Artykuł metodologiczny

Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57825

⸱

8 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Sciences, University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Pąkla Balanus (Amphibalanus) improvisus jest modelem do badania osmoregulacji i przeciwporostowości. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych. W tym miejscu opisano protokół całorocznej hodowli B. improvisus, w tym produkcji larw. Zilustrowano zastosowanie hodowlanych pąkli w badaniach ekspresji genów.

Streszczenie

Pąkle to skorupiaki morskie z osiadłymi dorosłymi i swobodnie pływającymi larwami planktonicznymi. Pąkla Balanus (Amphibalanus) improvisus jest szczególnie istotna jako model do badań nad mechanizmami osmoregulacyjnymi ze względu na jej ekstremalną tolerancję na niskie zasolenie. Jest również szeroko stosowany jako model biologii osadniczej, w szczególności w odniesieniu do badań nad przeciwporostowością. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych do badań. Opracowano protokół całorocznej hodowli B. improvisus i przedstawiono szczegółowy opis wszystkich etapów linii produkcyjnej (tj. zakładanie dorosłych kultur na panelach, zbieranie i hodowla larw pąkli oraz podawanie paszy dla dorosłych i larw). Opis zawiera również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i omawia krytyczne parametry (np. usuwanie zanieczyszczeń, produkcja paszy wysokiej jakości, potrzebna siła robocza i znaczenie wysokiej jakości wody morskiej). Każda partia z systemu hodowli daje maksymalnie około 12 000 naupliów i może dostarczyć cztery partie w ciągu tygodnia, dzięki czemu można wyprodukować do prawie 50 000 larw tygodniowo. Metoda stosowana do hodowli B. improvisus jest prawdopodobnie w dużym stopniu stosowana również do innych bezkręgowców morskich z wolno pływającymi larwami. Przedstawiono protokoły preparacji różnych tkanek od osób dorosłych, a także produkcji wysokiej jakości RNA do badań nad ekspresją genów. Opisano również, w jaki sposób hodowane dorosłe osobniki i hodowane karpiowate mogą być wykorzystywane w szerokim wachlarzu projektów eksperymentalnych do badania ekspresji genów w odniesieniu do czynników zewnętrznych. Wykorzystanie hodowlanych pąkli w ekspresji genów zilustrowano badaniami nad możliwymi rolami osmoregulacyjnymi ATPazy Na+/K+ i akwaporyn.

Wprowadzenie

Pąkle to skorupiaki morskie z osiadłymi dorosłymi i swobodnie pływającymi larwami planktonicznymi. Większość z 1200 gatunków pąkli zamieszkuje płytkie wody, a wiele z nich jest często narażonych na niskie zasolenie. Jeden gatunek, pąkla zatokowa Balanus (Amphibalanus) improwizuje (B. improvisus), może tolerować prawie słodką wodę, a Karol Darwin opisał ten gatunek z małego strumienia w ujściu Rio de la Plata w Urugwaju1. Ekstremalna tolerancja na niskie zasolenie sprawia, że B. improvisus jest szczególnie istotnym modelem do badań nad mechanizmami osmoregulacyjnymi2,3. Pąkla ta preferuje słonawe warunki, ale jest zdolna do życia w wodach o zasoleniu od około 1,6 psu do nawet 40 psu4. Jest to jedyny gatunek pąkli występujący w słonawym Morzu Bałtyckim. Uważa się, że B. improvisus pochodzi ze wschodniego wybrzeża kontynentu amerykańskiego, ale dziś można go znaleźć na całym świecie z powodu rozprzestrzeniania się przez shipping5. Jest to główny organizm zarastający i jest powszechnie spotykany na skałach, pomostach i kadłubach łodzi, a zatem ma ogólne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów biofoulingu na konstrukcjach w wodach morskich i słonawych6,7.

Podobnie jak większość innych pąkli, B. improvisus jest hermafrodytyczny z zapłodnieniem krzyżowym; rozmnażanie odbywa się poprzez kojarzenie się między sąsiednimi osobnikami za pomocą wydłużonego penisa i wewnętrznego zapłodnienia. Okres rozrodczy trwa głównie od maja do września. B. improvisus ma siedem pelagicznych stadiów larwalnych (sześć nauplii, po których następuje jedno stadium karpidowe8). Z zapłodnionego jaja wykluwa się larwa naupliusa, która swobodnie pływa i żeruje w słupie wody przez okres do kilku tygodni, zanim stanie się w nieżerującą larwę karpiowatego. Cypryd używa wielu wskazówek, aby znaleźć odpowiednie miejsce do osiedlenia się, a następnie przechodzi metamorfozę w siedzącego młodocianego pąkla9. Gatunek ten może być hodowany w laboratorium i żyje 1-2 lata w morzu (2-3 lata w hodowli laboratoryjnej). Średnio B. improvisus dorasta do 10 mm średnicy (maksymalnie około 20 mm) i osiąga maksymalną wysokość około 6 mm (chociaż może rosnąć wyżej w zatłoczonych warunkach). Gatunek można rozpoznać po gładkiej, wapiennej, równej skorupie (białej lub szarawej), promieniście wzorzystej wapiennej podstawie płytki muszli oraz kształcie płytek tergalowych1,10.

Pąkla B. improvisus ma kilka korzystnych cech jako model do badań nad osmoregulacją, z naciskiem na mechanizmy molekularne i fizjologiczne, a także interakcje ekologiczne i konsekwencje ewolucyjne. Jest również szeroko stosowany jako model do badań nad biologią osadniczą, w szczególności w odniesieniu do badań nad przeciwporostowością i związanymi z nimi mechanizmami7,11,12,13. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych do badań. Zdolność do hodowli tej pąkli przez cały cykl życia przez cały rok jest zatem głównym atutem umożliwiającym różnego rodzaju badania molekularne i mechanistyczne. Ponadto jego obecność w wodach morskich/słonawych na całym świecie pozwala na połączenie badań terenowych i eksperymentalnych. Kontrolowana hodowla może również wytworzyć rodziny o znanych rodowodami do długoterminowej hodowli14, a czas pokolenia wynoszący kilka miesięcy może pozwolić na długoterminową ewolucję eksperymentalną. Dostępny jest również szkic genomu i kilka transkryptomów, a zasoby te zostały wykorzystane do klonowania kilku genów (np. genów mających znaczenie w osmoregulacji)2,3.

Celem tego protokołu jest opisanie jak założyć i utrzymać hodowlę pąkli B. improvisus przez cały rok, aby przeprowadzić badania ekspresji genów na dorosłych lub larwach tego organizmu. Rittschof i wsp.15 krótko opisywał metodę hodowli pąkli od momentu wypuszczenia nauplii do osiedlenia się karpiowatych dla gatunku Balanus amphitrite. Protokół został dostosowany do całorocznej hodowli B. improvisus w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö (Szwecja) i przedstawiono szczegółowy opis wszystkich etapów linii produkcyjnej, w tym produkcji i hodowli larw pąkli, a także podawania paszy dla dorosłych i larw. Aby zapoznać się z pełną procedurą, zobacz Rysunek 1. Zastosowanie systemu hodowli jest zilustrowane kilkoma typowymi układami eksperymentalnymi i zilustrowane w funkcjonalnych badaniach genomicznych ATPazy Na+/K+ i akwaporyn, wyjaśniając ich możliwe funkcje w osmoregulacji2,3. Czasami konieczne jest zbadanie ekspresji genów w określonych tkankach, a niektóre z podstaw sekcji pąkli zostaną omówione. Dzięki dobremu zaopatrzeniu w wysokiej jakości wodę morską hodowla pąkli B. improvisus i potencjalnie wielu innych gatunków powinna być możliwa w laboratoriach morskich na całym świecie.

