Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Podsumowanie

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Streszczenie

Regulacja genów odgrywa ważną rolę w rozwoju. Liczne białka wiążące DNA i RNA wiążą swoje sekwencje docelowe z wysoką specyficznością, aby kontrolować ekspresję genów. Te białka regulatorowe kontrolują ekspresję genów na poziomie DNA (transkrypcja) lub na poziomie RNA (splicing pre-mRNA, poliadenylacja, transport, rozpad i translacja). Identyfikacja sekwencji regulatorowych pomaga zrozumieć nie tylko, w jaki sposób gen jest włączany lub wyłączany, ale także to, które geny są regulowane przez określone białko regulatorowe. W tym miejscu opisujemy jednoetapowe podejście, które umożliwia mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA. Polega na domieszkowaniu matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania, syntezie oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforooctianowym oraz izolacji frakcji związanej po inkubacji z białkiem. Interferencja ze strony nukleotydów typu innego niż dziki powoduje ich preferencyjne wykluczenie z frakcji związanej z białkiem. Jest to monitorowane za pomocą elektroforezy żelowej po selektywnym rozszczepieniu chemicznym jodem wiązań fosfodiestrowych zawierających fosforotioniany (mutageneza fosfotionianów lub PTM). To jednoetapowe podejście mutagenezy saturacji ma zastosowanie do charakterystyki dowolnego miejsca wiązania białka w RNA.

Wprowadzenie

Regulacja genów odgrywa ważną rolę w biologii. Geny mogą być regulowane na poziomie transkrypcji, splicingu przed mRNA, tworzenia końca 3', eksportu RNA, translacji, lokalizacji mRNA, rozpadu, modyfikacji/stabilności potranslacyjnej itp. Zarówno białka wiążące DNA, jak i RNA odgrywają kluczową rolę w regulacji genów. Podczas gdy molekularne analizy genetyczne zidentyfikowały wiele białek regulatorowych, tylko niewielka część z nich została w pełni scharakteryzowana pod kątem ich funkcji komórkowych lub miejsc wiązania in vivo. Analiza sekwencji filogenetycznej i mutageneza oferują uzupełniające się podejścia do charakteryzowania interakcji DNA-RNA-białko.

Białka wiążące RNA są ważne w procesach rozwojowych, w tym w różnicowaniu płciowym. Białko Drosophila Sex-lethal (SXL) lub główne białko zmiany płci jest nieobecne u mężczyzn, ale obecne u samic. Rozpoznaje sekwencje bogate w urydynę lub szlaki pirymidynowe sąsiadujące z określonymi miejscami splicingu w dalszych celach pre-mRNA (transformator, letalny dla płci i śmiertelny dla mężczyzn2) w komórkach somatycznych^1,2,3,4. Ponadto reguluje przełączanie miejsc poliadenylacji poprzez wiązanie się z bogatymi w urydynę sekwencjami wzmacniającymi poliadenylację we wzmacniaczu szczątkowego (e(r)) transkryptu5^,6. SXL prawdopodobnie reguluje dodatkowe cele w żeńskiej linii zarodkowej, które pozostają do zidentyfikowania^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Zazwyczaj, charakterystyka miejsca wiązania obejmuje mutagenezę, na przykład poprzez delecję lub podstawienie pojedynczych lub wielokrotnych nukleotydów. Każde zmutowane miejsce wiązania, w stosunku do sekwencji RNA typu dzikiego, jest następnie analizowane przy użyciu serii stężeń białka w celu określenia jego powinowactwa wiązania (K_d lub równowagowa stała dysocjacji) dla białka będącego przedmiotem zainteresowania; K_d to stężenie białka wymagane do uzyskania 50% wiązania RNA. Ten pracochłonny proces szczegółowej mutagenezy obejmuje generowanie i analizę licznych mutantów - trzech nukleotydów typu niedzikiego dla każdej pozycji w miejscu wiązania. W związku z tym istnieje potrzeba alternatywnego podejścia do szybszej, prostszej i niedrogiej mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA.

Tutaj opisujemy jednoetapowe podejście, które pozwala na mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA. Polega na domieszkowaniu matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania, syntezie oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforooctianowym oraz izolacji frakcji związanej po inkubacji z białkiem. Interferencja ze strony nukleotydów typu innego niż dziki powoduje ich preferencyjne wykluczenie z frakcji związanej z białkiem. Jest to monitorowane za pomocą elektroforezy żelowej po selektywnym rozszczepieniu chemicznym jodem wiązań fosfodiestrowych zawierających fosforotioniany (mutageneza fosfotionianów lub PTM). To jednoetapowe podejście mutagenezy saturacji ma zastosowanie do charakterystyki dowolnego miejsca wiązania białka w RNA.

