okrągłodennej z 3 szyjkami (RBF) pod mieszaniem magnetycznym przy 600 obr./min.
    2. Podłącz 3-szyjkowy RBF do aparatu Deana-Starka, który sam jest podłączony do kondensatora, utrzymuj cały system pod gazem obojętnym, azotem lub argonem.
    3. Umieść RBF z 3 szyjkami w kąpieli olejowej, podgrzej do 165 °C, mieszając z prędkością 600 obr./min.
    4. Usunąć śladowe ilości wody i 100 ml toluenu za pomocą destylacji azeotropowej.
    5. Usuń 3-szyjkowy RBF z oleju, odłącz aparat Deana-Starka, utrzymując warunki gazu obojętnego i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    6. Dodać 5,6 ml 100% trietyloaminy (3 molowe ekwiwalent) i 300 ml bezwodnego 100% toluenu do roztworu MeO-PEG17-OH, mieszając przy 600 obr./min.
    7. Przenieś 3-szyjkowy RBF do łaźni lodowej, utrzymuj mieszanie przy 600 obr./min i w warunkach gazu obojętnego.
    8. Rozcieńczyć 3,1 ml 100% chlorku metanosulfonylu (3 molowe ekwiwalent) w 30 ml 100% toluenu, powoli dodawać do 3-szyjkowego RBF przez lejek do dodawania, mieszając z prędkością 600 obr./min.
    9. Mieszać przez noc przy 600 obr./min w temperaturze pokojowej w warunkach obojętnych.
    10. Przefiltrować roztwór przez lejek Buchnera wypełniony ziemią okrzemkową (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia soli.
    11. Usunąć toluen za pomocą parownika obrotowego z łaźnią wodną ustawioną na 40 °C, obrotami 120 obr./min i ciśnieniem ustawionym na 50-100 milibarów.
    12. Produkt należy ponownie rozpuścić w 200 ml 100% dichlorometanu (DCM) i przefiltrować przez lejek Buchnera wypełniony ziemią okrzemkową (patrz tabela materiałów).
    13. Usunąć DCM za pomocą parownika obrotowego z łaźnią wodną ustawioną na 40 °C, obrotami przy 120 obr./min i ciśnieniem ustawionym na 450-600 milibarów.
    14. Ostrożnie ponownie rozpuść produkt w 100% DCM i powoli wytrącaj produkt, dodając go kroplami (za pomocą pipety Pasteura) do 500 ml lodowatego 100% eteru dietylowego. Utrzymuj mieszanie z prędkością 300 obr./min.
    15. Zdekantować lub odessać w celu usunięcia eteru dietylowego z wytrąconego produktu, MeO-PEG17-Mesylate, i przechowywać przez noc w eksykatorze próżniowym do całkowitego wyschnięcia.
    16. Produkt należy zużyć natychmiast lub przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  2. Zsyntetyzować tiooctan metoksy-poli(glikolu etylenowego) (MeO-PEG17-TA, II).
    1. Rozpuścić 5 g MeO-PEG17-Ms (I) w 200 ml 100% bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) w 3-szyjkowym RBF, mieszać z prędkością 600 obr./min w temperaturze pokojowej w gazie obojętnym.
    2. Dodać 2,5 g 100% węglanu potasu (ekwiwalent 3 molowe) do roztworu mieszającego.
      Uwaga: Węglan potasu nie rozpuści się całkowicie w roztworze.
    3. Rozcieńczyć 1,3 ml 100% kwasu tiooctowego (3 molowe ekwiwalent) w 100 ml 100% bezwodnego DMF i dodawać kroplami do roztworu przez lejek do dodawania.
      Uwaga: Kwas tiooctowy ma silny, nieprzyjemny zapach. Należy zadbać o to, aby wszystkie zabrudzone przedmioty w okapie chemicznym pozostały przez noc przed utylizacją lub czyszczeniem.
    4. Mieszać energicznie (600 obr./min lub więcej) przez noc w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Tworzenie się soli może łatwo zakłócić mieszanie tego roztworu. Należy zachować ostrożność, aby utrzymać mieszanie przez noc.
    5. Przefiltrować roztwór przez lejek Buchnera wypełniony ziemią okrzemkową (patrz tabela materiałów).
    6. Usuń DMF za pomocą parownika obrotowego z łaźnią wodną ustawioną na 60 °C, obrotami 120 obr./min i ciśnieniem ustawionym na 5-15 milibarów.
