Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek larw Drosophila do metabolomiki opartej na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS)

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57847

⸱

6 czerwca 2018

 , 
1Department of Biology, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przygotować larwy Drosophila do analizy metabolomicznej opartej na GC-MS.

Streszczenie

Ostatnie postępy w dziedzinie metabolomiki sprawiły, że muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się potężnym modelem genetycznym do badania metabolizmu zwierząt. Łącząc szeroki wachlarz narzędzi genetycznych Drosophila z możliwością badania dużych połaci pośredniego metabolizmu, podejście metabolomiczne może ujawnić złożone interakcje między dietą, genotypem, wydarzeniami w historii życia i sygnałami środowiskowymi. Ponadto badania metabolomiczne mogą odkryć nowe mechanizmy enzymatyczne i odkryć nieznane wcześniej powiązania między pozornie odległymi szlakami metabolicznymi. Aby ułatwić szersze stosowanie tej technologii wśród społeczności Drosophila, poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje, jak przygotować próbki larw Drosophila do analizy metabolomicznej opartej na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS). Nasz protokół zawiera opisy pobierania próbek larw, ekstrakcji metabolitów, derywatyzacji chemicznej i analizy GC-MS. Pomyślne ukończenie tego protokołu pozwoli użytkownikom zmierzyć względną obfitość małych metabolitów polarnych, w tym aminokwasów, cukrów i kwasów organicznych biorących udział w glikolizie i cyklach TCA.

Wprowadzenie

Muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się idealnym systemem do badania mechanizmu molekularnego, który reguluje pośredni metabolizm. Nie tylko większość szlaków metabolicznych między Drosophila a ludźmi jest zachowana, ale kluczowe czujniki składników odżywczych i regulatory wzrostu, takie jak insulina, Tor i myc, są również aktywne w klasie fly1,2. W rezultacie, Drosophila może być wykorzystywana do badania metabolicznych podstaw chorób ludzkich, od cukrzycy i otyłości po neurodegenerację i raka. W związku z tym rozwój larwalny Drosophila zapewnia idealne ramy do badania programu metabolicznego znanego jako glikoliza tlenowa lub efekt Warburga. Tak jak wiele nowotworów wykorzystuje glikolizę tlenową do generowania biomasy z węglowodanów, tak larwy Drosophila aktywują glikolizę tlenową w celu promowania wzrostu rozwojowego3,4,5. Te podobieństwa między metabolizmem larw i guzów sprawiają, że Drosophila jest kluczowym modelem do zrozumienia, w jaki sposób glikoliza tlenowa jest regulowana in vivo.

Pomimo faktu, że mucha stała się popularnym modelem do badania metabolizmu, większość badań nad Drosophila opiera się na metodach zaprojektowanych do pomiaru poszczególnych metabolitów3, takich jak trehaloza, trójglicerydy czy ATP. Ponieważ do pomiaru każdego metabolitu wymagany jest określony protokół, badania oparte na testach są pracochłonne, kosztowne i stronnicze w kierunku tych związków, które można zmierzyć za pomocą komercyjnych zestawów. Rozwiązaniem tych ograniczeń pojawiła się dziedzina metabolomiki, która zapewnia bardziej wydajny i bezstronny sposób badania metabolizmu Drosophila. W przeciwieństwie do badania opartego na teście, pojedyncza analiza metabolomiczna może jednocześnie mierzyć setki metabolitów małocząsteczkowych i zapewnić kompleksowe zrozumienie stanu metabolicznego organizmu6,7. Technika ta znacznie rozszerzyła zakres badań metabolicznych Drosophila i stanowi przyszłość tej rozwijającej się dziedziny8.

Badania metabolomiczne są prowadzone głównie przy użyciu trzech technologii: (i) magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), (ii) chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) oraz (iii) chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS)9. Każde podejście ma wyraźne zalety i wady, a wszystkie te technologie zostały wykorzystane do skutecznego zbadania metabolizmu Drosophila. Ponieważ badania prowadzone w naszym laboratorium koncentrują się na małych, polarnych metabolitach, stosujemy przede wszystkim metodę opartą na GC-MS. GC-MS zapewnia użytkownikowi szereg korzyści, w tym wysoką odtwarzalność, rozdzielczość pików, czułość oraz dostępność standardowej biblioteki spektralnej uderzenia elektronów (EI), która pozwala na szybką identyfikację odkrytych cech metabolicznych10,11. Przygotowanie próbek do GC-MS jest jednak nieco skomplikowane i wymaga starannej dbałości o szczegóły. