Method Article

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/57819

⸱

June 29th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik

.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda Replica Set to podejście do ilościowego pomiaru długości życia lub przeżywalności nicieni Caenorhabditis elegans w sposób wysokoprzepustowy, co pozwala pojedynczemu badaczowi na badanie większej liczby zabiegów lub schorzeń w tym samym czasie bez utraty jakości danych. Metoda wymaga powszechnego sprzętu, który można znaleźć w większości laboratoriów pracujących z C. elegans, a zatem jest prosta do przyjęcia. Podejście to koncentruje się na oznaczaniu niezależnych próbek populacji w każdym punkcie obserwacyjnym, a nie pojedynczej próbki w czasie, jak w przypadku tradycyjnych metod podłużnych. Punktacja polega na dodaniu cieczy do studzienek płytki wielodołkowej, co stymuluje C. elegans do poruszania się i ułatwia ilościowe określenie zmian w długości zdrowia. Inne główne zalety metody Replica Set to zmniejszone narażenie powierzchni agaru na zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu (np. pleśń lub grzyby), minimalne obchodzenie się ze zwierzętami oraz odporność na sporadyczne błędne oceny (takie jak nazywanie zwierzęcia martwym, gdy jest jeszcze żywe). Aby odpowiednio przeanalizować i zwizualizować dane z eksperymentu w stylu zestawu replik, opracowano również niestandardowe narzędzie programowe. Obecne możliwości oprogramowania obejmują wykreślanie krzywych przeżycia zarówno dla zestawu replik, jak i tradycyjnych eksperymentów (Kaplana-Meiera), a także analizę statystyczną dla zestawu replik. Przedstawione tutaj protokoły opisują tradycyjne podejście eksperymentalne i metodę zestawu replik, a także przegląd odpowiedniej analizy danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najbardziej przełomowych osiągnięć technologicznych w kierunku zrozumienia genetycznych podstaw starzenia się był rozwój RNAi opartego na żywieniu u C. elegans1; przed eksperymentalnym zastosowaniem RNAi, wiele fenotypów starzenia się nie było genetycznie podatnych. RNAi oparte na żywieniu uzyskuje się poprzez produkcję dsRNA w E. coli, który pasuje do endogennego mRNA C. elegans: IPTG indukuje dwukierunkową transkrypcję przez wstawkę cDNA C. elegans lub część otwartej ramki odczytu w plazmidzie2. Kiedy C. elegans żywi się nienaruszonym E. coli, dsRNA wytwarzane przez bakterie jest transportowane ze światła do komórek jelitowych przez białko transbłonowe SID-23, a następnie rozprowadzane przez resztę zwierzęcia za pośrednictwem SID-14. W każdej komórce egzogenne dsRNA jest przetwarzane przez kompleks Dicer w siRNA, które oddziałuje z dojrzałym mRNA poprzez komplementarne parowanie zasad, tworząc nowy dupleks siRNA-mRNA. Ten duplex jest rozpoznawany przez kompleks RISC i rozszczepiany, degradując w ten sposób endogenne mRNA5. W ten sposób, po prostu zmieniając wstawkę plazmidu, można dezaktywować funkcję prawie każdego genu w genomie C. elegans. Odkrycie to doprowadziło do stworzenia kilku dużych bibliotek RNAi opartych na żywieniu - kolekcji przekształconych stad E. coli, które można połączyć w celu uzyskania pokrycia około 86% znanych genów C. elegans6,7.

Od czasu rozwoju RNAi opartego na żywieniu, kompleksowe badania przesiewowe u C. elegans doprowadziły do odkrycia ponad 900 genów, które zmieniają długość życia podczas inaktywacji (czego dowodem są powiązania RNAi-fenotyp wyselekcjonowane w WormBase), które nazywamy gerogenami. Rola większości gerogenów w kontroli długowieczności została odkryta poprzez RNAi oparte na żywieniu w zaledwie kilku przełomowych raportach (zobacz Rysunek 1A i Plik Uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). W niektórych przypadkach te gerogeny zostały zidentyfikowane na podstawie pomiaru żywotności w jednym lub kilku punktach czasowych, co nie zapewnia wymiernej miary zmiany długości życia po leczeniu RNAi. W innych przypadkach geny te zostały ocenione ilościowo pod kątem zmian w długości życia, a także dodatkowych fenotypów związanych z wiekiem. Na przykład wcześniej zidentyfikowaliśmy 159 genów, które były niezbędne zarówno dla normalnej, jak i zwiększonej długości życia zwierząt ze zmniejszoną sygnalizacją insuliny/IGF-1 i określiliśmy ilościowo zmiany w długości zdrowia. Spośród nich 103 inaktywacje genów skutkują fenotypem progerycznym, ponieważ utrata spowodowała jedną lub więcej oznak przedwczesnego starzenia się8.

Podczas gdy niektóre gerogeny zostały powiązane ze 100 lub więcej badaniami (np. daf-16, daf-2, sir-2.1), ponad 400 gerogenów ma 10 lub mniej cytowań (Rysunek 1B i plik uzupełniający 2). Tak więc, podczas gdy kompleksowe badania przesiewowe RNAi oparte na żywieniu odkryły i pobieżnie scharakteryzowały setki domniemanych gerogenów, sposób, w jaki te geny funkcjonują w kontroli długowieczności i genetyczne powiązania między tymi produktami genów, pozostają słabo zbadane. Pełna analiza podłużna fenotypów związanych z wiekiem jest warunkiem wstępnym identyfikacji interakcji genetycznych między gerogenami (np. interakcji epistatycznych, interakcji asyntetycznych itp.). Uzyskanie głębszego wglądu w genetyczne powiązania między gerogenami wymaga wysokoprzepustowej metody ilościowej, która wykorzystuje również zalety RNAi opartego na karmieniu.