    7. Produkt rozpuścić w 100 ml 100% tetrahydrofuranu (THF) i dodać do kolumny wypełnionej neutralnym tlenkiem glinu w celu usunięcia zanieczyszczeń o barwie czerwono-pomarańczowej.
    8. Usunąć THF za pomocą parownika obrotowego z łaźnią wodną ustawioną na 40 °C, obrotami 120 obr./min i ciśnieniem ustawionym na 200-300 milibarów.
    9. Produkt z trudem rozpuszcza się w 100% DCM. Jeśli utworzy się osad soli, przefiltruj roztwór przez bibułę filtracyjną o wielkości porów 6 μm za pomocą lejka Buchnera.
    10. Powoli wytrącić produkt, dodając kroplami za pomocą pipety Pasteura do 500 ml lodowatego 100% eteru dietylowego, mieszając z prędkością 300 obr./min. Eter dietylowy może wymagać dalszego schładzania do temperatury -20 °C w zamrażarce przeciwwybuchowej przez kilka godzin, jeśli osad nie wypadnie z roztworu w temperaturze 4 °C.
    11. Dekantować lub aspirować w celu usunięcia eteru dietylowego z wytrąconego produktu, tiooctanu MeO-PEG17. Produkt należy przechowywać przez noc w eksykatorze próżniowym, a następnie w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 °C.
  3. Synteza kopolimeru diblokowego poli(glikolu etylenowego)-blok-poli(siarczek propylenu)-tiol (PEG 17-bl-PPS 35-SH, III).
    1. Rozpuścić MeO-PEG17-TA (II) w 10 ml 100% bezwodnego DMF w kolbie Schlenka pod argonem, mieszając z prędkością 400 obr./min w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.
    2. Dodać 1,1 molowego ekwiwalentu mettlenku sodu (0,5 M roztwór w metanolu), pozostawić do mieszania z prędkością 400 obr./min przez 5 minut.
    3. Szybko dodać 35 molowych ekwiwalentów 100% siarczku propylenu do roztworu. Mieszać z prędkością 400 obr./min przez 10 minut.
    4. Dodać 10 molowych ekwiwalentu 100% lodowatego kwasu octowego, mieszać z prędkością 400 obr./min przez 5 minut.
    5. Usuń DMF za pomocą parownika obrotowego z łaźnią wodną ustawioną na 60 °C, obrotami 120 obr./min i ciśnieniem ustawionym na 5-15 milibarów.
    6. Produkt należy ponownie rozpuścić oszczędnie w 100% DCM, wyprowadzić w 80 ml 100% metanolu, podzielić na dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml.
    7. Odwirować stożkowe probówki o stężeniu 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    8. Produkt PEG 17-bl-PPS35-SH należy przechowywać przez noc w eksykatorze próżniowym, a następnie w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 °C.

2. Montaż nanonośników PEG-bl-PPS za pomocą ręcznego zasilanego nanoprecypitacji błyskawicznej

  1. (Opcjonalnie) Wysterylizuj mieszalnik z ograniczonymi strumieniami uderzeniowymi (CIJ).
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) mieszalnik zanurzeniowy ze wszystkimi częściami zdemontowanymi w ciągu 0,1 M NaOH przez noc.
    2. Ponownie zmontuj mieszalnik CIJ i przepuść przez wodę wolną od endotoksyn za pomocą strzykawek typu luer-lock.
    3. Sprawdź pH wody i kontynuuj przepuszczanie wody, aż pH zarejestruje się jako neutralne.
  2. Rozpuść polimer PEG 17-bl-PPS35-SH i ładunek hydrofobowy w THF (roztwór uderzeniowy 1).
    1. Odważyć 20 mg PEG 17-bl-PPS35-SH w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodaj barwniki hydrofobowe (np. DiI, ICG), leki (np. rapamycynę) lub inne ładunki.
      Uwaga: Ładunek może być suchy lub rozpuszczony w mieszalnym z wodą rozpuszczalniku, najlepiej THF. Jeśli ładunek jest nierozpuszczalny w THF lub DMF, można użyć innego mieszalnego z wodą rozpuszczalnika, ale oszczędnie, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby polimer był rozpuszczalny. Ilość ładunku, który można załadować, zależy od właściwości samego ładunku (np. masy cząsteczkowej, hydrofobowości, względów sterycznych) i powinna być badana indywidualnie dla każdego przypadku11,12.