Protokół

1. Zbieranie dorosłych pąkli na polu w celu rozpoczęcia nowego stada lęgowego

  1. Na głębokości ≈ 1–3 m w spokojnych wodach należy rozmieścić przezroczyste panele termoplastyczne (polimetakrylan metylu) (110 x 110 x 1,5 mm3) w celu zebrania dorosłych pąkli z pola. Użyj ramek, które mogą pomieścić kilka paneli (Rysunek 2A), wywierć 2 otwory (o średnicy 6 mm) w górnych rogach każdego panelu i przymocuj panele do stojaka za pomocą opasek kablowych. W ten sposób panele będą zwisać pionowo w wodzie.
    1. Po osiadaniu pąkli (oznaczonych jako małe białe, twarde kropki na panelach), pozostaw panele na co najmniej 2-3 tygodnie, aby upewnić się, że pąkle są wystarczająco duże (5 mm), aby można je było przenieść do laboratorium bez wysuszenia lub uszkodzenia.
  2. Przynieś panele do laboratorium, gdy są pokryte osiadłym B. improvisus, który osiągnął rozmiar średnicy ok. 5 mm.
    UWAGA: Czas rozwoju dorosłych osobników do 5 mm na polu zależy w dużym stopniu od dostępności pożywienia i temperatury. Zwykle trwa to około 3 tygodni w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö (58.87 °N, 11.14 °E). Najczęściej panele dla nowego stada lęgowego są zwykle rozmieszczane pod koniec czerwca i zbierane pod koniec sierpnia.
  3. Przed wprowadzeniem paneli do hodowli należy oczyścić je z innych organizmów. Najważniejsze jest usunięcie innych gatunków pąkli. Należy pamiętać, że ważne jest, aby często czyścić panele, aby pozbyć się gatunków zanieczyszczających podczas uprawy, ponieważ znacznie zwiększy to szanse na przeżycie stada lęgowego.
  4. Umieść panele pionowo na krawędzi w stojaku z wyfrezowanymi rowkami w tacce polietylenowej (400 x 400 x 20 mm3) (rysunki 2C i 2E). Rowki w stojaku są oddalone od siebie o 15 mm.
  5. Aby przygotować tace, wykonaj otwór wejściowy u podstawy i otwór wyjściowy u góry po przeciwnej stronie każdej tacy. Podłączyć otwór wejściowy każdej tacy do zbiornika o pojemności 100 litrów zawierającego około 30 litrów wody z wlotem otwartej wody morskiej o temperaturze 20 °C, aby umożliwić przepływ z szybkością ok. 2 l na min.
    UWAGA: Do jednego zbiornika o pojemności 100 l podłączono do 8 tac.
  6. Podłączyć zbiornik o pojemności 100 l do wody morskiej o kontrolowanej temperaturze (20 °C) (np. dostarczanej przez pompę ciepła wymieniającą ciepło z dopływającej wody morskiej).
    UWAGA: Pąkla B. improvisus może rosnąć i rozmnażać się przy pełnym zasoleniu morskim (30–35 psu); Jednak zmniejszenie zasolenia do ok. 25 PSU poprzez dodanie słodkiej wody do zbiornika o pojemności 100 litrów zwiększa produkcję larw z hodowli.

2. Rozpoczynanie nowych pokoleń dorosłych z kulturowych Cyprydów

  1. Zbuduj kostki z paneli termoplastycznych otwartych u góry, sklejając ze sobą 5 paneli za pomocą nietoksycznej, wodoodpornej taśmy.
  2. Umieść kostkę na małej tacy (w przypadku wycieku) i napełnij ją wodą morską (25 psu). Utrzymuj wodę w temperaturze pokojowej (ok. 20 °C). Dodaj około 200 cyprydów na górze kostki.
  3. Karm młode osobniki 100 ml Skeletonema marinoi co drugi dzień (patrz krok 5) w kostce.
    UWAGA: Młode pąkle mogą mieć trudności ze spożyciem Artemia salina (patrz krok 3), ponieważ są duże, a zatem trudne do połknięcia dla nowo zasiedlonej pąkli.
  4. Zmieniaj wodę 1x w tygodniu.
  5. Po 2 tygodniach, gdy na panelach znajduje się wystarczająca liczba ustabilizowanych młodych osobników o średnicy co najmniej 5 mm, należy rozebrać kostkę i przenieść panele z młodymi osobnikami do tac z przepływającą wodą morską, a następnie nakarmić pąkle naupliami A. salina.

3. Kultura Artemia salina Nauplii jako pokarm dla dorosłych pąkli

  1. Skonfiguruj system hodowli A. salina za pomocą plastikowej butelki o pojemności 1,5 l, w której odcina się dno, a butelkę umieszcza się do góry nogami w stojaku i oświetla z boku. Zamontuj szyjkę butelki do silikonowej rurki za pomocą zacisku i przymocuj ją do pompy napowietrzającej (Rysunek 2D).
  2. Aby wykluć się z jaj, dodaj około 15 ml suchych, spoczynkowych jaj artemii do 1 l wody morskiej.
    UWAGA: Z jaj artemii wylęgają się larwy naupliusa po 24–48 godzinach. Aby opóźnić wylęg nauplii A. salina (np. w weekendy), światło można wyłączyć, aby nieznacznie obniżyć temperaturę.
  3. Aby zebrać nauplii z artemii, wyłącz napowietrzanie i przyciemnij górną część butelki folią aluminiową (lub podobną np. puszką). Oświetlaj dolną część butelki przez 10 minut. Wyklute naupliusy artemii będą płynąć w kierunku światła. Nie wyklute cysty opadną na dno, a muszle cyst będą unosić się na powierzchni.
  4. Otwórz zacisk na dole. Zbierz frakcję pośrednią jako gęstą populację pływających nauplii.
    UWAGA: Codziennie (z wyjątkiem weekendów) 1 l gęstej zawiesiny nauplii Artemia był ręcznie dodawany do 100-litrowego zbiornika łączącego się z tacami z dorosłymi pąklami. Unikaj karmienia pustymi skorupkami cyst, ponieważ nie zapewniają one składników odżywczych i głównie powodują konieczność częstszego czyszczenia kultury.

4. Zbieranie i hodowla larw pąkli

  1. Wyczyść panele z dorosłymi pąklami, delikatnie spryskując je słodką wodą i, jeśli to konieczne, usuń wszelkie zanieczyszczenia z muszli pąkli i paneli za pomocą miękkiej szczoteczki do zębów. Wyczyść również tace (bez pąkli) i rurki w gorącej (75 °C) słodkiej wodzie.
  2. Sito wykonane z siatki planktonowej o grubości 90 μm przyklejonej do końca przeciętej rury PVC (o średnicy 16 cm, wysokości 15 cm) umieścić w tacy polietylenowej (30 x 20 x 10 cm3) z portem przelewowym. Zbierz larwy B. improvisus na sicie przez noc (Rysunek 2C).
    UWAGA: Sito umieszczono tuż pod portem wyjściowym tacy paneli pąkli, aby odebrać wypływającą wodę i odfiltrować nauplii. Larwy pozostały na sicie, podczas gdy woda morska przelewała się przez małą tacę. Ta mała taca zapewniała, że sito nigdy nie wyschło.
  3. Umieść wiadro o pojemności 30 litrów w dużej łaźni wodnej, w której temperatura jest utrzymywana na poziomie 26 °C za pomocą grzałek akwariowych (Rysunek 2E). Napowietrzanie i mieszanie są zapewnione przez bąbelkowanie powietrza przez system.
  4. Napełnij wiadro 20 litrami przefiltrowanej wody morskiej (0,2 μm; 25 psu). Dodaj 1 l do wiadra z mieszanką 60/40 2 mikroalg okrzemkowych, S. marinoi i C. gracilis (patrz krok 5). Da to początkową gęstość około 5 x 104 okrzemek na ml w wiadrze.
    UWAGA: Larwy pąkli są pozytywnie fototaktyczne. Wiaderka zostały wykonane z nieprzezroczystego białego plastiku z pokrywkami, które przepuszczały trochę światła. Zimą pomieszczenie było oświetlone w ciągu dnia (8.00–17.00), ale ciemne w nocy. Latem światło z zewnątrz wpadało do pomieszczenia przez większą część dnia.
  5. Przenieś zebrane nauplii B. improvisus do naczynia krystalizującego (300 ml; 90 mm średnicy; 50 mm wysokości).
  6. Oświetl naczynie z boku, co przyciągnie larwy do źródła światła. Zbierz nauplia pąkli, które zbierają się przy wpadającym świetle, za pomocą pipety i przenieś je do innego naczynia krystalizującego. Usuń wszelkie pozostałe larwy artemii.
  7. Przenieś larwy nauplii B. improvisus do zlewki z 1 litrem przefiltrowanej wody morskiej.
  8. Policz liczbę nauplii, delikatnie mieszając zlewkę, aby uzyskać równomierną zawiesinę larw, a następnie pobierając pięć próbek o pojemności 1 ml z różnych miejsc w zlewce. Przenieś każdą próbkę do mikropłytki w celu oględzin za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Policz liczbę naupliusów w każdej z pięciu próbek i zsumuj je.
  9. Pomnóż policzoną liczbę przez 200 (1,000 ml/5 ml), aby oszacować, ile tysięcy larw znajduje się w całej zlewce. Jeśli w zlewce znajduje się zbyt wiele larw naupliusa, należy rozcieńczyć próbkę, aż gęstość wyniesie co najwyżej 14 000 larw/l (zwykle w zakresie 11 000–12 000 larw/l).
  10. Dodaj 1 l nauplii B. improvisus do jednego wiadra, dodając w ten sposób około 11 000–12 000 larw na wiadro.
    UWAGA: Upewnij się, że nie dodajesz więcej nauplii, ponieważ spowoduje to zbyt małą ilość pokarmu w stosunku do larw, a co za tym idzie, zwiększy śmiertelność.
  11. Po 3 dniach zbierz nauplia pąkli na sicie 90 μm. Następnie wyczyść wiadro (słodką wodą o temperaturze 75 °C), napełnij je przefiltrowaną wodą morską, dodaj nową karmę dla okrzemek (taką samą ilość jak na początku), a na koniec ponownie dodaj nauplii. Cyprydzi zaczynają pojawiać się po około 6 dniach (± 1 dniu).
  12. Najpierw zebrać cyprydy za pomocą sita o grubości 90 μm (zaprojektowanego jak w ppkt 4.2 powyżej). Następnie oddzielić nieliniejące nauplia pąkli i karpiowate za pomocą sita 320 μm na sitku 160 μm. Nauplii B. improvisus zbierają się na sicie 320 μm, a cyprydy na sicie 160 μm.
    UWAGA: Larwy karpiowatych mogą być przechowywane w temperaturze 10 °C w naczyniu krystalizującym w ciemności do późniejszego wykorzystania, do ok. 6 dni. Jednak przechowywanie może mieć wpływ na jakość i wydajność larw pąkli, więc eksperymenty porównujące różne zabiegi powinny w idealnym przypadku wykorzystywać larwy z tej samej partii (i podobny czas przechowywania), aby uniknąć mylących efektów16.

