Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Bestrofiny to rodzina kanałów jonowych zachowanych przez różne gatunki, od bakterii po ludzi¹. U ludzi gen BEST1, zlokalizowany na chromosomie 11q12.3, koduje białko błonowe Bestrophin-1 (BEST1), które ulega ekspresji głównie w błonie podstawno-bocznej komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oczu^2,3,4. Składa się z 585 aminokwasów, z których pierwsze ~350 są wysoce konserwatywne wśród gatunków i zawierają region transbłonowy, BEST1 działa jako CaCC u ludzi^1,5,6. Co więcej, homologi BEST1 u kurcząt i Klebsiella pneumoniae funkcjonują jako homopentamers^7,8, co sugeruje wysoki poziom ochrony w trakcie ewolucji.

U ludzi ponad 200 mutacji w genie BEST1 zostało klinicznie powiązanych z grupą chorób zwyrodnieniowych siatkówki zwanych bestrophinopatiami^1,9. Zgłoszono pięć specyficznych bestrofinopatii, w tym chorobę Best, dystrofię szklistkowatą o początku w wieku dorosłym, autosomalną dominującą witreoretinochoroidopatię, autosomalną recesywną bestrofinopatię i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i barwnik3^,4^{,10,11,12,13,14}. Choroby te, które prowadzą do pogorszenia wzroku, a nawet ślepoty, są obecnie nieuleczalne. Aby opracować terapie terapeutyczne i potencjalnie spersonalizowaną medycynę, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób te powodujące chorobę mutacje BEST1 wpływają na funkcję i strukturę kanału BEST1¹⁵. W tym celu badacze muszą uzyskać oczyszczone kanały bestrofiny (typu dzikiego i/lub zmutowanego) i przeprowadzić analizy in vitro^5,8.

Pierwszym kluczowym krokiem jest ekspresja kanałów bestrofiny od wyższych gatunków w komórkach ssaków. Ponieważ transdukcja wirusa bakulowirusa komórek HEK293-F (system BacMam) jest potężną metodą heterologicznej ekspresji białek błonowych^16,17, protokół ten wykorzystuje zoptymalizowany wektor BacMam (pEG BacMam) do solidnej ekspresji docelowego białka¹⁸, który w tym przypadku jest homologiem bestrofiny ssaków. Wektor ten został wykorzystany do ekspresji różnych białek błonowych, w tym receptorów sprzężonych z białkiem G, receptorów jądrowych i innych kanałów jonowych¹⁸. Istnieją również dowody na to, że wytworzone białka nadają się do krystalografii¹⁸. Przy wysokim poziomie ekspresji w komórkach HEK293-F białka można następnie oczyścić za pomocą chromatografii; W szczególności w przypadku bestrofinów można stosować zarówno chromatografię powinowactwa, jak i chromatografię wykluczającą wielkość.

Gdy ten protokół zostanie dopracowany dla kanału bestrofiny, oczyszczone białko może być następnie analizowane pod kątem jego funkcji i struktury odpowiednio za pomocą płaskiej dwuwarstwy lipidowej i krystalografii rentgenowskiej5^,8. Podsumowując, techniki te zapewniają potężny potok do funkcjonalnych i strukturalnych badań bestrofiny i innych kanałów jonowych.

1. Produkcja Bakulowirusów ekspresji BacMam

1. Wstaw sekwencję kodującą pożądanego białka bestrofiny ssaków do pEG BacMam vector¹⁸ z sekwencją rozpoznającą proteazę wirusa wytrawiania tytoniu (TEV), a następnie znacznikiem GFP-10x His na C-końcu białka.
2. Przejściowo transfekuj plazmid ekspresji do adhezyjnych komórek HEK293^{19,20,21,22,23}. Sprawdź ekspresję białka fuzyjnego GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym o powiększeniu 10X lub 20X, źródle wzbudzenia 488 nm i filtrze emisyjnym 510 nm (Rysunek 1A).
   Uwaga: Transfekcja na bazie polimerów jest rutynowo wykonywana z 1 μg plazmidowego DNA na 35-milimetrowej szalce komórek HEK293.
3. Wyprodukuj bakulowirusy w komórkach owadów Sf9 zgodnie z wcześniejszym opisem^16,17.
   Uwaga: Wirus pasażu 3 (P3), który będzie wykorzystywany do infekowania komórek HEK293-F w celu produkcji białka, może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
4. Określ miano (jednostki zakaźne) wirusa P3 za pomocą testu tworzenia płytki nazębnej^16,17.
   Uwaga: Ponieważ białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczone GFP, szybszą metodą sprawdzania jednostek zakaźnych jest zakażenie komórek Sf9 seryjnymi rozcieńczeniami wirusa i zliczenie liczby komórek fluorescencyjnych po 48 godzinach.