    3. Dodaj 500 μl 100% THF do polimeru i ładunku, energicznie wiruj do rozpuszczenia.
  3. Rozpuścić ładunek hydrofilowy w buforze wodnym (roztwór uderzeniowy 2). W tym celu w razie potrzeby rozpuścić ładunek hydrofilowy, który ma być załadowany w pęcherzykach polimerowych, w 500 μl buforu wodnego (np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, czystej wody itp.).
  4. Dodaj bufor do zbiornika.
    1. Dodać 2,5 ml wybranego buforu wodnego (np. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami) do zbiornika o odpowiedniej wielkości (np. szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml). Umieść zbiornik pod mieszaczem CIJ w taki sposób, aby odpływ z mieszalnika bezpośrednio wchodził do zbiornika.
  5. Załaduj roztwory uderzeniowe do oddzielnych plastikowych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml.
  6. Zderzaj ze sobą roztwory, aby jednocześnie utworzyć nanostruktury i obciążyć je ładunkiem.
    1. Włóż strzykawki do adapterów Luer-lock w górnej części mieszalnika CIJ.
    2. Jednym, płynnym i szybkim ruchem wciśnij obie strzykawki jednocześnie i z równą siłą.
      Uwaga: W przypadku wykonywania wielu uderzeń sekwencyjnych, najpierw zbierz odpływ do pustego zbiornika.
    3. (Opcjonalnie) Wykonaj wiele uderzeń. Podzielić powstający roztwór nanostruktury między dwie strzykawki i powtórzyć kroki 2.6.1-2.6.2 do 4 razy więcej.
    4. Zebrać odpływ z wodnego zbiornika wypełnionego buforem, przygotowanego w ppkt 2.4.1 i delikatnie wymieszać, aby zapewnić wymieszanie.
  7. Usuń rozładowany ładunek i rozpuszczalnik organiczny.
    1. (Opcja 1) Dializować preparat nanonośnika w tym samym buforze wodnym, który jest używany do uderzenia i w zbiorniku, używając przewodów o odpowiednim odcięciu MW przez co najmniej 24 godziny z co najmniej 2 wymianami buforu. Można to zrobić w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Nanonośniki będą zatrzymywane przez rurki o wartości odcięcia MW <100 000 kDa i mogą być potencjalnie zatrzymywane również przez wyższe wartości odcięcia. Ta opcja zachowuje sterylność, gdy jest wykonywana w BSC przy użyciu sterylnego buforu.
    2. (Opcja 2) Przefiltruj preparat przez kolumnę wykluczającą wielkość lub kolumnę do odsalania/wymiany buforu (np. kolumna Sepharose 6B) przy użyciu 1x PBS jako buforu wodnego.
      Uwaga: Ta opcja zachowuje sterylność, gdy jest wykonywana w BSC z kolumną, która została dokładnie wysterylizowana.
    3. (Opcja 3) Usunąć lotny rozpuszczalnik organiczny za pomocą suszenia próżniowego przez noc.
    4. (Opcja 4) Formułowanie filtra za pomocą systemu filtracji o przepływie stycznym przy użyciu filtra 50-100 kDa przy natężeniu przepływu 20-60 ml/min przez 15 minut do 1 godziny, w zależności od masy cząsteczkowej oczyszczanego niekapsułkowanego ładunku (większy ładunek zajmie więcej czasu).
  8. (Opcjonalnie) Skoncentrować preparat nanonośnika.
    1. (Opcja 1) Zagęszczać za pomocą systemu koncentratora wirowego (np. kolumna wirowa z odcięciem MW > 100 000), używana zgodnie z opisem producenta.
      Uwaga: Nanonośniki mogą wymagać ponownego zawieszenia między spinami i mogą wymagać pewnej liczby spinów, aby skoncentrować się do pożądanej objętości. Stężenie spinów może zmniejszać sterylność preparatów nanonośników.
    2. (Opcja 2) Zmniejsz objętość za pomocą suszenia próżniowego.
      Uwaga: W tych warunkach zmiana objętości jest trudna do kontrolowania i należy zachować ostrożność, aby utrzymać osmolarność przed i po stężeniu.
  9. Nanonośniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez tygodnie lub miesiące. Przed użyciem po przechowywaniu należy krótko zawirować preparaty nanonośników.

3. Charakterystyka preparatów nanonośników

  1. Mierzenie efektywności załadunku
    1. Jeśli ładunek jest fluorescencyjny lub silnie absorbuje przy danej długości fali poza zakresem 260-450 nm, należy zmierzyć fluorescencję/absorbancję za pomocą fluorymetru/spektrofotometru.
