Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57812

⸱

10 stycznia 2019

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

Mając na celu zrozumienie zachowań różnych bakteryjnych elementów koniugującego DNA w różnych warunkach, opisujemy protokół wykrywania różnic w częstotliwości koniugacji, z wysoką rozdzielczością, aby oszacować, jak skutecznie bakteria dawcy inicjuje koniugację.

Streszczenie

Koniugacja bakteryjna jest ważnym krokiem w poziomym transferze genów oporności na antybiotyki za pośrednictwem elementu koniugacyjnego DNA. Dogłębne porównania częstości koniugacji w różnych warunkach są konieczne, aby zrozumieć, w jaki sposób element koniugacyjny rozprzestrzenia się w przyrodzie. Jednak konwencjonalne metody porównywania częstości koniugacji nie są odpowiednie do pogłębionych porównań ze względu na wysokie tło spowodowane wystąpieniem dodatkowych zdarzeń koniugacji na selektywnej płytce. Udało nam się zredukować tło, wprowadzając metodę najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) i wyższe stężenie antybiotyków, aby zapobiec dalszej koniugacji w selektywnym płynnym pożywce. Ponadto opracowaliśmy protokół szacowania prawdopodobieństwa, jak często komórki dawcy inicjują koniugację, sortując pojedyncze komórki dawcy do pul biorców za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Używając dwóch plazmidów, pBP136 i pCAR1, można było wykryć różnice w częstości koniugacji w komórkach Pseudomonas putida w płynnym podłożu przy różnych szybkościach mieszania. Częstość inicjacji koniugacji była wyższa w przypadku pBP136 niż w przypadku pCAR1. Korzystając z tych wyników, możemy lepiej zrozumieć cechy koniugacji w tych dwóch plazmidach.

Wprowadzenie

Bakteryjna koniugacja ruchomych elementów genetycznych, plazmidów koniugacyjnych oraz elementów integracyjnych i sprzęgających (ICE) jest ważna dla horyzontalnego rozprzestrzeniania informacji genetycznej. Może promować szybką ewolucję i adaptację bakterii oraz przekazywać geny oporności wielolekowej1,2. Na częstotliwość koniugacji mogą mieć wpływ białka kodowane na elementach koniugacyjnych do mobilizacji DNA (MOB) i tworzenia par godowych (MPF), w tym pilusów płciowych, które są klasyfikowane według typu MOB i MPF3,4,5. Może mieć na to również wpływ para dawca i biorca6 oraz warunki wzrostu komórek7,8,9,10,11,12 (szybkość wzrostu, gęstość komórek, powierzchnia ciała stałego lub płynne podłoże, temperatura, dostępność składników odżywczych i obecność kationów). Aby zrozumieć, w jaki sposób elementy koniugacyjne rozprzestrzeniają się wśród bakterii, konieczne jest szczegółowe porównanie częstotliwości koniugacji.

Częstotliwość koniugacji między parami dawców i biorców po kryciu jest zwykle szacowana za pomocą konwencjonalnych metod w następujący sposób. (i) Po pierwsze, liczy się liczbę kolonii dawców i biorców; (ii) następnie liczone są kolonie biorców, które otrzymały elementy koniugacyjne (= transkoniuganty); (iii) i wreszcie, częstość koniugacji oblicza się, dzieląc jednostki tworzące kolonię (CFU) transkoniugantów przez jednostki dawcy i/lub biorcy13. Jednak przy użyciu tej metody tło jest wysokie ze względu na dodatkowe zdarzenia koniugacji, które mogą również wystąpić na selektywnych płytkach używanych do otrzymywania transkoniugancji, gdy gęstość komórek jest wysoka10. W związku z tym trudno jest wykryć niewielkie różnice w częstości (poniżej 10-krotnej różnicy). Niedawno wprowadziliśmy metodę liczby najbardziej prawdopodobnej (MPN) z wykorzystaniem płynnej pożywki zawierającej wyższe stężenie antybiotyków. Metoda ta zredukowała tło poprzez zahamowanie dalszej koniugacji w pożywce selektywnej; W ten sposób częstość koniugacji można było oszacować z większą rozdzielczością.