Najczęstszą zastępczą miarą starzenia się jest długość życia. Tradycyjne podejście do pomiaru śmiertelności C. elegans śledzi śmierć poszczególnych zwierząt w czasie w małej próbie populacji. Stosunkowo niewielka liczba zwierząt jest obserwowana z biegiem czasu i okresowo delikatnie szturchana platynowym drutem lub rzęsą, z ruchem jako wskaźnikiem żywotności (Rysunek 2A). Metoda ta jest szeroko stosowana, ponieważ zapewnia proste, bezpośrednie pomiary średniej i maksymalnej długości życia. Jednak ta tradycyjna metoda jest czasochłonna i stosunkowo mało przepustowa, co ogranicza liczbę zwierząt i warunki, które można jednocześnie mierzyć w kontrolowany sposób. Niedawne badanie symulacyjne wykazało, że wiele badań nad długością życia C. elegans nie bada wystarczająco dużej liczby zwierząt, aby móc wiarygodnie wykryć niewielkie zmiany między warunkami9. Co więcej, ta tradycyjna metoda polega na wielokrotnym obchodzeniu się z tą samą kohortą zwierząt w czasie, co z kolei może wprowadzić zanieczyszczenie i uszkodzić lub zabić coraz bardziej delikatne, starzejące się zwierzęta.

Opracowaliśmy alternatywną metodologię pomiaru długości życia C. elegans w "Replica Set". W tym celu duża populacja zsynchronizowanych pod względem wieku, izogenicznych zwierząt jest dzielona na szereg małych populacji (lub replik). Generowana jest wystarczająca liczba próbek replik, aby pokryć każdy punkt czasowy w planowanym eksperymencie. W każdym punkcie obserwacyjnym jedna z replik jest oceniana za liczbę żywych, martwych i ocenzurowanych zwierząt, a następnie zwierzęta w tej replikacji są odrzucane. W związku z tym, w oczekiwanej długości życia populacji jako całości, okresowo próbkowana jest seria niezależnych subpopulacji (Rysunek 2B). W przypadku korzystania z zestawów replik nie dochodzi do wielokrotnego poganiania zwierząt i wielokrotnego narażenia na potencjalne skażenie środowiska. Żywotność zaobserwowana w jednym punkcie czasowym jest całkowicie niezależna od każdej innej obserwacji, co minimalizuje obsługę i zwiększa przepustowość o co najmniej rząd wielkości. Pozwoliło nam to na ilościowe określenie zmian w długości życia setek klonów RNAi jednocześnie8,10.

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły do badania długości życia C. elegans zarówno za pomocą Zestawu Replik, jak i tradycyjnych metod oceny długowieczności C. elegans. Pokazujemy, że podobne wyniki uzyskuje się między metodami. Opracowaliśmy oprogramowanie wspomagające graficzną analizę danych dotyczących długości życia generowanych za pomocą obu podejść, które bezpłatnie udostępniamy na licencji GPL V3 (patrz tabela materiałów). "WormLife" jest napisany w R11 i zawiera graficzny interfejs użytkownika (GUI) do wykreślania danych, który został przetestowany w systemach Mac OS i Linux. Na koniec porównujemy i kontrastujemy ograniczenia każdej metody i podkreślamy inne kwestie brane pod uwagę przy wyborze między podejściami do pomiaru ilościowych zmian w długości życia C. elegans.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tradycyjna metoda oceny długowieczności C. elegans