      Uwaga: PEG-bl-PPS absorbuje silnie od 260-310 nm, a formulacje polimerowe absorbują od 310-450 nm, co może komplikować kwantyfikację ładunku absorbującego na podobnej długości fali.
    2. Jeżeli ładunek absorbuje promieniowanie w zakresie 260–450 nm i jest hydrofilowy, należy rozbić nanostruktury PEG-bl-PPS poprzez dodanie 25 μl preparatu do równej objętości 1%H2O2 lub 1% Triton X-100, a następnie oddzielić i odróżnić ładunek od absorbancji polimeru za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy użyciu kolumny wykluczającej wielkość kompatybilnej z wodnymi (np. kolumna Sepharose 6B) 11.
    3. Jeśli ładunek absorbuje się w zakresie 260-450 nm i jest rozpuszczalny w THF lub DMF, liofilizuj preparat poprzez zamrożenie 100 μl w plastikowej tubie o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C przez noc. Następnie umieść probówkę w szklanym pojemniku próżniowym i umieść na liofilizatorze. Odczekać 24 godziny na liofilizację, a następnie ponownie rozpuścić się w 50 μl DMF lub THF przed oddzieleniem i wykryciem za pomocą HPLC.
  2. Pomiar wielkości i morfologii nanonośnika
    1. Użyj dynamicznego rozpraszania światła (DLS)11 lub analizy śledzenia nanocząstek13, aby zmierzyć rozmiar nanonośnika.
      Uwaga: Oczekuje się, że nanonośniki utworzone z PEG 17-bl-PPS35-SH będą miały średnią średnicę w zakresie 100-200 nm, przy wskaźniku polidyspersyjności < 0,3.
    2. Określ morfologię nanonośnika za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryoTEM)14.
      Uwaga: Oczekuje się, że nanonośniki utworzone z PEG 17-bl-PPS35-SH będą pęcherzykami polimerowymi (polimeromami) z wyraźnie dostrzegalną membraną polimerową i w dużej mierze kulistym kształtem.
  3. (Opcjonalnie) Preparaty testowe dla endotoksyny
    1. (Opcja 1) Należy użyć testu komórkowego na obecność endotoksyny, np. komórek RAW Blue lub komórek HEK Blue TLR4 (patrz tabela materiałów), zgodnie z opisem producenta, w teście ilościowym lub jakościowym na obecność lipopolisacharydów (LPS)13.
    2. (Opcja 2) Użyj zestawu testowego Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15, zgodnie z opisem producenta.

4. Produkcja wysokoobrotowej pompy strzykawkowej dla FNP

  1. Wytwarzanie niestandardowych komponentów instrumentów.
    Uwaga: Modele 3D do obróbki wszystkich niestandardowych części są dostarczane w materiałach dodatkowych.
    1. Obrabiamy wielowarstwowe podwozia instrumentów z arkuszy akrylowych 3/4" i montujemy (patrz pliki uzupełniające 1-5).
      Uwaga: Akryl ma słabą odporność chemiczną. Jeśli instrument ma być używany z ostrymi rozpuszczalnikami, obrób podstawę z metalu uznanego za odpowiedni do danego zastosowania.
    2. Części do druku 3D z nadrukowanym tworzywem polilaktydowym (PLA).
      1. Wydrukuj 2-częściowe urządzenie do wydalania strzykawki (SE): SE część 1 - Tylny wózek do trzymania bloku FNP (Rysunek 5F, szara część; Plik uzupełniający 6) oraz SE część 2 - Przewodnik po wydalaniu z przodu (Rysunek 5F, część; Plik uzupełniający 7). Schematy znajdują się w pliku uzupełniającym 2.
      2. Wydrukuj nawiasy klamrowe czujnika podczerwieni (Rysunek 5I, czarne pola; Akta uzupełniające 8 i 9).
      3. (Opcjonalnie) Wydrukuj wspornik tłoka podwójnej strzykawki.
  2. Przymocuj warstwy podwozia instrumentu za pomocą sześciokątnych M5 i dodaj gumowe nóżki do podstawy.
  3. Skonfiguruj komputer jednopłytkowy z systemem operacyjnym Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (opartym na Linux Debian).