Koniugację można podzielić na trzy etapy: (1) przyłączenie pary dawca-biorca (2) zainicjowanie transferu koniugacyjnego oraz (3) dysocjacja pary14. Podczas etapów (1) i (3) zachodzi fizyczna interakcja między komórkami dawcy i biorcy; Tak więc gęstość komórek i warunki środowiskowe mogą wpływać na te etapy, chociaż ważne są również cechy pilusów płciowych. Krok (2) jest prawdopodobnie regulowany przez ekspresję kilku genów zaangażowanych w koniugację w odpowiedzi na zmiany zewnętrzne, na które mogą mieć wpływ różne cechy plazmidu, dawcy i biorcy. Chociaż fizyczne przyłączenie lub odłączenie par dawca-biorca może być matematycznie symulowane przy użyciu oszacowania komórek jako cząstek, częstotliwość kroku (2) powinna być mierzona doświadczalnie. Pojawiło się kilka doniesień o bezpośrednich obserwacjach tego, jak często dawcy mogą inicjować koniugację [krok (2)] za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej15,16; Jednak metody te nie są wysokoprzepustowe, ponieważ należy monitorować dużą liczbę komórek. W związku z tym opracowaliśmy nową metodę szacowania prawdopodobieństwa wystąpienia kroku (2) za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Nasza metoda może być zastosowana do dowolnego plazmidu, bez identyfikacji genów niezbędnych do koniugacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie dawcy z plazmidami znakowanymi genami oporności na białko zielonej fluorescencji (GFP) i kanamycynę

