Artykuł metodologiczny

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

DOI:

10.3791/57843

⸱

7 września 2018

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała, określane również jako immunoglobuliny (Ig), wydzielane przez zróżnicowane limfocyty B, plazmablasty/komórki plazmatyczne, w odporności humoralnej zapewniają potężną obronę przed atakującymi patogenami za pomocą różnych mechanizmów. Jednym z głównych celów szczepień jest indukcja ochronnych przeciwciał specyficznych dla antygenu, aby zapobiec zagrażającym życiu zakażeniom. Zarówno antygeny grasicze zależne (TD), jak i niezależne od grasicy (TI) mogą wywoływać silne odpowiedzi IgM specyficzne dla antygenu, a także mogą indukować produkcję przeciwciał z przełączaniem izotypów (IgG, IgA i IgE), a także wytwarzanie komórek B pamięci za pomocą komórek prezentujących antygen (APC). W tym miejscu opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi izotypów TD i TI Ig u myszy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). W tym protokole odpowiedzi TD i TI Ig są wywoływane u myszy przez immunizację dootrzewnową (ip) za pomocą sprzężonych haptenów antygenów modelowych TNP-KLH (w ałun) i polisacharydów TNP (w PBS). W celu wywołania odpowiedzi pamięciowej TD, szczepienie przypominające TNP-KLH w ałun podaje się po 3 tygodniach od pierwszego szczepienia tym samym antygenem/adiuwantem. Surowice myszy są zbierane w różnych punktach czasowych przed i po szczepieniu. Całkowite poziomy Ig w surowicy i przeciwciała specyficzne dla TNP są następnie oznaczane ilościowo za pomocą odpowiednio specyficznego dla izotypu Ig Sandwich i pośredniego testu ELISA. W celu prawidłowego ilościowego określenia stężenia w surowicy każdego izotypu Ig, próbki muszą być odpowiednio rozcieńczone, aby mieściły się w liniowym zakresie krzywych wzorcowych. Korzystając z tego protokołu, konsekwentnie uzyskiwaliśmy wiarygodne wyniki o wysokiej swoistości i czułości. W połączeniu z innymi uzupełniającymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, hodowla in vitro komórek B śledziony i barwienie immunohistochemiczne (IHC), protokół ten pozwoli naukowcom uzyskać kompleksowe zrozumienie odpowiedzi przeciwciał w danym środowisku eksperymentalnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B limfocyty są głównym czynnikiem odporności humoralnej i jedynym typem komórek u ssaków, które są zdolne do wytwarzania przeciwciał, określanych również jako immunoglobuliny (Ig)1,2. Przeciwciała wydzielane przez limfocyty B zapewniają potężną obronę przed atakującymi patogenami poprzez różne mechanizmy, w tym neutralizację, opsonizację i aktywację dopełniacza, co prowadzi do odporności ochronnej3. Wydzielanie przeciwciał przez limfocyty B osiąga się dopiero po pełnej aktywacji określonych limfocytów B, co zwykle wymaga dwóch odrębnych sygnałów3. Sygnał 1 jest przekazywany przez bezpośrednie wiązanie antygenu (Ag) z receptorem limfocytów B (BCR) wyrażającym się na powierzchni określonych naiwnych limfocytów B3. W zależności od źródła Sygnału 2, aktywację limfocytów B można podzielić na zależną od grasicy (TD) lub niezależną od grasicy (TI)3,4. W odpowiedzi antygenu TD sygnał 2 jest dostarczany przez aktywowane pokrewne komórki pomocnicze T CD4 (TH), które wyrażają CD154, ligand dla receptora kostymulującego CD40 wyrażonego na komórkach B1,2,3. W odpowiedzi antygenu TI sygnał 2 pochodzi albo z zaangażowania receptorów Toll-podobnych (TLR w przypadku typu 1 TI Ag), albo z rozległego sieciowania BCR (w przypadku typu 2 TI Ag) na limfocytach B3,4. Antygeny TI typu 1 (TI-1) to mikrobiologiczne ligandy TLR, w tym lipopolisacharydy bakteryjne (LPS), wirusowe RNA i mikrobiologiczne DNA CpG4,5. Antygeny typu 2 TI (TI-2) mają wysoce powtarzalną strukturę i są w stanie dostarczać przedłużoną i trwałą sygnalizację do komórki B poprzez wielokrotne sieciowanie BCRs4,6. Typowymi przykładami antygenów TI-2 są polisacharydy pneumokokowe i polisacharydy sprzężone z haptenami6,7. Zarówno antygeny TD, jak i TI mogą wywoływać silne odpowiedzi IgM specyficzne dla antygenu, a także mogą indukować produkcję przeciwciał z przełączanymi izotypami (IgG, IgA i IgE) z pomocą komórek prezentujących antygen (APC), takich jak komórki dendrytyczne (DCs)1,2,3. Co więcej, zarówno antygeny TD, jak i TI są w stanie indukować odpowiedzi pamięciowe za pomocą APC, ale antygeny TD są bardziej wydajne w indukowaniu generowania komórek B pamięci3,8.

W tym protokole, odpowiedzi TD i TI Ig są wywoływane u myszy przez dootrzewnową (i.p.) immunizację za pomocą haptenów skoniugowanych z antygenami modelowymi 2,4,6-trinitrofenyl-keyhole limpet hemocyjanin (TNP-KLH) i TNP-polisacharyd (neutralny, silnie rozgałęziony i o dużej masie), odpowiednio9,10,11. Antygeny TD są zwykle używane z adiuwantem w celu zwiększenia produkcji przeciwciał12. W naszym protokole TNP-KLH jest wstrzykiwany z ałunem, powszechnie stosowanym adiuwantem w badaniach nad szczepieniami12. Inne przykłady adiuwantów, które można zastosować, obejmują kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda (CFA lub IFA), monofosforylowo-lipidowy A/trehalozy dicorynomykolan (adiuwant "Ribi") i oligodeoksynukleotydy CpG itp.13,14. Po immunizacji surowice myszy są zbierane w różnych punktach czasowych, a przeciwciała specyficzne dla TNP w surowicach są oznaczane ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego specyficznego dla izotypu Ig (ELISA)9,10,11.

ELISA to test oparty na płytce, który jest szeroko stosowany jako narzędzie diagnostyczne w medycynie, a także jako narzędzie analityczne w badaniach biomedycznych15,16. Służy do wykrywania i ilościowego oznaczania analitów, w tym przeciwciał, hormonów, cytokin, chemokin i różnych antygenów itp. Test ELISA można wykonać w kilku różnych formatach, w tym bezpośrednim, pośrednim, kanapkowym i konkurencyjnym ELISA15,16. Ogólnie rzecz biorąc, polega na unieruchomieniu antygenu na stałej powierzchni, zwykle 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej, która jest inkubowana z przeciwciałem pierwotnym. Po inkubacji niezwiązane przeciwciało jest wypłukiwane. W bezpośrednim teście ELISA pierwszorzędowe przeciwciało jest bezpośrednio sprzężone z enzymem (zazwyczaj peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), który może rozszczepić substrat chromogenny, aby uzyskać widoczną zmianę koloru wykrytą przez przyrząd do wykrywania sygnału, taki jak spektrofotometr15,16. W przeciwieństwie do tego, jeśli przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem jest używane do wiązania przeciwciała pierwszorzędowego, jest to uważane za pośrednie ELISA15,16. Bezpośredni test ELISA jest szybszy, podczas gdy pośredni test ELISA jest bardziej czuły15,16. W teście ELISA typu sandwich płytki są pokryte przeciwciałem "wychwytującym" używanym do unieruchomienia antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w próbkach, a następnie przechwycony antygen może być wykryty przez inne przeciwciało "wykrywające" w sposób bezpośredni lub pośredni15,16. Test ELISA typu sandwich zapewnia wysoką swoistość, ponieważ antygen jest wykrywany przez dwa różne przeciwciała antygenu. W konkurencyjnym teście ELISA ustala się konkurencję między antygenem próbki a antygenem związanym z płytką w celu wiązania się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie stężenie antygenu w próbce określa się ilościowo, mierząc redukcję sygnału z substratu15,16. Konkurencyjny test ELISA może być wykonywany przy użyciu wyżej wymienionego formatu bezpośredniego lub pośredniego i jest przydatny do wykrywania małych antygenów z tylko jednym epitopem15,16.