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Zidentyfikuj geny, które mają być inaktywowane za pomocą RNAi opartego na karmieniu. Zakup przekształconych zapasów HT115 E. coli2 zawierających interesujący klon RNAi. Alternatywnie, należy sklonować cDNA interesującego genu do miejsca multiklonowania plazmidu L4440.
      UWAGA: HT115 to szczep E. coli z niedoborem RNazy III z indukowaną przez IPTG aktywnością polimerazy T7, który jest stosowany w celu zapobiegania degradacji dsRNA w bakteriach. Do badań długości życia, w których nie wykorzystuje się RNAi opartego na karmieniu, można użyć HT115 lub OP50 E. coli na standardowych płytkach NGM.
    2. Przygotować 3–6 (lub więcej) płytek RNAi o średnicy 6 cm na każdy warunek testowy (plik uzupełniający 3 dla przepisu). Płytki RNAi należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed wysiewem z bakteriami przez okres do kilku miesięcy.
    3. Wyhodować przekształconą E. coli przez noc (16–20 godzin, inkubator z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 180–220 obr./min).
      UWAGA: HT115 E. coli jest hodowany w LB z ampicyliną (50 mg / ml). Standardowa OP50 E. coli nie jest oporna na antybiotyki i jest hodowana bez ampicyliny. Objętość hodowli zależy od # płytek, ale zwykle wynosi od 8 do 100 ml LB, w zależności od projektu eksperymentalnego.
      1. Zagęścić bakterie przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 15–20 minut w wirówce stołowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad przy 1/10 objętości wyjściowej (tj. 10x) w LB z ampicyliną dla HT115 (lub bez ampicyliny dla wzorca OP50).
      2. Porcja 200 μL skoncentrowanych 10x bakterii na każdą 6 cm płytkę. Przygotować 3–4 powtórzenia na warunki testowe, z 2 dodatkowymi płytkami zapasowymi, do użycia w przypadku zanieczyszczenia. Przygotowując płytki, oznacz je tak, aby eksperymentator oceniający test był ślepy na warunki eksperymentalne, używając kodu koloru lub podobnego schematu kodowania. Upewnij się, że kod został zapisany.
      3. Pozostaw otwarte płytki do wyschnięcia w czystym środowisku, takim jak ławka z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta lub pozwól przykrytym płytkom wyschnąć na stole przez noc. Monitoruj płytki podczas suszenia, aby upewnić się, że agar jest suchy bez nadmiernego przesuszenia.
        UWAGA: Nadmierne suszenie płytek prowadzi do pękania agaru, co spowoduje, że C. elegans zagrzebie się w agarze. Zwilżenie powierzchni agaru również sprzyja zakopywaniu się.
    4. Wysuszone płytki należy przechowywać przez noc (do 24 godzin) w pojemniku na robaki w temperaturze pokojowej, aby umożliwić indukcję produkcji dsRNA. Po 1 dniu w temperaturze pokojowej przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni w szczelnie zamkniętej torbie z zamkiem błyskawicznym (aby zapobiec wysychaniu płytek). Przed użyciem zwróć płytki do temperatury pokojowej w torbie z zamkiem błyskawicznym, aby zapobiec kondensacji przedostawającej się do unoszących się w powietrzu zanieczyszczeń grzybiczych.
  2. Synchronizacja C. elegans z leczeniem podchlorynem
    UWAGA: Patrz plik uzupełniający 3, aby zapoznać się z przepisami na M9 i roztwór podchlorynu.
    1. Zbieraj dorosłe zwierzęta za pomocą M9. Użyj zatkanej szklanej pipety, aby przejść do 2 probówek o pojemności 15 ml.
    2. Rurki wirujące dla 30" przy ~2,000 obr./min. Sprawdź, czy na dnie rurki nie ma kałuży nicieni. Odessać supernatant. Przemyć dwa razy roztworem M9, powtarzając wirowanie i aspirację.
    3. Ponownie zawiesić C. elegans w 4 ml M9. Dodać 2 ml roztworu podchlorynu. Natychmiast wirować przez ~3 min, z okresowym energicznym wstrząsaniem. Po 3 minutach poszukaj chmury jaj pod mikroskopem preparacyjnym. Wiruj przez dodatkowe 10–20 s, jeśli jaja nie zostaną uwolnione po 3 minutach.
      UWAGA: Niezbędny jest czas leczenia podchlorynem. Jaja w grawitacyjnych osobnikach dorosłych są tym, co przetrwa leczenie. Po ~3 minutach dorosłe osobniki pękają i jaja wysypują się na zewnątrz. Jeśli jednak jaja znajdują się w roztworze podchlorynu zbyt długo po uwolnieniu, umrą. I odwrotnie, jeśli grawitujące dorosłe osobniki nie zostaną pozostawione w roztworze podchlorynu wystarczająco długo, żadne jaja nie zostaną uwolnione.
    4. Szybko przemyć roztworem M9 dwa razy, jak w kroku 2.1.2.
    5. Ponownie zawiesić granulat jaj C. elegans w 3 ml M9 i przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić zarodki do wylęgu się na noc w 3 ml roztworu M9 z rotacją w temperaturze 20 °C.