  1. Wprowadzenie genów markerowych do docelowego plazmidu pBP136
    nuta: Celem tego protokołu jest wygenerowanie pBP136::gfp. Szczepy bakteryjne i plazmidy użyte w tym badaniu wymieniono w Tabeli 1.
    1. Hoduj kultury Escherichia coli DH10B zawierające pBP13617 w 5 ml sterylnego bulionu Luria (LB) i E. coli S17-1λpir18 zawierającego pJBA2819 [zawierający gen oporności na kanamycynę (Km) i gen gfpmut3* z jego promotorem i terminatorem w mini-Tn5] w 5 ml sterylnego LB zawierającego 50 μg/ml Km w temperaturze 37 °C przez noc (O/N, 16–24 h) z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę (rpm).
    2. Zbiór i mycie
      1. Zbierz 1 ml każdej kultury, umieść ją w mikroprobówce o pojemności 2 ml i odwiruj (10 000 × g, temperatura pokojowa, 2 min). Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      2. Ponownie odwirować (10 000 × g, temperatura pokojowa, 2 min) i ponownie zawiesić w 500 μl sterylnego PBS.
    3. Łączenie filtrów
      1. Przygotuj sterylne płytki LB (z 1,6% agarem) i umieść na nich sterylny filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm. Wymieszaj 500 μl E. coli S17-1λpir zawierającego pJBA28 z E. coli DH10B zawierającym pBP136 i umieść mieszaninę na filtrze na płytce LB. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 30 °C. Wyjąć filtr z płytki LB, umieścić go w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 1 ml sterylnego PBS.
        Uwaga: pJBA28 może replikować się w obecności białka Π, kodowanego przez gen pir18, i może być przenoszony z S17-1λpir do DH10B. pBP136 nie zawiera genu markerowego17 i może być przenoszony z DH10B do S17-1λpir. Dlatego na tym etapie nie mogliśmy odróżnić S17-1λpir zawierającego pBP136 i pJBA28 od DH10B zawierającego pBP136 i mini-Tn5 (transponowanego do chromosomu lub pBP136). Następnie, w kolejnych krokach, wykorzystaliśmy ich mieszaniny jako dawców (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Wyhodować kulturę O/N powyższej mieszaniny kojarzeniowej w sterylnym LB zawierającym 50 μg/ml Km w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min i kulturą Pseudomonas putida KT2440 [wrażliwą na Km (Kms), wrażliwą na ryfampicynę (Rifs), wrażliwą na gentamycynę (Gms) i odporną na tetracyklinę (Tcr)] w pożywce zawierającej 12,5 μg/ml Tc w temperaturze 30 °C i wytrząsaniu przy 200 obr./min.
    5. Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich (mieszaniny współpracującej i KT2440) do dopasowania filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.
    6. Przygotować sterylne płytki LB zawierające 50 μg/ml Km i 12,5 μg/ml Tc (płytki LB + Km + Tc).
    7. Rozcieńczyć ponownie zawieszoną mieszaninę na filtrze membranowym sterylnym PBS (101–105-krotnie), a następnie rozprowadzić każde rozcieńczenie na płytkach LB + Km + Tc i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2–3 dni.
    8. Wybierz kolonie z płytek, wyhoduj kulturę O/N w sterylnym LB zawierającym Km i Tc oraz P. Resinovorans CA10dm4RG (Rifr i Gmr)6 w sterylnym LB zawierającym Rif (25 μg/mL) i Gm (30 μg/mL) w temperaturze 30 °C i 200 obr./min.
      nuta: Jak opisano w poprzedniej notatce, kolonie na płytkach LB + Km + Tc (od 1.1.7.) mogą być KT2440 zawierającymi pBP136 przenoszący mini-Tn5 i KT2440 z mini-Tn5, ponieważ pJBA28 może być bezpośrednio przenoszony z S17-1λpir zawierającego pBP136 i pJBA28 do KT2440. Dlatego wymagane jest kolejne krycie z P. resinovorans CA10RG, aby uzyskać docelowy pBP136 z mini-Tn5 w kolejnych krokach.
    9. Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.
    10. Przygotuj sterylne płytki LB zawierające płytki Rif, Gm i Km (płytki LB + Rif + Km + Gm).
    11. Zawiesić mieszaninę ponownie na filtrze, a następnie rozcieńczyć ją10 1–10 5-krotnie, rozprowadzić na płytkach LB + Rif + Km + Gm i inkubować płytki przez 2–3 dni w temperaturze 30 °C.
    12. Wybierz kolonie i sprawdź, czy są siedliskiem pBP136 metodą PCR przy użyciu określonych starterów dla plazmidu.
  2. Wprowadzenie genu selektywnego markera do docelowego plazmidu pCAR1
    Uwaga: Celem tego protokołu jest wygenerowanie pCAR1::gfp
    1. Wyhoduj kulturę O/N P. putida KT2440 zawierającą pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 przy 200 obr./min i 30 °C i E. coli S17-1λpir18 zawierającej pJBA28 w 5 ml sterylnego LB zawierającego 50 μg/mL Km przy 200 obr./min i 37 °C.
    2. Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.
    3. Wyjmij filtr z płytki LB, umieść go w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 1 ml sterylnego PBS.
    4. Rozcieńczyć zawieszoną mieszaninę sterylnym PBS (101–105-krotnie) i rozprowadzić rozcieńczoną mieszaninę na sterylnych selektywnych płytkach LB + Tc + Km.
      Uwaga: pCAR1 nie replikuje się w E. coli; w ten sposób P. putida KT2440 zawierający pCAR1 z mini-Tn5 można wybrać na tabliczkach LB + Tc + Km.
    5. Wybierz kolonię z talerza i wyhoduj kulturę O/N w sterylnym LB zawierającym Km i Tc oraz kulturę P. Resinovorans CA10dm4RG w sterylnym LB zawierającym Rif i Gm (200 obr./min, 30 °C).
    6. Po zebraniu i umyciu jak w kroku 1.1.2 należy użyć komór do połączenia filtra (O/N, 30 °C) jak w kroku 1.1.3.
    7. Zawiesić mieszaninę ponownie na filtrze, a następnie rozcieńczyć ją, rozprowadzić na płytkach LB + Rif + Km + Gm i inkubować płytki przez 2–3 dni w temperaturze 30 °C.
    8. Wybierz kolonie i sprawdź, czy zawierają pCAR1 metodą PCR ze specyficznymi starterami dla plazmidu.
  3. Potwierdź przenośność oznakowanych plazmidów i przygotuj dawców do kolejnych kroków
    Uwaga: Celem tego protokołu jest potwierdzenie przenośności wyżej skonstruowanych plazmidów i przygotowanie dawców do kolejnych kroków.
    1. Wyhoduj kulturę O/N P. resinovorans CA10dm4RG zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w sterylnym LB zawierającym Km i kulturę P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq, w której PA1/O4/O3-gfpmut3* nie ulega ekspresji z powodu chromosomalnego genu lacIq]21 w 3 ml LB zawierającego Tc (200 obr./min, 30 °C).
    2. Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.
    3. Umieść filtr w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i ponownie zamieszaj z 1 ml sterylnego PBS. Rozcieńczyć zawieszoną mieszaninę sterylnym PBS (101–105-krotnie), rozprowadzić rozcieńczoną mieszaninę na sterylnych selektywnych płytkach LB + Tc + Km.
    4. Wybierz kolonie i sprawdź, czy zawierają każdy z plazmidów metodą PCR z określonymi starterami.
      nuta: Potwierdzenie pozycji insercji mini-Tn5 poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie po ekstrakcji plazmidu jest opcjonalne, aby potwierdzić, że insercja nie wpływa na funkcję transferu plazmidów.