5. Hodowla mikroalg jako pokarmu dla larw pąkli Nauplius

UWAGA: Glony były uprawiane w 3 różnych typach kultur: (i) kulturach podstawowych, które służą do długoterminowego utrzymania szczepów, które były używane do zaszczepiania w górę; (ii) rozpoczęcie hodowli, które są pierwszym krokiem w zwiększaniu skali działalności; i wreszcie (iii) kultura produkcyjna, która jest końcową skalą produkcji dużych ilości glonów jako paszy dla pąkli.

  1. Zamów gatunki okrzemek z Kolekcji Kultur Glonów i Pierwotniaków (CCAP) do wykorzystania jako pokarm dla larw pąkli nauplius. Dwa gatunki Skeletonema marinoi (szczep CCAP 1077/5) i Chaetoceros simplex var. gracilis (szczep CCAP 1085/3) dają dobre wyniki jako pasza.
  2. Przefiltrować całą wodę morską przeznaczoną do użycia w kulturach glonów, używając systemu filtrów z wkładem o nominalnej wielkości porów 0,2 μm. (Przefiltrowana woda morska ma być również używana do wylęgu jaj A. salina i hodowli larw pąkli nauplius). Przefiltrowaną wodę morską należy sterylizować w autoklawie w celu uzyskania kultur glonów (w temperaturze 105 °C przez 5 minut).
  3. Przygotuj podłoże do hodowli mikroalg, używając autoklawowanej wody morskiej wzbogaconej roztworem f/2 Guillarda, zawierającym nieorganiczne składniki odżywcze, metale śladowe i witaminy (zobacz Guillard 197517 dla szczegółowej receptury). Ponadto należy przygotować roztwór krzemianu (Na2SiO3), ale należy go przechowywać oddzielnie od wzbogacenia f/2, aby zapobiec wytrącaniu się ciał stałych.
    UWAGA: Stężenia roztworu podstawowego do wzbogacania i roztworu podstawowego krzemianu przygotowano do użycia jako 1 ml dodatku każdego z nich do 1 litra wody morskiej.
  4. Wszystkie urządzenia używane w hodowli glonów należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Autoklawować zakręcane probówki z 1 ml wzbogacenia f/2 i 1 ml roztworu krzemianu. Dodaj roztwory wzbogacające i krzemianowe do tej wody, gdy autoklawowane szkło i płyny ostygną do temperatury pokojowej.
  5. Hoduj podstawowe kultury mikroalg w 40 ml probówkach z zakrętkami.
    1. Napełnij probówki około 30 ml wzbogaconej wody morskiej. Zaszczepić kultury sterylną pipetą Pasteura, używając około 1 ml 2-tygodniowej kultury podstawowej. Zakrętka jest następnie zakładana, ale nie dokręcana, aby umożliwić pewną wymianę gazu. Jeśli to możliwe, inokulację należy przeprowadzić w komorze z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
      UWAGA: Celem kultur podstawowych jest utrzymanie kultur glonów w perspektywie długoterminowej i służenie jako inokulum dla kultur wyjściowych. Kultury podstawowe były ponownie inokulowane co 2 tygodnie.
    2. Nową kulturę podstawową należy wystawić na działanie światła białego o intensywności ok. 25–50 μmol m-2 s-1 (przy cyklu światło-ciemność 16:8 h). Przenieś stare kultury magazynowe do niskiego natężenia światła jako kopię zapasową. Wyrzuć wszystkie 2-tygodniowe kultury podstawowe.
  6. W celu zwiększenia skali do kultury produkcyjnej glonów, należy zaszczepić kultury wyjściowe z kultury podstawowej i wyhodować je w 500 ml kolbach Erlenmeyerflask.
    1. Autoklaw 4 kolby Erlenmeyera, pipety i bawełniane korki z 300 ml przefiltrowanej (0,2 μm) wody morskiej oraz 4 probówki ze wzbogaceniem f/2 o pojemności 0,3 ml i 4 z roztworami krzemianów. Schłodzić wzbogacenie f/2 i krzemian do temperatury pokojowej, a następnie dodać roztwory do kolb Erlenmeyera. Zaszczep je ok. 1 ml 2-tygodniowej kultury podstawowej.
      UWAGA: Przygotować 2 kolby z S. marinoi i 2 z C. simplex.
    2. Umieścić kolby na stole do wytrząsania w świetle o natężeniu 50 μmol m-2 s-1. Kiedy kultury wyjściowe osiągną gęste populacje glonów (koloru żółto-brązowego), są gotowe do wykorzystania jako inokulum dla kultur produkcyjnych, które zapewnią larwom pąkli pożywienie.
  7. Hoduj kultury produkcyjne w 4-litrowych butelkach z poliwęglanu z silikonowymi korkami z 2 wywierconymi otworami wyposażonymi w szklane rurki.
    1. Podłącz 1 szklaną rurkę sięgającą do dna butelki do pompy powietrza za pomocą silikonowej rurki wyposażonej w filtr powietrza 0,2 μm. Upewnij się, że druga szklana rurka kończy się tuż pod silikonowym korkiem i jest wypełniona bawełną, aby umożliwić wydostawanie się wstrzykiwanego powietrza.
    2. Każdego tygodnia napełniaj cztery 4-litrowe butelki przefiltrowaną wodą morską i sterylizuj je w autoklawie razem z korkami. Ponadto w autoklawie należy umieścić 4 probówki z 4 ml roztworów wzbogacających f/2 i krzemianowych.
    3. Po schłodzeniu dodać do butelek roztwory wzbogacające f/2 i krzemianowe, a następnie zaszczepić je połową objętości kultur startowych w kolbach Erlenmeyera.
    4. Umieść cztery butelki o pojemności 4 litrów w natężeniu światła 50–100 μmol m-2 s-1.
    5. Kultury produkcyjne należy zebrać po ok. 1 tygodniu; są one wtedy wystarczająco gęste, aby można je było wykorzystać do karmienia larw pąkli nauplius.
      UWAGA: Kultury produkcyjne mają żywotność około 2 tygodni, co oznacza, że w każdej chwili dostępnych jest 8 aktywnych butelek produkcyjnych.