    6. Obliczyć gęstość zwierząt L1 (lub zarodków) na μl, upuszczając 10 μl roztworu L1 3x na 6-centymetrową płytkę i policz liczbę zwierząt L1, aby obliczyć średnią liczbę L1s/μL.
      UWAGA: Zwierzęta L1 z czasem się ustabilizują. Dlatego roztwory L1 należy okresowo mieszać.
    7. Wysiewaj 50 zwierząt L1 na talerzu. Odwróć płytki i uszczelnij gumką. Umieść talerze w plastikowym pudełku na robaki. Zamknij pudełko w dużej torbie z zamkiem błyskawicznym. Przenieść do inkubatora o temperaturze 20 °C.
  3. Zapobieganie wytwarzaniu potomstwa przez dodanie 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR)
    1. Hodować zwierzęta do fazy L4 w temperaturze 20 °C. Sprawdzić, czy zsynchronizowane zwierzęta rozwinęły się do L4 około 40 godzin po wysiewie (krok 2.1.7).
      UWAGA: Czas rozwoju C. elegans będzie się różnił w różnych temperaturach12, a tempo wzrostu zmutowanych zwierząt, dla których tempo nie zostało scharakteryzowane, musi zostać empirycznie przetestowane.
      1. Dodaj 160 μl 50x FUdR do każdej 6 cm płytki ze zwierzętami L4.
        UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR na etapie L4. Dla wygody przygotuj 1,000 zapasów FUdR, rozpuszczając 1 g FUdR w 10 ml ultraczystegoH2O. Filtruj i sterylizuj materiał FUdR z filtrem 0,2 μm i strzykawką o pojemności 10 cm3. Porcjować ~1 ml bulionu do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Sprawdź płytki pod kątem obecności samców C. elegans. Usuń wszystkie męskie.
      UWAGA: Długość życia jest zwykle mierzona dla hermafrodytów, a nie dla samców. Hermafrodyty, które łączą się w pary, żyją krócej niż zwierzęta niekojarzone, nawet w obecności FUdR13. Samce są mniejsze i szczuplejsze niż hermafrodyty i można je łatwo rozpoznać po charakterystycznym haczykowatym ogonie14.
    3. Włóż pudełko z powrotem do torby z zamkiem błyskawicznym. Powrócić do inkubatora o temperaturze 20 °C.
  4. Opłacalność punktacji
    1. Codziennie oceniaj żywotność, delikatnie dotykając głowy zwierzęcia platynowym drutem lub rzęsą. Oceń zwierzęta, które się nie poruszają, jako martwe i usuń je z talerza (Rysunek 2A). Zapisz liczbę zaobserwowanych zmarłych dla każdego warunku dla każdego punktu czasowego obserwacji.
      UWAGA: Aby zmniejszyć ryzyko błędu systematycznego, eksperymentator musi pozostać ślepy na warunki eksperymentalne i podobnie nie może odwoływać się do wyników z poprzednich punktów czasowych podczas oceniania.
    2. Cenzuruj zwierzęta, które pękają, umierają z powodu innych oczywistych wad rozwojowych lub pełzają po boku naczynia: usuń te zwierzęta i zapisz ich liczbę w każdym obserwowanym punkcie czasowym w celu uwzględnienia w analizie statystycznej. Dodatkowo, jeśli zostaną znalezione samce, usuń je i zapisz zaobserwowaną liczbę.
    3. Powtarzać od kroku 1.4.1 codziennie, aż żadne zwierzę nie pozostanie przy życiu.
      UWAGA: Jeśli trawnik E. coli znacznie się zmniejszy lub na talerzu zacznie rosnąć grzyb, przenieś wszystkie pozostałe zwierzęta na świeży talerz z odpowiednimi RNAi i FUdR.
  5. Analiza danych - wykresy i statystyki
    1. Wprowadź lub otwórz zarejestrowane dane obserwacyjne w oprogramowaniu wspomagającym analizę przeżycia za pomocą nieparametrycznego estymatora Kaplana-Meiera15 i log-rank test16 (patrz plik uzupełniający 3). Pamiętaj, aby uwzględnić ocenzurowane zwierzęta. Nie należy uwzględniać samców, u których zaobserwowano, jeśli takie istnieją.
      UWAGA: Formaty danych mogą się różnić w zależności od oprogramowania, ale powszechnym formatem jest rejestrowanie każdego obserwowanego zwierzęcia na osobnej linii. Eksperymentalny punkt czasowy, w którym zwierzę zostało zaobserwowane jako martwe, jest czasem "zdarzenia". W przypadku cenzury, czas "wydarzenia" jest punktem czasowym, w którym zwierzę zostało ocenzurowane. Zazwyczaj znajduje się tam pole lub pole wyboru wskazujące ocenzurowane obserwacje.
    2. Wykreśl krzywe przeżycia Kaplana-Meiera. Należy wybrać mniej niż sześć warunków dla jednej powierzchni, jeśli w celu poprawy czytelności przeprowadzono wiele testów.
      1. Sprawdź, czy nie występują problemy z danymi, które są widoczne wizualnie — brakujące obserwacje, nieoczekiwane wyniki kontroli itp. — i zająć się nimi przed analizą statystyczną.
    3. Użyj funkcji testu log-rank w swoim oprogramowaniu, aby wykonać porównania statystyczne parami. Upewnij się, że wszystkie dostępne opcje postępowania z ocenzurowanymi wynikami są odpowiednio ustawione dla danych ocenzurowanych prawostronnie.

