Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

19 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Streszczenie

Samice ssaków okresowo owulują prawie stałą liczbę oocytów podczas każdego cyklu rui. Aby utrzymać taką regularność i okresowość, regulacja zachodzi na poziomie osi podwzgórze-przysadka-gonady oraz na rozwijających się pęcherzykach w jajniku. Pomimo aktywnych badań, mechanizmy rozwoju pęcherzyków nie są jasne ze względu na kilka etapów od uśpionej pierwotnej aktywacji pęcherzyka do owulacji, a także ze względu na złożoność regulacji, która różni się na każdym etapie pęcherzyka. Aby zbadać mechanizmy rozwoju pęcherzyków i dynamikę pęcherzyków w całym cyklu rui, opracowaliśmy model hodowli tkanki jajnikowej myszy, który można wykorzystać do obserwacji rozwoju pęcherzyków za pomocą mikroskopu. Systematyczny rozwój pęcherzyków, okresowa owulacja i atrezja pęcherzyków mogą być odtwarzane w modelu hodowli jajników, a warunki hodowli można eksperymentalnie modulować. W tym miejscu pokazujemy przydatność tej metody w badaniu mechanizmów regulacyjnych rozwoju pęcherzyków jajnikowych i innych zjawisk jajnikowych.

Wprowadzenie

Jajniki samic myszy zawierają kilka tysięcy pęcherzyków1, a okresowa owulacja dojrzewa około dziesięciu oocytów w każdym cyklu rui. Pęcherzyki dzielą się na kilka etapów rozwojowych: pęcherzyki pierwotne, pierwotne, wtórne, antralne i Graafa, w zależności od formy ziarnistej warstwy komórkowej otaczającej każdy oocyt. Większość pierwotnych mieszków włosowych jest uśpiona, a niektóre z nich są aktywowane i rosną w pęcherzyki pierwotne w każdym cyklu rui2. Po wtórnym etapie folikularnym rozwój pęcherzyków jest regulowany głównie przez gonadotropiny, hormon folikularny (FSH) i hormon luteinizujący (LH). Jednak pierwotny i pierwotny rozwój pęcherzyków jest niezależny od gonadotropiny, a mechanizmy regulacyjne, które rządzą tymi etapami, pozostają słabo uzasadnione3,4,5. Oprócz czynników wzrostu i hormonów, pęcherzyk pierwotny i pierwotny jest regulowany przez interakcje między pęcherzykami6,7. W związku z tym przeprowadziliśmy analizy dynamiki pęcherzyków w tkankach jajnika myszy i zbadaliśmy związane z tym mechanizmy regulacyjne za pomocą kultur tkanek jajnika8,9,10.

Tutaj wprowadzamy dwie metody modelowania hodowli tkanek jajników. Pierwszy służy do analizy rozwoju pęcherzyków poprzez pomiar obszarów pęcherzyków, a drugi służy do badania mechanizmu regulacyjnego podczas wczesnego rozwoju pęcherzyków od pierwotnego do wtórnego etapu pęcherzyka u myszy transgenicznych. Do analizy rozwoju pęcherzyków wykorzystaliśmy głównie jajniki 4-tygodniowych samic myszy, ponieważ pozwalają one na łatwą wizualizację pęcherzyków. Aby wywołać okresową owulację i modelować rozwój pęcherzyków in vivo, odtworzyliśmy wyrzut LH i zaobserwowaliśmy owulację, atrezję pęcherzyków i wydzielanie estradiolu w warunkach hodowli tkankowej. Wykonano obrazy wyhodowanych jajników, a procesy rozwoju pęcherzyków przeanalizowano, śledząc zmiany w obszarze pęcherzyka. Jednak w analizach mikroskopowych w jasnym polu rozróżnienie między pierwotnymi a wczesnymi pęcherzykami pierwotnymi było niejasne. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykrywania małych pęcherzyków i rozróżniania pęcherzyków pierwotnych, pierwotnych i wtórnych w hodowanych tkankach jajnika przy użyciu Oogenesin1 (Oog1) pro3.9 i R26-H2B-mJajniki transgenicznych myszy Cherry w dniach 0 i 4 po urodzeniu11. Ekspresja Oog1 jest wykrywalna w oocytach po wejściu w mejozę i stopniowo wzrasta wraz z rozwojem pęcherzyków, co pozwala na obserwację przejścia od pęcherzyków pierwotnych do pierwotnych za pomocą obrazów poklatkowych hodowanej tkanki jajnika11,12. Chociaż do badania czynników aktywujących uśpione pęcherzyki pierwotne zastosowano metody morfologiczne13,14,15,16, fizjologiczny rozwój pęcherzyków w jajnikach jest trudny do zaobserwowania, a wpływ różnych czynników pozostaje niescharakteryzowany. Obecne metody hodowli zostały zaprojektowane w celu rozwiązania tego problemu w analizach czynników docelowych w czasie rzeczywistym.

W obecnym badaniu śledziliśmy rozwój mieszków włosowych za pomocą metody obrazowania poklatkowego i scharakteryzowaliśmy proces rozwoju pęcherzyków. Nasze nowatorskie metody oferują bezprecedensowe narzędzie do badania fizjologii jajników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były trzymane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 23 ±1 °C z cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Protokoły opieki nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Medycznym w Aichi i zostały zatwierdzone przez obecny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i potraw

  1. Aby przygotować podstawową pożywkę hodowlaną, dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/ml), LH (10 mU/ml) i penicylinę-streptomycynę (penicylinę, 100 U/ml; streptomycynę, 100 mg/ml) do minimalnej niezbędnej pożywki alfa (MEM-alfa) i wymieszać w probówkach o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Całkowite objętości wymaganych pożywek hodowlanych różnią się w zależności od eksperymentu, ale 1 ml pożywki hodowlanej jest na ogół wystarczający na 3,5 cm naczynia hodowlane ze szklanym dnem.
  2. Wlać 1 ml porcji mieszanej pożywki hodowlanej do 3,5 cm naczyń hodowlanych ze szklanym dnem i umieścić w szalkach 30-milimetrowe wkładki do hodowli komórkowych. Wstępnie podgrzej podłoża i naczynia w inkubatorze (5% CO2 i 37 °C).

2. Przygotowanie tkanki jajnikowej

  1. Wstępnie podgrzana sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (−) i MEM-alfa zawierające 5% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w inkubatorze (5%CO2 i 37 °C).
    UWAGA: Około 3 ml porcji PBS (−) na jajnik wystarcza do użycia podczas rozwarstwiania jajników, a 1 ml porcji MEM-alfa wystarczają do przejściowego przechowywania pojedynczych jajników w szalkach o średnicy 3,5 cm.
  2. Wytnij jajniki od 4-tygodniowej samicy myszy ICR (nazwanej tak na cześć Instytutu Badań nad Rakiem) i przytnij tkanki otaczające jajnik za pomocą nożyczek i pęsety pod mikroskopem stereoskopowym. Usunięte jajniki należy zarezerwować w pożywce hodowlanej (patrz krok 2.1) do czasu użycia.
    1. Umieścić pojedyncze jajniki na bibule filtracyjnej zwilżonej wstępnie podgrzanym PBS (−) (patrz krok 2.1) i pokroić na 4 części za pomocą ostrza mikrotomu pod mikroskopem stereoskopowym.
      UWAGA: Jajniki 4-tygodniowych myszy ICR mają średnicę około 2 mm. Liczba sztuk zależy od wielkości jajnika; Jednak kawałki o grubości około 500 μm pozwalają na prawidłowe obserwacje pęcherzyków (w kawałkach grubszych niż 500 mm przezroczystość tkanki jest zmniejszona; w kawałkach cieńszych niż 500 mm wiele pęcherzyków antralnych ulega pęknięciu i utracie).
    2. Po rozbiorzeniu umieść pokrojone próbki jajników we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej na 3,5 cm szalkach (patrz krok 2.1).

3. Posiew tkankowy jajnika

  1. Upuść około 0,5 μl pożywki hodowlanej na plasterki tkanki jajnika na wkładkę do hodowli komórkowej, w której tkanka jajnika zostanie osadzona za pomocą mikropipety.
  2. Umieść każdą pokrojoną próbkę w kropli pożywki hodowlanej na wkładkach do hodowli komórkowych za pomocą pęsety.
  3. Hodowla tkanek jajnika w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  4. Wymieniaj pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę co 2 dni.
    UWAGA: Harmonogram zmian pożywki w hodowli wycinków jajników od 4-tygodniowych myszy ICR jest przedstawiony w Rysunek 1.
    1. Aby odtworzyć wyrzut LH, należy traktować jajniki 4-tygodniowych myszy ICR pożywką zawierającą 100 mU / mL FSH i LH przez 12 godzin co 4 dni (Rysunek 1).

4. Obrazy mikroskopowe jajników hodowlanych

  1. Obrazowanie hodowanych jajników należy rozpocząć po 1 dniu, kiedy tkanki przylgną do wkładek do hodowli komórkowych i wykonywać analizy mikroskopowe konfokalne lub odwrócone w odstępach 24 godzin, aby umożliwić wystarczający wzrost pęcherzyków między punktami czasowymi.
    UWAGA: Mikroskopia konfokalna jest lepsza od mikroskopii odwróconej do obserwacji pęcherzyków w całych hodowanych jajnikach.

5. Obrazowanie poklatkowe zakulturowanych jajników

  1. Zoptymalizuj warunki obrazowania poklatkowego, w tym intensywność lasera i czasy naświetlania, dla systemu obrazowania (Tabela 1).
    1. Wybierz sparowane próbki jajników od pojedynczych myszy do wykorzystania jako grupa terapeutyczna i kontrolna. Zmieniaj intensywność lasera i czas naświetlania, aby uzyskać najlepsze obrazy (Tabela 1).
    2. Porównaj wzrost pęcherzyków w każdych warunkach hodowli, mierząc obszary pęcherzyków na obrazach próbek kontrolnych w odstępach 24-godzinnych oraz w próbkach obrazowania poklatkowego (patrz krok 6). Jednocześnie należy policzyć liczbę owulowanych komórek jajowych w każdym zestawie jajników i wybrać optymalne warunki obrazowania poklatkowego.
  2. Rejestruj obrazy w odstępach 30-minutowych za pomocą systemu obrazowania poklatkowego w określonych warunkach (tabela 1).