6. Projektowanie badań eksperymentalnych z wykorzystaniem pąkli

  1. Umieść panele z młodymi lub dorosłymi pąklami w kontrolowanych akwariach, gdzie mogą być uprawiane w identycznych warunkach. Nazywa się to eksperymentem w ogrodzie pospolitym, który na przykład może być wykorzystany do zrozumienia lokalnych adaptacji lub plastyczności fenotypowej18, lub do zbadania zmian ekspresji genów w odniesieniu do czynników zewnętrznych (np. zasolenia, temperatury lub pH).
    UWAGA: Możliwe jest również wykorzystanie pąkli zbieranych bezpośrednio z pola na panelach. Zaletą korzystania z osobników wyhodowanych w laboratorium jest to, że można uniknąć efektów matczynych przy użyciu następnego pokolenia potomstwa.
    1. Wystaw pąkle na działanie określonych warunków środowiskowych w wybranym przedziale czasowym, a następnie odłów dorosłych (np. w celu badań nad ekspresją genów)2.
  2. W przypadku eksperymentów z larwami karpiowatych w celu zbadania ekspresji genów3, umieść karpiowate w kontrolowanych akwariach, w których larwy mogą być hodowane w identycznych warunkach.
    1. Zbierz karpiowate po określonych okresach czasu, filtrując je za pomocą sit (zgodnie z opisem w kroku 4.7) i ekstrahując RNA zgodnie z poniższymi protokołami (krok 8).

7. Sekcja pąkli

  1. Oczyść przestrzeń laboratoryjną, w której przeprowadzana jest sekcja i pobieranie próbek DNA, zarówno przed, jak i między osobami, w tym wszystkie narzędzia do preparacji. Odbywa się to przy użyciu chloru do ławki (lub 96% etanolu do kleszczy).
    UWAGA: Oznaczone probówki zawierające pożywki utrwalające (etanol lub roztwór stabilizujący RNA) są przygotowywane z wyprzedzeniem.
  2. Wybierz duże i krótkotrwale zagłodzone osobniki (nie karm ich przez 2 dni przed sekcją). Oczyść skorupę pąkli szczoteczką do zębów, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia innymi gatunkami (np. bakteriami, glonami) i spłucz ją wodą.
    UWAGA: Powodem krótkotrwałego głodzenia osób przed sekcją jest uniknięcie jakiegokolwiek zanieczyszczenia DNA (np. z torbieli artemii w jelitach).
  3. Umieść poszczególne pąkle na równej powierzchni, przymocowane do panelu lub luźno w naczyniu. Wypreparuj odpowiednie tkanki od osoby dorosłej. Istnieje kilka sposobów preparowania pąkli, w zależności od celu badania.
    1. Metoda preparacji A: naprawienie całej pąkli tak szybko, jak to możliwe.
      1. Usuń całą pąklę z panelu za pomocą skalpela, wkładając ją pod pąklę i blisko powierzchni panelu.
        UWAGA: W większości przypadków ta manipulacja pozostawia płytkę podstawną prawie nienaruszoną, nie wpływając w ten sposób na pąklę w środku.
      2. Ostrożnie rozbij zewnętrzną powłokę z jednej strony, wkładając kleszcze (Rysunek 3). Ma to na celu ułatwienie wniknięcia medium utrwalającego do wnętrza skorupy.
        UWAGA: Jeśli skorupa nie zostanie w ogóle uszkodzona przed umieszczeniem pąkli w probówce, może to prowadzić do wolniejszego procesu utrwalania i późniejszej gorszej jakości DNA.
      3. Umieść złamaną pąklę w probówce zawierającej roztwór do przechowywania RNA lub etanol. Pozostaw pąklę w roztworze na co najmniej 24 godziny w celu jej utrwalenia. Po zamocowaniu pąkli zwierzę można wyjąć z podłoża mocującego i umieścić na tacy preparucyjnej. Cirri, płaszcz i soma (ciało) mogą być oddzielone od siebie i umieszczone w oddzielnych probówkach w celu dalszej ekstrakcji DNA lub RNA.
        UWAGA: Ważne jest, aby obserwować, czy wewnątrz pąkli znajdują się blaszki jajowe z zapłodnionymi jajami. Jeśli są obecne, należy je usunąć przed przystąpieniem do ekstrakcji DNA, aby uniknąć znalezienia wielu genotypów w próbce.
    2. Metoda preparacji B: usunięcie pąkli ze skorupy przed jej utrwaleniem.
      UWAGA: Metoda ta nie zawsze może prowadzić do pobrania próbki płaszcza, ponieważ jest on przymocowany do wnętrza skorupy wapiennej. Ale może to być szybka metoda pobierania próbek DNA od danej osoby.
      1. Ostrożnie usuń, za pomocą kleszczy preparacyjnych, płytki tergalowe i tarczkowe (Rysunek 3), wkładając końcówkę kleszczyków między płytki tergalowe i tarczowe, chwytając płytkę i delikatnie pociągając, aby je usunąć.
      2. Chwyć cirri kleszczami i wyciągnij pąklę prosto i umieść ją bezpośrednio w 96% etanolu lub roztworze stabilizującym RNA w celu utrwalenia.
        UWAGA: Zdarza się, że w tym samym czasie pobiera się próbki z płaszcza, co jest widoczne jako cienki nabłonek o ciemnej pigmentacji (u B. improvisus). W przeciwnym razie płaszcz można usunąć z wnętrza skorupy za pomocą skalpela, a następnie umieścić w etanolu lub roztworze stabilizującym RNA.
        UWAGA: Płytki tergalowe i tarczkowe (jeśli są nienaruszone) można wysuszyć i zachować, ponieważ są one przydatne do identyfikacji gatunku10. Ogólnym zaleceniem, jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do gatunku, jest również sfotografowanie całej pąkli przed rozpoczęciem sekcji.

8. Ekstrakcja RNA do ilościowego PCR

  1. Dorosłe osobniki, które mają być wykorzystane do ekstrakcji RNA, umieścić w roztworze stabilizującym RNA, inkubować przez noc (do 24 godzin) w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Larwy Cyprydów są preferencyjnie zamrażane na sucho, bez RNA, później bezpośrednio w temperaturze -80 °C, poprzez umieszczenie ich w krioprobówkach, a następnie zanurzenie probówek na krótko (30 s) w ciekłym azocie przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C.
  2. W czasie ekstrakcji RNA rozmrozić pąkle na lodzie i użyć ich w stanie nienaruszonym lub wyciąć tkanki, które mają być użyte (patrz krok 7).
    UWAGA: Ze względu na dużą różnorodność genetyczną między osobnikami (≈ 3–5% zmienności w regionach kodowania; Alm Rosenblad i wsp., dane niepublikowane) zaleca się zebranie pewnej liczby dorosłych osobników, co minimalizuje efekt zmienności sekwencji między osobnikami na późniejszym etapie qPCR.
  3. W celu ekstrakcji RNA dodać 350 μl buforu do lizy dostarczonego z zestawem do przygotowania RNA do probówek homogenizacyjnych zawierających 2,8 mm kulek ceramicznych.
    UWAGA: Kulki ceramiczne zapewniają lepszą wydajność RNA w porównaniu do sonikacji (wyniki reprezentatywne).
  4. Weź dorosłego pąkla (całego lub tkanki) lub zbierz co najmniej 20 larw karpiowatych za pomocą kleszczy i umieść je w probówkach homogenizacyjnych.
  5. Przejdź bezpośrednio do rozdrabniania i homogenizacji za pomocą młyna perełkowego.
  6. Umieść probówki homogenizacyjne z próbką i kulkami w uchwycie młynka do kulek. Potrząsaj nimi z częstotliwością 4,0 m/s przez 20 s. Schłodzić próbkę przez 1 minutę na lodzie. Powtórz 2 razy.
  7. Przygotuj RNA zgodnie z protokołem dostępnego na rynku zestawu do izolacji RNA.
    UWAGA: Przed zastosowaniem metod ekstrakcji RNA należy przeprowadzić ocenę ryzyka (w tym odczytanie kart charakterystyki) w celu zidentyfikowania niebezpiecznych substancji chemicznych, które wymagają użycia dygestorium i innej odzieży ochronnej, w tym rękawic (np. dodanie β-merkaptoetanolu do buforu do lizy podczas ekstrakcji RNA powinno odbywać się w dygestorium).
  8. Określ ilościowo RNA. Przygotować roztwór roboczy i dodać wzorzec oraz próbki do całkowitej objętości 200 μl. Wirować je przez 2-3 s i inkubować przez 2 minuty. Włóż probówki do fluorometru i dokonaj odczytów.
  9. Sprawdzić próbki RNA pod kątem zanieczyszczenia białkami za pomocą spektrofotometru i sprawdzić ich integralność RNA za pomocą automatycznego systemu elektroforezy (wyniki reprezentatywne).
    UWAGA: W przypadku preparatów dobrej jakości zaleca się, aby RNA miało stosunek 260/280 nm 2–2,2 i DNA około 1,8. Niższe wartości wskazują na zanieczyszczenie białkami i konieczność optymalizacji procedury ekstrakcji.