Protokół

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd mutagenezy fosforotionianów i podsumowuje kluczowe etapy tego procesu.

1. Generowanie biblioteki mutantów — Matryca dopingującego DNA z nukleotydami typu niedzikiego

1. Zsyntetyzuj T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA.
2. Zsyntetyzować domieszkowany oligonukleotyd (nić komplementarna) przez syntezę chemiczną na syntetyzatorze DNA odpowiadającym miejscu wiązania białka. Podczas syntezy chemicznej należy użyć odpowiedniej mieszaniny fosforamidytów dla każdego miejsca domieszkowania (X poniżej) o stosunku 90% A jako nukleotyd typu dzikiego i 10% T jako nukleotyd typu niedzikiego (więcej szczegółów na temat tego stosunku można znaleźć w reprezentatywnych wynikach).
   Uwaga: Tutaj sekwencja domieszkowanego oligonukleotydu to 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'. Podkreślona sekwencja jest odwrotnym dopełnieniem miejsca wiązania białka SXL oraz dodatkowymi nukleotydami poza miejscem wiązania, które zapewniają użyteczne kontrole potwierdzające, że nie każda zmiana w RNA wpływa na wiązanie, a także są kontrolami obciążenia dla porównania i normalizacji nukleotydów w miejscu wiązania. Do opracowania proponowanej metodologii wykorzystano sekwencję miejsca wiązania SXL UUUUUUUUUUUUUU, która jest obecna w transformatorze pre-mRNA^14,15,16,17. Sekwencja pisana kursywą jest komplementarna do sekwencji startera T7 i jest promotorem T7 do transkrypcji in vitro.

2. Synteza RNA

1. Zsyntetyzuj RNA w reakcji transkrypcji 20 μl, jak opisano wcześniej¹⁸.
   1. Wymieszaj bufor transkrypcyjny T7 i 1 μM oligonukleotydu T7, 1 μM domieszkowanego oligonukleotydu, 10 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM GTP, po 1 mM ATP, CTP i UTP (trifosforan guanozyny, adenozyny, cytydyny i urydyny) oraz 2 U/μL polimerazy RNA T7.
   2. Dodaj, w dwóch oddzielnych probówkach do mikrowirówek, 0,167 mM α-tio ATP lub 0,05 mM α-tio UTP, aby włączyć fosforotioniany (patrz schematy w Rysunek 2) do RNA.
      UWAGA: W przypadku alternatywnych protokołów dodać 0,2 mM α-tioCTP lub 0,2 mM α-tioGTP do odpowiedniej reakcji transkrypcji zawierającej domieszkowany oligonukleotyd w celu przetestowania dwóch pozostałych podstawień nukleotydów.
   3. Inkubować mieszaninę reakcyjną syntezy RNA przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Do próbki RNA dodać 2,5 μl termolabilnej fosfatazy alkalicznej i 2,5 μl buforu 10xfosfatazy. Inkubować tę reakcję 25 μl przez 10–30 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia 5' fosforanów.
3. Enzym fosfatazy alkalicznej należy dezaktywować przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 2–5 minut.
4. Znakować radioizotopowo koniec 5' zdefosforylowanego RNA (5 pmole) za pomocą 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 i 1 μl ^γ-32P ATP w objętości reakcyjnej 10 μl. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30–60 minut w temperaturze 37 °C.
5. Dezaktywować enzym kinazy polinukleotydowej T4 przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C przez 20–30 minut.
6. Żel oczyszcza RNA przez elektroforezę w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Zlokalizuj RNA na żelu za pomocą autoradiografii. Wyciąć plasterek żelu zawierający znakowane radioaktywnie RNA, rozdrobnić w probówce do mikrowirówki, dociskając do ścianek końcówką pipety i zanurzyć w buforze proteinazy K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecylosiarczan sodu). Obracaj rurkę w temperaturze pokojowej od 2 godzin do nocy.
7. Odwirować zawiesinę żelu, wyrzucić żel i zebrać roztwór buforowy.
8. Dwukrotnie ekstrahować roztwór równą objętością chloroformu fenolowego i raz chloroformem i zebrać fazę wodną.
9. Dodać do fazy wodnej 0,1 objętości 3M octanu sodu o pH 5,2, nośnikowym tRNA lub glikogenu i 2,5 objętości etanolu. Utrzymywać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
10. Odwirowywać próbkę przez 5–10 minut w mikrowirówce wysokoobrotowej o sile 16 873 x g. Ostrożnie usunąć roztwór buforu/etanolu, nie naruszając osadu RNA.
11. Umyj granulat 70% etanolem i odwiruj przez 2–5 minut. Ostrożnie usuń etanol. Wysuszyć pelety na powietrzu.
12. Zawiesić granulat w 20–50 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki z radioznakowanym RNA, stosując odpowiednie środki ostrożności i osłonę z pleksiglasu w celu ochrony przed radioaktywnością. Obecnie kolumny wirowe są częściej stosowane i wygodniejsze do usuwania nieinkorporowanej radioaktywności, jako alternatywa dla żelowego oczyszczania RNA.

