Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do opracowania modelu raka in vivo przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Taki model może być bardzo przydatny do oceny terapii przeciwnowotworowych.

Streszczenie

Model zwierzęcy in vivo, który naśladuje ludzkiego raka, może mieć różne zastosowania, które dostarczają istotnych informacji klinicznych. Obecnie stosowane techniki opracowywania modeli nowotworów in vivo mają znaczne ograniczenia. Dlatego w tym badaniu dążymy do wdrożenia technologii arkuszy komórkowych w celu opracowania modelu raka in vivo. Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest z powodzeniem rozwijany u nagich szczurów przy użyciu arkuszy komórkowych utworzonych z komórek linii komórkowej HCC. Arkusze komórek rakowych są generowane w wyniku adhezji wewnątrzkomórkowej i tworzenia struktury warstwowej, kontrolowanej przez macierz zewnątrzkomórkową. Pozwala to na przeszczepienie arkusza HCC do wątroby i stworzenie modelu zwierzęcego z guzem w ciągu miesiąca. Ponadto badana jest rola mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w rozwoju tego modelu nowotworu. Oprócz arkusza linii komórkowej HCC tworzone są kolejne dwa arkusze komórek: arkusz komórek HCC i MSC szpiku kostnego (BMMSC) oraz arkusz komórek HCC i MSC pępowiny (UCMSC). Arkusze, które zawierają kombinację zarówno komórek HCC, jak i MSC, są również zdolne do wytworzenia zwierzęcia z nowotworem. Jednak dodanie MSCs zmniejsza rozmiar powstałego guza, a ten niekorzystny wpływ na rozwój guza różni się w zależności od źródła zastosowanych MSCs. Wskazuje to, że arkusz komórek wykonany z niektórych podtypów MSC może być wykorzystany w leczeniu i kontroli nowotworu.

Wprowadzenie

HCC to pierwotny rak wątroby, który jest znacząco związany ze złym rokowaniem. Rocznie u prawie pół miliona nowych pacjentów diagnozuje się HCC, co stanowi 85% pacjentów z rakiem wątroby na całym świecie¹. Hepatokarcynogeneza nie jest chorobą występującą w jednej postaci; Jest to raczej zbiór chorób, które mają różne cechy histopatologiczne oraz zmienność genetyczną i genomową, a także zróżnicowane wyniki prognostyczne 1. Dlatego głównymi wyzwaniami w opracowaniu skutecznej strategii terapeutycznej HCC są ograniczona wiedza na temat biologii HCC oraz brak odpowiedniego eksperymentalnego modelu zwierzęcego, który mógłby pomóc w zrozumieniu tej złożonej choroby. Model zwierzęcy in vivo, który naśladuje ludzkiego raka, jest niezbędny do selekcji genów kandydujących i identyfikacji markerów prognostycznych/predykcyjnych związanych z indukcją raka, a także do badania różnych czynników, które mogą wpływać na reakcje raka na środki terapeutyczne.

Badania in vitro nad rakiem nadal wiążą się z poważnymi ograniczeniami. Wynika to z faktu, że komórki nowotworowe tracą wiele ze swoich cech in vivo, gdy są utrzymywane w hodowli. Zmiany, które zachodzą w komórkach in vitro, wynikają z braku fizjologii całej tkanki w warunkach ex vivo. Interakcja rakowa między komórkami (zrębowa, immunologiczna, naczyniowa, nabłonkowa itp.) w mikrośrodowisku guza ma ogromny wpływ na charakterystykę komórek rakowych². Mikrośrodowisko guza może zmieniać ekspresję genów/białek komórek nowotworowych i cechy fenotypowe, a także potencjały angiogenetyczne i przerzutowe. W dwuwymiarowym (2-D) systemie hodowli in vitro brakuje również odpowiedniej macierzy tkankowej, która jest niezbędna do regulacji progresji nowotworu. W związku z tym, ze względu na te ograniczenia, modele in vivo powinny być zawsze wykorzystywane do wspierania wstępnych wyników modeli in vitro. W tym badaniu wykorzystujemy technologię arkuszy komórkowych do opracowania modelu zwierzęcego in vivo, który wyjaśnia cały proces biologiczny leżący u podstaw HCC.

