Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Podsumowanie

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Streszczenie

Charakterystyka immunofenotypowa i analiza molekularna od dawna są używane do wyznaczania heterogeniczności i definiowania odrębnych populacji komórek. FACS jest z natury testem jednokomórkowym, jednak przed analizą molekularną komórki docelowe są często izolowane prospektywnie luzem, tracąc w ten sposób rozdzielczość pojedynczej komórki. Analiza ekspresji genów w pojedynczej komórce pozwala zrozumieć różnice molekularne między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W masowej analizie komórek nadreprezentacja odrębnego typu komórki powoduje odchylenia i niedrożności sygnałów z rzadkich komórek o znaczeniu biologicznym. Wykorzystując sortowanie indeksu FACS sprzężone z analizą ekspresji genów w pojedynczej komórce, populacje mogą być badane bez utraty rozdzielczości pojedynczej komórki, podczas gdy komórki z pośrednią ekspresją markerów powierzchniowych są również wychwytywane, co umożliwia ocenę znaczenia ciągłej ekspresji markerów powierzchniowych. W tym miejscu opisujemy podejście, które łączy ilościową kontrolę odwrotnej transkrypcji pojedynczej komórki (RT-qPCR) i sortowanie indeksu FACS w celu jednoczesnego scharakteryzowania heterogeniczności molekularnej i immunofenotypowej w populacjach komórek.

W przeciwieństwie do metod sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, użycie qPCR ze specyficzną amplifikacją docelową pozwala na dokładne pomiary transkryptów o niskiej obfitości z mniejszą liczbą przerw, podczas gdy nie jest mylone przez problemy związane z różnicami w głębokości odczytu między komórkami. Ponadto, dzięki bezpośredniemu sortowaniu indeksowemu pojedynczych komórek w buforze do lizy, metoda ta pozwala na przeprowadzenie syntezy cDNA i specyficznej docelowej amplifikacji wstępnej w jednym kroku, a także na korelację następnie uzyskanych sygnatur molekularnych z ekspresją markera na powierzchni komórki. Opisane podejście zostało opracowane w celu badania pojedynczych komórek hematopoetycznych, ale jest również z powodzeniem stosowane na innych typach komórek.

Podsumowując, opisane tutaj podejście pozwala na czuły pomiar ekspresji mRNA dla panelu wstępnie wybranych genów z możliwością opracowania protokołów dla późniejszej prospektywnej izolacji molekularnie odrębnych subpopulacji.

Wprowadzenie

Uważa się, że każda pojedyncza komórka krwi znajduje się w hierarchii komórkowej, gdzie komórki macierzyste tworzą wierzchołek na szczycie szeregu coraz bardziej zaangażowanych pośrednich progenitorów, które ostatecznie różnicują się w końcowe komórki efektorowe niosące określone funkcje biologiczne¹. Duża część wiedzy na temat organizacji systemów komórek macierzystych została wygenerowana w układzie krwiotwórczym, głównie ze względu na możliwość prospektywnego izolowania odrębnych populacji krwiotwórczych wysoce wzbogaconych o komórki macierzyste lub różne komórki progenitorowe² przez sortowanie FACS. Pozwoliło to na analizę funkcjonalną lub molekularną wielu z tych populacji, głównie poprzez profilowanie ekspresji genów^3,4. Jednak podczas analizy ekspresji genów w populacjach masowych indywidualne różnice między komórkami są uśredniane i tracone⁵. Tak więc niezdolność do wykrycia różnic między komórkami w heterogenicznych frakcjach komórek może zaburzyć nasze zrozumienie krytycznych procesów biologicznych, jeśli małe podzbiory komórek uwzględniają wnioskowaną funkcję biologiczną tej populacji^6,7. I odwrotnie, badanie sygnatur ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki daje możliwość nakreślenia heterogeniczności i obejścia przysłaniających wpływów z nadreprezentowanych podzbiorów komórek⁸.