2. Metoda oceny długowieczności C. elegans

UWAGA: Podczas gdy tradycyjna metoda wymaga 3-6 tablic na warunek (patrz 1.1.2. powyżej), metoda Replica Set wymaga znacznie więcej (zobacz krok 2.2.2 poniżej). Tradycyjna metoda polega na tym, że zwierzęta znajdują się na tej samej płycie przez cały eksperyment (Rysunek 2A). W przeciwieństwie do tego, w przypadku zestawu replik zwierzęta są oceniane tylko raz: wiele identycznych powtórzeń jest ustawianych na początku eksperymentu, tak że jedna powtórzona jest oceniana w każdym punkcie czasowym (na próbę) (Rysunek 2B).

  1. Konfiguracja biblioteki.
    UWAGA: Dodatkowe szczegóły dotyczące postępowania z klonami RNAi są omówione tutaj, ponieważ protokół Replica Set jest podatny na jednoczesne ocenianie wielu klonów RNAi i może być skalowany do znacznie ponad 100 klonów jednocześnie. Kolekcje klonów RNAi są przechowywane jako zapasy glicerolu utrzymywane na płytce w formacie 96-dołkowym. W eksperymentach z zestawem replik wykorzystuje się płytki 24-dołkowe. Każda studzienka to inny warunek testowy, który może odpowiadać kolekcji klonów RNAi, różnym zabiegom chemicznym, szczepom zwierzęcym i tak dalej.
    1. Ułóż układ podbiblioteki dla kolekcji klonów RNAi w taki sposób, aby były spełnione następujące warunki:
      1. Upewnij się, że w 96-dołkowej kolekcji basenik A1 jest pustą kontrolą ujemną wektora.
      2. Wstaw losowo dodatkową pustą kontrolkę wektora w każdych 24 dołkach.
      3. Podziel 96-dołkową płytkę na bloki po 24 dołki, tak aby każda 24-dołkowa płytka miała w jednej losowo włożonej kontroli ujemnej (Rysunek 2C).
      4. Wstawić losowo kontrolę pozytywną do każdej grupy 24-dołków (Rysunek 2C).
        UWAGA: Kontrola pozytywna jest zależna od pytania doświadczalnego. Na przykład, patrząc na kolekcję klonów RNAi, które wydłużają żywotność, często uwzględnia się daf-2(RNAi). I odwrotnie, patrząc na skróconą żywotność, często stosuje się daf-16 (RNAi).
  2. Przygotowanie zestawów replik
    UWAGA: Liczba potrzebnych powtórzeń jest równa minimalnej liczbie punktów czasowych (Rysunek 2B). Trzeba wiedzieć a posteriori, jak długo mierzyć długość życia przed rozpoczęciem eksperymentu, a także częstotliwość punktacji (np. eksperyment z zestawem replik trwający 40 dni z punktacją co drugi dzień wymaga przygotowania co najmniej 20 zestawów replik dla każdego warunku na początku eksperymentu). Zaleca się wykonanie ~5 dodatkowych zestawów kopii zapasowych (patrz 2.2.2 i 2.2.2.3 poniżej).
    1. Aby stworzyć nowy stempel podbiblioteki RNAi, zaszczepij 200 μL LB+Amp na studzienkę w formacie 96-dołkowym (płytki 600 μL) za pomocą 96-pinowego replikatora płytkowego, wykonując następujące czynności:
      1. Wysterylizuj 96-pinowy replikator płytki, sekwencyjnie zanurzając szpilki w 50% wybielaczu, ultraczystym H2Oi etanolu. Trzymaj szpilki zanurzone przez co najmniej 30 sekund dla kroków wybielacza i etanolu. Po zanurzeniu w etanolu krótko podpal końcówki. Powtórzenie.
        UWAGA: Pamiętaj, aby spłukać cały wybielacz i nie pozostawiać szpilek wystawionych na działanie wybielacza przez dłuższy czas, ponieważ wybielacz może powodować korozję kołków ze stali nierdzewnej.
      2. Ostrożnie zdjąć samoprzylepną foliową osłonę z zamrożonej 96-dołkowej płytki biblioteki zapasów glicerolu i delikatnie, ale stanowczo zmielić końcówki wysterylizowanego replikatora płytek do dołków nadal zamrożonych zapasów glicerolu. Zaszczepić 200 μL kultur LB + Amp i uszczelnić zaszczepioną płytkę przepuszczalną membraną. Pozwól kulturom rosnąć przez noc na blacie.
      3. Wysterylizuj replikator płytki jak w kroku 2.1.1, ostrożnie usuń uszczelkę z płynnej płytki hodowlanej po nocnym wzroście i zanurz końcówki kołków replikatora. Przyłóż końcówki równomiernym naciskiem do prostokątnej płytki agarowej LB amp+tet i delikatnie przenieś bakterie z kołków na płytkę małymi okrężnymi ruchami, upewniając się, że między sąsiednimi miejscami pozostała odpowiednia przestrzeń. Pozostawić kolonie do wzrostu przez noc na płytce agarowej w temperaturze 37 °C. Patrz plik uzupełniający 3 w celu przygotowania płytek LB + Amp/Tet.
      4. Przed użyciem przechowywać płytkę agarową w temperaturze 4 °C odwróconą (pokrywką do dołu), zawinięta w folię parafinową.
        UWAGA: Przechowywanie kolonii pokrywą do góry pozwoli na kondensację w celu zanieczyszczenia krzyżowego klonów RNAi! Kolonie E. coli mogą być przechowywane przez 2–8 tygodni w temperaturze 4 °C, w zależności od poszczególnych klonów RNAi, ponieważ klony RNAi zachowują skuteczność w indukowaniu dsRNA po indukcji IPTG przez różny okres czasu. W przypadku małych zbiorów klonów RNAi, wydajność RNAi powinna być empirycznie określona za pomocą RT-qPCR w celu potwierdzenia knockdownu.