Ponad dziesięć lat temu, laboratorium Okano stworzyło nowatorską metodę inżynierii tkankowej opartą na technologii arkuszy komórkowych³. Technika ta wykorzystuje termoczułe tworzywo hodowlane, aby umożliwić odwracalną adhezję/odklejanie komórek poprzez kontrolowanie hydrofobowości powierzchni. Metoda ta pozwala na delikatne zbieranie hodowanych komórek w nienaruszonym formacie trójwymiarowym (3D) (tj. arkuszu komórek), z dobrze zachowaną macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i interakcjami międzykomórkowymi. Technika arkusza komórkowego wymaga wstępnego powlekania szalek hodowlanych reagującym na temperaturę polimerowym poli(N-izopropylolakrylamidem) (Am), który jest dostępny na rynku i gotowy do użycia. W temperaturze poniżej 20 °C polimery Am ulegają uwodnieniu i rozpuszczają się w roztworach wodnych, natomiast w wyższej temperaturze (37 °C) polimery ulegają odwodnieniu i przekształcają się w mętny osad. Polimer zawiera hydrofilowe łańcuchy amidowe i hydrofobowe łańcuchy boczne (grupy izopropylowe). W wysokich temperaturach ruch Browna cząsteczek wody jest zintensyfikowany, podczas gdy w niskiej temperaturze cząsteczki wody otaczające grupy izopropylowe struktury uwodnionej rozpadają się i grupy hydrofobowego agregatu izopropylowego na skutek oddziaływań hydrofobowych. W związku z tym cały łańcuch polimeru agreguje się i wytrąca ⁴.

W prezentowanym badaniu, technika ta została wykorzystana do opracowania modelu zwierzęcego HCC przy użyciu trzech różnych arkuszy komórek. Pierwszy zastosowany arkusz składa się wyłącznie z komórek linii komórkowej HCC, podczas gdy pozostałe dwa arkusze składają się z kombinacji komórek linii komórkowej HCC i MSC pochodzących z dwóch różnych źródeł: MSC szpiku kostnego (BMMSC) i MSC rdzenia pępowinowego (UCMSC). MSCs to niehematopoetyczne komórki zrębowe, które są zdolne do różnicowania pochodnych wewnątrzkomórkowych linii mezenchymalnej, w tym adipocytów, osteocytów, chondrocytów i miocytów⁵. Powodem, dla którego wykorzystujemy te komórki podczas tworzenia arkusza komórek rakowych, jest niespójne raportowanie wpływu MSCs na nowotwory. Zasugerowano, że MSCs mogą mieć dwa różne fenotypy: "MSC1", fenotyp prozapalny i "MSC2", fenotyp immunosupresyjny⁶. MSCs wyrażają receptory toll-podobne (TLR). Pobudzanie TLR4 MSCs zwiększa wydzielanie przez nie czynników prozapalnych, podczas gdy torowanie TLR3 zwiększa wydzielanie czynników immunosupresyjnych⁶. Badanie in vitro tych dwóch fenotypów wykazało, że kokultura MSC1 z liniami komórek rakowych osłabiała wzrost komórek rakowych, podczas gdy kohodowla MSC2 miała odwrotny efekt⁷. Oznacza to, że MSCs mogą być pronowotworowe lub przeciwnowotworowe, w zależności od ich fenotypu. W związku z tym, oprócz opracowania modelu zwierzęcego HCC przy użyciu technologii arkuszy komórkowych, chcemy zbadać wpływ przeszczepów MSC na rozwój guza oraz to, czy użycie tych komórek wzmocni, czy ograniczy rozwój tego modelu.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etycznego Uniwersytetu Króla Sauda w zakresie opieki nad zwierzętami. Zabiegi chirurgiczne, środki znieczulające i inne leki stosowane u zwierząt są zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Króla Sauda. Wszystkie prace eksperymentalne wykonywane są przez odpowiednio przeszkolony personel.

1. Budowa arkusza komórkowego

1. Posmaruj szalki hodowlane (3,5-centymetrowe szalki hodowlane reagujące na temperaturę) nierozcieńczoną płodową surowicą bydlęcą (FBS) i upewnij się, że pokryły całą powierzchnię naczynia.
   UWAGA: Ten krok jest ważny dla oderwania arkusza komórek, ponieważ wspomaga wzrost komórek w monowarstwie i zapobiega agregacji komórek.
2. Inkubować szalki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ i 95% powietrza.
3. Usuń nadmiar FBS z powlekanych naczyń i pozostaw naczynia do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 godzinę.
4. Przygotować trzy zawiesiny komórek: 1 x 10⁶ komórek HepG2, 1 x 10⁶ komórek HepG2 z BMMSC i 1 x 10⁶ komórek HepG2 z UCMSC (w stosunku 4:1 zarówno dla BMMSC, jak i UCMSC).
5. Wysiew odpowiednią zawiesinę komórkową do każdego oznakowanego naczynia.
6. Zawiesić wszystkie komórki w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ i 95 % powietrza.

2. Oderwanie arkusza komórkowego

1. Przy 100% zbiegu komórek wyjmij naczynia z inkubatora w temperaturze 37 °C.
2. Inkubować szalkę z arkuszem komórek HepG2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, podczas gdy szalki z arkuszy komórek HepG2/BMMSC i HepG2/UCMSC przez 30 - 40 minut w temperaturze 20 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%_CO2 i 95% powietrza.
   UWAGA: Arkusz komórek wykonany tylko z HepG2 jest delikatny; obniżenie temperatury do 20 °C powoduje uszkodzenia struktury blachy.