Do tej pory opracowano wiele protokołów do analizy ekspresji genów w pojedynczej komórce; każde podejście ma swoje własne zastrzeżenia. Najwcześniejszą metodą była fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ (RNA-FISH), która mierzy ograniczoną liczbę transkryptów na raz, ale jest wyjątkowa, ponieważ pozwala na badanie lokalizacji RNA^9,11. Opracowano również wczesne metody wykorzystujące PCR i qPCR do wykrywania pojedynczego lub bardzo niewielu transkryptów¹². Jednak ostatnio zostały one zastąpione przez metody oparte na mikrofluidyce, które mogą jednocześnie analizować ekspresję setek transkryptów na komórkę w setkach komórek za pomocą qPCR, a tym samym pozwalają na wysokowymiarową analizę heterogeniczności przy użyciu wcześniej określonych paneli genowych^10,13. Ostatnio technologie oparte na sekwencjonowaniu RNA stały się szeroko stosowane do analizy pojedynczych komórek, ponieważ teoretycznie mogą one mierzyć cały transkryptom komórki, a tym samym dodawać wymiar eksploracyjny do analizy heterogeniczności^10,14. Multipleksowana analiza qPCR i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki mają różne cechy, dlatego uzasadnienie zastosowania którejkolwiek z metod zależy od zadanego pytania, a także od liczby komórek w populacji docelowej. Wysoka przepustowość i niski koszt na komórkę wraz z bezstronnymi, eksploracyjnymi cechami sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki są pożądane, gdy badane są nieznane komórki lub duże populacje. Jednak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest również nastawione na częstsze sekwencjonowanie transkryptów o dużej obfitości, podczas gdy transkrypty o niskiej obfitości są podatne na zaniki. Może to prowadzić do powstania bardzo złożonych danych, które stawiają wysokie wymagania analizie bioinformatycznej w celu ujawnienia ważnych sygnałów molekularnych, które często są subtelne lub ukryte w szumie technicznym¹⁵. Tak więc, w przypadku dobrze scharakteryzowanych tkanek, jednokomórkowa analiza qPCR przy użyciu wstępnie określonych paneli starterów wybranych pod kątem funkcjonalnie ważnych genów lub markerów molekularnych może służyć jako czułe, proste podejście do określenia heterogeniczności populacji. Należy jednak zauważyć, że w porównaniu z sekwencją RNA pojedynczej komórki, koszt na komórkę jest na ogół wyższy w przypadku jednokomórkowych metod qPCR. W tym miejscu opisujemy podejście, które łączy jednokomórkowy RT-qPCR (zmodyfikowany z Teles J. i wsp.¹⁶), do sortowania indeksu FACS¹⁷ i analizy bioinformatycznej¹⁸ w celu jednoczesnego scharakteryzowania heterogeniczności molekularnej i immunofenotypowej w populacjach.

W tym podejściu, populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania jest barwiona, a pojedyncze komórki są sortowane przez FACS bezpośrednio do buforu do lizy w 96-dołkowych płytkach PCR. Jednocześnie poziomy ekspresji dodatkowego zestawu markerów powierzchni komórki są rejestrowane dla każdej pojedynczej komórki podczas sortowania FACS, metody określanej jako sortowanie indeksowe. Zlizowany materiał komórkowy jest następnie amplifikowany, a ekspresja genów wybranego zestawu genów analizowana za pomocą RT-qPCR, przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Strategia ta umożliwia analizę molekularną posortowanej pojedynczej komórki, a także jednoczesną charakterystykę ekspresji markera na powierzchni komórki każdej pojedynczej komórki. Poprzez bezpośrednie mapowanie molekularnie odrębnych podzbiorów komórek na ekspresję indeksowanych posortowanych markerów, subpopulacje można powiązać ze specyficznym immunofenotypem, który można wykorzystać do ich prospektywnej izolacji. Metoda jest opisana krok po kroku w Rysunek 1. Z góry określony panel genów dodatkowo przyczynia się do wyższej rozdzielczości docelowej ekspresji genów, ponieważ omija pomiar nieistotnych, licznych genów, które w przeciwnym razie mogłyby zasłaniać subtelne sygnały ekspresji genów. Co więcej, specyficzna amplifikacja docelowa, jednoetapowa odwrotna transkrypcja i amplifikacja pozwalają na solidny pomiar transkryptów o niskiej ekspresji, takich jak czynniki transkrypcyjne lub niepoliadenylowane RNA. Co ważne, metody qPCR pozwalają na pomiar mRNA z białek fuzyjnych, które są istotne przy badaniu niektórych chorób nowotworowych¹⁹. Wreszcie, skoncentrowana liczba badanych genów, niski wskaźnik rezygnacji i ograniczone różnice techniczne między komórkami sprawiają, że metoda ta jest łatwa do analizy w porównaniu z metodami o wyższych wymiarach, takimi jak sekwencja RNA pojedynczej komórki. Postępując zgodnie z protokołem, można przeprowadzić cały eksperyment, od sortowania komórek po analizowane wyniki, w ciągu trzech dni, dzięki czemu jest to nieskomplikowana i szybka metoda czułej, wysokoprzepustowej analizy ekspresji genów jednokomórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie płytek do lizy