6. Analiza wzrostu mieszków włosowych

  1. Aby przeanalizować rozwój mieszków włosowych, zmierz obszary mieszków włosowych na przechwyconych obrazach za pomocą oprogramowania ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. Początkowo ustaw skalę obrazu, klikając "Ustaw skalę" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi. Wprowadź długości boków przechwyconego obrazu i odpowiadającą im liczbę pikseli w pustych polach odpowiednio "Znana odległość" i "Odległość w pikselach".
    2. Kliknij "Wolna ręka" na pasku narzędzi i obrysuj mieszki włosowe na przechwyconych obrazach w jasnym polu.
    3. Kliknij "Zmierz" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi.
      UWAGA: Jeśli potrzebne są inne dane pomiarowe, kliknij "Ustaw pomiar" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi i zaznacz odpowiednie pola na liście.

7. Analiza rozwoju pęcherzyków przy użyciu myszy transgenicznych

  1. Pobrać jajniki z dni po urodzeniu 0 i 4 (P0 i P4) samic myszy transgenicznych zawierających transgeny Oog1pro3.9 i R26-H2B-mCherr i posiewać je na insertach, jak opisano w krokach 1.1–3.2, z wyjątkiem tego, że nie należy kroić jajników P0 i P4.
  2. Pożywkę hodowlaną należy zastąpić świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką w 3,5 cm szalkach w inkubatorze zawierającym 5% CO2 w temperaturze 37 °C co 2 dni.
    UWAGA: Stężenie LH w pożywce hodowlanej jajników P0 i P4 może pozostać stałe, ponieważ wyrzuty LH nie występują u myszy P0 i P4.
  3. Ustawić mikroskop tak, aby uwidocznił tylko pęcherzyki pierwotne AcGFP1-dodatnie w hodowanych jajnikach P4 (Tabela 1).
    UWAGA: W jajnikach samic myszy P4 obecne są tylko pęcherzyki pierwotne i pierwotne.
  4. Uchwyć obrazy hodowanych jajników transgenicznych myszy P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry w odstępach 30-minutowych, korzystając z ustawień stosowanych dla jajników P4 (patrz krok 5.2).
  5. Śledź i analizuj rozwój pęcherzyków za pomocą sygnałów AcGFP1 i H2B-mCHerry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia protokół wymiany mediów podczas hodowli tkanki jajnika. Zgodnie z tym programem, jajniki 4-tygodniowych myszy ICR były hodowane i obrazowane w odstępach 24-godzinnych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Rysunek 2). Podczas 3-tygodniowej hodowli tkanek jajnika większość pęcherzyków antralnych i wtórnych uległa degeneracji w wyniku atrezji pęcherzyków, a niektóre z nich owulowały (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opracowaliśmy dwie nowe metody badania rozwoju pęcherzyków w jajnikach myszy. Pierwsza metoda polega na hodowli pokrojonych tkanek dorosłych myszy jajnikowych, a następnie analizie rozwoju pęcherzyków, a druga polega na wykorzystaniu obrazowania poklatkowego w celu wizualizacji wczesnego rozwoju pęcherzyków na etapie niezależnym od gonadotropin. Wcześniej stosowaliśmy obecną metodę hodowli tkanki jajnika do oceny wpływu czynnika hamującego białaczkę i progesteronu na rozwój pęcherzyków

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Naojiro Minami (Uniwersytet w Kioto) za dostarczenie myszy Oog1pro3.9. Badania te były wspierane przez JSPS (KAKENHI #JP15H06275) i Fundację Nitto.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hormon folikulotropowy z ludzkiej przysadkiSIGMAF4021
Hormon lutenizujący z przysadki koniSIGMAL9773
Roztwór penicyliny i streptomycynyWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a, GlutaMax, bez nukleotydówThermo Fisher32561037
Naczynie ze szklanym dnemMatTekP35G-0-10-C35mm szalka, nr 0 szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 10mm
Wkład do hodowli komórkowych MillicellMerck MilliporePICM0RG50Średnica: 315 mm, wielkość porów: 0,4 mm, materiał: hydrofilowy PTTE
3,5 cm naczynia do hodowli komórkowychGreiner Bio-ONE627160
50ml / probówka wirówkowa z potrójną nasadką uszczelniającąIWAKI2345-050
Niskoprofilowe ostrza jednorazowe 819Leica14035838925
LSM 710Mikroskop konfokalnyCarl Zeiss
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric CorporationObrazowanie poklatkowe
BZ-X700KEYENCEObrazowanie poklatkowe

Bibliografia

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozw j p cherzykaatrezja p cherzykaobrazowanie time lapseanaliza w programie ImageJterapia FSH i LHhodowla przekroj w jajnikap cherzyki pierwotnetransgeniczne mCherry
Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.