    2. Oblicz minimalną liczbę płytek 24-dołkowych niezbędnych do jednej próby eksperymentu: (# płytki na zestaw replik) x (oczekiwane # punkty czasowe). Upewnij się, że dołączono kilka dodatkowych zestawów replik do obsługi problemów, takich jak zanieczyszczenie (Rysunek 2B).
      UWAGA: Całkowita liczba klonów RNAi określa liczbę 24-dołkowych płytek do wykonania jednego zestawu replik dla każdego punktu czasowego (Rysunek 2C).
      1. Przygotuj płytki 24-dołkowe, zgodnie z krokiem 1.1.2 (plik uzupełniający 3 dla przepisu). Oznacz płytki podczas ich przygotowywania, aby eksperymentator oceniający test był ślepy na warunki eksperymentalne, używając kodu koloru lub podobnego schematu kodowania.
      2. Zaszczepić jeden zestaw 1,5 ml kultur LB + Amp na każde 10 replik (patrz 2.2.2). Zaszczepić kultury na 96 dołkach z płytkami głębokimi za pomocą replikatora płytki (jak w 2.1.3) i koloniach bakteryjnych z 2.1.4 (Rysunek 2C, po lewej). Uszczelnić oddychającą membraną, rosnąć 20 godzin ( 37 °C) z potrząsaniem.
      3. Wysiew 120 μl kultury przez noc na każdą płytkę za pomocą 6-dołkowej pipety wielokanałowej z regulowanymi odstępami między końcówkami (Rysunek 2C, po prawej). Suche płytki odkryte w okapie z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta. Nie suszyć nadmiernie. Przechowuj talerze przez noc w temperaturze pokojowej.
  3. Synchronizacja C. elegans za pomocą leczenia podchlorynem
    1. Oblicz minimalną liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentu: minimum # potrzebnych L1 = (15-20 zwierząt/studzienkę)(24 dołki/płytkę)(X płytek/zestaw replik)(Y zestawy replik).
      UWAGA: Metoda Replica Set wymaga większej liczby zwierząt niż metoda tradycyjna. Jedna 10-centymetrowa płyta pełna grawitacyjnych robaków może dostarczyć 20 000–50 000 zwierząt L1, w zależności od zagęszczenia grawitacyjnych osobników. Podobnie, dwadzieścia 6-centymetrowych talerzy daje około ~30 000 zwierząt L1. Zaplanuj przygotowanie preparatu z jajek, który podwoi minimalną liczbę potrzebnych zwierząt. Jeśli populacja w trakcie przygotowań głodowała, ponownie nakarmić lub pokroić na nową płytę i pozwolić co najmniej trzem generacjom na pokarm przed kontynuacją17,18. Pamiętaj, aby zamrozić resztki L1.
    2. Wykonaj kroki od 1.2 do 1.2.6, tak jak w tradycyjnej metodzie, aby uzyskać zsynchronizowane zwierzęta L1. Wysiewaj 15–20 zwierząt L1 do każdej studzienki za pomocą pipety z 6 dołkami o regulowanych odstępach i zbiornika na odczynniki, podobnie jak w 1.2.7. Okresowo mieszaj roztwór L1 zapobiegaj osiedlaniu się zwierząt.
  4. Zapobieganie wytwarzaniu potomstwa przez dodanie 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR)
    1. Wykonaj krok 1.3.1. Przygotuj sterylny 50x FUdR (patrz krok 1.3.1.1).
    2. Gdy zwierzęta osiągną L4, dodaj 25 μl 50x FUDR do każdego dołka na 24-dołkowej płytce za pomocą 6-kanałowej pipety o regulowanych odstępach.
  5. Rentowność punktacji
    1. Usuń jeden zestaw powtórzonych płytek i zalej studnie roztworem M9, zapisz całkowitą liczbę zwierząt w studzience, a następnie delikatnie dotknij głowy nieruchomych zwierząt za pomocą wykałacza do robaków (Rysunek 2B). Zwierzęta, które nie mogą się poruszać, są oceniane jako martwe. Wyrzuć nacięte płytki. Rejestruj żywotność dziennie.
      UWAGA: Zwierzęta, które pękają, wykazują poważne wady morfologiczne, nie rozwinęły się lub wpełzły na brzeg studni, mają być cenzurowane poprzez wykluczenie ich zarówno z wartości martwej, jak i całkowitej.
      1. Zapisz liczbę zwierząt, które są cenzurowane w każdej studzience w każdym punkcie czasowym oddzielnie od innych wartości.
      2. Nie oceniaj studni, w których nie ma pożywienia lub są skażone (np. grzybem lub szlamem); takie studnie są uważane za ocenzurowane. Ocenzuruj również studnię, jeśli wszystkie zwierzęta wykazują wady morfologiczne lub rozwojowe. Nagraj zdarzenie cenzurowania dla tego klonu/studni RNAi w tym punkcie czasowym.
      3. Po nacięciu zduplikowanej płytki wyrzuć ją. Kontynuuj zdobywanie nowego zestawu replik każdego dnia, aż wszystkie zwierzęta we wszystkich studniach zginą. Aby zmniejszyć ryzyko błędu systematycznego, eksperymentator musi pozostać ślepy na warunki eksperymentalne i podobnie nie może odwoływać się do wyników z poprzednich punktów czasowych podczas punktacji.
      4. Jeśli wszystkie zwierzęta w studni były martwe w danym punkcie czasowym, to po punktacji tego dnia sprawdź, czy wszystkie zwierzęta zostały ocenione jako martwe przez dwa kolejne punkty czasowe dla danej studni. Jeśli tak, to opłacalność punktowa nie jest już potrzebna do tego dobrze w kolejnych punktach czasowych.
      5. Przeprowadzenie dodatkowych niezależnych prób eksperymentalnych. Śledź wyniki kolejnych badań oddzielnie od wyników poprzednich badań, z odnotowanym numerem badania.