Alternatywne techniki pomiaru przeciwciał obejmują test radioimmunologiczny (RIA), test elektrochemiluminescencji (ECL) i test powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)17. RIA był pierwszym opracowanym testem immunologicznym, który mierzy obecność antygenu (lub przeciwciała) o wysokiej swoistości i czułości przy użyciu odczynników znakowanych radioizotopem18,19. Jednak ze względu na obawy związane z toksycznością radioaktywną, kosztami utylizacji, okresem trwałości i specjalnymi licencjami na pracę z materiałami promieniotwórczymi, ELISA jest lepszą i wygodniejszą techniką do powszechnych zastosowań20,21. ECL jest bardzo czułym testem, w którym reakcje chemiluminescencyjne są inicjowane przy użyciu energii elektrycznej w celu wygenerowania wysoce reaktywnych form ze stabilnych prekursorów na powierzchni elektrody i mogą być używane do pomiaru ilości analitów (takich jak antygeny lub przeciwciała)22. Jednak ECL wymaga specjalnego instrumentu i dlatego nie jest tak szeroko stosowany jak ELISA23. SPR to test bezpośredni, który może być używany do pomiaru wiązania ligandów (np. przeciwciał) z unieruchomionymi cząsteczkami (np. antygenami) na powierzchni chipa czujnika24. SPR wykrywa interakcje w czasie rzeczywistym bardzo dokładnie i nie wymaga użycia znakowanych odczynników, jak w przypadku testu ELISA. Jednak SPR wymaga również specjalnego sprzętu i ma niższą czułość niż ELISA17. Biorąc pod uwagę ograniczenia metod alternatywnych, ELISA jest najbardziej odpowiednią i wygodną techniką dla naszych celów w tym protokole. W tym miejscu opisano zastosowanie testu sandwich ELISA do analizy całkowitych poziomów izotypu Ig oraz procedury pośredniego testu ELISA do analizy izotypów Ig specyficznych dla antygenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań na zwierzętach Uniwersytetu Rutgers. Wszystkie myszy są używane zgodnie z wytycznymi NIH i zgodnie z protokołem zwierzęcym zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Przygotowanie myszy i kolekcja surowic naiwnych myszy

  1. Trzymaj wszystkie myszy do eksperymentów immunizacyjnych w określonym obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów.
  2. Do badań nad szczepieniami należy użyć dopasowanych płciowo, młodych dorosłych (8-12 tygodni) myszy kontrolnych z nokautem i rodzeństwem miotu, które mają tych samych rodziców i klatki.
  3. Zaplanuj harmonogramy szczepień i pobierania surowicy, jak pokazano w Rysunek 1.
  4. Zbierz naiwną surowicę każdej myszy na 7 dni (-7 dni) przed szczepieniem. Postępuj zgodnie z procedurami krwawienia zadoczodołowego i przygotowania surowicy, jak opisano poniżej w kroku 4.

2. Przygotowanie polisacharydu TNP (antygenu TI) i TNP-KLH (antygenu TD)

  1. Dokładnie rozpuścić proszki antygenowe w sterylnym PBS (pH 7,4), aby uzyskać 0,5 mg/ml polisacharydu TNP i 1 mg/ml roztworów podstawowych TNP-KLH. Każdą podstawową zawartość antygenu rozmieścić w sterylnych probówkach do mikrofuge o stężeniu 0,5 ml/probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania podwielokrotności antygenu.
  2. W dniu wstrzyknięcia należy obliczyć potrzebną objętość polisacharydu TNP (50 μg/100 μl/mysz) lub TNP-KLH (100 μg/100 μl/mysz) w zależności od liczby myszy do wstrzyknięcia. Rozmrozić odpowiednią liczbę podwielokrotności polisacharydu TNP lub TNP-KLH w temperaturze pokojowej (RT).
  3. W przypadku wstrzykiwań TNP-KLH należy najpierw rozcieńczyć adiuwant ałunu (40 mg/ml) 3 objętościami sterylnego PBS do końcowego stężenia 10 mg/ml. Upewnij się, że mieszanina adiuwantów ałunu jest dobrze zawieszona przed rozcieńczeniem.
  4. Połączyć równą objętość 10 mg/ml zawiesiny adiuwantu ałunu z kroku 2.3 i rozmrożonego roztworu TNP-KLH (1 mg/ml) w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Przygotować tę mieszankę TNP-KLH/ałun świeżo przed wstrzyknięciem.

