Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Summary

Tutaj opisujemy protokół decelularyzacji żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka.

Abstract

Przewody naczyniowe używane podczas większości operacji naczyniowych to allogeniczne lub syntetyczne przeszczepy, które często prowadzą do powikłań spowodowanych immunosupresją i słabą drożnością. Inżynieria tkankowa oferuje nowatorskie rozwiązanie do generowania spersonalizowanych przeszczepów z naturalną macierzą zewnątrzkomórkową zawierającą komórki biorcy przy użyciu metody decelularyzacji i recelularyzacji. Przedstawiono szczegółową metodę wykonywania decelularyzacji żyły odpiszczelowej człowieka oraz recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej. Żyłę zdecelularyzowano przez perfuzję 1% Triton X-100, 1% fosforanu tri-n-butylu (TnBP) i 2000 jednostek Kunitza dezoksyrybonukleazy (DNazy). Triton X-100 i TnBP perfuzjono w stężeniu 35 ml/min przez 4 godziny, podczas gdy DNazę perfundowano w tempie 10 ml/min w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Żyłę przemyto w ultraczystej wodzie i PBS, a następnie wysterylizowano w 0,1% kwasie nadoctowym. Został ponownie przemyty w PBS i wstępnie kondycjonowany w podłożu śródbłonkowym. Żyłę podłączono do bioreaktora i perfundowano pożywką śródbłonkową zawierającą 50 j.m./ml heparyny przez 1 godzinę. Recelularyzacja przeprowadzono poprzez napełnienie bioreaktora świeżą krwią, rozcieńczoną w stosunku 1:1 w roztworze Steena i dodanie czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzących z gruczołów dokrewnych (80 ng/ml), zasadowych czynników wzrostu fibroblastów (4 μl/ml) i kwasu acetylosalicylowego (5 μg/ml). Bioreaktor został następnie przeniesiony do inkubatora i poddany perfuzji przez 48 godzin z prędkością 2 ml/min, utrzymując poziom glukozy w zakresie 3-9 mmol/l. Następnie żyłę przemywano PBS, wypełniono pożywką śródbłonkową i perfundowano przez 96 godzin w inkubatorze. Leczenie Triton X-100, TnBP i DNazą spowodowało decellularyzm żyły odpiszczelowej w 5 cyklach. Żyła pozbawiona komórek wyglądała na białą w przeciwieństwie do żył normalnych i recellularnych (jasnoczerwona). Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazało obecność jąder tylko w normalnych, ale nie w żyłach pozbawionych komórek. W żyle recellularizowanej barwienie H&E wykazało obecność komórek na powierzchni światła żyły.

Introduction

Przewody naczyniowe są wymagane w przypadku kilku stanów klinicznych, takich jak tętniaki, zwężenie tętnicy szyjnej i miażdżyca, prowadzące do poważnych problemów naczyniowych. Chirurdzy używają autologicznych, allogenicznych lub syntetycznych przewodów naczyniowych, aby przywrócić funkcjonalny dopływ krwi. Chociaż stosowanie autologicznych naczyń krwionośnych jest nadal uważane za idealne podejście, ich dostępność u pacjentów jest znacznie ograniczona. Alternatywy, takie jak przeszczepy allogeniczne lub syntetyczne, mają poważne problemy z leczeniem immunosupresyjnym i słabą drożnością prowadzącą do reoperacji^1,2, co skutkuje poważnymi obciążeniami zdrowotnymi dla krajów. Inżynieria tkankowa naczyń krwionośnych ma na celu zapewnienie przeszczepom naturalnej homologii i komórek autologicznych. W ten sposób układ odpornościowy biorcy rozpoznaje przeszczepiony przeszczep jako jaźń, a ponieważ taki przeszczep zawiera naturalne białka i komórki w oryginalnej konfiguracji, może działać lepiej w porównaniu z obecnymi alternatywami. Narządy inżynierii tkankowej, takie jak bladder³, urethra⁴, trachea⁵ i veins^6,7, zostały z powodzeniem wykorzystane w klinice.

Inżynieria tkankowa do produkcji spersonalizowanych przeszczepów wymaga przeszczepu od dawcy, a następnie decelularyzacji i recelularyzacji. Decelularyzacja to obiecująca technologia usuwania komórek z tkanek i narządów^8,9,10. Decelularyzacja może być przeprowadzana za pomocą określonych metod fizycznych, chemicznych i enzymatycznych¹¹ lub poprzez ich połączenie. Przy optymalnym zastosowaniu tych metod, tkanki pozbawione komórek mogą mieć podobne białka strukturalne i funkcjonalne w macierzy zewnątrzkomórkowej podobne do tkanek natywnych. Takie narządy posiadają wewnętrzną zdolność do wzmacniania przyczepiania, migracji, proliferacji i różnicowania napływających komórek macierzystych.