2. Obliczanie częstotliwości koniugacji metodą MPN

  1. Przygotuj sterylne płytki LB + Km i LB + Gm.
  2. Hodować kulturę O/N P. putida SMDBS zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w 3 ml sterylnego LB zawierającego Km i kulturę P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) w 3 ml LB zawierającej Gm (140 obr./min, 30 °C).
  3. Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra w temperaturze 30 °C przez 45 minut, jak w kroku 1.1.3.
  4. Seryjnie rozcieńczyć powyższą kulturę dawcy i biorcy (101 –107) i rozprowadzić ją na płytkach LB + Km (dawca) lub LB + Gm (biorca) (każda w trzech egzemplarzach), aby policzyć jednostki tworzące kolonię (CFU). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
  5. Zawiesić mieszaninę na filtrze w sterylnym LB zawierającym Km i Gm i seryjnie rozcieńczyć (od 21 do 224–107.2) za pomocą 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (w poczwórnym odstępie).
  6. Inkubować 96-dołkową płytkę przez odpowiedni czas (2 dni w temperaturze 30 °C).
  7. Policz jtk dawcy i biorcy na płytkach (krok 2.4) i policz liczbę studzienek, w których rosną transkoniuganty.
  8. Oblicz MPN i jego odchylenie za pomocą programu do obliczania MPN opracowanego przez Jarvisa i wsp. 22, który jest dostępny pod adresem http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Wprowadź nazwę eksperymentu (np. 'test'), datę eksperymentu (np. 2018/4/9), liczbę serii testów i maksymalną liczbę rozcieńczeń (wpisać '24') w wierszu #7 arkusza "Program" pliku Excel ("MPN_ver5.xls").
    2. Wpisać "2-1 (= 0,5)" do 2-24 (= 5,96 × 10-8)" w kolumnie "współczynnik rozcieńczenia d", "0,01" w kolumnie "objętość w ml lub g w" i "4" w polu "Liczba probówek n" w automatycznie tworzonych tabelach "danych wejściowych".
    3. Wprowadzić liczbę studzienek, w których transkoniuganty rosną przy każdym rozcieńczeniu próbki (0–4).
    4. Naciśnij prawy górny przycisk "Oblicz wyniki", a następnie uzyskaj wyniki (w MPN/μL) i ich 95% granice ufności (dolna i górna).
  9. Oblicz częstość koniugacji plazmidów, dzieląc liczbę transkoniugantów (MPN/ml) przez liczbę komórek dawcy i biorcy (CFU/ml).