1. Korzystając z ławki wolnej od RNA/DNA, przygotuj wystarczającą ilość buforu do lizy dla 96 studzienek, z dodatkiem 10%, mieszając 390 μl wody wolnej od nukleaz, 17 μl 10% NP-40, 2,8 μl 10 mM dNTP, 10 μl 0,1 M DTT i 5,3 μl inhibitora RNAzy (patrz tabela materiałów). Wiruj i zakręć w dół.
2. Rozprowadzić 4 μl buforu do lizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i uszczelnić płytki folią samoprzylepną. Zakręć rurki, aby zebrać płyn na dnie talerzy. Trzymaj płytki na lodzie do czasu sortowania komórek (maksymalnie 24 godziny).

2. Przygotowanie komórek do sortowania komórek

1. Rozmrozić odpowiednią liczbę komórek (w tym przypadku CD34 wzbogacone w hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe) do eksperymentu. 1 x 10⁶ komórek jest odpowiednich do sortowania około trzech 96-dołkowych płytek pojedynczych komórek z kontrolami.
2. Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodawaj 1 ml FBS co 30 s, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 8 ml. Wirować komórki w wirówce o sile 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
3. Zawiesić komórki w 8 ml buforze barwiącym (PBS z 2% FBS) i odwirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
4. Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym o pojemności 200 μl i usunąć komórki w celu uzyskania barwień kontrolnych.
5. Wykonaj fluorescencję minus jedną kontrolę (FMO) dla każdego fluoroforu, barwiąc frakcję komórek w 50 μl buforu barwiącego. W tym przykładzie 6 probówek do mikrowirówek z 20 000 komórek jest używanych jako FMOS. Należy pamiętać, że liczba komórek powinna być dostosowana w zależności od badanej populacji. Dodać wszystkie przeciwciała w tym samym stężeniu, co w barwieniu próbki, z wyjątkiem jednego do każdej probówki.
6. Wykonaj pojedyncze barwienia dla każdego fluoroforu, barwiąc frakcję komórek w buforze 50 μl dla każdego użytego fluoroforu. W tym przykładzie użyto 6 probówek do mikrowirówek z 20 000 komórek. Należy zauważyć, że cel dla każdego przeciwciała musi być wyrażony przez komórki używane do kontroli. Dodać każde przeciwciało w tym samym stężeniu, co w barwieniu próbki w poszczególnych probówkach. Dodatkowo przechowuj 20 000 niebarwionych komórek w 50 μl jako niebarwioną kontrolę.
7. Do próbki komórki dodać przeciwciała o odpowiednim stężeniu. Stosowane są tutaj CD34-FITC w stężeniu 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 oraz Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50 i CD235a-PECy5 1/1000.
8. Inkubować komórki z przeciwciałami przez 30 minut na lodzie w ciemności.
9. Przemyć komórki 3 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
10. Zawieś ponownie komórki i powtórz krok 2.9.
11. Ponownie zawiesić próbkę w 500 μl i FMO w 100 μl buforze barwiącym z 1/100 7AAD i przefiltrować komórki przez filtr 50 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.