Recelularyzacja to dynamiczny proces wprowadzania komórek do przeszczepu, a komórki macierzyste biorcy mogą być używane do klinicznego przeszczepu. Komórki macierzyste obecnie wykorzystywane do takich celów obejmują szpik kostny, mezenchymalny i mieszkańców narządów^3,5,6. W badaniach na zwierzętach i badaniach naukowych wykorzystano komórki macierzyste pochodzenia mezenchymalnego, które są płodowe i indukowane pluripotencjalne^12,13,14. Proces ten wymaga bioreaktora (komory, w której znajduje się żyła i zapewnia niezbędne warunki, takie jak temperatura, gazy, pH i ciśnienie), komórek i pożywek hodowlanych. Wyzwaniem w recelularyzacji jest uzyskanie wymaganej liczby komórek określonego typu i strategii wysiewu, dzięki której komórki mogą dotrzeć do całej tkanki lub narządu. Mimo że do tej pory nie wygenerowano i nie oceniono żadnej kompletnej tkanki lub narządu pod względem strukturalnym i funkcjonalnym, kilka postępów w tej dziedzinie i wstępne wyniki wskazują na przyszłą możliwość¹⁵. Kluczową funkcją żyły jest śródbłonek światła, który kontroluje infiltrację komórek zapalnych do tkanek oraz środkowa warstwa mięśni gładkich, która pomaga w zwężaniu, a także zapewnia siłę do utrzymania ciśnienia krwi¹⁶. Badania wykazały, że podczas uszkodzenia endotelializacja następuje albo w wyniku zespolenia, albo z krążących śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC) we krwi^17,18,19. Nasza strategia recelularyzacji żył opiera się na EPC obecnych we krwi krążącej.

Inżynieria tkankowa żył i tętnic została przeprowadzona przez kilka grup stosujących różne strategie decelularyzacji i recelularyzacji^20,21. Nasza grupa przeprowadziła również i opracowała strategie decelularyzacji i recelularyzacji żył biodrowych i sutkowych^6,7. Decelularyzacja została przeprowadzona przez mieszanie żyły w Triton X-100, fosforanie tri-n-butylu (TnBP) i enzymie dezoksyrybonukleazie (DNaza). Recelularyzację przeprowadzono przy użyciu komórek śródbłonka i mięśni gładkich pochodzących ze szpiku kostnego⁶ lub krwi obwodowej⁷. Żyły zrekomórkowane za pomocą któregokolwiek z protokołów wykazały kliniczną obietnicę w zapewnianiu funkcjonalnego zaopatrzenia w krew w transplantacji pacjentów pediatrycznych z dodatkową niedrożnością żyły wrotnej wątroby^6,7.

Obecnie opracowaliśmy zmodyfikowaną wersję tego samego protokołu dla lepszej i łatwiejszej wydajności decelularyzacji, recelularyzacji i obsługi żył o małej średnicy w bioreaktorze. Obecny protokół decelularyzacji wymagał perfuzji detergentów przez żyłę przy użyciu ciśnienia zamiast mieszania z detergentami. Protokół recelularyzacji obejmuje dodatkowy etap wstępnego kondycjonowania w celu poprawy adhezji komórek i dodania czynników wzrostu w krążącej krwi w celu poprawy adhezji, przeżycia i proliferacji komórek. Udoskonaliliśmy również konstrukcję bioreaktora, wykorzystując produkty dostępne na rynku. W artykule przedstawiono szczegółowy opis zmodyfikowanego protokołu wykonywania decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka.

Protocol

Użyta tkanka i protokół tego artykułu są zgodne z etycznymi wytycznymi Uniwersytetu w Göteborgu.

1. Przygotowanie i przechowywanie tkanek

1. Wytnij otaczającą tkankę z pobranej żyły odpiszczelowej za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek.
   UWAGA: Żyła odpiszczelowa jest wycinana z kończyny dolnej człowieka przez chirurgów naczyniowych. Żyła odpiszczelowa użyta w tym artykule jest nieużywaną częścią po operacji pomostowania.
2. Aby zapobiec wyciekowi podczas perfuzji, podwiąż wszystkie boczne gałęzie na ich końcach za pomocą szwów i kleszczy.
3. Trzymaj żyłę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS). Przemyj żyłę, zmieniając PBS 2-3 razy, aby usunąć nadmiar krwi. Przechowywać żyłę przez zamrożenie w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie zestawów do decelularyzacji i bioreaktora do recelularyzacji

UWAGA: Za pomocą nożyczek przetnij silikonowe rurki tak, jak pokazano w Tabeli 1.