3. Przygotowanie do oszacowania prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę

  1. Wyhodować kulturę O/N P. putida SMDBS zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w 3 ml sterylnego LB zawierającego Km i kulturę P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) w 3 ml sterylnego LB zawierającego Gm, używając kolb 300 ml (140 obr./min, 30 °C) jako prekultur.
  2. Przenieść 200 μl kultury wstępnej do 200 ml świeżego sterylnego LB zawierającego Km lub Gm w kolbach o pojemności 500 ml i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 140 obr./min.
  3. Zmierzyć zmętnienie kultury przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru UV-VIS i umieścić kulturę rozcieńczoną w LB (101–108-krotnych rozcieńczeniach) na płytce LB zawierającej Km lub Gm. Inkubować te płytki LB w temperaturze 30 °C przez 1–2 dni i oznaczyć jtk.
  4. Wykreśl wartości OD600 i CFU z czasem wzrostu, aby wygenerować krzywe wzrostu dawcy i biorcy.
  5. Hoduj kultury szczepu dawcy i biorcy do środkowej fazy logarytmicznej, w oparciu o krzywą wzrostu.
  6. Po pobraniu i umyciu komórek należy przygotować 101–103 jtk dawcy w 10 μl LB i 105–10 7 jtk biorcy w 100 μl LB.
  7. Wymieszać 10 μl kultur dawcy i 100 μl kultur biorcy o różnej gęstości na płytkach 96-dołkowych (w trzech powtórzeniach). Na przykład wymieszaj 101 CFU dawcy i 105 CFU biorcy i dodaj go do każdej z 96 studzienek, a następnie wymieszaj 101 CFU dawcy i 106 CFU biorcy w innej 96-dołkowej płytce i tak dalej.
  8. Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 45 minut, a następnie dodać wysokie stężenia antybiotyków (100 μg/ml Km i 60 μg/ml Gm) do każdego dołka, aby zahamować dalszą koniugację.
  9. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
  10. Policz liczbę studni, w których rosną transkoniuganty.
  11. Wybierz gęstość biorcy, która jest odpowiednia do oszacowania prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę na podstawie powyższych danych (transkoniuganty powinny znajdować się w co najmniej 1 dołku na 96-dołkowej płytce).
    nuta: Transkoniuganty będą rosły we wszystkich studzienkach, gdy gęstość komórek dawcy i biorcy jest wysoka i w studzience występuje więcej niż jedna koniugacja. W przeciwieństwie do tego, w żadnych studzienkach nie zostaną znalezione żadne transkoniuganty, gdy gęstość komórek jest zbyt niska. W następnej sekcji pojedyncza komórka dawcy jest sortowana do studzienki. W związku z tym zagęszczenie odbiorców powinno być maksymalne.

4. Oszacowanie prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę

  1. Przygotować 200 ml kultury w środkowej fazie logarytmicznej dawcy P. putida SMDBS zawierającego pBP136::gfp lub pCAR1::gfp i biorcy P. putida KT2440RGD, jak opisano w 3.6–3.7.
  2. Umieścić 106 jtk biorcy w 100 μl LB w każdym dołku 96-dołkowej płytki.
  3. Skonfiguruj system FACS (cytometria przepływowa i sorter komórek z ramieniem robota, laserem argonowym 488 nm i kryzą dyszy 70 μm). Ustawione na forward scatter (FSC), z progiem 1% jako wyzwalaczem akwizycji. Dostosuj wzmocnienie H i wzmocnienie A FSC i rozpraszania bocznego (SSC) przy maksymalnej czułości, co może wykluczyć sygnały fałszywie dodatnie, używając PBS jako kontroli negatywnej. Ustaw bramkę sortowania w oparciu o FSC i SSC oraz tryb sortowania 0,5 drop, aby uzyskać maksymalną czystość sortowania.
  4. Sortuj pojedynczą komórkę dawcy za pomocą FACS na płytce LB (384 różne plamki), inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni, a następnie policz, ile kolonii pojawia się na płytce z posortowanych komórek.
    nuta: Ta procedura służy do walidacji ustawionej bramki. Jeśli na płytce znajdują się 384 kolonie, oznacza to, że 100% posortowanych komórek może utworzyć kolonie. Średnia trafność sortowania wynosi zawsze 90–95%.
  5. Posortować pojedynczą komórkę dawcy za pomocą FACS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z biorcą (4.2).
  6. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 30 °C, a następnie dodać wysokie stężenia antybiotyków (100 μg/ml Km i 60 μg/ml Gm) do każdego dołka, aby zapobiec dalszemu koniugacji.
  7. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
  8. Policz liczbę studni, w których rosły transkoniuganty, zgodnie z oględzinami gołym okiem.
  9. Oblicz prawdopodobieństwo koniugacji zainicjowanej przez dawcę, dzieląc liczbę studzienek z transkoniugantami przez całkowitą liczbę dołków, w których dawca został posortowany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie częstotliwości koniugacji metodą MPN