    Uwaga: Oprogramowanie do obsługi przyrządu jest dostępne na żądanie. Kod źródłowy oprogramowania instrumentu dostępny na żądanie. Po otrzymaniu spakowanego pliku pobierz wszystkie zależności określone w pliku README. Oprogramowanie to zawiera prosty graficzny interfejs użytkownika, który umożliwia kontrolę nad pracą urządzenia, w tym podstawowymi parametrami pracy (prędkość silnika, kierunek itp.). Użytkownicy są zachęcani do rozwijania istniejącego kodu źródłowego i programowania niestandardowych modułów dostosowanych do wykorzystania w ich własnych eksperymentach. Całe oprogramowanie zostało napisane przy użyciu Pythona 2.7.12 i nie jest obecnie kompatybilne z Pythonem 3. Wykorzystywane są moduły RPi, PicoBorgRev, kivy i wieloprocesorowe. Plik README zawiera szczegółowe informacje dotyczące licencji na dystrybucję oprogramowania.
  4. Zainstaluj szczotkowy silnik prądu stałego 24 V (Rysunek 5A) i prowadnicę precyzyjną (skok 4,5" (114,3 mm); śruba 1,27 mm) (Rysunek 5C).
    Uwaga: Zastosowany tutaj silnik prądu stałego 24 V mamaks. RPM max, Imax i moment obrotowy przy pełnym obciążeniu odpowiednio 4 252 RPM, 4.83 A i ~0.2 N*m.
    1. (Opcjonalnie) Umieść wyściółkę pod silnikiem, aby tłumić wibracje podczas pracy.
      Uwaga: Zaleca się przycięcie gumowej podkładki o grubości 2-3 mm w celu dopasowania do wymiarów wózka silnika podstawy przyrządu.
    2. Zamontuj precyzyjny suwak do podstawy instrumentu.
      1. Tymczasowo usuń pręt gwintowany.
      2. Zamontuj suwak za pomocą dwóch płaskich maszynowych #8-32.
    3. Zamontuj silnik prądu stałego na prowadnicy precyzyjnej za pomocą sprzęgła belki śrubowej (długość 1-1/4") zawierającego otwory o średnicy 6/16" i 1/4".
      Uwaga: W zależności od grubości akrylu użytego do obróbki warstw bazowych instrumentu, do wypoziomowania silnika i precyzyjnych wałów ślizgowych mogą być potrzebne podkładki techniczne.
  5. Zmontuj platformę wypędzającą z metalowych płyt i narożnych wsporników w kształcie litery L (Rysunek 5D). Zamontuj platformę z metalu nieszlachetnego na platformie przesuwnej (przymocowanej do pręta gwintowanego) za pomocą #6-32. Zobacz schemat prowadnicy precyzyjnej dostarczony przez producenta, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ograniczeń montażowych.
  6. Zmontuj konfigurację systemu wydalania strzykawki.
    1. Przymocuj bloki poduszkowe ruchu liniowego (platformy montażowe + łożysko ruchu liniowego) na chromowanych szynach ze stali nierdzewnej M8 (równoległe szyny stalowe można łatwo zaobserwować w Rysunek 5).
    2. Gwintować szyny przez liniową prowadnicę/wspornik wału i szyny blokujące. Użyj trzech prowadnic na szynę. Zamontuj części SE 1 i 2 na oprawach stojących za pomocą maszynowych M4.
    3. Luźno połącz części SE 1 i 2 za pomocą sześciokątnych M8. Skonfiguruj przestrzeń między SE część 1 i 2 ze śrubowymi sprężynami naciskowymi zakrywającymi każdą, która jest zabezpieczona między dwiema nylonowymi tulejami skierowanymi do wewnątrz (patrz Rysunek 5F). Zamontuj te tuleje na zewnątrz SE część 1 i SE część 2.
  7. Obwód przewodowy (patrz Rysunek 6 dla schematu okablowania rdzenia)
    1. Podłącz sterownik silnika do pinów I2C/SDA, 3.3 V i GND w komputerze jednopłytkowym.
    2. Podłącz zaciski silnika prądu stałego do bloków M- i M+ płyty sterownika silnika. Podłącz zasilacz 24 V, 2,5 A (Rysunek 5B) do bloków V+ i GND sterownika silnika (sterownik jest zamknięty w prostej skrzynce elektronicznej w ostatecznym projekcie, patrz Rysunek 5H).
    3. Podłącz piny 3V3 i 5V płyty sterującej silnikiem do odpowiednich pinów w komputerze jednopłytkowym. Podłącz piny SDA i SCL sterownika silnika odpowiednio do pinów 3 i 5 komputera jednopłytkowego.