1. Konfiguracja decelularyzacji 1 (dla perfuzji i mycia Triton X-100)
   1. Do komory o pojemności 2 litrów (plastikowej wanny) przyklej taśmą wszystkie trzy kawałki rurki A, jak pokazano w Rysunek 1A.
      UWAGA: Przyklej jedną rurkę do jednej ścianki w miejscu, w którym krawędź styka się z dnem komory (wlotem detergentu), a pozostałe dwie rurki do przeciwległej ścianki w odległości 5 - 10 cm między nimi, w zależności od długości żyły. Co najmniej 5 cm tych rurek powinno być również przyklejone taśmą do dna komory (wlot i wylot żyły).
   2. Za pomocą męskich i żeńskich złączy Luer połącz szeregowo rurkę doprowadzającą detergent do rurki B, następnie rurki F, rurki C i na końcu do wlotu żyły. Umieścić rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej I.
   3. Weź kolejną rurkę C i podłącz jeden koniec do ujścia żyły. Umieść drugi koniec w szklanym słoiku z dolnym wylotem węża, który znajduje się 45 cm nad komorą (wylot detergentu) i przyklej go taśmą, aby zabezpieczyć. Weź rurkę G i wepchnij jeden koniec do wylotu węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w komorze żylnej.
      UWAGA: Zdjęcia kompletnej konfiguracji (czerwone strzałki), komory i kierunku przepływu (białe strzałki) są pokazane w Rysunek 1A.
2. Konfiguracja decelularyzacji 2 (dla perfuzji TnBP)
   1. Weź szklany słoik o pojemności 1 litra i umieść jeden koniec rurki C (wlot detergentu) w słoiku, aż rurka dotknie dna słoika.
   2. Podłącz drugi koniec do rurki F, a następnie rurki C. Umieść drugi koniec rurki C w słoiku do połowy głębokości (wlot żyły). Umieścić rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej I.
   3. Weź rurkę D i umieść jeden koniec w słoiku (wylot żyły) do połowy głębokości, a drugi koniec w szklanym słoiku z dolnym wężem umieszczonym na wysokości 45 cm od wlotu żyły (wylotu detergentu). Aby zabezpieczyć, zaklej taśmą rurki wlotowe i wylotowe detergentu.
   4. Umieść szklany słoik o pojemności 1 l na mieszadle magnetycznym i trzymaj magnes wewnątrz butelki.
   5. Weź rurkę G i wepchnij jeden koniec na wylot węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w szklanym słoiku o pojemności 1 l.
      UWAGA: Obraz kompletnej konfiguracji (czerwone strzałki), komory i kierunku przepływu (białe strzałki) jest pokazany w Rysunek 1B.
3. Konfiguracja decelularyzacji 3 (dla perfuzji DNazy)
   1. Weź szklaną butelkę o pojemności 250 ml i umieść oba końce probówki C. Umieść środkową część rurki w kasecie pompy perystaltycznej II.
      UWAGA: Jeden koniec rurki jest wlotem roztworu, a drugi koniec rurki jest podłączony do wlotu żyły. Ujście żyły pozostawia się wolne w roztworze.
   2. Umieść cały zestaw wraz z pompą w temperaturze 37 °C. Obraz kompletnej konfiguracji i kierunku przepływu jest pokazany w Rysunek 1C.
4. Bioreaktor recelularyzacyjny
   1. Przygotuj wszystkie części, jak pokazano na Rysunek 2A.
   2. Jak pokazano w Rysunek 2B, weź 4-portową nasadkę i włóż do każdego portu, rurkę H (wylot żyły), rurkę I (wlot mediów) i rurkę J (wlot żyły). Włóż drugi koniec rurki H do 4^{. portu (}gniazda mediów).
      UWAGA: Widok 4-portowej nasadki od góry jest pokazany na Rysunek 2C. Aby ułatwić wkładanie rurek, przytnij krawędzie do ostrego punktu nożyczkami.
   3. Zegnij drugi koniec rurki J w kształt litery U i zawiąż ją szwem. Podłącz złącza redukcyjne do wewnętrznych końców rurek H i J.
   4. Umieść probówkę o pojemności 60 ml z płaską podstawą w szklanej butelce o pojemności 250 ml, a następnie umieść powyższą konfigurację w probówce, jak pokazano w Rysunek 2D. Jak pokazano na Rysunek 2E, połącz rury K, E i K szeregowo. Podłącz jedną rurkę K do wlotu żyły, a drugą rurkę K do wlotu mediów.
      UWAGA: Schemat ideowy konfiguracji i kierunku przepływu jest widoczny na Rysunek 2F.
   5. Wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie.