3. Reakcja wiązania białek i separacja związanego RNA

1. Ekspresja rekombinowanego białka i oczyszczanie z E. coli.
2. Oszacować stężenie białka rekombinowanego za pomocą spektrofotometrii lub przez rozdzielenie w żelu poliakryloamidowym SDS obok znanego wzorca białka, albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Zwizualizuj interesujące Cię białko i standard BSA, barwiąc żel Coomassie Brilliant Blue R-250. Określić ilościowo białko w porównaniu ze znanymi ilościami rozcieńczeń BSA na tym samym żelu.
   UWAGA: Przechowywać białko rekombinowane w temperaturze -80 °C do czasu użycia i rozcieńczyć w 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES), pH 8,0, 1 mM ditiotreitolu (DTT), 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glicerolu. Stosowanie 0,5–1,0 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanu sulfonylu (PMSF) jest opcjonalne.
3. Przeprowadź reakcję wiązania RNA (20–100 μl) w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 jednostki/μl inhibitora RNazy, 0,09 μg/μL acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, 1 mM EDTA, 0,15 μg/μL tRNA, 5'-końcu znakowanego radioaktywnie RNA i 6 μL o odpowiednim stężeniu (stężenie, w którym ~50% RNA wiąże się z białkiem) białka.
   UWAGA: Ten bufor wiążący działa dla trzech białek wiążących RNA (SXL, U2AF⁶⁵ i PTB), ale musi być standaryzowany dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Oszacuj stężenie białka empirycznie, stosując różne rozcieńczenia dla danego preparatu białkowego, które jest wymagane do uzyskania około 50% wiązania RNA. Ten warunek lub K_d reprezentuje najbardziej wrażliwą część krzywej wiązania RNA.
4. Inkubować reakcję wiązania białek przez 20–30 minut w temperaturze 25 °C (lub na lodzie).
5. Oddzielić frakcję RNA związaną z białkiem od frakcji niezwiązanej, stosując jedno z dwóch podejść:
   1. Wiązanie filtra nitrocelulozowego
      1. Reakcję wiązania (20–100 μl) nanieść na filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego w temperaturze pokojowej.
         UWAGA: Tylko kompleks RNA-białko jest zatrzymywany na filtrze, a niezwiązane RNA przepływa przez filtr. Podejście polegające na wiązaniu filtra pozwala na szybszy odzysk związanego RNA oraz jest szybsze i prostsze w porównaniu z testem przesunięcia ruchliwości żelu. Umieszczając membranę DEAE pod filtrem nitrocelulozowym, możliwe jest również zebranie niezwiązanej frakcji RNA lub wolnego RNA w celu porównania z frakcją związaną.
      2. Pokrój część filtra nitrocelulozowego zawierającą zatrzymany radioaktywny RNA na mniejsze kawałki, aby zmieściły się w probówce do mikrowirówki, zanurz w wystarczającej ilości buforu PK (300–500 μl zawierającego 10–20 μg PK), aby zanurzyć fragmenty filtra, i wymyj RNA z filtra na 2-3 godziny lub na noc.
      3. Ekstrakt z fenol-chloroformem, chloroformem i zebrać fazę wodną. Dodać octan sodu i etanol, a po inkubacji w zamrażarce odwirować, umyć, wysuszyć i ponownie zawiesić RNA w wodzie uzdatnionej przez DEPC. Wykonaj następujące kroki zgodnie z opisem w krokach od 2.10 do 2.14 powyżej.
   2. Zmiana mobilności żelu
      1. Przygotuj i polimeryzuj 5% natywny żel poliakryloamidowy (60:1 Akrylamid:bis-akrylamid) w 0,5x TBE (standardowy bufor Tris-Boran-EDTA) przed rozpoczęciem reakcji wiązania, jako alternatywę dla metody wiązania filtra.
      2. Żel należy wstępnie uruchomić przez 15 minut pod napięciem 250 V w chłodni (4 °C).
      3. Załaduj każdą reakcję wiązania (powyżej) do oddzielnych studzienek powyższego żelu wstępnego.
         UWAGA: Bufor do przechowywania białka zapewnia wystarczającą ilość glicerolu do załadowania próbki do studzienek.
      4. Oddzielić RNA związane z białkiem za pomocą elektroforezy żelowej w chłodnym pomieszczeniu pod napięciem 250 V przez 1 do 2 godzin, w zależności od wielkości RNA i konkretnego białka.
      5. Zlokalizuj położenie kompleksu RNA-białko na żelu za pomocą autoradiografii. Wyciąć plasterek żelu zawierający kompleks RNA-białko. Eluować RNA z wycinka żelu, krusząc wycinek żelu i mocząc go w buforze PK.
      6. Ekstrahować fenol-chloroformem, chloroformem i zebrać fazę wodną. dodać octan sodu i etanol, a po inkubacji w zamrażarce odwirować, przemyć, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Wykonaj następujące kroki zgodnie z opisem w krokach od 2.10 do 2.14 powyżej.