3. Wykonanie zabiegu chirurgicznego

Uwaga: Podczas czasu inkubacji do oderwania arkusza komórkowego, rozpocznij procedurę na zwierzętach.

1. Instrukcja przygotowania obszaru operacyjnego
   1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy przeprowadzać w sterylnym, oddzielnym miejscu w laboratorium, takim jak kaptur, komora laminarna lub aseptyczny sala operacyjna. Upewnij się, że wszystkie powierzchnie obszaru operacyjnego są nieporowate, uszczelnione, trwałe i nadające się do dezynfekcji.
   2. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuchy, rękawice, maski na twarz oraz pokrowce na głowę i buty.
   3. Na początku operacji należy używać narzędzi chirurgicznych, które są czyste i wysterylizowane (poprzez autoklawowanie; nasączony trzpień pod wysokim ciśnieniem).
   4. Zmieniaj rękawiczki między szczurami.
2. Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
   1. Użyj nagich szczurów w wieku od 8 do 12 tygodni.
   2. Stwórz znieczulenie do wstrzykiwań dla szczurów.
      1. Aby przygotować roztwór znieczulający, ketaminę-ksylazynę, zmieszać 2 ml ketaminy, 1 ml ksylazyny (w stężeniu 20 mg/ml) i 1 ml sterylnej soli fizjologicznej (np. 0,9% chlorku sodu) w sterylnej fiolce do pobierania surowicy o pojemności 10 ml i dobrze wstrząsnąć przed użyciem.
      2. Aby zastosować znieczulenie, wstrzyknąć dootrzewnowo 0,2 ml roztworu ketaminy-ksylazyny na 100 g masy ciała szczura.
         UWAGA: Całkowita dawka roztworu wynosi 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
   3. Usuń widoczny brud/zanieczyszczenia z pola operacyjnego.
   4. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału (przyciśnięcie opuszki stopy do obu tylnych stóp).
      UWAGA: Jeśli uszczypnięcie opuszki stopy powoduje reakcję, powtórz dawkę 0,05 ml/100 g (mniej więcej co 30 minut), a następnie ponownie sprawdź głębokość znieczulenia.
   5. Zdezynfekuj obszar operacyjny dwuetapowym peelingiem z użyciem jodu powidonu/izopropanolu.
   6. Przykryj szczura sterylną serwetą, aby uniknąć zanieczyszczenia nacięcia.
   7. Wstrzyknąć szczurom podskórnie buprenorfinę (0,01 - 0,05 mg/kg)⁸ przed wykonaniem nacięcia.
   8. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj od 7 do 10 cm nacięcia między skórami a leżącymi pod nimi mięśniami, aby odsłonić wątrobę.
      1. Oddziel mięsień brzucha od skóry płaską tylną krawędzią skalpela.
      2. Ostrożnie dźgnij linea alba za pomocą skalpela i przedłuż cięcie ostrymi nożyczkami.

4. Przeszczep arkusza komórkowego

Uwaga: Przeszczep komórek jest wykonywany na wątrobie.

1. Zbierz arkusz komórek z naczynia hodowlanego.
   1. Delikatnie postukaj naczyniem hodowlanym o ławkę, aby oderwać arkusz od jego powierzchni.
   2. Oddziel arkusz komórek od powierzchni naczynia, zeskrobując krawędź arkusza w półkolu za pomocą sterylnej końcówki pipety.
   3. Delikatnie wyjmij całą pożywkę z naczynia hodowlanego.
   4. Upewnij się, że arkusz jest nienaruszony i bez żadnych uszkodzeń, w przeciwnym razie nie można go użyć (Rysunek 1).
      UWAGA: Powstałe arkusze mogą być wykrywane bezpośrednio przez oko.
2. Przygotuj sterylną membranę (bibułę filtracyjną), aby pobrać arkusz komórek z naczynia.
   1. Najpierw namocz membranę zwykłą solą fizjologiczną. Następnie usuń nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnego wacika.
   2. Umieść mokrą membranę na arkuszu komórek, unikając zagnieceń i pęcherzyków powietrza między membraną a arkuszem komórek.
   3. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej na membranę i arkusz komórek, aby łatwiej je zebrać.
      Uwaga: Aby uniknąć zerwania arkusza komórek, nie używaj zimnej soli fizjologicznej i podnoś membranę i arkusz komórek za pomocą kleszczy.
   4. Pozostaw membranę na kilka sekund, aby upewnić się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do membrany, a następnie zbierz go.
3. Przygotuj wątrobę do przeszczepu arkusza komórek.
   1. Upewnij się, że powierzchnia wątroby jest sucha, delikatnie stukając w nią sterylnym wacikiem.
   2. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść membranę z arkuszem komórek na pojedynczym płacie wątroby szczura.
   3. Dodaj kilka kropli sterylnej soli fizjologicznej i delikatnie dociśnij membranę, aby oderwać od niej arkusz komórek.
   4. Odczekaj 5 minut przed ostrożnym zdjęciem membrany.
      UWAGA: Ma to na celu upewnienie się, że arkusz komórek jest prawidłowo przymocowany do wątroby.
   5. Na koniec zamknij leżące poniżej mięśnie i nacięcia skóry za pomocą nylonowych szwów 5-0.
   6. Zdezynfekować obszar operacyjny za pomocą powidonu-jodu.
      Uwaga: Rysunek 2 pokazuje schemat procedury przeszczepu arkusza komórkowego na wątrobie nagiego szczura.