2. Ekspresja białka

1. Utrzymać komórki HEK293-F w hodowli zawiesinowej z pożywką ekspresyjną HEK293-F w inkubatorze z wilgotnością 37 °C z 8% CO₂ . Użyj jednorazowych kolb hodowlanych, które są 2-2,5 razy większe niż objętość kultury i obracaj kulturę na platformie orbitalnej z prędkością 135 obr./min.
   Uwaga: Zaleca się infekowanie komórek, gdy znajdują się one między przejściami 5 i 30 oraz wykonywanie tych czynności pod kapturem hodowli komórkowej.
2. Na 24 godziny przed infekcją wirusową dodać 15 μl błękitu trypanowego do 15 μl porcji hodowli komórkowej i sprawdzić gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Rozcieńczyć komórki do 0,6 x 10⁶ komórek/ml w kolbach po 2 x 2 l każda, z 500 ml pożywki podgrzanej w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Martwe komórki są zabarwione na niebiesko przez błękit trypanowy. Pożądana żywotność komórek wynosi >95%.
3. W dniu zakażenia należy sprawdzić gęstość i żywotność komórek (krok 2.2).
   Uwaga: Wysoka żywotność komórek wynosząca >95% jest niezbędna do skutecznej infekcji i ekspresji białek. Oczekiwana gęstość komórek wynosi ~1,0 x 10⁶ komórek/ml (wyhodowanych przez noc z 2 x 500 ml hodowli komórkowej 0,6 x 10⁶ komórek/ml). Oczekiwana całkowita liczba komórek to ~1,0 x 10⁹.
4. Dodaj bakulowirusy P3 do komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5. Aby określić ilość wirusa do zaszczepienia, użyj następującego równania:
   
5. Potrząsaj komórkami na platformie orbitalnej z prędkością 135 obr./min w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 8% CO₂ przez 24 godziny.
6. Dodać 10 mM maślanu sodu do hodowli komórkowej i kontynuować inkubację przez 48 godzin
   Uwaga: W przypadku niektórych białek obniżenie temperatury hodowli komórkowej do 30 °C po dodaniu maślanu sodu może poprawić ekspresję i stabilność.
7. Pod mikroskopem fluorescencyjnym o powiększeniu 10X lub 20X, źródłem wzbudzenia 488 nm i filtrem emisyjnym 510 nm sprawdź procent i jasność zielonych komórek, które bezpośrednio reprezentują wydajność białka (bestrofina-GFP-10xHis) (Rysunek 1B).
   Uwaga: Procent zielonych komórek oblicza się według wzoru: 100 x (Zielone komórki/Łączna liczba komórek). O dobrym poziomie ekspresji białek świadczy silna zielona fluorescencja pod mikroskopem.
8. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowej objętości ~80 ml. Zawiesinę komórek podzielić na 2 stożkowe probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie białka