3. Immunizacja myszy

  1. Wykonaj dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie polisacharydu TNP lub TNP-KLH/ałunu, aby uodpornić myszy za pomocą strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wprowadzić igłę pod kątem około 30°, najlepiej w prawym dolnym kwadrancie każdej myszy, aby zapobiec wstrzyknięciu do narządów wewnętrznych.
  2. Wstrzyknąć i.p. 100 μL polisacharydu TNP na mysz w dniu 0 w celu immunizacji TI Ag (Rysunek 1A).
  3. Wstrzyknąć i.p. 200 μl mieszanki TNP-KLH/ałunu (świeżo przygotowanej w kroku 2.4) na mysz w dniu 0 w celu immunizacji TD Ag. Powtórz to samo wstrzyknięcie w dniu 21 jako szczepienie przypominające do badań pamięci (Rysunek 1B).
  4. Po wstrzyknięciu należy umieścić każdą mysz z powrotem w klatce i utrzymywać wszystkie myszy, którym wstrzyknięto implanty, w określonym stanie wolnym od patogenów.

4. Krwawienie retro-orbitalne i przygotowanie surowicy

  1. Zbierz surowice myszy w różnych punktach czasowych: w przypadku immunizacji polisacharydowej TNP, zbierz surowice myszy w dniu -7 i 7 (Rysunek 1A); w przypadku immunizacji TNP-KLH/ałunu, zbierz surowice myszy w dniu -7, 7, 14 i 28 (Rysunek 1B).
  2. W przypadku krwawienia zadoczodołowego znieczulenie każdej myszy 5% izofluranem przez 1–2 minuty w komorze bezpieczeństwa biologicznego25. Wykonaj odruch pedałowania, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie każdej myszy.
  3. Przytrzymaj znieczuloną mysz w jednej ręce palcem wskazującym i kciukiem, odciągając skórę wokół gałki ocznej do tyłu, tak aby gałka oczna wystawała z oczodołu25. Włożyć nieheparynizowaną pipetę Pasteura lub rurkę kapilarną pod kątem 45° do wewnętrznego kącika oczodołu pod gałką oczną25.
  4. Delikatnie uciskaj w dół i delikatnie obracaj pipetę lub rurkę, aby wbić się do żyły i zebrać 150–200 μl krwi do pipety lub probówki. Natychmiast przenieś krew do sterylnej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i umieść mysz z powrotem w klatce, aby wyzdrowiała.
  5. Pozostaw próbki krwi w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny w celu koagulacji.
  6. Odwirować skrzepnięte próbki krwi w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść klarowną surowicę znajdującą się na wierzchu skrzepu krwi do nowej sterylnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
  7. Powtórz krok 4.6 jeszcze raz, aby usunąć resztki skrzepu krwi i zebrać przezroczystą surowicę.
  8. Podwielokrotność surowicy rozlać do sterylnych probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml w stężeniu 50 μl/probówkę i przechowywać surowice w temperaturze -80 °C.
  9. Naprzemiennie krwawienie z oka w różnych punktach czasowych tak, aby każde oko było krwawione co najwyżej dwa razy w całym eksperymencie. W przypadku krwawienia końcowego zbierz do 1 ml krwi od każdej myszy przed eutanazją. Poddaj mysz eutanazji za pomocą 5% CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Limfocyty B śledziony można pobrać do analiz cytometrii przepływowej i badań hodowli in vitro. Przygotowujemy również genomowe DNA ze splenocytów, aby zweryfikować genotyp każdej myszy.