3. Przygotowanie roztworów

1. Roztwór 1 (10x woda): Do 1 l ultraczystej wody dodać 2 g azydku sodu i 18,6 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Mieszaj, aż sole się rozpuszczą.
2. Roztwór 2 (1x woda): Weź 100 ml roztworu 1 i dodaj 900 ml ultraczystej wody.
3. Roztwór 3 (5x Triton X-100): Do 950 ml ultraczystej wody dodać 50 ml Triton X-100, 1 g azydku sodu i 9,3 g EDTA. Mieszaj, aż się rozpuści.
4. Roztwór 4 (1x Triton X-100): Weź 200 ml roztworu 3 i dodaj 800 ml ultraczystej wody.
5. Roztwór 5 (1x TnBP): Dodać 10 ml TnBP za pomocą pipety 10 ml do 990 ml roztworu 2.
6. Roztwór 6 (40 jednostek Kunitza/ml DNazy): Dodać 2 000 jednostek Kunitza DNazy do 50 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego Dulbecco zawierającej CaCl₂ i MgCl₂. Przygotuj świeże i natychmiast zużyj.
7. Roztwór 7 (PBS): Dodać 24 g chlorku sodu, 0,6 g chlorku potasu, 4,32 g fosforanu sodu i 0,72 g fosforanu potasu do 3 l ultraczystej wody. Mieszaj, aż się rozpuści. Dostosować pH do 7,4. Wysterylizuj 1 l PBS w autoklawie i przechowuj oddzielnie.
8. Roztwór 8 (0,1% kwas nadoctowy): Do 50 ml sterylnego roztworu 7 dodać 50 μl kwasu nadoctowego. Przygotuj świeże i natychmiast zużyj.

4. Przygotowanie podłoża śródbłonkowego

1. Dodać 5 ml L-glutaminy, 5 ml anty-anty-anty, 50 ml ludzkiej surowicy AB i wszystkie składniki zestawu czynnika wzrostu EGM-2 z wyjątkiem płodowej surowicy bydlęcej do 500 ml pożywki dla MCDB131 pod sterylnym kapturem.

5. Decelularyzacja żyły odpiszczelowej

1. Rozmrozić ludzką żyłę odpiszczelową od -80 °C w temperaturze pokojowej. Ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C i ponownie rozmrozić w temperaturze pokojowej.
2. Wytnij biopsję o długości 2 mm za pomocą nożyczek i utrwal w formaldehydzie na 24 - 48 godzin w temperaturze pokojowej. Przywiąż każdy koniec żyły do zadziorów męskiego i żeńskiego łącznika Luer za pomocą szwu.
3. Podłącz żyłę do zestawu decelularyzacji 1 i napełnij 1 litr roztworu 2. Utymulować przez 15 min przy 35 ml/min. Opróżnij zawartość instalacji.
4. Dodać 1 l roztworu 4 i stosować przez 4 godziny w stężeniu 35 ml/min. Opróżnić zawartość zestawu.
5. Dodać 500 ml roztworu 2 i stosować przez 5 minut. Opróżnić zawartość zestawu. Powtórz ten krok. Odłącz żyłę od konfiguracji perfuzji 1 i podłącz do konfiguracji perfuzji 2.
6. Dodać 1 l roztworu 5, włączyć mieszadło i utrwalać przez 4 godziny przy 35 ml/min.
   UWAGA: Roztwór 5 wygląda na mętny po włączeniu mieszadła i przez cały czas perfuzji.
7. Odłączyć żyłę od zestawu perfuzyjnego 2 i przemywać żyłę na zewnątrz i wewnątrz strzykawką lub pipetą o pojemności 10 ml w 4 podmianach ultraczystej wody przez 5 - 10 minut.
8. Podłączyć żyłę do zestawu perfuzyjnego 3, dodać 50 ml roztworu 6 i wysysać z prędkością 10 ml/min w komorze o temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Opróżnij zawartość zestawu i odłącz żyłę od zestawu.
9. Podłącz żyłę do zestawu perfuzyjnego 1, napełnij 1 litr roztworu 2 i perfuzjuj przez noc z prędkością 35 ml/min. Powtórz kroki od 5.4 do kroku 5.9 4 razy (w sumie 5 cykli). Ponownie wykonaj biopsję, jak podano w kroku 5.2.
   UWAGA: Pomiń krok 5.8 druga część w cyklach 1 i 3.
10. Opróżnij zawartość instalacji. Napełnić 1 l roztworu 2 i uzgadniać przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Zmień roztwór 2 po 12 godzinach. Opróżnij zawartość instalacji. Napełnij 1 l ultraczystej wody i uzyskuj przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Wymień ultraczystą wodę po 12 godzinach. Opróżnij zawartość zestawu. Napełnić 1 l roztworu 7 i uzgadniać przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Zmień roztwór 7 po 12 godzinach.

6. Weryfikacja decelularyzacji

1. Umyj biopsje utrwalone formaliną w ultraczystej wodzie przez 15 minut. Przetwarzaj w procesorze tkanek zgodnie ze standardowymi protokołami i zanurz w parafinie²².
2. Wytnij skrawki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu i zabarwij hematoksyliną Meyera i 0,2% alkoholową eozyną (H&E) zgodnie ze standardowymi protokołami²².
3. Obejrzyj pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy nie ma utraty jąder w tkance pozbawionej komórek w porównaniu z normalną tkanką.