W naszym poprzednim raporcie porównaliśmy częstotliwości konjugacji pBP136::gfp or pCAR1::gfp w trzykrotnie rozcieńczonym płynnym medium LB (1/3 LB) przy różnych prędkościach mieszania, po 45-minutowym kojeniu w kolbach z mieszadłem o pojemności 125 ml10Porównaliśmy częstotliwości konjugacji pBP136::gfp or pCAR1::gfp z 10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół o wysokiej rozdzielczości do wykrywania różnic w częstości koniugacji w różnych warunkach, przy użyciu metody MPN do oszacowania liczby transkoniugancji. Jednym z ważnych kroków w protokole jest rozcieńczenie mieszaniny dawcy i biorcy po kryciu, aż nie wyrosną żadne transkoniuganty. Kolejnym krokiem jest dodanie wysokich stężeń antybiotyków do selektywnej pożywki płynnej, aby zapobiec dalszej koniugacji. Procedury te mogą zmniejszyć tło spowodowane dalszą koniugacją w pożywce selektyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr K. Kamachi z Narodowego Instytutu Chorób Zakaźnych (Japonia) za dostarczenie pBP136 oraz prof. dr H. Nojiri z Uniwersytetu Tokijskiego (Japonia) za dostarczenie pCAR1. Jesteśmy również wdzięczni profesorowi dr Molinowi Sølenowi z Duńskiego Uniwersytetu Technicznego za udostępnienie pJBA28. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI (numery grantów 15H05618 i 15KK0278) dla MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600Roztwór
osłonowy Fluorosfery (10 μ m)Beckman-Coulter6605359koraliki do założenia
inkubatoraYamato Scientific Co. Ltd211197-IC802
Spektrofotometr UV-VIS UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
96-dołkowe płytkiNIPPON Genetics Co, LtdTR5003
mikropłytka typu szalka PetriegoAXEL1-9668-01do walidacji sortowania
membranowyADVANTECC045A025Awspółpracujących z filtrami
Nichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0,5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ Pipety
wielokanałoweNichiryo CO., Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0,5-10 μ L, 20-200 μ L
TryptonBD Difco211705
Ekstrakt drożdżowyBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
AgarNakarai tesque01162-15
ryfampicynaWako185-01003
gentamycynaWako077-02974
kanamycynaWako115-00342
Szalka PetriegoAXEL3-1491-51Mikroprobówki JPND90-15
Fukaekasei131-815C
500 ml jednorazowa kolba obrotowaCorningCLS3578
FACS filtr do pipet L

Bibliografia

  1. Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
  2. Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
  3. Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
  4. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  5. Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
  6. Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
  7. Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
  8. Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
  9. Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
  10. Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248(2017).
  11. Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
  12. Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
  13. Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
  14. Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
  15. Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
  16. Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
  17. Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
  18. Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
  19. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
  20. Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
  21. Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
  22. Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
  23. Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
  24. Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
  25. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
  26. Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
  27. Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Częstość konjugacjinajbardziej prawdopodobna liczbasortowanie komórek aktywowane fluorescencjątransfer plazmidowego DNAPseudomonas putidageny oporności na antybiotykihoryzontalny transfer genówrozcieńczenia seryjnejednostki tworzące kolonie
Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.