9. Ekspresja genów: synteza cDNA i qPCR

  1. Potraktuj otrzymany RNA DNazą, aby usunąć wszelkie pozostałe DNA przed wykonaniem cDNA do qPCR.
    1. Sprawdź, czy genomowe DNA nie jest zanieczyszczone, dodając próbkę RNA, ale bez odwrotnej transkryptazy podczas przygotowywania cDNA. Jeśli dochodzi do amplifikacji PCR wybranego genu na cDNA wykonanej bez odwrotnej transkryptazy, występuje zanieczyszczenie DNA w RNA.
      UWAGA: W przypadku próbek, które mają być używane do sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA przy użyciu technologii sekwencjonowania nowej generacji), etap DNazy jest mniej krytyczny. W szczególności w przypadku próbek o niskim poziomie RNA etap DNazy można pominąć, aby nie stracić zbyt dużej ilości RNA w procesie.
  2. Przeprowadź syntezę cDNA na RNA traktowanym DNazą, używając ilości RNA w zakresie określonym w komercyjnym zestawie do syntezy cDNA, ale zwykle użyj co najmniej 50 ng.
  3. Zaprojektuj startery qPCR tak, aby wyżarzały się w częściach genu będącego przedmiotem zainteresowania, w których identyczność sekwencji między osobnikami jest tak wysoka, jak to możliwe, ale tożsamość sekwencji między paralogami genów jest tak niska, jak to możliwe. Proszę zapoznać się z odpowiednimi publikacjami dotyczącymi konkretnych par starterów używanych do badań ekspresji genów ATPa+/K+ class="xref">3 i akwaporyny2 (Rysunek 5).
    UWAGA: W tym celu można wykorzystać dane sekwencji RNA od setek karpiowatych lub kilku dorosłych osobników.
  4. Zaprojektuj startery dla genu, które mają być używane do normalizacji poziomów ekspresji (np. aktyna). Startery stosowane z powodzeniem dla aktyny to: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3' i odwrotnie: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
    UWAGA: Aktyna jest powszechnie stosowanym genem kontrolnym. Jednak inne zostały również zasugerowane jako odniesienie i przetestowane na pąklach19. Oprócz aktyny przetestowano użycie RPL8, 36B4, EF1 i NADHd1 jako odniesienia3. Stwierdzono, że nie ma dużych różnic w poziomach ekspresji odpowiednich genów referencyjnych między somą, cirri, dorosłymi lub karpiowatymi.
  5. Zoptymalizuj temperaturę wyżarzania dla zaprojektowanych starterów, dodając coraz większe ilości cDNA (zwykle w zakresie 0,25–50 ng) do mieszaniny zawierającej SYBR Green, dNTP, polimerazę i po 0,3 μM startera do przodu i do tyłu.
  6. Uruchom protokoły qPCR w różnych temperaturach wyżarzania w następujący sposób: początkowa temperatura denaturacji 95 °C przez 3 minuty, etap denaturacji w 95 °C przez 20 s, temperatury wyżarzania 55–63 °C przez 20 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s. W sumie uruchom 40 cykli PCR.
    UWAGA: Sprawność startera powinna mieścić się w zakresie 90–105% i jest obliczana jako E = (10^(-1/nachylenie)-1) x 100, gdzie nachylenie jest nachyleniem krzywej uzyskanej podczas wykreślania wartości logarytmicznej stężeń cDNA w stosunku do ich wartości progowych cyklu (Ct).
  7. Wykonaj qPCR przy użyciu odpowiedniej ilości cDNA, zwykle 1–10 ng, używając protokołu PCR opisanego w kroku 3 z optymalną temperaturą wyżarzania.
    UWAGA: Większa ilość cDNA jest używana tylko w przypadku genów, które ulegają ekspresji w bardzo niskich ilościach.

Wyniki

Stosując opisaną procedurę hodowli dorosłych osobników B. improvisus, można uzyskać do czterech partii larw naupliusów tygodniowo. Zbiór larw naupliusów byłby możliwy niemal każdej nocy, jednak wymagałoby to większego zaangażowania personelu oraz rozbudowanej infrastruktury (przy dużej liczbie osobników w stadzie hodowlanym kultura uwalnia larwy w sposób ciągły). Dodatkowym czynnikiem ograniczającym produkcję larw wydaje się być dostępność wysokiej jakości paszy, w szczególności okrzemki Skeletonema. Maksymalnie każda partia z systemu hodowlanego składa się z około 12 000 naupliusów, co oznacza, że tygodniowo można wyhodować do 50 000 naupliusów. Niemniej jednak w niektórych tygodniach liczba produkowanych larw może być nawet dziesięciokrotnie mniejsza. Pojedynczy dorosły osobnik może wytworzyć do 7 000 larw na dobę14, co oznacza, że na każdą partię larwy uwalnia 1–2 osobniki dorosłe. W ciągu tygodnia około 70–90% zebranych naupliusów przekształci się w cypridy (co daje maksymalnie około 30 000 cyprid tygodniowo), które mogą być wykorzystane w testach osiadania oraz badaniach molekularnych.

Należy podkreślić, że cechy cyprid wykazują zmienność między partiami, a ogólnie zmienność między partiami jest większa niż zmienność w obrębie pojedynczej partii. Na przykład sukces osiadania w testach osiadania waha się od 30 do 70% dla różnych partii. Najprawdopodobniej jest to spowodowane indywidualną zmiennością genetyczną między konkretnymi parami osobników dorosłych uwalniających larwy w różnych okresach próbkowania. Oczywiście zaleca się, aby powtórzone eksperymenty (repliki biologiczne) obejmowały cypridy z kilku partii, jeśli mają zostać sformułowane bardziej ogólne wnioski z wyników. Zmienność między partiami stawia wymagania przed planem eksperymentalnym, w którym należy zastosować odpowiednie kontrole i normalizacje w badaniach ekspresji genów. Jednakże, nawet po zastosowaniu kilku procedur normalizacji statystycznej, które znacznie redukują zmienność między partiami, niektóre efekty wynikające z przynależności do partii są zazwyczaj nadal widoczne (dane niepublikowane).

Postępując zgodnie z przedstawionym protokołem, możliwe jest uzyskanie średnio 500 ng wysokiej jakości RNA z zaledwie 20 cypridów, niezależnie od etapu osiadania pierzniczek (Tabela 1). Jakość RNA jest zazwyczaj oceniana na podstawie stosunku pików 18S do 28S (przewidywane położenia tych dwóch pików wskazano na Rysunku 4). Jednak w przypadku pierzniczek i wielu innych stawonogów, rRNA 28S ulega degradacji podczas ogrzewania (będącego częścią metody analizy) i migruje wspólnie z pikiem 18S20. Z tego powodu w tego typu analizach dla pierzniczek w zasadzie występuje tylko jeden pojedynczy pik rRNA. Z przeprowadzonego testu (Rysunek 4) wynika wyraźnie, że homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych zapewnia najwyższą integralność RNA i jest zatem metodą zalecaną. Ilość i jakość RNA są wystarczające do przygotowania wysokiej jakości bibliotek do sekwencjonowania, co pozwala na uzyskanie średnio 70 milionów odczytów na próbkę (liczba odczytów zależy oczywiście od poziomu multipleksowania podczas sekwencjonowania). Ilość RNA jest również wystarczająca do syntezy cDNA i analizy ekspresji qPCR dla dużej liczby genów.

Rysunek 5 przedstawia wyniki analiz qPCR akwaporyn oraz wariantów splicingowych pompy Na+/K+ ATPase (NAK1), w których badano zmiany ekspresji w odpowiedzi na zmiany bodźców środowiskowych2,3. Porównanie względnej ekspresji długiego i krótkiego wariantu splicingowego NAK1 wykazuje dwukrotny wzrost poziomu mRNA długiej formy NAK1 przy niskim zasoleniu w stosunku do krótkiej formy NAK (Rysunek 5A). Zatem dane wskazują, że splicing alternatywny sprawia, iż forma długa dominuje w warunkach niskiego zasolenia. W przypadku akwaporyn widoczne jest, że dwa paralogi transportujące wodę, AQP1 i AQP2, wykazują różnicową ekspresję (Rysunek 5B). W szczególności w tkance płaszcza widać, że ekspresja AQP1 jest znacznie obniżona przy niższym zasoleniu, co nie występuje w przypadku AQP2. Zamiast tego AQP2 wykazuje nieco zwiększoną ekspresję przy niższym zasoleniu, ale w somie. Wyniki te stanowią podstawę do badań nad funkcjonalną rolą różnych transporterów jonowych i akwaporyn B. improvisus w osmoregulacji pąkli.