      Uwaga: Polecenia są wydawane do silnika prądu stałego z komputera jednopłytkowego za pośrednictwem sterownika silnika. Prędkość obrotowa silnika jest kontrolowana poprzez regulację napięcia na zaciskach silnika za pomocą modulacji szerokości impulsu. W tej konfiguracji maksymalny prąd przepływający przez silnik 24 V DC (natężenie prądu przy pełnym obciążeniu: 4,83 A) jest ograniczony do 2,5 A przez zasilacz 24 V. Zaleca się, aby obwód silnika był podłączony przez normalnie zamknięty (NC) wyłącznik awaryjny (Rysunek 5J). W ten sposób można zakłócić działanie obwodu silnika, aby umożliwić podstawową operację awaryjnego wyłączania.
    4. Podłącz przednie i tylne czujniki zbliżeniowe podczerwieni (cyfrowe czujniki odległości, Rysunek 5I) do pinów GPIO RPi odpowiednio 24 i 23.
      1. Poprowadź okablowanie czujnika przez kanały w podstawie przyrządu.
        Uwaga: Czujniki podczerwieni to bezdotykowe czujniki ruchu świateł przerywających o zasięgu wykrywania 2-10 cm.
      2. 4.7.4.2 Zatrzaśnij przewodowe czujniki podczerwieni w wydrukowanych w 3D klamrach czujnika podczerwieni (Rysunek 5I, czarne skrzynki) i zamontuj na podstawie instrumentu. Po prawidłowym umieszczeniu w usztywnieniu czoło czujnika powinno wystawać na zewnątrz z prostokątnego otworu ortezy o wymiarach 14 mm x 7 mm.
        Uwaga: te szelki czujnika mogą być tymczasowo zamontowane za pomocą rzepu lub kleju (tymczasowe mocowanie jest przydatne w celu odpowiedniego dopasowania i optymalizacji rozmieszczenia czujnika podczerwieni). Alternatywnie, montaż na stałe poprzez wywiercenie małych otworów prowadzących w podstawie przyrządu i zabezpieczenie klamer M2.
    5. Podłącz 7-calowy ekran dotykowy LCD do pinów 5 V, GND i interfejsu szeregowego wyświetlacza (DSI) komputera jednopłytkowego. Zespół 7-calowego wyświetlacza RPi i LCD jest pokazany w Rysunek 5G.

5. Wytwarzanie polimeromów za pomocą FNP za pomocą specjalnie zaprojektowanej szybkiej pompy strzykawkowej

  1. (Opcja 1) Użyj trybu automatycznego uruchamiania.
    1. Wybierz opcję Auto Run (Automatyczne uruchamianie) z menu głównego. System poprosi użytkowników, aby zezwolili silnikowi na automatyczne ustawienie platformy wypychania strzykawki na początku precyzyjnego suwaka. Przed kontynuowaniem upewnij się, że ścieżka przed i za metalową płytą jest wolna.
    2. Załadować plastikowe strzykawki o pojemności 1 ml zgodnie z opisem w punkcie 2.5 i zamontować strzykawki na żeńskich złączach Luer mieszalnika CIJ. Załaduj mieszalnik CIJ (z dołączonymi strzykawkami) do prostokątnego otworu tylnego wózka wydechowego (patrz Rysunek 5E).
    3. Ustaw żądaną prędkość silnika (jednostki: obr./min) za pomocą suwaka w graficznym interfejsie użytkownika (patrz uwaga poniżej, aby zapoznać się z ważnymi kwestiami). Optymalna prędkość obrotowa silnika będzie zależeć od konkretnej pompy i konfiguracji, ale musi zapewniać natężenie przepływu co najmniej 1 ml/s dla podanych tutaj wymiarów kanału mieszalnika CIJ.
