Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzki genom koduje cztery paralogi bestrophin, a mianowicie BEST1, BEST2, BEST3 i BEST4. BEST1, kodowany przez gen BEST1, jest kanałem Cl- aktywowanym przez Ca2+ (CaCC), ulegającym ekspresji głównie w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE). Fizjologiczne i patologiczne znaczenie BEST1 podkreśla fakt, że ponad 200 odrębnych mutacji w genie BEST1 zostało genetycznie powiązanych ze spektrum co najmniej pięciu zaburzeń zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak dystrofia plamki żółtej (choroba Best). Dlatego zrozumienie biofizyki kanałów bestrofiny na poziomie pojedynczej cząsteczki ma ogromne znaczenie. Jednak uzyskanie oczyszczonych kanałów jonowych ssaków jest często trudnym zadaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji białek bestrofiny ssaków za pomocą systemu transferu genów bakulowirusa BacMam i ich oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Oczyszczone białka mogą zostać wykorzystane w późniejszych analizach funkcjonalnych i strukturalnych, takich jak zapis elektrofizjologiczny w dwuwarstwach lipidowych i krystalografia. Co ważne, rurociąg ten może być przystosowany do badania funkcji i struktur innych kanałów jonowych.
Wprowadzenie
Bestrofiny to rodzina kanałów jonowych zachowanych przez różne gatunki, od bakterii po ludzi1. U ludzi gen BEST1, zlokalizowany na chromosomie 11q12.3, koduje białko błonowe Bestrophin-1 (BEST1), które ulega ekspresji głównie w błonie podstawno-bocznej komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oczu2,3,4. Składa się z 585 aminokwasów, z których pierwsze ~350 są wysoce konserwatywne wśród gatunków i zawierają region transbłonowy, BEST1 działa jako CaCC u ludzi1,5,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wytwarzanie baculowirusów ekspresyjnych BacMam
- Wprowadzić sekwencję kodującą wybranego białka bestrofiny ssaków do wektora pEG BacMam18 zawierającego sekwencję rozpoznawania proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV), a następnie GFP-10x His-tag na C-końcu białka.
- Przeprowadzić przejściową transfekcję plazmidu ekspresyjnego do adherentnych komórek HEK29319,20,21,2,23. Sprawdzić ekspresję białka fuzyjnego z GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 10X....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Intensywność fluorescencji w przejściowo przetransfekowanych adhezyjnych komórkach HEK293 (Rysunek 1A) jest dobrym wskaźnikiem przewidywanego poziomu ekspresji białka w komórkach HEK293-F w zawiesinie (Rysunek 1B). Jeśli białko docelowe nie wykazuje dobrej ekspresji lub jest błędnie zlokalizowane w komórkach HEK293 po transfekcji przejściowej, zaleca się rozważenie modyfikacji konstruktu ekspresyjnego (np. zmianę pozycji.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje użyteczny proces ekspresji i oczyszczania kanałów jonowych bestrofiny ssaków, który ma być wykorzystany w przyszłych analizach in vitro . Podczas gdy urządzenie FPLC jest wymagane do chromatografii wykluczającej rozmiar, pompa strzykawkowa jest wystarczająca do wszystkich etapów chromatografii powinowactwa, w tym wiązania, mycia i elucji. W przypadku używania pompy strzykawkowej do przepychania roztworów (w strzykawce) przez kolumnę, konieczne jest podłożenie strony sprężyny, aby uniknąć wpy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany z grantów NIH EY025290, GM127652 i University of Rochester na start-up.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Naukowy | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazol | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Naukowy | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatyna A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Fluorek fenylometylosulfonylu | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM zol | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle średni | Spektrofotometr ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Homogenizator wysokociśnieniowy | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| Kolumna HisTrap | GE | 17-5248-01 | |
| Kolumna Superdex-200 | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 Filtry odśrodkowe | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 Filtry odśrodkowe | Millipore | UFC810024 | |
| Optima XE-90 Beckman | Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Żel prefabrykowany Mini-PROTEAN | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Odczynnik do transfekcji PolyJet | Wektor SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam Otrzymany | z laboratorium Gouaux w Instytucie Vollum |
Bibliografia
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