7. Recelularyzacja

1. Wysterylizuj żyłę, umieszczając ją w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 50 ml roztworu 8. Mieszać z prędkością 80 obrotów na minutę (obr./min) w wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
2. Od teraz należy obchodzić się z żyłą pod szafką z przepływem laminarnym (LAF), aby zachować sterylność. Przenieść żyłę za pomocą sterylnych kleszczyków do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 50 ml sterylnego roztworu 7 i 500 μl antyanty-anty. Mieszać jak wyżej przez 12 godzin. Zmienić roztwór 7 co najmniej dwa razy w międzyczasie.
3. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś żyłę do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 50 ml pożywki śródbłonkowej. Mieszać jak wyżej przez 11 godzin.
4. Zmontuj bioreaktor za pomocą sterylnych rękawiczek pod szafką LAF. Przywiąż żyłę do wlotu i wylotu żyły bioreaktora za pomocą sterylnego szwu i kleszczyków.
5. Podłącz żyłę do bioreaktora i napełnij ją tym samym medium. Dodać heparynę w stężeniu 50 j.m./ml i perfuzjować przez 1 godzinę w stężeniu 2 ml/min w temperaturze 37 °C.
6. Pobrać 15 - 25 ml świeżej krwi (w zależności od długości żyły) od dawcy w probówkach próżniowych pokrytych heparyną i rozcieńczyć w stosunku 1:1 roztworem Steena. Następnie dodaj czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzący z gruczołów dokrewnych (EG-VEGF, 80 ng / ml), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF, 4 μl / ml) i kwas acetylosalicylowy (5 μg / ml).
7. Przenieść bioreaktor do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wysysać przez 48 godzin z prędkością 2 ml/min.
8. Po około 12 godzinach przenieś bioreaktor do szafy LAF, pobierz kroplę krwi i zmierz poziom glukozy za pomocą urządzenia do monitorowania stężenia glukozy we krwi. Jeśli poziom jest mniejszy niż 3 mmol/L, dodaj glukozę, aby uzyskać zakres 7 - 9 mmol/L. Powtarzaj ten krok co 8 - 12 godzin.
9. Po 48 godzinach przenieś bioreaktor do szafy LAF i spuść krew z bioreaktora. Dodać 30 ml sterylnego roztworu 7 i perfuzjować przez 5 minut. Odcedź roztwór. Dodać 30 ml sterylnego roztworu 7 i perfuzjować przez 5 minut. Powtórz dwa razy lub do momentu, gdy stracisz krwistoczerwony kolor.
   UWAGA: Biopsję można wykonać w celu weryfikacji przyczepu komórki. Odłącz żyłę, odetnij 5 mm krawędzie żyły nożyczkami i wyrzuć je. Wykonaj biopsję zgodnie z opisem w kroku 5.2 i ponownie podłącz żyłę do bioreaktora (krok opcjonalny).
10. Dodać 30-45 ml pożywki śródbłonkowej i perfuzjować przez 96 godzin w inkubatorze w tempie 2 ml/min.
    UWAGA: Dodawaj podłoże śródbłonkowe, aż żyła zostanie zanurzona.
11. Przenieś bioreaktor do szafy LAF, odłącz żyłę recelularyczną, odetnij 5 mm krawędzie żyły za pomocą nożyczek i wyrzuć. Wykonaj biopsję, jak opisano w kroku 5.2.

8. Weryfikacja recelularyzacji

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji 6 i wykonaj barwienie H&E. Zbadaj szkiełka pod mikroskopem pod kątem obecności komórek.

Results

Ogólna morfologia żyły normalnej jest jasnoczerwona (Rysunek 3A). Czerwony kolor jest tracony w progresywnych cyklach decelularyzacji (cykl 2, Rysunek 3B; cykl 3, Rysunek 3C), a w 5 cyklu wygląda blado i biało (Rysunek 3D). Żyła recellularyczna po perfuzji krwi (Ryc. 3E) i perfuzji śródbłonka (Rycina 3F) ma jaskrawoczerwony kolor. 5 cykli leczenia decelularyzacją skutecznie usunęło komórki z żyły, ponieważ nie zaobserwowano niebieskich jąder w barwieniu H&E (Figura 4B). W przeciwieństwie do tego, kilka jąder zaobserwowano w żyle prawidłowej (Ryc. 4A). Obecność przyłączonych komórek po stronie światła jest widoczna w barwieniu H&E w żyle recellularnej krwią przez 48 godzin (Ryc. 4C, czarne strzałki) i po perfuzji z podłożem śródbłonkowym przez 96 godzin (Rysunek 3D, czarne strzałki).