1. Inkubować stożkowe probówki zawierające osady komórkowe w mieszającej łaźni wodnej w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, aby się rozmroziły. Ponownie zawiesić komórki w 2x (w/v) objętości buforu A (Tabela 1) (np. 10 g osadów komórkowych w 20 ml buforu) uzupełnionego inhibitorami proteinaz (aprotyniną, leupeptyną, pepstatyną A i fluorkiem fenylometylosulfonylu) w temperaturze 0,1-1,0 mM. Intensywnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
2. Lizować komórki za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego. Przepuść zawiesinę komórek przez homogenizator przy ciśnieniu 7-10 MPa, w sumie 3-4 razy, aby uzyskać pełną homogenizację. Trzymaj lizat komórkowy na lodzie przez 2-3 minuty między rundami.
3. Dodać detergent [np. 2% w/v n-dodecylo-β-D-d-maltopiranozydu (DDM)] do lizatu komórkowego. Inkubować z mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C w celu ekstrakcji białek błonowych.
   Uwaga: Rodzaj detergentu musi być zoptymalizowany dla każdego docelowego białka^18,24.
4. Wirować przy 150 000 x g w ultrawirówce w temperaturze 4 °C przez 1 h.
   Uwaga: Wszystkie poniższe czynności są wykonywane w temperaturze 4 °C.
5. Zebrać klarowny lizat komórkowy i przepuścić go przez 5 ml kolumny powinowactwa His Trap Ni²⁺-NTA, wstępnie zrównoważonej buforem A (Tabela 1).
   Uwaga: Po odwirowaniu klarowny lizat komórkowy zostanie umieszczony między osadkiem na dole a mętną warstwą na górze. Użyj pipety transferowej o pojemności 10 ml, aby ostrożnie zebrać klarowny lizat, a następnie zmień na pipetę o pojemności 1 ml na ostatnie kilka mililitrów lizatu. Unikaj osadu, który może zatkać kolumnę Ni²⁺; Jednak niewielka ilość wierzchniej warstwy jest drobna lub można ją odfiltrować za pomocą filtra 1,5 μm.
6. Przemyć kolumnę 25 ml buforu B, a następnie 40 ml buforu C (odpowiednio tabele 2 i 3).
   Uwaga: Jest to dobre miejsce na przerwę, ponieważ całkowite oczyszczenie może zająć do 12 godzin, a białko może pozostać stabilne, gdy jest podłączone do kolumny przez noc.
7. Podłączyć kolumnę do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i wymyć białko z kolumny za pomocą 13 ml buforu D (Tabela 3) z frakcjonowaniem. Zebrać frakcje wzbogacone w białko zgodnie z odczytem absorbancji UV.
   Uwaga: Warunki FPLC są następujące: wielkość frakcji 1,0 ml, alarm ciśnienia przed kolumną ustawiony na 0,3 MPa i natężenie przepływu 0,5 ml/min.
8. Zmierzyć stężenie eluowanego produktu białkowego na spektrofotometrze mikroobjętościowym. Odczytać absorbancję przy 280 nm.
9. (Opcjonalnie) Aby usunąć znacznik GFP-10xHis, dodaj proteazę TEV w stosunku masowym 1:1 i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 min.
   Uwaga: Znacznik może, ale nie musi, wpływać na funkcję lub strukturę oczyszczonego kanału. Obliczyć ilość TEV na podstawie objętości i stężenia zebranego białka z kroków 3.7-3.8. Na przykład, jeśli 10 ml produktu elucji zostanie pobrane i zmierzone przy 0,1 mg/ml, całkowita masa białka wynosi 10 x 0,1 = 1 mg, a 1 mg TEV zostanie użyte do trawienia.
10. Zagęścić białko za pomocą 15 ml odśrodkowego (50 lub 100 kDa) zespołu filtrującego, wirując z prędkością 4 000 x g w 4 °C do końcowej objętości 400-500 μl (dla pętli ładowania próbki 2 ml na FPLC).
    Uwaga: Czas wirowania w celu zagęszczenia różni się w zależności od stężenia i wielkości białka. Aby uniknąć nadmiernej koncentracji, która może spowodować wytrącanie się białka, najpierw wiruj przez 10 minut, a następnie obserwuj pozostałą objętość i oszacuj czas kolejnego wirowania (np. 2-5 minut) i tak dalej, aby uzyskać ostateczną objętość. Pipetować między wirowaniami, aby rozproszyć białko, które jest przyciągane na dno filtra.
11. Przenieść skoncentrowane białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i usunąć wszelkie osady lub pęcherzyki ze skoncentrowanego produktu. Wirować w temperaturze >12 000 x g przez 5-10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
12. Załadować produkt końcowy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły z okrągłą końcówką do systemu FPLC do chromatografii wykluczania wielkości z kolumną wykluczającą wielkość wstępnie zrównoważoną buforem E (Tabela 5).
    Uwaga: Warunki FPLC są następujące: wielkość frakcji 0,5 ml, alarm ciśnienia przed kolumną ustawiony na 2,50 MPa, objętość przepływu ustawiona na 30 ml buforu E (tabela 5) i natężenie przepływu ustawione na 0,5 ml/min.
13. Zauważ, że dobrze zachowujące się białka działają jako pojedynczy pik (Rysunek 2A) i zbierają frakcję białkową odpowiadającą temu pikowi (Rysunek 2A).
14. Zagęścić białko za pomocą filtra odśrodkowego o pojemności 4 ml lub 0,5 ml (o tej samej wartości granicznej masy cząsteczkowej co w kroku 3.10) i odwirować przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C do końcowego stężenia 5-10 μg/μl. Użyć spektrofotometru, aby sprawdzić stężenie produktu końcowego (etap 3.8).
    Uwaga: Czas wirowania jest różny, ponieważ objętość produktu końcowego może się różnić w zależności od prób oczyszczania. Zwykle wirowanie trwa 10-20 minut. Zaleca się pipetowanie między wirowaniami w celu rozproszenia białka, które jest ściągane na dno filtra.
15. Przenieś skoncentrowane białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Usunąć osad przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g > przez 5-10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj 10 μl porcji do przechowywania w temperaturze -80 °C i zachowaj jedną małą porcję o pojemności 2-5 μl, aby działać na żelu SDS-PAGE o nachyleniu 4-15% przy 9 V/cm (Rysunek 2B).
16. Potwierdź tożsamość oczyszczonego białka za pomocą spektrometrii mas⁸.
    Uwaga: Analizę in vitro funkcji i struktury oczyszczonego białka można przeprowadzić odpowiednio za pomocą planarnej dwuwarstwy lipidowej i krystalografii rentgenowskiej^5,8.