3. Dane wykresu

UWAGA: W metodzie Replica Set stosuje się dopasowanie krzywej, aby przybliżyć średnią i maksymalną długość życia. Parametry do oceny śmiertelności C. elegans pasują do krzywej logitowej19. Ponieważ większość narzędzi do przetrwania nie obsługuje dopasowywania krzywych logitowych, opracowano nowy program do wykreślania krzywych logit (dla Replica Set); Obsługiwane są również krzywe Kaplana-Meiera (dla metody tradycyjnej).

  1. Rozpocznij pracę z oprogramowaniem. Pobierz plik zip z informacją o wydaniu dla bieżącej wersji (patrz sekcja Materiały). Wyodrębnij plik zip do folderu. Zobacz plik "readme" w wyodrębnionym folderze, aby uzyskać dodatkowe instrukcje instalacji.
  1. Uruchom interfejs drukowania. Znajdź lokalizację katalogu "code" w folderze wyodrębnionym z pliku zip (np. "/Users/UserName /Desktop/WormLife/code").
    1. Wprowadź następujące polecenia w konsoli języka R, zastępując właśnie zidentyfikowaną ścieżkę folderu. Naciśnij enter lub return po każdym wprowadzonym wierszu: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Poczekaj, aż interfejs załaduje się w nowym oknie, wywołując domyślny ekran, jak pokazano w Rysunek 3A. Niech R działa w tle.
  2. Formatowanie danych jako plików z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV) lub wartościami rozdzielanymi tabulatorami (TSV). Określ kolumny i nazwy w zależności od typu analizy. Zobacz Plik uzupełniający 4 (zestaw replik) i plik uzupełniający 5 (tradycyjny/Kaplana-Meiera), aby uzyskać wstępnie sformatowane przykładowe dane.
    UWAGA: Dane muszą być podane w "długim" formacie, tj. jeden wiersz na szczep/leczenie na punkt czasowy na badanie. Pliki CSV są zalecane w celu zapewnienia najlepszej zgodności między platformami.
    1. Usuń wiersze odpowiadające obserwacjom, które zostały pominięte lub ocenzurowane. Sprawdź, czy nie ma brakujących wartości lub wartości nieliczbowych, ponieważ może to spowodować błąd podczas importowania danych.
    2. W przypadku tradycyjnej analizy w stylu Kaplana-Meiera nie należy gromadzić danych z niezależnych badań – należy je wykreślić osobno. W przypadku analizy zestawu replik połącz dane z wielu prób, a następnie zbadaj je przy użyciu funkcji "TrialView" (patrz 6.3.3.4).
  3. Korzystanie z interfejsu drukowania
    1. Załaduj plik danych ("importuj" w menu "Plik") za pomocą okna dialogowego. Aby otworzyć pliki ".csv", zmień typ pliku z listy rozwijanej na ".csv" (domyślnie ".txt/.tsv"), przejdź do folderu z plikiem danych. W tym przypadku plik jest przykładowymi danymi zestawu replik (plik uzupełniający 4).
      UWAGA: Zaimportowanie pliku, gdy zestaw danych jest już otwarty, zastąpi bieżący zestaw danych.
    2. Wybierz plik do zaimportowania, aby uruchomić kreatora importu, który przeprowadzi Cię przez proces identyfikacji kolumn wybranego pliku (Rysunek S1A dla zestawu replik). Jeśli dane wejściowe odpowiadają eksperymentowi z zestawem replik, wybierz "Logit" jako typ badania.
      UWAGA: Przepływ pracy importu różni się między zestawem replik (Rysunek S1A) a tradycyjnym (Kaplan-Meier) (Rysunek S1B).
    3. "Wykreśl dane". Wybierz "Dodaj linię", aby rozpocząć wykreślanie danych. (Linia odpowiada jednemu zestawowi warunków. Istnieją funkcje pomagające w eksperymentach, w których przetestowano wiele warunków).
      1. Wykreślić warunki kontrolne - w przypadku przykładu dane N2 (WT) z L4440 (pusty wektor) RNAi są odpowiednie. Wybierz "Dodaj linię" w menu "Wykresy", aby uruchomić kreatora dodawania linii: wybierz warunek do wykreślenia i parametry graficzne do przedstawienia linii.
        1. Aby ręcznie dodać krzywą dla innego warunku, powtórz kroki opisane w sekcji 3.3.3.1
        2. Aby zmienić kolor lub symbol wykresu dla linii, wybierz "Modyfikuj linię" w menu "Wykres
          3. ".
        3. Aby usunąć linię bez czyszczenia wszystkich linii, wybierz "Usuń linię" w menu "Wykres
          4. ".
        4. Aby wyczyścić wszystkie linie na bieżącym wykresie, wybierz "Wyczyść linię" w menu "Wykres
          5. ".
        5. Aby zastąpić automatycznie wybraną maksymalną wartość osi x (czasu), użyj opcji "Ustaw skalę X" w menu "Wykres".
          UWAGA: Oś y (ułamek, który przetrwał) zawsze wyświetla wartości od 100% (góra) do 0% (dół) w krokach co 20%. Oś x jest zawsze wyświetlana w krokach co 5. Etykiety osi nie są drukowane, aby zapewnić elastyczność etykietowania po zapisaniu obrazów wydruku.
      2. Aby zapisać obrazy aktualnie wyświetlanego wykresu w formacie JPEG, należy skorzystać z opcji "Zapisz wykres" w menu "Plik"; zapisywany jest tylko bieżący wykres.
      3. W celu stworzenia indywidualnych wykresów dla wielu różnych warunków w jednym eksperymencie, oprogramowanie umożliwia zdefiniowanie i wykreślenie "serii".
        UWAGA: Implementacja koncepcji serii poprawia wydajność podczas pracy z dużymi eksperymentami.
        1. Jeśli zaczynasz od pustego obszaru roboczego wykresu, dodaj linie odpowiadające warunkom kontrolnym, które mają być spójne na wszystkich powierzchniach w serii (patrz 3.3.3.1).
        2. Zdefiniuj serię za pomocą opcji "Zdefiniuj serię" w menu Wykresy. Wybierz warunek odpowiadający linii, który ma być wyświetlany jako pierwszy w serii; Można wybrać tylko jeden. Należy wybrać parametry graficzne (kolor linii i symbol wydruku) dla linii, jak w 3.3.3.1.
        3. Przejrzyj wykresy dla różnych warunków testowych. Przełączaj wyświetlanie "linii szeregowej" między warunkami za pomocą przycisków strzałek w lewo/w prawo znajdujących się po bokach głównego okna wykresu, a także na górnym pasku menu (Rysunek 3A-C).
          UWAGA: Jeśli wybrana linia serii jest w tym samym stanie, co jedna z poprzednio dodanych linii kontrolnych/odniesienia, nowa linia może wydawać się nałożona.
        4. Zdefiniuj serię, aby udostępnić pewne inne funkcje (Zapisz wykresy serii i Trialview - zobacz 3.3.3.4 dla tego ostatniego). Po zdefiniowaniu serii użyj opcji "Zapisz wykresy serii" z menu "Plik", aby zapisać poszczególne pliki obrazów działki dla każdej działki w serii w nowym folderze.
      4. Trialview — wizualizacja wyników niezależnych prób eksperymentu z zestawem replik. Jeśli przeprowadzono wiele badań dla jednej lub więcej grup próby, należy wykreślić dane z poszczególnych badań i zbiorcze dane ze wszystkich badań oddzielnie, aby ocenić spójność między niezależnymi badaniami (patrz Rysunek 3D).
        1. Ustaw serię zgodnie z opisem w 3.3.3.3. Różne próby zostaną wykreślone dla każdej z "różnych" grup próbek na innym obrazie w porównaniu z odpowiednimi próbami dla określonych próbek referencyjnych/kontrolnych.
