Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Streszczenie

Mleczan i pirogronian są kluczowymi produktami pośrednimi wewnątrzkomórkowych szlaków metabolicznych energii. Monitorowanie stosunku mleczanu do pirogronianu w komórkach pomaga określić, czy istnieje nierównowaga w metabolizmie energetycznym związanym z wiekiem między mitochondrialną fosforylacją oksydacyjną a glikolizą tlenową. W tym miejscu pokazujemy wykorzystanie komercyjnych zestawów do testów kolorymetrycznych dla mleczanu i pirogronianu w organizmie modelowym C. elegans. Ostatnio czułość i dokładność zestawów do testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych uległa znacznej poprawie dzięki badaniom i rozwojowi prowadzonym przez producentów odczynników. Ulepszone odczynniki umożliwiły stosowanie testów na małą skalę z 96-dołkową płytką w C. elegans. Ogólnie rzecz biorąc, test fluorymetryczny ma lepszą czułość niż test kolorymetryczny; Jednak podejście kolorymetryczne jest bardziej odpowiednie do stosowania w zwykłych laboratoriach. Inną ważną kwestią w tych testach do oznaczania ilościowego jest wytrącanie białek w homogenizowanych próbkach C. elegans. W naszej metodzie wytrącania białek do przygotowania próbki stosuje się popularne środki strącające (np. kwas trichlorooctowy, kwas nadchlorowy i kwas metafosforowy). Próbkę testową bez białka przygotowuje się przez bezpośrednie dodanie zimnego środka strącającego (końcowe stężenie 5%) podczas homogenizacji.

Wprowadzenie

Stężenia mleczanu i pirogronianu są powszechnie uważane za produkty pośrednie metabolizmu energetycznego i są związane ze stanami glikolizy, cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i łańcucha transportu elektronów w komórkach organizmów tlenowych. Szereg reakcji w glikolizie utlenia glukozę do pirogronianu, który leży na skrzyżowaniu metabolicznym i może zostać przekształcony w węglowodany poprzez glukoneogenezę, do kwasów tłuszczowych i metabolizmu energetycznego przez acetylo-CoA oraz do aminokwasu alaniny. Cykl TCA zachodzi w obecności wystarczającej ilości rozpuszczonego tlenu i ma zasadnicze znaczenie dla konwersji glukozy w energię. Szczególnie zmiana metabolizmu wtórnego jest interesującym zjawiskiem, w którym glikoliza jest wykorzystywana głównie do produkcji energii, a tlenowe oddychanie mitochondrialne, które obejmuje cykl TCA i łańcuch transportu elektronów, jest regulowane w dół w komórkach raka ssaków^1,2. Wykazaliśmy niedawno, że poziom mleczanu i wynikający z niego stosunek mleczanu do pirogronianu (L/P) zmniejszyły się podczas starzenia się w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans (C. elegans). Podobnie, odkryliśmy, że ortolog-1 supresora nowotworów ssaków p53 u C. elegans odgrywa ważną rolę w związanych z wiekiem zmianach metabolizmu energetycznego poprzez aktywację jego celów transkrypcyjnych³.

W testach biologicznych, takich jak pomiar stężeń mleczanu i pirogronianu w komórkach, czułość, dokładność, wielkość próbki i czas inkubacji zestawów do testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych uległy znacznej poprawie. Dzięki innowacjom technologicznym jesteśmy teraz w stanie analizować różne metabolity i metabolity pośrednie bez hodowli C. elegans na dużą skalę, co jest trudne ze względu na jego niewielkie rozmiary. Ogólnie rzecz biorąc, czułość testu kolorymetrycznego jest o rząd wielkości mniejsza niż w przypadku testu fluorymetrycznego; Jednak podejście kolorymetryczne jest bardziej odpowiednie w przypadku wspólnych laboratoriów. Co więcej, technika ekstrakcji obejmująca homogenizację i wytrącanie białek ma kluczowe znaczenie dla ilościowego oznaczania stężeń mleczanu i pirogronianu w komórkach C. elegans, ponieważ nicienie te są zamknięte w egzoszkielecie zwanym naskórkiem, w przeciwieństwie do linii komórkowych hodowanych przez ssaki^4,5. W tym miejscu opisujemy protokół analizy stężeń mleczanu i pirogronianu przy użyciu komercyjnych zestawów do testów kolorymetrycznych, w tym końcówek do ekstrakcji próbki z C. elegans.