3. Sortowanie komórek

1. Upewnij się, że maszyna FACS jest prawidłowo skonfigurowana z opóźnieniem upuszczenia oraz konfiguracją i śledzeniem cytometru (CST), które zostały ostatnio wykonane zgodnie z instrukcjami producenta, aby upewnić się, że odpowiednie komórki są posortowane. W przypadku komórek krwiotwórczych zaleca się stosowanie dyszy 85 mikronów i maksymalną prędkość 4, podczas gdy optymalna szybkość zdarzeń wynosi od 800 do 2000 zdarzeń/s.
2. Skorygować nakładanie się widma, wykonując kompensację fluorescencji i ustawiając bramki zgodnie z kontrolami FMO lub wewnętrznymi kontrolami ujemnymi.
3. Przeprowadzić ponowną analizę populacji docelowej, sortując co najmniej 100 komórek docelowych do nowej probówki mikrowirówkowej ze 100 μl buforu barwiącego. FACS analizuje posortowane komórki, rejestrując posortowaną próbkę i upewniając się, że trafiają one do bramki sortowania.
4. Ustaw sortowanie płytek jednokomórkowych, centrując kroplę w dołku A1 w płytce 96-dołkowej. Po wyśrodkowaniu posortuj 50–100 cząstek o wielkości 6 μm do wszystkich studzienek wokół krawędzi pustej płytki 96-dołkowej, aby upewnić się, że wszystkie studzienki będą miały komórkę w środku każdej studzienki.
5. Jeśli to możliwe, można dodać dodatkową kontrolę w celu zapewnienia, że żywe komórki są sortowane, sortując pojedyncze komórki do wzrostu in vitro. Komórki krwiotwórcze można hodować na 96-dołkowych płytkach z dnem U w 100 μl SFEM z 1% penicyliną streptomycyną, 100 ng/ml FLT3L, TPO i SCF. Przeanalizuj każdy dołek po 3 dniach w hodowli pod kątem kolonii komórkowych za pomocą mikroskopu.
6. Usuń folię samoprzylepną z płyt. Posortuj pojedynczą komórkę zainteresowania (tutaj komórki Lin-CD34 + CD38-) do 92 z 96 dołków, aktywuj sortowanie INDEX w oprogramowaniu do sortowania FACS, aby zapisać profil immunofenotypowy dla innych interesujących markerów (tutaj CD45RA, CD49f i CD90) dla każdej pojedynczej komórki.
7. Posortuj dwie studzienki z odpowiednio 10 i 20 komórkami w celu kontroli liniowości we amplifikacji PCR. Zwykle stosuje się studzienki H1 i H2.
8. Utrzymuj dwie studzienki bez żadnych komórek jako kontrolki bez szablonu, zwykle studzienki H3 i H4.
9. Uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i obracaj płytki o gramaturze 300 x g przez 1 minutę przed zatrzaskowym zamrożeniem na suchym lodzie.
10. Zamrożone talerze przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania. Posortowane i zlizowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Odwrotna transkrypcja i specyficzna amplifikacja docelowa