Intensywność fluorescencji w transfekowanych transfekowanych komórkach adhezyjnych HEK293 (Rysunek 1A) jest dobrym wskaźnikiem przewidywanego poziomu ekspresji białka w zawiesinie komórek HEK293-F (Rysunek 1B). Jeśli białko docelowe nie ulega dobrej ekspresji lub jest nieprawidłowo zlokalizowane w komórkach HEK293 po transfekcji przejściowej, zaleca się rozważenie modyfikacji konstruktu ekspresji (np. zmiana pozycji znacznika GFP lub dokonanie mutacji/obcięć białka docelowego). Małe kultury zawiesinowe HEK293-F (np. kultury o pojemności 25 ml) są stosowane w celu optymalizacji warunków ekspresji białek, wśród których MOI infekcji i temperatura hodowli były najważniejsze we wcześniejszych doświadczeniach.

Udane oczyszczanie jest sygnalizowane przez pojedynczy główny pik przy oczekiwanej objętości elucji w chromatografii wykluczającej wielkość (Rysunek 2A) i pojedynczy dominujący prążek na zdenaturowanym żelu SDS-PAGE (Rysunek 2B). Jeśli w chromatografii wykluczania wielkości pojawia się wiele pików, ważne jest, aby zebrać każdy pik i uruchomić natywny żel w celu określenia, który pik zawiera funkcjonalne pentamery kanałowe. Należy zauważyć, że pomiędzy dwoma konstruktami białkowymi poziom ekspresji, wskazywany przez intensywność fluorescencji w czasie zbioru, niekoniecznie koreluje z końcowym plonem, ponieważ każdy konstrukt białkowy zachowuje się inaczej podczas oczyszczania. Aby uzyskać dobrze zachowujące się białko bestrofiny, 200-500 μg końcowego oczyszczonego produktu można zwykle uzyskać z 1 l komórek zawiesinowych HEK293-F.

Rycina 1: Ekspresja białka bestrofiny ssaków. Obrazy mikroskopowe bestrofiny ssaków znakowanej GFP ulegającej ekspresji w (A) adhezyjnych komórkach HEK293 przez transfekcję plazmidu oraz w (B) zawiesinie komórek HEK293F przez zakażenie bakulowirusem. Po lewej = zielona fluorescencja; prawy = jasne pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Oczyszczanie białka bestrofiny ssaków. (A) Oczyszczone powinowactwem białka znakowane GFP umieszczono na kolumnie filtracyjnej żelu wykluczającego wielkość jako jeden główny pik. Zbierano ułamki między liniami przerywanymi. (B) Końcowy produkt białkowy prowadzony na żelu SDS-PAGE z drabinkami (lewa kolumna). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Bufor do oczyszczania białek A (bufor do ponownego zawieszania)

Tabela 2: Bufor do oczyszczania białka B (bufor do pierwszego płukania)

Tabela 3: Bufor do oczyszczania białka C (bufor do płukania po raz drugi)

Tabela 4: Bufor do oczyszczania białek D (bufor elucyjny)

Tabela 5: Bufor do oczyszczania białek E (Żelowy bufor filtracyjny)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.