Rysunek 1: Montaż zestawów perfuzyjnych do decelularyzacji.A) Zdjęcie przedstawiające zmontowany zestaw decelularyzacji 1 dla Triton X-100 i mycie. Białe strzałki pokazują ścieżkę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty i wyloty żył i roztworów. B) Zdjęcie przedstawiające zmontowany zestaw do decelularyzacji 2 do perfuzji TnBP. Podobnie, jak w konfiguracji decelularyzacji 1, białe strzałki wskazują ścieżkę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty i wyloty dla żył i roztworów. C) Zdjęcie przedstawiające zmontowany zestaw do decelularyzacji 3 do perfuzji dezoksyrybonukleazy. Białe strzałki pokazują ścieżkę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty do żył i roztworów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie i montaż bioreaktora do recelularyzacji. A) Zdjęcie przedstawiające materiały potrzebne do montażu bioreaktora. B) Rysunek wnętrza nasadki 4-portowej pokazujący rozmieszczenie króćców redukcyjnych (czerwone strzałki), punkty do połączenia wlotu i wylotu żyły (białe strzałki) oraz układ rurek H, I i J. Wolny koniec rurki H jest umieszczany w bioreaktorze w celu powrotu mediów. C) Odpowiednie rurki wchodzące i wychodzące można zobaczyć z górnej strony nasadki 4 portów. D) Zdjęcie przedstawiające zmontowany bioreaktor. E) Zdjęcie przedstawiające całą konfigurację bioreaktora z pompą perystaltyczną. Rurki K przedłużają połączenia od bioreaktora do pompy perystaltycznej. F) Schematyczne przedstawienie całego systemu perfuzji bioreaktora. Pomarańczowe strzałki wskazują kierunek przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ogólna morfologia żył podczas decelularyzacji i recelularyzacji. A) Ogólna morfologia normalnej żyły ma jaskrawoczerwony kolor. Kolor jest tracony wraz ze wzrostem liczby cykli decelularyzacji B) cykl 2 i C) cykl 3. D) Po 5 cyklach żyła wygląda na bladą i białą. Żyła po perfuzji z E) krwią przez 48 godzin i F) z podłożem śródbłonkowym przez 96 godzin ponownie ma jaskrawoczerwony kolor. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka żył pozbawionych komórek i recelularyzowanych. Obraz barwienia hematoksyliną i eozyną A) normalnej żyły zawiera wiele niebieskich jąder, ale nie ma ich w B) żyle zdecelularizowanej. W żyle recellularnej z C) krwią przez 48 godzin i z D) śródbłonkiem przez 96 godzin, zauważono przyczepienie komórek (czarne strzałki) w świetle światła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiona tutaj technika decelularyzacji żył odpiszczelowych jest łatwą, prostą i opłacalną metodą, którą można również zastosować do wszystkich żył o małej średnicy, takich jak żyły pępowinowe i sutkowe. Roztwory decelularyzacyjne i ich stężenia stosowane w tej metodzie pochodzą z naszych poprzednich wyników ^6,7. Mimo że zalecamy 5 cykli decelularyzacji, w niektórych żyłach zauważyliśmy również całkowitą decelularyzację w 3 cyklach. Jednak powtarzalne wyniki uzyskano przy użyciu 5 cykli. Stosując ten protokół, z powodzeniem przeprowadziliśmy decelularyzację żył o różnej długości do 30 cm (wynik niepublikowany). Podniesienie wylotu roztworu decelularyzacyjnego o 45 cm wytworzy ciśnienie 33 mmHg wewnątrz żyły. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to kluczowy krok w decelularyzacji całej żyły w sposób jednolity i powtarzalny w ciągu 5 cykli. Wybrane ciśnienie jest 3 razy wyższe niż normalne ciśnienie w żyle odpiszczelowej (5 - 10 mmHg), ale jest takie samo jak w żyłach niewydolnych (żylaki)²³. Ponadto spekulujemy, że to wysokie ciśnienie wytworzy znaczną siłę na ścianach żył i dlatego może pomóc w skutecznym i szybszym usuwaniu komórek.

Ponieważ TnBP jest rozpuszczalnikiem organicznym i jest nierozpuszczalny w wodzie, ważne jest mieszanie detergentu, aż stanie się mętny; W przeciwnym razie detergent będzie unosił się na wodzie. Z tego samego powodu, aby TnBP był zmieszany z roztworem, rurka wylotowa detergentu została umieszczona w górnej części szklanego słoika z wylotem węża. O skutecznym usuwaniu TnBP z żyły po jej użyciu w każdym cyklu świadczy brak pływających kropelek TnBP w przemytej wodzie. Zauważyliśmy również, że pominięcie kroku DNazy również spowodowało decelularyzację tkanki, ale w kilku przypadkach zauważono stosunkowo wysoką zawartość DNA w tkance pozbawionej komórek. Ponieważ wysokie ciśnienie i wysokie natężenia przepływu nie są wymagane do efektywnej aktywności DNazy, można zastosować niską szybkość perfuzji (10 ml/min). Zastosowano inną pompę perystaltyczną, ponieważ jej mniejszy rozmiar pomaga w łatwej obsłudze zestawu. Ponieważ zauważyliśmy, że uszkodzenie większości komórek podczas decelularyzacji powoduje cykl 2, sugerujemy pominięcie leczenia DNazą podczas cykli 1 i 3 (wynik niepublikowany). Mimo że charakterystyka i kwantyfikacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej nie zostały przeprowadzone w tym manuskrypcie, nasze wcześniejsze doświadczenia z podobnymi protokołami decelularyzacji wykazały zachowanie właściwości biomechanicznych, struktury macierzy zewnątrzkomórkowej i białek⁷. Chociaż nasze wstępne eksperymenty kwantyfikacyjne z tymi żyłami dały podobny wynik (niepublikowany), nasze już opublikowane wyniki wzmocnią tę pewność.