5. Test ELISA specyficzny dla izotypu myszy Ig

  1. Przygotować i roztwory przed testem ELISA.
    1. Przygotować 500 ml buforu sprzęgającego (PBS, pH 7,4).
    2. Przygotuj 500 ml roztworu do przemywania (PBS-T (0,05% tween 20), pH 7,4).
    3. Przygotować 100 ml buforu blokującego (1% BSA w PBS, pH 7,4, przechowywany w temperaturze 4 °C).
    4. Przygotować 1 l buforu substratowego (1 M dietanoloaminy, pH 9,8 (97 ml dietanoloaminy w 1 lH2O, pH dostosowane przy użyciu 10 M HCl) i 0,5 mM MgCl2). Chroń bufor podłoża przed światłem, owijając butelkę folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotować 100 ml roztworu zatrzymującego (3 M NaOH).
  2. Pokryj płytki ELISA:
    1. W przypadku całkowitego izotypu Ig w surowicy ELISA, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml specyficznych dla izotypu poliklonalnych kozich anty-mysich Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A lub E) Abs w buforze sprzęgającym (PBS) w stężeniu 100 μl/basenik.
    2. W przypadku specyficznego dla TNP izotypu Ig ELISA, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml TNP(38)-BSA w PBS w 100 μl/basenik.
    3. W przypadku izotypu Ig ELISA o wysokim powinowactwie specyficznym dla TNP, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml TNP(3)-BSA w PBS przy 100 μL/base26. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Po inkubacji powlekania przemyć płytki 2 razy 200 μl/studzienkę PBS-T. Wyrzuć bufor do mycia i osusz talerze (postukaj każdą płytką do góry nogami o stos ręczników papierowych) po każdym praniu.
  4. Zablokować płytki: dodać 200 μl/basenik buforu blokującego (1% BSA w PBS) do powlekanych płytek i inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Podczas gdy płytki się blokują, przygotować rozcieńczenia wzorców izotypu Ig i próbek surowicy w buforze blokującym na oddzielnej, niepoddanej działaniu 96-dołkowej płytce w temperaturze 150 μl/basenik.
    1. Przygotować wzorce izotypu Ig 250 ng/ml jako wyjściowe stężenie wzorcowe (St01) i wykonać 7 do 10 seryjnych rozcieńczeń wzorców Ig w stosunku 1:2 (St02 do St07 lub St10, Rysunek 2A).
    2. Przygotować próbki surowicy myszy przy współczynniku rozcieńczenia 1:100 lub 1:500 jako rozcieńczeniu początkowym i wykonać 3 lub 4 seryjne rozcieńczenia 1:10 dla całkowitego izotypu Ig lub seryjne rozcieńczenia 1:5 dla izotypu Ig specyficznego dla TNP dla każdej próbki surowicy (Rysunek 2A). W przypadku testu IgE ELISA należy przygotować próbki surowicy myszy o współczynniku rozcieńczenia 1:2 jako rozcieńczeniu początkowym i wykonać 3 z następujących po sobie seryjnych rozcieńczeń 1:5 każdej próbki surowicy.
  6. Po zablokowaniu umyć płytki z kroku 5.4 trzykrotnie 200 μl/studzienkę PBS-T i osuszyć płytki po każdym myciu.
  7. Przenieść 100 μl/basenik rozcieńczonych wzorców izotypu Ig (odpowiednich do wychwytywania i wykrywania Abs) i rozcieńczonych próbek surowicy z etapu 5.5 na płytki przygotowane w kroku 5.6. Inkubować płytki z wzorcami i próbkami w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Umyj płytki 3 razy 200 μl/dołek PBS-T i osusz płytki po każdym myciu.
  9. Do każdej płytki dodać 100 μl/basenik 10 μg/ml odpowiedniego skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną (AP) koziego anty-mysiego Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A lub E) Abs rozcieńczonego w buforze blokującym.
  10. Inkubować płytki z Abs sprzężonym z AP przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej. W celu wykrycia IgE inkubować płytki przez 1–2 godziny w temperaturze 37 °C.
  11. Przygotować 1 mg/ml roztworu substratu, rozpuszczając dwie tabletki substratu fosfatazy 5 mg w 10 ml buforu substratowego.
  12. Umyj każdą płytkę 5 razy 200 μl/dołek PBS-T i osusz płytki po każdym myciu.
  13. Dodać 100 μl/studzienkę roztworu substratu do każdej płytki. Pozwól, aby reakcja rozwinęła się w temperaturze pokojowej, co zwykle trwa tylko kilka minut.