      Uwaga: Podczas ustawiania natężenia przepływu należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. W pionowej, ręcznej konfiguracji FNP reagenty są wydalane ze strzykawek z szybkością ~1 ml / s, ale mogą być bardzo zmienne podczas jazdy ręcznej. Jest to po prostu natężenie przepływu przez cylinder strzykawki, które jest kontrolowane przez szybkość, z jaką użytkownik przesuwa tłok strzykawki. Należy pamiętać, że szybkość 1 ml/s nie odnosi się do natężenia przepływu na wylocie z dyszy o mniejszej średnicy. Przy wyżej określonych wymiarach kanału należy zachować ~1 ml/s, aby zapewnić odpowiednią liczbę Reynoldsa dla mieszania turbulentnego10. Można stosować różne natężenia przepływu, o ile średnica kanału jest odpowiednio dostosowana, aby utrzymać liczbę Reynoldsa, która obsługuje warunki turbulentne. Tłoki strzykawki są przesuwane przez prostopadłą metalową płytkę, która porusza się wzdłuż precyzyjnego aluminiowego suwaka sprzężonego ze szczotkowym silnikiem prądu stałego 24 V. W tej konfiguracji na maksymalne natężenie przepływu w beczce ma wpływ szereg czynników, w tym (1) maksymalna prędkość obrotowa silnika (4 252 obr./min) i skok suwaka precyzyjnego (1,27 mm), która jest sprzężona z wałem silnika, (2) moment obrotowy silnika (~0,2 N*m momentu obrotowego przy pełnym obciążeniu), który jest potrzebny do pokonania oporu przepływu (3) wkład ciśnienia wstecznego spowodowany wchodzeniem i wychodzeniem płynu z mieszalnika CIJ, oraz (4) wytrzymałość używanych strzykawek (użytkownicy powinni zwracać uwagę na siły działające na strzykawki i używać strzykawek o odpowiedniej mocy). W odniesieniu do punktu (2), przy zwiększaniu natężenia przepływu wymagany jest wystarczający moment obrotowy, aby uniknąć zatrzymania silnika przy jednoczesnym utrzymaniu stałego wydalania pod rosnącym ciśnieniem wstecznym. Natężenia przepływu w beczce – aby zilustrować natężenie przepływu w beczce, jakie może osiągnąć wspomniany system, rozważmy przypadek, w którym FNP jest wykonywany przy użyciu reagentów załadowanych do dwóch jednomililitrowych strzykawek. Aby osiągnąć natężenie przepływu 1 ml / s przez cylinder, silnik musi przesunąć metalową płytkę o odległość określoną przez długość tłoka (~68 mm dla typowej strzykawki o pojemności jednego ml) w ciągu jednej sekundy. Biorąc pod uwagę skok 1,27 mm prowadnicy precyzyjnej, wynika z tego, że silnik prądu stałego pracujący z prędkością 4 252 obr./min jest w stanie przesunąć platformę do ~90 mm/s (71 obr/s*1,27 mm/obr). Odpowiada to natężeniu przepływu w beczce wynoszącemu ~1,3 ml/s, które przekracza docelową szybkość 1 ml/s.
    4. Przed uruchomieniem przyrządu sprawdź system, aby upewnić się, że ścieżka platformy jest wolna od przeszkód oraz że przednie i tylne czujniki zbliżeniowe IR są wolne od przeszkód (czujniki podczerwieni to małe czarne skrzynki w pobliżu precyzyjnych zacisków suwakowych; patrz Rysunek 5I). Upewnij się również, że wylot rurki kapilarnej z mieszalnika CIJ jest poprowadzony do odpowiedniego pojemnika zbiorczego (np. szklanej zlewki itp.).
    5. Aby usunąć reagenty ze strzykawek i do mieszalnika CIJ, naciśnij przycisk Uruchom w interfejsie oprogramowania.
  2. (Opcja 2) Użyj trybu pracy ręcznej. Zapoznaj się z powyższymi wskazówkami dotyczącymi trybu automatycznego uruchamiania i zwróć uwagę na następującą zmianę w kroku 5.1.5: naciśnij przycisk do przodu wciśnięty w sposób ciągły przez zakończenie biegu (tj. platforma przesuwa się w odpowiedzi na zdarzenie po naciśnięciu, a silnik zatrzyma się w odpowiedzi na zdarzenie po zwolnieniu).