        2. Aby zapisać obrazy TrialView, przejdź do opcji "Drukuj TrialViews" w menu Data; obraz JPEG zostanie wygenerowany dla każdego wykresu w serii.
          UWAGA: Przykładowe wyniki to Rysunek 3D przedstawia przypadek z dwoma próbami.
    4. Tabela podsumowania mediany żywotności dla danych zestawu replik. Sprawdź wizualnie krzywe, aby upewnić się, że dane są odpowiednio dopasowane, a następnie wybierz opcję "Tabela podsumowania" w menu Dane, aby zapisać tabelę wartości mediany długości życia (czas przy 50% przeżyciu na krzywej logitowej) dla każdego typu próbki.
  4. Analiza statystyczna danych wygenerowanych za pomocą metody Replica Set
    1. Aby przeprowadzić analizę statystyczną między dwiema grupami z eksperymentu Replica Set, zmodyfikuj i uruchom skrypt języka R dostarczony w pliku zip wydania (zobacz "Skrypt szablonu analizy statystycznej WormLife. R").
      UWAGA: Biegła znajomość języka R nie jest wymagana do uruchomienia skryptu. Dodatkowa dokumentacja znajduje się w komentarzach w pliku. Skrypt jest gotowy do analizy przykładowych danych zestawu replik. Można również analizować dane wygenerowane przez użytkownika w odpowiednim formacie (patrz plik uzupełniający 4).
      1. Otwórz plik skryptu w R (R GUI lub RStudio).
        UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie skryptu bez jego uruchamiania.
      2. Zmodyfikuj lokalizacje niezbędnych plików, aby pasowały do lokalizacji na komputerze.
        UWAGA: Te ścieżki plików muszą być "w pełni kwalifikowane" (tj. powinny zawierać pełną lokalizację pliku, w tym foldery).
        1. Zmodyfikuj ścieżki (lokalizacje plików/folderów) dla "wlDir" (lokalizacja katalogu), "dataFile" (plik danych zestawu replik do analizy), "compFile" (specyfikacja porównań do uruchomienia, jeśli ma to zastosowanie) i "outputPath" (lokalizacja, w której zostaną zapisane pliki wynikowe).
      3. Ustaw nazwy kolumn w sekcji "Określ kolumny w pliku danych", jeśli nazwy kolumn w pliku, który ma być analizowany, różnią się od nazwy pliku przykładowego. Określ kolumnę dla każdego parametru. Jeśli badanie obejmuje wiele szczepów, ale nie ma RNAi (lub innego leczenia), należy uwzględnić kolumnę w pliku danych z pustymi wpisami lub taką samą dla wszystkich wierszy (np. "no_treatment" itp.).
      4. Ustaw parametr "compFile". Jeśli parametr "compFile" jest ustawiony na NA, zostaną uruchomione wszystkie możliwe porównania parami grup.
        UWAGA: Grupa jest definiowana przez kombinację szczepu/genotypu i traktowania, które są łączone i wyświetlane jako "strain_treatment". W przypadku większych badań z wieloma grupami można dostarczyć plik CSV określający porównania. Zobacz przykładowy plik "comps_rsm_example.csv".
      5. Ustawia liczbę iteracji dla ponownego próbkowania Monte Carlo ("k.resamp", wartość domyślna to 1 000).
        UWAGA: Wartości P równe 0 mogą zostać zwrócone, gdy zostanie wykonanych zbyt mało iteracji; W takich przypadkach należy zgłosić "p <0,01" (jeśli K.resamp = 100) lub "p <0,001" (jeśli K.resamp = 1 000) itd.
      6. Uruchom skrypt: przycisk "source" w RStudio (w prawym górnym rogu okna edycji) lub "dokument źródłowy" w menu "edytuj" w graficznym interfejsie użytkownika języka R. (Wykonanie może zająć trochę czasu).
      7. Gdy wskaźnik "zajęty" R nie jest już wyświetlany, otwórz katalog wyjściowy - pojawi się tabela z wynikami każdego porównania (mediana przeżycia, wartości p, zmiana mediany długości życia).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy opracowywaniu każdej nowej metodologii konieczne jest, aby nowa metoda odzwierciedlała przyjęte wyniki poprzednich podejść i spełniała standardy w danej dziedzinie. Wcześniej wykazaliśmy empirycznie, że zestaw replik i tradycyjne metody oznaczania długości życia C. elegans dają podobne wyniki20. C. elegans typu dzikiego (N2) utrzymywany w temperaturze 20 °C zazwyczaj żyje od 20 do 25 dni, co zaobserwowaliśmy zarówno przy użyciu tradycyjnego (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno metoda tradycyjna, jak i metoda replik wymagają synchronizacji zwierząt w wieku chronologicznym. Uwzględniamy metodę, która synchronizuje zwierzęta za pomocą leczenia podchlorynem grawitacyjnych osobników dorosłych, gdzie tylko zapłodnione jaja z grawicznym dorosłym osobnikiem przeżywają leczenie. Zarodki te wylęgają się w płynnej zawiesinie i zatrzymują rozwój w pierwszym stadium larwalnym (L1). Po wysianiu zwierząt L1 do pożywienia (np. E. coli wykazującej ekspresję dsRNA do genu będącego prze...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tej pracy opisanej w tym manuskrypcie zostało zapewnione przez: Biuro Rektora Uniwersytetu w Rochester oraz Dziekanat Szkoły Medycyny i Stomatologii za pośrednictwem Centrum Nauk o Zdrowiu dla Innowacji Obliczeniowych (HSCCI); Stypendium Ellison Medical Foundation New Scholars in Aging (AG-NS-0681-10) Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzenie i analiza danych, decyzja o publikacji lub przygotowanie manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IPTG (beta-digalaktopiranozyd izopropylowy-D-1-tigalaktopiranozyd)Gold Bio12481C100
FuDR (5-fluoro-2'-deoksyurydyna)Alfa AesarL16497
24-dołkowe płytki hodowlaneGreiner Bio-One#662102
Trójkątna, nieobrobiona płytka jednodołkowa, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 µ L Płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One#786261
2mL Płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One#780286
Uszczelka płytkowa przepuszczająca powietrzeVWR60941-086
96-pinowy replikator płytekNunc250520
baktopeptonVWR90000-368
agar bakteriologicznyAffymetrix/USB10906
Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)Zobacz także Kamath i in., Nature 2003.
Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Zobacz także Rual i in., Badania nad genomem 2004. Ta biblioteka jest również dostępna w Dharmacon.
WormLife- Oprogramowanie do analizy przeżycia zestawu replikSamuelson LabN/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Pusty plazmid wektorowyAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OAZAhttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Grafpad Pryzmathttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854(1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278(2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964(2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Replica Set MethodC elegans LifespanHigh throughput ScreeningFeeding based RNAiSurvival Curve AnalysisMulti well Plate AssayFUdR TreatmentL1 Animal SeedingPlate ReplicatorData Analysis Software

Related Articles