4. Analiza produktów fosforotanianu jodu w celu wykrycia pozycji zmutowanych nukleotydów

1. Dodać 1 mM jodu do 20 μl wody uzdatnionej DEPC zawierającej do 10 μg nośnika tRNA, aby rozszczepić RNA (związane i całkowite RNA) w miejscach włączenia fosforotionianu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
   UWAGA: Więcej szczegółów na temat rozkładu jodu w nieco innych warunkach — 7% (v/v) jodoetanolu, ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 3 minuty — można znaleźć w Gish & Eckstein 1988¹⁹.
2. Wytrącić rozszczepiony RNA, dodając octan sodu/etanol, jak opisano powyżej. Zawiesić ponownie w barwniku ładującym do żeli denaturujących. Podgrzej i załaduj próbkę w celu oddzielenia fragmentów RNA za pomocą elektroforezy w 15–20% denaturującym żelu poliakrylamidowym.
3. Żel poliakrylamidowy należy narazić na folię rentgenowską.
4. Wykrywanie prążków we frakcji związanej w stosunku do całkowitej puli za pomocą autoradiografii.
   UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności z jodem w okapie. Do pokazanej tutaj separacji RNA stosuje się żel w kształcie klina, który uzyskuje się poprzez podwojenie grubości obu przekładek na dole płytek żelowych poprzez włożenie dodatkowego calowego elementu dystansowego na dnie żelu. Taki kształt pozwala na bardziej jednolite lub bliższe odstępy między krótszymi fragmentami RNA. Alternatywnie, zamiast klisz rentgenowskich można użyć luminowizora do wykrywania i ilościowego oznaczania radioaktywności.

Wyniki

Zasada mutagenezy saturacji z użyciem dopingu:

Aby uzyskać odpowiedni stosunek molowy nukleotydów typu dzikiego i innych, użyj równej mieszaniny wszystkich czterech nukleotydów, jeśli ma być analizowana tylko jedna pozycja. Jeśli jednak wiele pozycji jest analizowanych jednocześnie, stosunek nukleotydów typu innego niż dzikiego do nukleotydów typu dzikiego musi zostać dostosowany, tj. zmniejszony. W przeciwnym razie, opróc...

Dyskusja

Mutageneza od dawna jest stosowana do charakteryzowania miejsc wiązania białek. Po pierwsze, można skonstruować serię mutantów i indywidualnie przetestować je w testach wiązania, aby przeanalizować ich wpływ na powinowactwo wiązania. Podczas gdy standardowe podejście mutagenezy oferuje sposób analizy kilku sekwencji, wiele kroków związanych z podejściem standardowym, takich jak konstruowanie mutantów i przeprowadzanie serii reakcji wiązania dla każdego mutanta, jest pracochłonne i czasochłonne oraz może nie pozwalać na m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Uridine 5' a-tiotrifosforan	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenozyno-5' a-tiotrifosforan	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Kolektor próżniowy	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  25  mm Szklany mikroanalityczny filtr próżniowy
Kolektor próżniowy	Millipore	XX2702552	1225 Kolektor próżniowy do pobierania próbek
Nitroceluloza	Milipora	HAWP
Nitroceluloza	Schleicher & Zestaw do	PROTRAN
NEB		M0508
T4 Kinaza polinukleotydowa	NEB	M0201S
Proteinaza K	NEB	P8107S
T7 Polimeraza RNA	NEB	M0251S
RNasin	Promega		Inhibitor RNazy
Szklane płytki	Standard
Sprzęt do elektroforezy żelowej	Standardowy	Standardowe
filmy rentgenowskie	Standardowe
Standardowe Roztwory żelu poliakrylamidowego	Standardowe	Standard