Recelularyzacja przy użyciu krwi jest wygodnym i łatwym procesem w przypadku rozszerzonych komórek szpiku kostnego, ponieważ można uniknąć długiego czasu ekspansji komórek, spontanicznych mutacji w rozszerzonych komórkach, inwazji chirurgicznej i dyskomfortu dla pacjenta. Ponieważ wiadomo, że śródbłonek może również zachodzić z krążących EPC, postawiliśmy hipotezę, że perfuzja z krwią, a następnie perfuzja z podłożem śródbłonkowym będzie wystarczająca do recelularyzacji. Bezpieczeństwo tkanek żylnych zmodyfikowanych przy użyciu podobnej metody wynika z pomyślnych wyników przeszczepu, gdy dwie takie żyły zostały wszczepione dzieciom z dodatkową niedrożnością żyły wrotnej wątroby⁷. Spekulujemy, że czynniki wzrostu w zdecelularizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej pozwolą na przyłączenie krążących EPC z krwi²⁴. Recelularyzacja żył zgodnie z podobnym protokołem wykazała komórki dodatnie dla receptora VEGF-2 i klastra różnicowania (CD) 14 na świetle, podczas gdy komórki eksprymujące CD45 zaobserwowano w przydankach⁷. Wyobrażamy sobie również, że ciągła warstwa śródbłonka może nie być obserwowana we wszystkich przypadkach, zwłaszcza przy użyciu krwi od starszych i chorych pacjentów, ponieważ wiadomo, że takie osoby mają zmniejszoną liczbę krążących komórek progenitorowych²⁵. Postulujemy jednak, że perfuzja z własną krwią biorcy może maskować wiele antygenów, które są narażone z powodu decelularyzacji, a tym samym może zmniejszyć ryzyko wystąpienia niepożądanych reakcji zapalnych po przeszczepie, w przeciwieństwie do przeszczepiania tylko bezkomórkowych naczyń krwionośnych. Ponadto perfuzja krwi może odkładać zwiększony poziom czynników wzrostu na świetle i przydankach, co z kolei może rekrutować zwiększoną liczbę krążących komórek progenitorowych, co powoduje szybki proces recelularyzacji in vivo.

Zalety konstrukcji bioreaktora zastosowanej w tym badaniu to kompletny autoklaw, łatwy montaż, opłacalność, łatwa obsługa i najmniejsze prawdopodobieństwo uszkodzenia. Z naszego doświadczenia, przy użyciu obecnego projektu, żyły o długości do 10 cm zostały zrekomórkowane. Mimo że żyły o długości do 25 cm mogą być również rekomórkowane poprzez utrzymywanie żyły w kształcie litery "U" wewnątrz bioreaktora, powinno to zostać zweryfikowane. Konstrukcja bioreaktora pokazuje, że kierunek przepływu w żyle jest przeciwny do grawitacji i jest tak zaprojektowany, ponieważ jest to normalny kierunek przepływu dla tych żył u ludzi. 12-godzinna perfuzja pożywki śródbłonkowej ma na celu wstępne kondycjonowanie żyły i zwiększenie powinowactwa do przyczepiania przychodzących EPC. Dodanie dodatkowej heparyny i perfuzji przez 1 godzinę zmniejszy ryzyko tworzenia się skrzepów krwi w probówkach podczas perfuzji krwi.

Wymagana objętość krwi zależy od długości żyły. Podstawową zasadą, którą kierujemy się w odniesieniu do objętości krwi, jest to, że żyła powinna być zanurzona we krwi. Podczas pracy z objętościami krwi większymi niż 45 ml może być wymagane sporadyczne mieszanie, aby zapobiec gromadzeniu się komórek na dnie bioreaktora. Dodaliśmy roztwór Steena do krwi, ponieważ zawiera on dużą ilość białek i składników niezbędnych do utrzymania zdrowych tkanek podczas przeszczepu narządów^26,27. Dodanie VEGF i b-FGF jest korzystne, ponieważ są one silnymi angiogennymi czynnikami wzrostu²⁸, a ich obecność indukuje migrację, proliferację i różnicowanie EPC 29,30,31,32. Ilość dodanego VEGF opiera się na naszych poprzednich niepublikowanych wynikach, w których proliferację EPC zaobserwowano na poziomie 80 ng / ml. Dodanie aspiryny hamuje aktywację płytek krwi³³, zmniejszając w ten sposób szanse na ich przyczepienie się do warstwy śródbłonka. Ciągłe monitorowanie i dodawanie glukozy będzie również korzystne dla proliferacji komórek i zapobiegania hemolizie czerwonych krwinek.