Schemat cyklu życiowego organizmów morskich; pobieranie próbek DNA/RNA; hodowla naupliusów i cypridów, eksperyment osiedleńcze.
Rycina 1Przegląd całej procedury hodowli oraz ekstrakcji RNA do badań ekspresji genów u osobników dorosłych. Aby rozpocząć nową hodowlę, panele mocuje się do ramy i umieszcza w morzu na głębokości 1–3 m. Po kilku tygodniach panele z osobnikami dorosłymi/młodymi umieszcza się pionowo w regałach w kuwetach w laboratorium. Każda kuweta mieści około 40 paneli z osobnikami dorosłymi. Przy około 100 osobnikach dorosłych na panel, w każdej kuwecie hodowanych jest łącznie ≈ 4 000 osobników dorosłych. Dorosłe pereznie karmi się za pomocą Artemia or mogą być utrzymywane przez cały rok. Larwy naupliusy są zbierane z tacek kilka razy w tygodniu poprzez filtrowanie przez sito. Zebrane naupliusy przenosi się do wiader utrzymywanych w 26 °C w kąpieli wodnej i karmione mikroalgami. Nauplii hoduje się do czasu przejścia w stadium nieżywiących się cypridów, które następnie zbiera się poprzez filtrowanie. W warunkach laboratoryjnych można zakładać nowe panele poprzez osadzanie cypridów na panelach, aby zapewnić nowe panele do całorocznej hodowli lub w celu wykorzystania ich w konkretnych układach eksperymentalnych ze zmienionymi warunkami zewnętrznymi. Następnie, pod koniec eksperymentu lub w określonych punktach czasowych, izoluje się RNA z osobników młodocianych/dorosłych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ wodny z wygrodzeniami, układem sedymentacji i filtracją wody do eksperymentu z zakresu nauk o morzu.
Rycina 2Zdjęcia niektórych kluczowych etapów procedury hodowli. (ANa tym obrazie przedstawiono ramki z panelami służącymi do pobierania nowych populacji z terenu.B) Na tym obrazie przedstawiono panele z dorosłymi pąklami z B. improvisus w statywach umieszczonych w tackach. Panele są rozmieszczone w odstępach około 2 cm. (CNa obrazie przedstawiono tace z panelami z pąklami oraz zbiornik do karmienia po lewej stronie. Z każdej tacy odpływa woda przez wylot, w którym umieszczono sita do zbierania larw naupliusów.D) Na tym obrazie przedstawiono produkcję Artemia pasza dla dorosłych pierścienic.E) Na obrazie przedstawiono hodowlę naupliusów w wiaderkach umieszczonych w łaźni wodnej ustawionej na 26 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat anatomiczny piziarni; opisane płytki opercularne, soma, cirri do celów edukacyjnych.
Rycina 3Opis początkowych etapów sekcji dorosłych perezaków: usuwanie ciała z muszli. (A) Chwyć jedną z płytek opercularnych, ostrożnie wsuwając pęsetę przez otwór. Delikatnie pociągnij, aby usunąć płytkę i odsłonić zwierzę. (B) Wyciągnij zwierzę, chwytając za część somy tuż poniżej cirri. (C) Ten panel przedstawia ogólną anatomię pąkli. Płaszcz i potencjalnie zapłodnione jaja (w jajniku) pozostają w jamie muszli podczas wyciągania ciała. Uwaga dotycząca anatomii pąkli (bardziej szczegółowy opis znajduje się u Andersona)9płytki ścienne serكونnicy są nachylone do wewnątrz i razem tworzą stożek przypominający wulkan. Otwór, czyli apertura, jest przykryty dwiema płytkami operkularnymi, które tworzą drzwiczki, lub operculum, służące do zamykania apertury. Serkonnice z rodzaju Acorn barnacles zazwyczaj posiadają wapienną płytkę podstawną, która jest silnie przytwierdzona do substratu; jednak niektóre gatunki serkonnic nie posiadają tej wapiennej płytki (np., S. balanoides). Piszczelnice wydzielają egzoszkielet z ciemno pigmentowanego płaszcza (karapaks). Zewnętrzna powierzchnia dwuwarstwowego płaszcza ulega zwapnieniu, stając się sztywną, natomiast wewnętrzna powierzchnia płaszcza nie jest zwapniała i w związku z tym pozostaje elastyczna. Wewnątrz otworu znajdują się w pozycji wciągniętej cirri. Są to wyrostki piersiowe, których piszczelnice używają do odżywiania się poprzez filtrowanie. Jajniki znajdują się blisko podstawy piszczelnicy, natomiast jądra tkwią w somie. Rysunek został zaadaptowany z Panova. i wsp.21 i zostało opublikowane za zgodą wydawnictwa Springer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Analiza fluorescencji; wykres intensywności zależny od czasu; piki emisji w 44s.
Rycina 4: Określanie integralności rRNA za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej. RNA przygotowano dwiema różnymi metodami homogenizacji: (A) sonikacją oraz (B) za pomocą kulek ceramicznych. Jednostka na osi y, FU, oznacza jednostki fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy; wpływ zasolenia i pCO2 na dane NKA-L1; ekspresja AQP w somie, cirri i płaszczu; istotność statystyczna.
Rycina 5: Wyniki ekspresji genów z dwóch różnych badań nad genami istotnymi dla osmoregulacji u B. improvisus. (A) Panel ten przedstawia różnicową ekspresję, zmierzoną za pomocą qPCR, wariantów splicingowych Na+/K+ ATPase NAK1 w odpowiedzi na różne poziomy zasolenia i pCO23. W wariancie o niskim zasoleniu ekspresja długiej izoformy (NAK1-L) jest zwiększona w stosunku do krótkiej (ANOVA, P < 0,001). (B) Panel ten przedstawia ekspresję akwaporyn u osobników dorosłych B. improvisus podczas ekspozycji na różne poziomy zasolenia2. Do określenia poziomów ekspresji akwaporyn w stosunku do aktyny wykorzystano qPCR. Osobniki dorosłe inkubowano przy 3 różnych poziomach zasolenia (3, 20 i 33 PSU) przez 14 dni. Do przygotowania RNA wyizolowano somę, cirri i płaszcz osobników dorosłych. Na obu rycinach słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Symbole ** i *** wskazują poziom istotności (ANOVA), odpowiednio 0,01 i 0,001. Ryciny te zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Lind et al.2,3. Obie ryciny zostały opublikowane za zgodą PLoS ONE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Faza osiadaniaCałkowita ilość RNA (ng)
Swobodne pływanie512
Eksploracja: Zamknij wyszukiwanie518
Przymocowany cyprid550
Świeżo przeobrażona osobnik młodociany832

Tabela 1: Wydajność izolacji RNA. Tabela ta przedstawia ilość RNA wyekstrahowanego za pomocą zestawu do preparatyki RNA z pul 20 osobników cyprid zebranych na różnych etapach procesu osiadania.

Dyskusja

Hodowla pąkli w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö (Szwecja) trwa od ponad 20 lat i jest wykorzystywana do badań w wielu różnych obszarach badawczych. W ciągu ostatnich lat opublikowano ponad 30 prac naukowych, w których wykorzystano system hodowli, w tym badania nad przeciwporostowością13,22, hydrodynamiką23, ekologią chemiczną24, zmianami klimatu16, biologią ewolucyjną5 i biologią molekularną2.

Aby uniknąć selekcji niektórych osobników, które są bardziej przystosowane do środowiska laboratoryjnego (osobniki, które mogą nie być reprezentatywne dla dzikiej populacji), zaleca się coroczne zbieranie nowego stada lęgowego z pola. Ponadto dobrą praktyką jest również coroczne odmładzanie kultury, ponieważ w ciągu normalnego roku śmiertelność u dorosłych wynosi około 50-80%. Jednakże, jeżeli celem jest wytworzenie linii wsobnych lub rozpoczęcie badań nad ewolucją doświadczalną, należy wykorzystać tylko rodziny hodowane w laboratorium.