Protokół

1. Zsynchronizowana kultura C. elegans

1. Przed wysiewem należy wyhodować szczep Escherichia coli (E. coli) OP50 przez noc w temperaturze 37 °C w 300 ml płynnego podłoża bulionowego Luria-Bertani (LB). Przechowywać kulturę OP50 w temperaturze -4 °C.
   1. Aby przygotować płynną pożywkę bulionową LB, użyj 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 1,5 ml 1 N NaOH i dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoklaw.
      UWAGA: Szczepy OP50 i C. elegans są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA).
2. Aby zrobić agar z pożywką do wzrostu nicieni (NGM), użyj 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 17 g agaru i 975 ml wody dejonizowanej. Autoklaw. Schłodzić do temperatury 55 °C, a następnie sterylnie dodać kolejno 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w EtOH i 25 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 na 90-milimetrowych szalkach Petriego.
   1. Dla 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 użyj 108,3 g KH₂PO₄ i 46,6 g K₂HPO₄ i dodaj wodę dejonizowaną do 1 L. Autoclave⁶.
3. Rozprowadź 1-2 ml kultury OP50 na płytkach agarowych NGM. Aby uzyskać cienką warstwę OP50, inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej przed dodaniem jakichkolwiek nicieni.
   UWAGA: Płytki agarowe NGM zaszczepione OP50 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie.
4. Dodać co najmniej 100 robaków na płytkę agarową NGM z OP50 i hodować w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia wieku dorosłego. Wymagane są co najmniej trzy płytki.
5. Aby zebrać jaja w macicy, przenieś grawitacyjne hermafrodyty z trzech płytek agarowych NGM, z których każda zawiera 5 ml buforu S w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i umyj robaki 3 razy 15 ml buforu S za pomocą wirowania przy 300 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
   1. Aby zrobić bufor S, użyj 5,9 g NaCl i 50 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0, dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoclave⁶.
6. Rozpuść robaki w alkalicznym roztworze podchlorynu do aksenizacji i izolacji jaj luzem (0,5 ml świeżego wybielacza lub odpowiednik: 5-6% podchlorynu sodu, 0,1 ml 10 M NaOH, około 4,5 ml buforu S)⁶, i odstaw roztwór na 10-15 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez odwrócenie.
   UWAGA: W ciągu 15 minut dorosłe robaki powinny się rozpuścić, pozostawiając mętny roztwór jaj uwolniony z ich tusz (uwolnione jaja należy potwierdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego). Zamiast 0,1 ml 10 N NaOH można również użyć 0,2 ml 5 N NaOH.
7. Po potraktowaniu podchlorynem przemyć granulki jaj 3 razy 15 ml buforu S i ponownie zawiesić w 5-6 ml buforu S. Wylęgać uwolnione jaja podczas nocnej inkubacji w temperaturze 20 °C w buforze S bez E. coli w celu przeprowadzenia synchronicznej z wiekiem hodowli larw w stadium L1.
8. Aby określić przybliżoną liczbę larw w stadium L1, należy policzyć robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego w 10 μl buforu S po ponownym zawieszeniu larw co najmniej 3 razy i obliczyć średnią. Następnie przenieść larwy w stadium L1 na pięć płytek agarowych NGM z OP50 (1 500-3 000 robaków na płytkę za pomocą 90-milimetrowej szalki Petriego) i hodować w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium młodego dorosłego osobnika, kiedy rozpoczyna się samozapłodnienie i składa się kilka jaj (zwykle po 3 dniach).

2. Ekstrakcja frakcji komórkowej z C. elegans

1. Zbierz robaki w stadium młodego dorosłego (5-dniowe zwierzęta) z pięciu płytek agarowych NGM z buforem S (Rysunek 1A).
   1. Aby wybrać tylko żywe robaki przy użyciu metody sacharozy⁶ do flotacji na 30% (w/v) sacharozy, wymieszaj robaki zawieszone w 3-4 ml buforu S z równą objętością lodowatej sacharozy 60% (w/v) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Obracać probówkę o masie 1 500 x g przez 15 s w temperaturze 4 °C i usunąć pływające robaki do świeżej probówki, odsuwając je od ścianki probówki za pomocą pipety Pasteura.
2. Przemyć robaki 3 razy buforem S przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Sprawdź mokrą objętość umytych robaków po odwirowaniu za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 000 μl (Rysunek 1B).
3. Dodaj umyte robaki do równej objętości lodowatego 10% (w/v) kwasu trichlorooctowego (TCA; końcowe stężenie 5%) w celu wytrącenia białka (Rysunek 1C). Zamiast TCA można zastosować kwas nadchlorowy (PCA) lub kwas metafosforowy.
4. Homogenizuj robaki ze środkiem strącającym za pomocą 40 uderzeń tłuczka w homogenizatorze teflonowym (młynek do tkanek Potter-Elvehjem) z obrotem do 1,300 obr./min na lodzie.
5. Przenieś homogenat do świeżej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura i poddaj sonikacji za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego przez 3 minuty (3 razy po 1 minutę) z 20% cyklem pracy na lodzie.
6. Klarować homogenat przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zneutralizować supernatanty za pomocą 4 M KOH (0,25 objętości do 10% TCA) przez 20 minut na lodzie i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant (jako próbka badana) może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia następujących testów.