Ponieważ od biorcy wymagana jest tylko prosta próbka krwi, można ją uznać za łatwą i wykonalną procedurę wymagającą mniejszej wiedzy technicznej. Mimo że cała przedstawiona tutaj procedura od początku do końca trwa 20 dni, przechowywanie żył pozbawionych komórek jako produktu z półki skróci procedurę do 8 dni dla pacjentów. Chociaż przechowywanie żył pozbawionych komórek technicznie nie powinno wpływać na skuteczność recelularyzacji, należy je ocenić. Żyły inżynierii tkankowej powstałe w wyniku tej procedury mogą być wykorzystywane w klinice do operacji pomostowania, zastępowania niedrożnych żył, niewydolności żylnej prowadzącej do żylaków bez konieczności immunosupresji, a tym samym zapewniając lepszą jakość życia pacjenta.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-portowa nasadka	CPLabSafety	WF-GL45-4Kit
Kwas acetylosalicylowy	Sigma Aldrich	A5376
Anti-Anti	Life Technologies	15240-062
B-FGF	Lonza	cc-4113B
System monitorowania stężenia glukozy we krwi - Free style Lite	Abbott	70808-70
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769
DNase-I	Worthington	LS0020007
PBS firmy Dulbecco z CaCl2 i MgCl2	Sigma Aldrich	D8662
EDTA sól disodowa dwuwodna	AlfaAesar	A15161.
EGM-2	Lonza	CC-4176
EG-VEGF	Peprotech	100-44
Butelka szklana 250ml	VWR	2151593	Można użyć dowolnej butelki z nakrętką GL45
Butelka szklana 1L	VWR	2151595	Można użyć dowolnej butelki z nakrętką GL45
Szklany słoik 500ml z dolnym odpływem węża	Kimble Chase Life Science	14607
Heparyna	Leo	387107
Rurki próżniowe powlekane heparyną	Becton Dickinson	368480
Ludzkie serum AB Sigma	Aldrich	H3667
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
Luer Kobieta z 1/8 "ID Barb	Oina	LF-2PP-QC	Do rurki silikonowej 3X5mm
Luer Żeńskie z 3/32 "ID Barb	Oina	LF-1.5PP-QC	Do rurki silikonowej 2X4mm
Luer Male z 3/32" ID Barb	Oina	LM-1.5PP-QC	Do rurki silikonowej 2X4mm
Luer Male z 1/8" ID Barb	Oina	LM-2PP-QC	Do rurki silikonowej 3X5mm
Luer Male z 5/32" ID Barb	Cole Parmer	EW-45518-06	Do rurki silikonowej 5X8mm
MCDB 131	Life Technologie	10372-019
Na kwas octowy	Sigma Aldrich	433241
Pompa perystaltyczna I	Masterflex	7524-45	Do konfiguracji decelularyzacji 1 i 2. Zastosowana kaseta to 7519-75
Pompa perystaltyczna II	Ismatec	ISM941	do konfiguracji decelularyzacji 3 i bioreaktora recelularyzacji.
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P5405
Wodorofosforan potasu	Sigma Aldrich	P9791
Łącznik redukcyjny 1,5mmX2,5mm	Biotech	ISM569A
Shaker	Ika	KS4000 i  control
Sodium Azide	Sigma Aldrich	71290
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	13423
Wodorofosforan sodu	Merck	71640-M
Roztwór Stena	Xvivo	19004
Szew	Agnthos	14817
Fosforan tri-n-butylu	AlfaAesar	A16084.AU
Triton-X-100	AlfaAesar	A16046. OF
Probówka 60ml z płaską podstawą	Sarstedt	60596
Rurka A	VWR	2280706	Wytnij 3 kawałki, każda o długości 25 cm do decelularyzacji perfuzji steup 1 i 2
Rurka B	VWR	2280706	Wytnij 1 kawałek o długości 35 cm do decelularyzacji perfuzji
Rurka C	VWR	2280706	Wytnij 5 kawałków, każda o długości 75 cm do perfuzji decelularyzacyjnej steups 1-3
Tube D	VWR	2280706	Wytnij 1 kawałek o długości 90 cm do decelularyzacji perfuzyjny steup 2
Tube E	VWR	2280706	Wytnij 1 kawałek o długości 20 cm do recelularyzacji perfuzyjnej
Rurka F	VWR	2280713	Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 15 cm do decelularyzacji perfuzyjny steup 1 i 2 Rurka
G	VWR	2280713	Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 60 cm do decelularyzacji Rurka perfuzyjna 1 i 2
Rurka H	VWR	2280703	Wytnij 1 kawałek o długości 15 cm do rurki perfuzyjnej do recelularyzacji
Rurka I	VWR	2280703	Wytnij 1 kawałek o długości 20 cm do recelularyzacji rurki perfuzyjnej
Rurka J	VWR	2280703	Wytnij 1 kawałek o długości 25 cm do recelularyzacji perfuzji
Rurka K	VWR	2280703	Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 35 cm, aby uzyskać efekt perfuzji recelularyzacji