Dobrym momentem na zbieranie B. improvisus na panelach w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö jest czerwiec-sierpień, ponieważ w tym czasie w morzu znajduje się duża ilość larw karpiowatych. Sprawdzaj panele co tydzień, aby zobaczyć, kiedy zaczyna się osadzanie pąkli i ręcznie usuwaj inne osiadłe gatunki niż B. improvisus (np. małże, osłonice, mszywioły, hydroidy, nemerteany/rureczki i inne gatunki pąkli) z paneli (np. za pomocą szczoteczki do zębów). Wokół Tjärnö występują trzy płytkowodne gatunki pąkli (B. improvisus, Semibalanus balanoides i Balanus crenatus). Jednak B. improvisus jest dominującym zanieczyszczeniem gładkich, twardych powierzchni w okresie od lipca do sierpnia. S. balanoides ma swój okres osiadania wczesną wiosną i preferuje głównie naturalne podłoża (np. kamienie). B. crenatus może występować w niskich ilościach na panelach w okresie letnim.

Możliwe jest również rozpoczęcie nowych dorosłych pokoleń pąkli z hodowlanych karpiowatych, co byłoby niezbędne, gdyby ustanowiono pewne linie o określonych cechach lub w badaniach nad ewolucją eksperymentalną. Najwygodniejszym sposobem na rozpoczęcie nowych pokoleń dorosłych jest osadzenie cyprydów na panelach termoplastycznych w laboratorium. Panele te z nowo osiadłymi karpiowatymi mogą być również wykorzystywane w zabiegach eksperymentalnych lub do ekspozycji w terenie. W nagłych przypadkach można również użyć dorosłych osobników na głazach z pobliskiego stanowiska (np. Idefjorden w przypadku Laboratorium Badań Morskich Tjärnö), gdzie B. improvisus jest powszechny. Te już zadomowione dorosłe osobniki są traktowane w taki sam sposób, jak dorosłe osobniki na panelach, w ten sposób umieszczane są na tacach i karmione za pomocą systemu przepływowego. Komory przepływowe mogą być również używane do zakładania paneli z pąklami25. Są to komory przepływowe z siatką planktonową po bokach, na których nie osiadają karpiowate, z panelami jako jedyną powierzchnią osiadania dla larw.

Istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla stworzenia długotrwałej, funkcjonującej hodowli pąkli, obejmujących wszystkie etapy życia. Metody stosowane do hodowli B. improvisus są prawdopodobnie w dużym stopniu stosowane również do innych bezkręgowców morskich z swobodnie pływającymi, planktotroficznymi larwami. Procedury hodowli w przypadku niektórych gatunków są już dobrze opisane (np. w przypadku omułków jadalnych i różnych gatunków ostryg)26, podczas gdy w przypadku innych bezkręgowców morskich istnieje zaledwie kilka przykładów długoterminowych kultur obejmujących cały ich cykl życia. Jedna z pierwszych udanych prób hodowli pąkli (B. amphitrite) została przeprowadzona przez Rittschof i wsp.15. Przed rozważeniem założenia zakładu hodowli pąkli należy dysponować długoterminowymi zasobami finansowymi i osobistymi. Utrzymanie tego rodzaju całorocznej hodowli pąkli wymaga co najmniej jednej osoby pracującej na pół etatu. W przyszłości może istnieć pewien potencjał dla automatyzacji niektórych etapów linii produkcyjnej, głównie hodowli mikroalg27. Ponadto, aby odnieść sukces, niezbędny jest dostęp do dużych ilości wysokiej jakości wody morskiej. Hodowla mikroalg, artemii i pąkli nie wiąże się z żadnymi szczególnymi procedurami bezpieczeństwa. Jednak testy niektórych substancji przeciwporostowych lub toksycznych chemikaliów mogą wymagać specjalnych środków ostrożności.

Panele były sprawdzane kilka razy w tygodniu pod kątem zanieczyszczeń. Woda morska użyta w hodowli została wypompowana z głębokości 40 m w fiordzie Koster przed Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö i została przepuszczona przez dwa filtry piaskowe przed wejściem do laboratoryjnego systemu wodnego. Gdyby nie przeprowadzono filtrowania wody, w kulturze byłoby znacznie więcej zanieczyszczeń. Niezbędne jest regularne czyszczenie paneli w kulturze z detrytusu i innych bezkręgowców (np. hydroidów tworzących rozłogi i drapieżnych nemerteanów), które dostają się do systemu poprzez dostarczanie wody morskiej z pola. Na przykład, jeśli nie są produkowane żadne larwy, mimo że kultura została dobrze odżywiona i poza tym wydaje się być w dobrym stanie, problemem może być obecność nemerteanów, które wydają się hamować krycie. Naturalnie, wiele organizmów zanieczyszczających w kulturze w Laboratorium Badań Morskich Tjärnö było specyficznych dla zachodniego wybrzeża Szwecji, a inne rodzaje organizmów skażających będą powszechne i będą stanowić większe wyzwanie w innych obszarach geograficznych. Na zachodnim wybrzeżu Szwecji rzadko można znaleźć na panelach zanieczyszczenie innymi gatunkami pąkli. Od czasu do czasu stwierdza się pojawienie się S. balanoides , ale jest to problem marginalny (co najwyżej jedno zanieczyszczenie S. balanoides na 10 000 próbek B. improvisus ). Brak gatunków zarażających był najprawdopodobniej uzależniony od reżimu zakładającego nowe kultury w okresie letnim, kiedy larwy B. improvisus były silnie dominujące. Ponadto stwierdzono również wyraźne wzbogacenie B. improvisus na panelach, ponieważ gatunek ten jest selektywny dla gładkich powierzchni13.

Konieczne jest usunięcie martwych dorosłych pąkli. Jeśli puste muszle zostaną pozostawione na panelach, mogą stać się schronieniem zarówno dla nauplii artemii , jak i dla różnych gatunków zanieczyszczających. Ponadto zauważono, że martwe osobniki wpływają na samopoczucie sąsiednich osobników, prawdopodobnie poprzez uwalnianie toksycznych związków podczas rozkładu. Dodatkową konsekwencją śmiertelności dorosłych osobników jest to, że niektóre osobniki zostaną pozostawione same i zbyt daleko od innych dorosłych, aby umożliwić krycie (nawet jeśli pąkle mają najdłuższego penisa w świecie zwierząt w stosunku do jego rozmiaru)28. Osobniki te przeżyją, ale są nieproduktywne dla larw. Jednak te samotne dorosłe osobniki można delikatnie usunąć bez uszkadzania płytki podstawy i umieścić poziomo blisko innych, aby umożliwić krycie. Pąkle można również kryć, umieszczając panele z jednym dorosłym osobnikiem na każdym, ale na tyle blisko, aby mogło dojść do zapłodnienia krzyżowego. W ten sposób można wytworzyć linie genetyczne14.

Bardzo ważne jest, aby produkować paszę o wysokiej jakości i karmić kultury prawie codziennie. Nawet kilka dni bez jedzenia może skutkować zmniejszeniem uwalniania larw. Wcześniejsze badania składu diety wykazały, że okrzemki są niezbędne do wzrostu i przetrwania naupliusów pąkli. Kilka gatunków okrzemek wydaje się być odpowiednich jako pokarm, chociaż małe lub pojedyncze komórki (o średnicy mniejszej niż 10 μm) mogą być niezbędne do spożycia nauplii. Gatunki S. marinoi, C. simplex i T. pseudonana okazały się odpowiednią paszą dla nauplii B. improvisus , a także łatwe w uprawie. Ponadto jakość paszy jest na ogół wyższa w przypadku glonów rosnących wykładniczo. Doniesiono również, że okrzemki są niezbędne do tworzenia produktywnych kultur B. amphitrite15. Teoria dotycząca znaczenia okrzemek mówi, że mają one unikalny profil kwasów tłuszczowych i są szczególnie bogate w wysoce wielonienasycony kwas tłuszczowy 20:529. Wykazano, że niektóre kwasy tłuszczowe są ważne dla pomyślnego rozwoju larw ostryg30.