3. Test mleczanowy za pomocą zestawu do testów kolorymetrycznych

1. Zmierzyć stężenie mleczanu w badanych próbkach za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Przeprowadzić badania dwustronne dla próbek testowych. Dodać 5 lub 10 μl badanych próbek do 96-dołkowej płytki i dostosować objętość do 50 μl na basenik za pomocą buforu do oznaczania mleczanów dostarczonego z zestawem.
2. W przypadku krzywej wzorcowej mleczanu rozcieńczyć 100 mM wzorca L(+)-mleczanu do 1 mM buforem do oznaczania mleczanu. Dodaj 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μL wzorca mleczanu 1 mM L(+)-mleczanu, który jest dostarczony z zestawem, do szeregu studzienek.
3. Dodać 50 μl mieszaniny reakcyjnej (zawierającej 46:2:2 buforu do oznaczania mleczanu, mieszaniny enzymów mleczanowych i sondy mleczanowej w DMSO, bezwodnej; wszystkie odczynniki są dostarczane z zestawem) lub mieszanki kontrolnej tła (zawierającej 48:2 buforu do oznaczania mleczanu i sondy mleczanowej) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, podczas gdy próbki są chronione przed światłem.
4. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek i odjąć absorbancję mieszaniny kontrolnej tła od absorbancji mieszaniny reakcyjnej.
5. Wykreślić krzywą wzorcową mleczanu. Obliczyć stężenia mleczanu w badanych próbkach na podstawie wzorcowej krzywej mleczanu.

4. Oznaczanie pirogronianu za pomocą zestawu do testów kolorymetrycznych

1. Zmierzyć stężenie pirogronianu w supernatantach (próbkach testowych) za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Przeprowadzić badania dwustronne dla próbek testowych. Dodać 10 μl badanych próbek i 90 μl odczynnika roboczego (zawierającego 94:1 mieszaniny enzymów i odczynnika barwnikowego, które są dostarczone z zestawem) do 96-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, podczas gdy próbki są chronione przed światłem.
2. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
3. Wykreślić krzywą standardową pirogronianu. Obliczyć stężenia pirogronianu w badanych próbkach na podstawie krzywej wzorcowej pirogronianu.

5. Test białka do normalizacji z zawartością białka

1. Zmierzyć stężenie białka w supernatantach (próbkach testowych) za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Jednak ten krok nie ogranicza się do zestawu testowego, a do pomiaru stężenia białka można zastosować inne podejścia.
2. Znormalizować wartości stężeń mleczanu i pirogronianu w badanych próbkach, stosując każde całkowite stężenie białka.
   Uwaga: Stężenie białka w badanych próbkach jest wystarczająco wykrywane nawet po wytrąceniu białka i jest wykorzystywane do etapu normalizacji między próbkami.

Wyniki

Wykorzystując testy kolorymetryczne do ilościowego oznaczenia stężeń mleczanu i pirogronianu, wykazaliśmy dokładność tych metod w porównaniu z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi C. elegans^7,8. W tym przypadku proces wytrącania białek podczas ekstrakcji próbek był najważniejszym etapem pozwalającym na uzyskanie dokładnych wartości. Do wytrącania białek w celu przygotowania próbek testowych można zastosować powszechni...

Dyskusja

W przypadku korzystania z tych zestawów do testów kolorymetrycznych najbardziej krytycznym etapem ekstrakcji próbki w celu dokładnego wykrycia mleczanu komórkowego i pirogronianu u C. elegans jest proces wytrącania białek podczas homogenizacji (ryc. 1). Nie jest bezwzględnie konieczne stosowanie homogenizatora teflonowego, ponieważ inne homogenizatory (np. młynki do tkanek odbijanych i stożkowych lub młynki perełkowe) są również przystosowane do ekstrakcji robaków na małą s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania kolorymetrycznego/fluorymetrycznego mleczanu	BioVision	#K607-100	testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych 100; Przechowywać w temperaturze -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	testów kolorymetrycznych/fluorometrycznych 100; Przechowywać w temperaturze -20oC
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific	#23225	test kolorymetryczny; przechowywać w   temperatura pokojowa
Kwas Trichlorooctowy	Wako Pure Chemical	#207-04955	przechowywać w temperaturze pokojowej
Homogenizator teflonowy	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Zamiast Iwaki/Pyrex, dostępne przez Wheaton