1. Przygotuj mieszankę starterów dla wszystkich 96 celów genowych, dodając 2 μl każdej pary starterów, w tym startery genów porządkowych i startery dla wzbogaconego RNA kontrolnego, w probówce wolnej od RNAZA o pojemności 1,5 ml na ławce wolnej od RNA/DNA. Jeśli używasz mniej niż 96 starterów, dodaj równoważną objętość wody wolnej od nukleaz dla brakujących starterów. Startery są zamawiane osobno, aby pasowały do pożądanego panelu genów.
2. Wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną mieszankę amplifikacji docelowej, dodając 632,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 101,2 μl Taq / indeksu górnego III, 151,8 μl mieszanki starterów i 0,7 μl wzbogaconego w kontrolny RNA. Wykonaj ten krok na ławce wolnej od DNA. Wymieszaj przez wirowanie i odwiruj, aby zebrać płyn na dnie tuby. Przechowywać na lodzie do czasu dodania do próbki.
3. Przygotuj mieszaninę kontrolną bez odwrotnej transkrypcji dla czterech studzienek, mieszając 27,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 1,76 μl enzymu Taq, 6,6 μl mieszanki starterów i 2,64 μl wody wolnej od nukleaz. Skok kontrolnego RNA. Wykonaj ten krok na ławce wolnej od DNA. Wirować i wirować w dół, aby zebrać płyn na dnie probówki i trzymać na lodzie do momentu dodania do próbki.
4. Rozmrozić płytki lizatu na lodzie. Dodać 8,75 μl wcześniej przygotowanej mieszanki odwrotnej transkrypcji i specyficznej amplifikacji docelowej do 92 dołków, w tym kontroli liniowości i bez matrycy. Dodać 8,75 μl mieszaniny kontrolnej bez odwrotnej transkrypcji do czterech pozostałych studzienek. Uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płyt.
5. Wstępna odwrotna transkrypcja i specyficzna amplifikacja docelowa poprzez uruchomienie płytki w maszynie do PCR zgodnie z programem przedwzmacniacza; krok 1: 50 °C przez 60 minut, krok 2: 95 °C przez 2 minuty, krok 3: 95 °C przez 15 s, krok 4: 60 °C przez 4 minuty, powtórz kroki 3–4 24 razy i na koniec krok 5: 8 °C na zawsze.
6. Po zakończeniu PCR należy przechowywać płytkę w temperaturze 8 °C do krótkotrwałego przechowywania i -20 °C do długotrwałego przechowywania.
   UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania. Wzmocniony materiał może być przechowywany w temperaturze 8 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

5. Przygotowanie płytek do próbek i testów do multipleksowej analizy ekspresji genów mikroprzepływowych

1. Przygotować płytkę do ładowania testu, pipetując 3 μl odczynnika do ładowania testu do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Dodać 3 μl każdego startera do poszczególnych studzienek na płytce obciążeniowej testu.
2. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płytek.
3. Przygotować płytkę rozcieńczającą, pipetując 8 μl wody wolnej od nukleaz do wszystkich studzienek płytki 96-dołkowej. Dodać 2 μl amplifikowanej próbki do płytki rozcieńczającej, uzyskując końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:5.
4. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną, mieszaj przez płytkę wirową przez 10 s, a na koniec odwiruj, aby zebrać płyn na dnie płytek.
5. Przygotować mieszaninę do ładowania próbki, ostrożnie mieszając 352 μl mieszanki wzorcowej z 35,2 μl odczynnika do ładowania próbki. Przygotować płytkę do ładowania próbki, dodając 3,3 μl mieszanki ładującej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej.
6. Dodać 2,7 μl z rozcieńczonej próbki do każdego dołka płytki do ładowania próbki.
7. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płytek.

6. Ładowanie chipa mikroprzepływowego

1. Wyjmij nowy chip mikroprzepływowy 96 x 96. Przygotuj wloty, nakłuwając je strzykawką z nakrętką, aby upewnić się, że można je przesunąć.
2. Usunąć pęcherzyki ze strzykawek. Dodaj pełną objętość strzykawek do każdego zaworu, przechylając chip o 45 stopni i dociskając zawór. Podłącz chip do kontrolera IFC.
3. Załaduj każdy wlot testu 4,25 μl z każdego dołka na płytce do ładowania testu. Unikaj bąbelków. Jeśli w studzience pojawią się bąbelki, usuń je końcówką pipety.
4. Kontynuuj ładowanie każdego wlotu próbki 4,25 μl z każdego dołka na płycie do ładowania próbki, unikaj pęcherzyków, a jeśli pojawią się pęcherzyki, usuń je końcówką pipety.
5. Załaduj chip za pomocą kontrolera IFC.
6. Sprawdź, czy chip wygląda równo i czy wszystkie komory zostały załadowane. Usuń kurz z powierzchni wióra, dotykając go taśmą. Uruchom chip na multipleksowej platformie mikroprzepływowej ekspresji genów.

7. Uruchamianie chipa na multipleksowej platformie mikroprzepływowej ekspresji genów

1. Po załadowaniu chipa do multipleksowej platformy mikroprzepływowej ekspresji genów, nazwij próbkę.
2. Ustaw ROX jako pasywny barwnik. Ustaw pojedynczą sondę i FAM-MGB jako fluorescencję. Użyj standardu 96 x 96 v2 jako protokołu. Rozpocznij bieg.
3. Usuń chip po zakończeniu uruchamiania.