Z biegiem lat nie odnotowano przypadków szkodliwych chorób w kulturze pąkli. W wielu komercyjnych akwakulturach bezkręgowców, takich jak ostrygi i małże, choroby są dość powszechne i mogą być bardzo szkodliwe. Odnotowano również szkodliwe działanie wirusów w dzikich populacjach. Rodzima ostryga we Francji została zastąpiona przez portugalską ostrygę Crassostrea angulata w 1925 roku, ale gatunek ten został zniszczony przez irydowirusa około 1970 roku31. Ostatnio doszło do masowej śmiertelności ostryg pacyficznych Crassostrea gigas w kulturach na całym świecie, co wydaje się być związane z herpeswirusem opryszczki ostreidów 132. Do tej pory nie opublikowano żadnych doniesień na temat patogenów, bakterii lub wirusów na pąklach. Jednak w trwającym projekcie genomowym dotyczącym B. improvisus znaleziono sekwencje wirusa (Alm Rosenblad i wsp., dane niepublikowane), ale bez widocznego związku z objawami choroby. Mieszaniny antybiotyków były wcześniej stosowane w kulturach, aby zminimalizować ryzyko infekcji bakteryjnych; Jednak ta procedura jest obecnie zaniechana i jak dotąd nie spowodowało to żadnych problemów z zanieczyszczeniem.

Jeśli woda morska jest podgrzewana (jak opisano powyżej), przegrzanie może być najpoważniejszym ryzykiem na linii produkcyjnej kultur. Jest to oczywiście trudne do zabezpieczenia przed przegrzaniem, chociaż można zastosować czujniki i odpowiednie systemy alarmowe (np. wysyłanie wiadomości e-mail lub SMS do osób odpowiedzialnych). Tego rodzaju incydenty w przeszłości skutkowały w kulturze znacznymi zabójstwami dorosłych. Może to oczywiście być druzgocące i zrujnować długoterminowe inwestycje czasu i pieniędzy. W szczególności byłoby to katastrofalne, gdyby ustanowiono wsobne linie genetyczne. Aby zapewnić długowieczność takich linii i zabezpieczyć je przed przypadkową utratą, pożądane byłoby opracowanie metodologii kriokonserwacji pąkli. Doniesiono, że larwy ostryg pacyficznych mogą zostać zamrożone i ożywione z częściowym sukcesem33. Kriobankowość jest również cennym narzędziem służącym ochronie zasobów genetycznych wielu gatunków34. Nawet nauplia z B. amphitrite przetrwały zamrożenie35 i stwierdzono, że 20% zamrożonych osobników z powodzeniem przekształciło się w karpiowate36. Do tej pory nie przyjęto jednak stosowania zamrożenia w celu zapewnienia długoterminowej trwałości upraw, ale byłoby to rzeczywiście konieczne w celu utrzymania wybranych linii; Byłby to niezbędny krok do ugruntowania pozycji B. improvisus jako potężnego systemu modeli morskich.

W tym miejscu przedstawiono protokół preparacji różnych tkanek od dorosłych osobników B. improvisus (tj. cirri, soma i mantel). Należy jednak podkreślić, że można również pobrać inne tkanki. Na przykład tkanka miękka między zewnętrznym a wewnętrznym płaszczem gatunku błoniastej Tetraclita japonica formosana została starannie wyizolowana i wykorzystana do ekstrakcji RNA i analizy sekwencyjnej RNAekspresji genów 37. Opisany tutaj zoptymalizowany protokół ekstrakcji zapewnia wystarczające ilości wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania z minimalnej ilości materiału wyjściowego. Po pierwsze, zbieranie pojedynczych larw bezpośrednio do probówek homogenizacyjnych minimalizuje wszelkie straty podczas przenoszenia z jednej probówki do drugiej. Ponadto, spośród różnych testowanych metod, homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych okazała się najbardziej efektywna pod względem wydajności i integralności RNA w porównaniu z sonikacją lub homogenizacją tłuczkową. Planując eksperymenty z ekspresją genów lub genomiką, należy pamiętać o wyzwaniu, jakim jest wysoka zmienność genetyczna pąkli, przynajmniej w przypadku B. improvisus. Barnacle ma różnorodność genetyczną w zakresie 3–5%, nawet w regionach kodujących (Alm Rosenblad i wsp., dane niepublikowane). To oczywiście stawia szczególne wymagania dotyczące projektowania starterów do analizy qPCR, w której należy zidentyfikować bardziej konserwatywne regiony i wykorzystać je jako szablony dla starterów w celu uzyskania spójnych wyników ekspresji między partiami. Konserwatywne regiony dla genów docelowych, takich jak akwaporyny i ATPazy Na+/K+, można zidentyfikować, badając zmienność sekwencji tych genów w danych sekwencyjnych RNA uzyskanych z populacji karpiowatych zawierających setki osobników. Do analizy genomu zostanie pobrana próbka DNA. Jednak uzyskanie wysokiej jakości DNA od B. improvisus może być wyzwaniem21.

Podsumowując, uznana kultura pąkli okazała się pomocna w różnego rodzaju badaniach eksperymentalnych. W szczególności całoroczna produkcja larw pozwala nam na prowadzenie eksperymentów bez ograniczania się do naturalnie występującego okresu tarła (w przypadku B. improvisus jest to okres letni). Uzyskane larwy można wykorzystać do przeprowadzenia szerokiego zestawu badań eksperymentalnych, w tym testów osadniczych, testów behawioralnych, badań ekspresji określonych genów, a także badań transkryptomu całego genomu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant 2017-04559 od Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (VR) oraz wspierany przez UE projekt SEAFRONT dla Andersa Blomberga. W szczególności utworzenie zakładu hodowli było na przestrzeni lat wspierane przez dotacje dla Pera R. Jonssona z następujących agencji finansujących: SSF (Szwedzka Fundacja Badań Strategicznych) w ramach programu Nauka i technologia morska oraz MISTRA w ramach programu Marine Paint. Kent Berntsson odegrał kluczową rolę we wczesnych fazach tworzenia ośrodka hodowlanego. Dodatkowe fundusze na utworzenie ośrodka hodowlanego pochodzą z Centrum Morskiej Biologii Ewolucyjnej (www.cemeb.science.gu.se), które jest wspierane przez grant Linneusza ze Szwedzkich Rad ds. Badań Naukowych FORMAS i VR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Panele z pleksi (polimetakrylanu metylu)Plastic produkter, Bromma, Szwecjaprzezroczysta
szklana butelka
ArtemiaINVE Akwakultura, BelgiaPrzetestowaliśmy różne firmy; to jest naprawdę najlepsza
Skeletonema marinoi (szczep CCAP 1077/5)CCAP (kolekcja kultur glonów i pierwotniaków); Szkocja szczep 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (szczep CCAP 1085/3)CCAP (kolekcja kultur glonów i pierwotniaków); Szkocja szczep 1085/3
System filtrów z wkładem MilliporeMillipore 
wkład o nominalnej wielkości porów 0,2 i mikro; mMilipore wkład CWSS01S03Duża pojemność dla dużych objętości
butelki z poliwęglanuNalgeneautoklawalowane
RNA późniejQiagen76106  Roztwór utrwalający do konserwacji RNA
Turbo Zestaw wolny od DNAInvitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907Zestaw DNAzy do usuwania DNA z przygotowanego RNA
Zestaw do syntezy cDNA iScript Zestaw do syntezy cDNA1708890 Biorad
SYBR Green supermixBiorad1708880Dye do QPCR
RNeasy minikitQiagen74104Ekstrakcja RNA u dorosłych lub wielu karpiowatych
Homogenizacja tkanek miękkich CK 14, probówki 2 mlPrecellysKT03961-1-003.2Kulki ceramiczne do homogenizacji
RNeasy micro kitQiagen74004Ekstrakcja RNA kilku karpiowatych
PET 1,5 l

Bibliografia

  1. Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192(2017).
  3. Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069(2013).
  4. Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
  5. Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082(2016).
  6. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
  7. Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
  8. Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
  9. Anderson, D. T. Barnacles - structure, function, development and evolution. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).
  10. Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
  11. Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
  12. Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
  13. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
  14. Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
  15. Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
  16. Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
  17. Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).
  18. Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156(2014).
  19. Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62(2009).
  20. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159(2010).
  21. Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
  22. Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
  23. Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957(2016).
  24. Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
  25. Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
  26. Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
  27. Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
  28. Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
  29. Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
  30. Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
  31. Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
  32. Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
  33. Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486(2014).
  34. Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
  35. Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
  36. Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
  37. Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla p klihodowla larwanaliza ekspresji gen wbadania osmoregulacjibadania nad przeciwdzia aniem obrastaniusekcja tkanekekstrakcja RNAanaliza qPCRmorski system modelowy
Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.