  14. Odczyt każdej płytki przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek wraz z powiązanym z nim oprogramowaniem.
    1. Kliknij "Ustawienia", aby ustawić długości fal "Lm1" na "405 nm" i kliknij "OK".
    2. Kliknij "Szablon", aby przypisać "Puste" studnie, "Standardowe" i "Nieznane" studnie zgodnie z konfiguracją 96-dołkowej płytki.
    3. W przypadku dołków "Standardy" kliknij "Seria", aby ustawić "Pierwszą próbkę" jako "St01", wybierz "Rozpocznij od" na "Górze" i ustaw "Replikacje" na "2". Zaznacz "Przykładowy deskrypt"i wprowadź "Wartość standardowa": wybierz "Jednostki" jako "ng/ml", ustaw "Wartość początkową" na "250", ustaw "Krok przez" na "2". Kliknij "OK".
    4. Kliknij "Odczyt", aby odczytać płytkę, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec osiągnie gęstość optyczną (OD) ~1.
    5. Kliknij menu "Plik" i kliknij "Zapisz", aby zapisać plik.
    6. Kliknij "Odczyt", aby ponownie odczytać tabliczkę, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec zbliży się do OD405 odpowiednio ~1.5, 2 i 2.5.
  15. Zatrzymać reakcję, dodając 25 μL/basenik 3M NaOH. Wykonaj kroki od 5.12 do 5.15 dla jednej płytki na raz.
  16. Analizuj dane ELISA za pomocą oprogramowania powiązanego z czytnikiem mikropłytek:
    1. Sprawdź wartości OD405 wzorców izotypu Ig odczytywanych plików i wybierz odpowiedni odczyt z dobrym zakresem liniowym wzorców do szczegółowej analizy danych.
    2. Wybierz program dopasowania 4-parametrowego, aby wykreślić krzywe standardowe. Należy sprawdzić współczynnik krzywej wzorcowej (R2), który musi wynosić > 0,98, aby zapewnić dobrą jakość danych.
    3. Sprawdzić, czy wartości OD405 w każdej próbce zmniejszają się wraz ze wzrostem współczynników rozcieńczenia. Pobierz stężenie wszystkich rozcieńczonych studzienek na próbki, klikając "Nieznane".
    4. Wybrać odpowiedni studzienek dla każdej próbki z OD405 w zakresie liniowym krzywej wzorcowej izotypu Ig do obliczenia stężenia.
    5. Obliczyć stężenie izotypu Ig w surowicy każdej próbki, korzystając ze wzoru: stężenie Ig w surowicy = stężenie w wybranym dołku x współczynnik rozcieńczenia.
  17. Rysuj wykresy i wykonuj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania9,10,11. Wykonaj pionowe wykresy punktowe poziomów izotypu Ig w surowicy, aby porównać odpowiedzi Ig w tym samym punkcie czasowym. W przypadku badań odpowiedzi pamięci TD należy wykonać krzywe odpowiedzi w czasie, aby zbadać odpowiedzi izotypu Ig przed i po szczepieniu przypominającym. Użyj słupków błędów, aby pokazać odchylenie standardowe (SD) każdej grupy próbek. Aby porównać odpowiedzi izotypu Ig między dwoma genotypami myszy, należy użyć niesparowanego testu t dla danych dwustronnych w celu określenia istotności statystycznej. Ustaw wartość p < 0,05 jako znacząco różną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy tego protokołu do zbadania roli krytycznego regulatora układu odpornościowego, TRAF3, w odpowiedziach izotypów TI i TD Ig9,10,11. TRAF3 bezpośrednio lub pośrednio reguluje transdukcję sygnału wielu wrodzonych i nabytych receptorów immunologicznych, w tym między innymi nadrodziny receptorów TNF, receptorów Toll-podobnych i receptora limfocytów T/CD2827,<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy protokół charakterystyki odpowiedzi izotypu TD i TI Ig u myszy za pomocą testu ELISA. Pomyślne wdrożenie tego protokołu wymaga użycia materiałów określonych w tabeli 1, w tym płytek testowych ELISA, Ags do immunizacji, przeciwciał i wzorców specyficznych dla izotypu Ig myszy. Należy zachować ostrożność, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych w celu uzyskania testu ELISA. Rozcieńczenia wzorców i próbek surowicy należy przeprowadzić na oddzielnych płytkach niepo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty National Institutes of Health R01 CA158402 (P. Xie) i R21 AI128264 (P. Xie), grant Departamentu Obrony W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), Pilot Award od Cancer Institute of New Jersey poprzez Grant numer P30CA072720 od National Cancer Institute (P. Xie), Busch Biomedical Grant (P. Xie), Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), oraz stypendium Anne B. i Jamesa B. Leathem (S. Zhu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przestrajalny czytnik mikropłytek VersaMaxMDS Technologie analityczneVERSAMAXSprzęt do odczytu płytek