  3. (Opcja 3) Użyj trybu ręcznego pozycjonowania platformy; ten tryb pozwala użytkownikom ustawić platformę poprzez uruchomienie silnika z niską prędkością (20% mocy) w odpowiedzi na przyciski do przodu i do tyłu w interfejsie oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiliśmy prosty protokół formułowania nanonośników zdolnych do ładowania hydrofilowego i hydrofobowego ładunku, które są bezpieczne dla in vivo podawania myszom i naczelnym11,13. Dołączyliśmy również szczegółowy protokół syntezy polimeru użytego w naszych reprezentatywnych wynikach, wraz z opisem wytwarzania niestandardowego przyrządu do mechanicznie kontrolowanego uderzania roztworów w mieszalniku CIJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy szczegółowe instrukcje dotyczące szybkiego wytwarzania polimerosomów przy użyciu PEG 17-bl-PPS35-SH jako kopolimeru diblokowego. Polimeromy pęcherzykowe są pierwotną morfologią agregatu złożonego w tym stosunku hydrofilowego PEG i hydrofobowego bloku PPS o masie cząsteczkowej. Po wielokrotnym uderzeniu mają średnicę i polidyspersyjność, które odpowiadają polimeromom wytłaczanym przez membranę 200 nm po uformowaniu przez uwodnienie cienkiej warstwy. Protokół ten elim...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie personelu i oprzyrządowania ze strony Zakładu Biologii Strukturalnej Uniwersytetu Northwestern. Dziękujemy za wsparcie ze strony R.H. Lurie Comprehensive Cancer Center Uniwersytetu Northwestern oraz Placówek Biologii Strukturalnej Uniwersytetu Northwestern. Bezpośredni detektor elektronów Gatan K2 został zakupiony za fundusze przekazane przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds z The Chicago Community Trust. Dziękujemy również następującym obiektom na Uniwersytecie Northwestern: Interdyscyplinarnemu Ośrodku Nauk o Powierzchni Keck, Ośrodkowi Biologii Strukturalnej, Ośrodku Obrazowania Biologicznego, Centrum Zaawansowanego Obrazowania Molekularnego oraz Rdzeniowi Sprzętu Analitycznego Bionanotechnologii. Badania te były wspierane przez grant National Science Foundation 1453576, National Institutes of Health Director's New Innovator Award 1DP2HL132390-01, Center for Regenerative Nanomedicine Catalyst Award oraz McCormick Catalyst Award 2014. SDA było częściowo wspierane przez NIH Predoctoral Biotechnology Training Grant T32GM008449.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw startowy CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
Platforma łożysk liniowych (mała) - średnica 8 mmAdafruit1179
Linear Motion Wałek 8 mm, długość 330 mm, chromowany, utwardzany powierzchniowo, metrycznyZestaw VXB11868
Prowadnica/podpora wału szyny liniowej - średnica 8 mmAdafruit1182
Precyzyjna prowadnica w pozycji ręcznej 4,5 cala skok, udźwig 15 funtówMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Silnik prądu stałego IronHorse Iron HorseMTPM-P10-1JK43
Oficjalny ekran dotykowy Raspberry Pi Foundation 7" Wyświetlacz LCDRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Zaawansowane sterowanie silnikiem dla Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Nośnik Pololu z cyfrowym czujnikiem odległości Sharp GP2Y0D810Z0F 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Łącznik belki śrubowej dociskowej, polerowane aluminium, cale, 5/16" średnica otworu A, średnica otworu 1/4" B, średnica zewnętrzna 1" OD, długość 1-1/4", 44 lb-in Nominalny moment obrotowyRulandPSR16-5-4-A
Eter monometylowy glikolu polietylenowegoSigma Aldrich202495
Chlorek metanosulfonyluSigma Aldrich471259
ToluenSigma Aldrich179418
Toluen, bezwodnySigma Aldrich244511
TrietyloaminaSigma AldrichT0886
Celite 545 (Ziemia Okrzemkowa)Sigma Aldrich419931
DichlorometanSigma Aldrich
Eter dietylowySigma Aldrich296082
N,N-dimetyloformamid, bezwodnySigma Aldrich227056
Węglan potasuSigma Aldrich791776
Kwas tiooctowySigma AldrichT30805
TetrahydrofuranSigma Aldrich360589
Aluminium tlenek, obojętny, aktywowany, Brockmann ISigma Aldrich199974
Roztwór mettlenku sodu, 0,5 M w metanoluSigma Aldrich403067
Siarczek propylenuSigma AldrichP53209
Kwas octowySigma AldrichA6283
MetanolSigma Aldrich320390
Wodorotlenek sodu, roztwór 1,0 NSigma AldrichS2770
Woda wolna od endotoksynGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Papierowe paski pHFisher Scientific13-640-508
Bez endotoksyn Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
Fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific03-337-4
1 ml strzykawka wykonana w całości z tworzywa sztucznegoThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Kolumna do chromatografii cieczowejMieszalnik CIJ Sigma AldrichC4169
HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Roztwór nadtlenku wodoruSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL Testy LALLonzaN183-125
320269,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flash NanoprecipitationPolymer VesiclesBioactive Protein LoadingImmunostimulant DeliverySynthetic NanocarriersHigh Speed Syringe PumpConfined Impingement JetsDynamic Light ScatteringCryogenic Transmission Electron MicroscopyTangential Flow Filtration

Powiązane artykuły