8. Wstępna analiza przebiegu chipów

1. Załaduj dane do oprogramowania do analizy PCR w czasie rzeczywistym.
2. Załaduj nazwy genów i nazwy komórek, wklejając układy komórek i genów z pliku rozdzielanego tabulatorami.
3. Otwórz widok obrazu i wybierz ROX jako barwnik. Sprawdź, czy wszystkie studzienki mają pasywny barwnik ROX.
4. Sprawdź, czy wszystkie wykresy wzmocnienia wyglądają dobrze, z gładką krzywą wzmocnienia bez skoków (podobnie jak w Rysunek 3E).
5. Upewnij się, że wszystkie pojedyncze komórki mają ekspresję dołączonego kontrolnego RNA, aby upewnić się, że wszystkie zostały prawidłowo załadowane.
6. Upewnij się, że wszystkie komórki mają ekspresję genów porządkowych, a tym samym zostały prawidłowo posortowane.
7. Upewnij się, że kontrole liniowości 10 i 20 komórek mają około 1 CT różnicy, aby zweryfikować wzmocnienie liniowe.
8. Sprawdź, czy w próbkach kontrolnych noRT występuje ekspresja. Jeśli ekspresja zostanie wykryta w noRT, rozważ zmianę sond na sondy, które nie wykrywają genomowego DNA w kolejnych przebiegach.
9. Eksportuj dane w plikach csv do dalszej analizy.

9. Analiza pojedynczej komórki za pomocą SCExV

UWAGA: Dostępny jest film wprowadzający²⁰ przedstawiający narzędzie. W tym miejscu przedstawiono krótką rekomendację, w jaki sposób przeprowadzić analizę z wykorzystaniem kontrolek wprowadzonych w protokole.

1. Połącz się z witryną SCexV²⁰.
2. Prześlij wyeksportowane pliki CSV.
3. Wybierz wzbogacone kontrolne RNA jako kontrolę pozytywną. Usuń każdą komórkę, która ma kontrolną CT RNA powyżej 25. Znormalizuj dane do mediany ekspresji kontrolnego RNA.
4. Kliknij "Gotowe tutaj -> Analizuj". Usuń kontrolki noRT, notemplate, 10 i 20 komórek w opcji wykluczania komórki.
5. Grupowanie komórek z wybranym podejściem do grupowania z oczekiwaną liczbą klastrów. Eksport przeanalizowanych wartości.

10. Analiza sortowania indeksów

1. Otwórz oprogramowanie do analizy FACS i załaduj zindeksowane próbki.
2. Otwórz edytor skryptów i uruchom skrypt dostępny w Quinn J. i wsp.²¹
3. Teraz, gdy oprogramowanie do analizy FACS powinno utworzyć bramkę dla każdej z pojedynczych komórek, otwórz edytor układu i pokoloruj komórki zgodnie z grupowaniem z SCexV (dostępnym w pliku o nazwie "Sample_complete_Data.xls").

Wyniki

Opisany protokół jest szybki, łatwy do wykonania i wysoce niezawodny. Przegląd konfiguracji eksperymentalnej jest przedstawiony w Rysunek 1. Cały protokół, od sortowania pojedynczych komórek, po specyficzną amplifikację docelową, pomiary ekspresji genów i wstępną analizę, można przeprowadzić w ciągu trzech dni. Przykład analizowanych wyników w postaci mapy cieplnej, która przedstawia wstępne analizowane dane z analizy ekspresji genów jednokomórkowych przy uży...