SOFTmax PRO 5.3MDS Technologie analityczneSOFTmax PRO 5.3Oprogramowanie do czytnika płytek
GraphPad PrismGraphPadPrism Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk
TNP-AECM-polisacharyd (FICOLL)TechnologiebiowyszukiwaniaF-1300-10A TI Ag do immunizacji
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag do immunizacji
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (współczynnik koniugacji: 38)Powłoka Ag do specyficznego dla TNP ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (współczynnik koniugacji: 3)Powłoka Ag dla wysokiego powinowactwa specyficznego dla TNP
Ig Imject AlumFisher Naukowy PI-77161Adiuwant ałunu do immunizacji
Falcon Rurki polipropylenoweFisher Scientific 14-959-11A Doinsulinowej TNP-KLH/ałun
BDFisher Scientific 14-829-1BDo wstrzykiwania i.p. myszom
Immuno 96-dołkowe płytki, płaskodenneFisher Scientific 14-245-61Do 96-dołkowych mikropłytek ELISA
bez obróbki, okrągłodenneVWR82050-622Do seryjnych rozcieńczeń wzorców i próbek
Substrat fosfatazy, tabletki 5 mg PodłożeSigmaS0942-200TABPodłoże AP
DietanoloaminaVWRIC15251690Składnik buforu substratowego
AP Kozioł anty-mysi IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab dla myszy IgM
Goat anty-mysz IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab dla myszy IgG1
Goat anty-mysz IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab dla myszy IgG2a
Koza anty-mysz IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab dla myszy IgG2b
Goat anty-mysz IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab dla mysz IgG3
Koza anty-mysz IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab dla myszy IgA
Koza anty-mysz IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab dla myszy IgE
AP-Goat anty-mysia IgMSouthernBiotech1020-04Detekcja Ab dla myszy IgM
AP-Goat anty-mysz IgG1SouthernBiotech1070-04Wykrywanie Ab dla myszy IgG1
AP-Goat anty-mysie IgG2aSouthernBiotech1080-04Detekcja Ab dla myszy IgG2a
AP-Goat anty-mysia IgG2bSouthernBiotech1090-04Detekcja Ab dla myszy IgG2b
AP-Goat anty-mysia IgG3SouthernBiotech1100-04Detekcja Ab dla myszy IgG3
AP-Goat anty-mysia IgASouthernBiotech1040-04Detekcja Ab dla myszy IgA
AP-Goat anty-mysie IgESouthernBiotech1110-04Wykrywanie Ab dla myszy IgE
Mysz IgM standardBD Biosciences553472IgM specyficzne dla TNP, klon  G155-228
Mysi standard IgG1BD Biosciences554054IgG1 specyficzny dla TNP, klon  107.3
Mysi standard IgG2aBD Biosciences556651IgG2a specyficzny dla TNP, klon  G155-178
Mysi standard IgG2bBD Biosciences554055IgG2b specyficzny dla TNP, klon  49.2
Mysi standard IgG3BD Biosciences553486IgG3 specyficzny dla KLH, klon  A112-3
Mysi standard IgABD Biosciences550924IgA indukowane olejem mineralnym, klon  MOPC-320
Mysi standard IgEBD Biosciences557079IgE specyficzne dla TNP, klon  Zobacz materiał C38-2
inkubacji strzykawki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12(2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7(2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719(2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997(2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

immunoglobuliny zale ne od grasicyanaliza surowicy mysiejELISA specyficzna dla izotypuimmunizacja TNP KLHimmunizacja polisacharydem TNPpobieranie krwi drog retroorbitalnczytnik mikrop ytekcytometria przep ywowa

Powiązane artykuły