5. Opieka pooperacyjna

1. Bezpośrednio po operacji należy umieścić szczura indywidualnie, aby uniknąć kanibalizmu lub uduszenia, i regularnie go monitorować (co najmniej co 15 minut), aż będzie przytomny i w pełni zdolny do poruszania się.
2. Następnie oceniaj szczury codziennie przez 5 - 14 dni, co najmniej 5 dni po operacji, aby upewnić się, że nie ma żadnych komplikacji. Podczas codziennej oceny upewnij się, że spełnione są następujące warunki.
   1. Rana jest zamknięta, a szwy nienaruszone, bez nadmiernego ucisku.
   2. W miejscu nacięcia nie ma oznak infekcji, takich jak ciepło, nadmierny obrzęk czy ropna wydzielina.
   3. Nie ma żadnych objawów związanych z bólem, takich jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, utrata masy ciała, odwodnienie, zwijanie skóry lub szybki i otwarty oddech w ustach. Aby opanować umiarkowany lub silny ból pooperacyjny, jeśli występuje, należy wstrzykiwać szczurom podskórnie buprenorfinę (0,01 - 0,05 mg / kg) co 6 - 8 godzin ⁹ przez minimum 48 - 72 godziny po operacji.

6. Analiza przeszczepionego obszaru

1. Miesiąc po przeszczepie należy skaryfikować szczura i pobrać przeszczepiony obszar do analizy histologicznej i immunohistochemicznej.

Wyniki

Rakotwórczość przeszczepionych komórek u szczurów:

Miesiąc po przeszczepie, u wszystkich przeszczepionych komórek w wątrobach szczurów rozwinęły się guzy (Rysunek 3). Średnia wielkość guzów rozwiniętych z arkuszy komórkowych HepG2, HepG2/BMMSC i HepG2/UCMSC wynosiła odpowiednio 4,5 cm, 4 cm i 2,5 cm¹⁰.

Dyskusja

Szeroko zakrojona liczba badań poświęcona jest opracowaniu odpowiedniego przedklinicznego modelu zwierzęcego in vivo , który przypomina ludzkie nowotwory. Obecnie główne podejścia stosowane do tworzenia zwierzęcych modeli nowotworów obejmują inżynierię genetyczną i przeszczepianie komórek¹¹. Genetycznie modyfikowane modele zwierzęce są dobrymi narzędziami do identyfikacji i walidacji docelowych genów, a także do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw toksyczności wywołan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynniki
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM o wysokiej zawartości glukozy	Sigma	D5671-500ML
Penicylina/streptomycyna	Life Technology	15070063
Sterylna sól fizjologiczna	Sigma	S0817-1GA
Ludzka linia komórkowa HepG2	ATCC, USA	HB-8065
Linia komórkowa MSCs ludzkiego szpiku kostnego	PromoCell, USA	C-12974
ludzka tkanka pępowinowa MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamina 50%	Rompun, Bayer
Ksylazyna 2%	Rompun	23076-35-9
Alfadyna®   rozwiązanie.	Riyadh Pharma	LBL0816
Jednorazówki:
15 ml polipropylenowa probówka wirówkowa PP o wysokiej czystości	Falcon
3,5 cm sterylne szalki do hodowli UpCell z bibułą filtracyjną (membraną)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µ l   Końcówki do pipet	Sigma	CLS4868-1000EA
Podstawowa procedura serwety	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment  Pipeta
Plus, zmienna objętość	Eppendorf®   Badania®	Z683779-1EA
Inkubator do hodowli tkankowych 37 ° C, 5% CO2	Dowolna marka
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Dowolna marka
Inkubator kultur tkankowych 20 ° C, 5% CO2	Dowolna marka
Sterylne narzędzia chirurgiczne i nagie szczury:
Kleszcze
Nożyczki
nbsp;
Szew nylonowy  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Strzykawki tuberkulinowe	Fisher Scientific	14-826-88
Nagie szczury	Rzeka