Dyskusja

W ostatnich latach analiza ekspresji genów w pojedynczej komórce stała się cennym uzupełnieniem w celu określenia heterogeniczności różnych populacji komórek²³. Pojawienie się technologii sekwencjonowania RNA teoretycznie daje możliwość pomiaru całego transkryptomu komórki, jednak metody te są skomplikowane ze względu na różnice w głębokości sekwencjonowania między komórkami i zaniki. Jednokomórkowy qPCR oferuje czułą i solidną analizę ekspresji setek krytycznych genów, w której wszystkie komórki ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	Klon: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	Klon: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	Klon: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	Klon: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	Klon: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	Klon: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	Klon: 6H6
CD235A PECY5	Pharma	559944	Klon GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	Klon: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	Klon: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	Klon: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	Klon: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	Klon: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery U	VWR	10861-564
SFEM	Technologie komórek macierzystych	9650
Penicylina streptomycyna	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Probówka 15 ml	Sarstedt	62.554.502
Probówka Eppendorph	Sarstedt	72.690.001
Koraliki CST	BD
Koraliki Accudrop	BD	345249	6 i mikro; M cząstki
Folia samoprzylepna Clear	Thermo scientific	AB-1170
Folia samoprzylepna Folia	Thermo scientific	AB-0626
96-dołkowa płytka do PCR	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1,5 ml probówka	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific	85124
10 mM dNTP	Takara	4030
0,1 M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019
Jednoetapowy zestaw qRT-PCR CellsDirect	Invitrogen	11753-100
Woda bez neukleazy	Invitrogen	11753-100	z zestawu CellsDirect
2x Reaction Mix	Invitrogen	11753-100	z zestawu CellsDirect
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	Invitrogen	11753-100	z zestawu CellsDirect
Platinum  Taq  Polimeraza DNA	Invitrogen	10966026
Zestaw kontrolny komórek TaqMan do tomografii komputerowej	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control	Invitrogen 4386995		z zestawu do kontroli komórek TaqMan do CT
20x kontrola Xeno RNA Test ekspresji genów Taqman	Invitrogen	4386995	z zestawu kontrolnego komórek TaqMan
do CT 96.96 Zestaw do pobierania próbek/ładowania— 10 IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2x Test Ładowanie odczynnika	Fluidigm		z 96.96 Zestaw do ładowania próbki/ładowania
20x	Płyn		od 96.96 Zestaw
Płyn w przewodzie kontrolnym	Fluidigm		z zestawu 96.96 do próbek/ładowania
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	FlowJo
V10		TreeStar TreeStar
Analiza PCR w czasie rzeczywistym	Fluidigm Fluidigm
CD179a.VPREB1	Thermofisher	Hs00356766_g1
naukowy ACE	Thermofisher Hs00174179_m1
AHR	Thermofisher Hs00169233_m1
BCR_ABL.52	Thermofisher	Hs03043652_ft
BCR_ABL41	Thermofisher Hs03024541_ft
naukowy BMI1	Thermofisher	Hs00995536_m1
naukowy CCNA2	Thermofisher	Hs00996788_m1
naukowy CCNB1	Thermofisher	Hs01030099_m1
CCNB2	Thermofisher	naukowy Hs01084593_g1
CCNC	Thermofisher	Hs01029304_m1
naukowy CCNE1	Thermofisher Hs01026535_g1
naukowy CCNF	Thermofisher naukowy	Hs00171049_m1
CCR9	Thermofisher naukowy	Hs01890924_s1
CD10. MME	Thermofisher	Hs00153510_m1
naukowy CD11a	Thermofisher	Hs00158218_m1
naukowy CD11c.ITAX	Thermofisher	Hs00174217_m1
naukowy CD123. IL3RA	Thermofisher Hs00608141_m1
naukowy CD133. PROM1	Thermofisher naukowy	Hs01009250_m1
CD151	Naukowy Thermofisher	Hs00911635_g1
CD220. INSR	Thermofisher Hs00961554_m1
naukowy CD24. HSA	Thermofisher Hs03044178_g1
naukowy NCOR1	Thermofisher Hs01094540_m1
naukowy CD26. DPP4	Thermofisher	Hs00175210_m1
naukowy CD274	Thermofisher Hs01125301_m1
naukowy CD276	Thermofisher Hs00987207_m1
naukowy CD32. FCGR2B	Thermofisher Hs01634996_s1
naukowy CD33	Thermofisher naukowy	Hs01076281_m1
CD34	Thermofisher naukowy	Hs00990732_m1
CD344. FZD4	Thermofisher	Hs00201853_m1
naukowy CD352. SLAMF6	Thermofisher	Hs01559920_m1
naukowy CD38	Thermofisher Hs01120071_m1
naukowy CD4	Thermofisher	Hs01058407_m1
naukowy CD41. ITGA2B	Thermofisher Hs01116228_m1
naukowy CD49f.ITGA6	Thermofisher Hs01041011_m1
naukowy CD56. NCAM1	Thermofisher Hs00941830_m1
naukowy CD9	Thermofisher	Hs00233521_m1
naukowy CD97	Thermofisher	Hs00173542_m1
naukowy CD99	Thermofisher	Hs00908458_m1
naukowy CDK6	Thermofisher	Hs01026371_m1
naukowy CDKN1A	Thermofisher	Hs00355782_m1
naukowy CDKN1B	Thermofisher	Hs01597588_m1
naukowy CDKN1C	Thermofisher	Hs00175938_m1
naukowy CEBPa	Thermofisher	Hs00269972_s1
naukowy CSF1r	Thermofisher Hs00911250_m1
naukowy CSF2RA	Thermofisher naukowy
CSF3RA	Thermofisher Hs01114427_m1
naukowy E2A. TCF3	Thermofisher Hs00413032_m1
naukowy EBF1	Thermofisher	Hs01092694_m1
naukowy ENG	Thermofisher	Hs00923996_m1
naukowy EPOR	Thermofisher	naukowy Hs00959427_m1
ERG	Thermofisher naukowy	Hs01554629_m1
FLI1	Thermofisher Hs00956711_m1
naukowy FLT3	Thermofisher Hs00174690_m1
naukowy FOXO1	Thermofisher	Hs01054576_m1
naukowy GAPDH	Thermofisher naukowy	Hs02758991_g1
GATA1	Thermofisher Hs00231112_m1
naukowy GATA2	Thermofisher naukowy
GATA3	Thermofisher	Hs00231122_m1
naukowy GFI1	Thermofisher	Hs00382207_m1
naukowy HES1	Naukowy Thermofisher	Hs01118947_g1
HLF	Thermofisher	naukowy Hs00171406_m1
HMGA2	Hs00171569_m1		Thermofisher
HOXA5	Thermofisher Hs00430330_m1
naukowy HOXB4	Thermofisher	Hs00256884_m1
naukowy ID2	Hs04187239_m1		naukowy Thermofisher
IGF2BP1	Hs00198023_m1		naukowy Thermofisher
IGF2BP2	Thermofisher	Hs01118009_m1
naukowy IKZF1	Thermofisher naukowy	Hs00172991_m1
IL1RAP	Thermofisher naukowy	Hs00895050_m1
IL2RG	Thermofisher	naukowy Hs00953624_m1
IRF8	Thermofisher naukowy	Hs00175238_m1
ITGB7	Thermofisher Hs01565750_m1
naukowy ZESTAW	Thermofisher naukowy
Lin28B	Thermofisher Hs01013729_m1
naukowy LMO2	Naukowy Thermofisher	Hs00153473_m1
LYL1	Naukowy Thermofisher	Hs01089802_g1
Meis1	Naukowy Thermofisher	Hs01017441_m1
mKi67	Hs01032443_m1Naukowy Thermofisher
MPL	Thermofisher	Hs00180489_m1
naukowy MPO	Thermofisher	Hs00924296_m1
naukowy NFIB	Thermofisher	Hs01029175_m1
naukowy Notch1	Thermofisher naukowy	Hs01062011_m1
naukowy Pten ThermofisherRAG2	Thermofisher Hs01851142_s1
naukowy RPS18	Thermofisher naukowy	Hs01375212_g1
RUNX1	Thermofisher naukowy	Hs00231079_m1
Shisa2	Thermofisher naukowy	Hs01590823_m1
Spi1	Thermofisher naukowy	Hs02786711_m1
Sterylny.IgH	Thermofisher naukowy	Hs00378435_m1
TAL1	Thermofisher naukowy	Hs01097987_m1
THY1	Thermofisher naukowy	Hs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2	Thermofisher naukowy	Hs00958618_m1
VWF	Thermofisher Hs00169795_m1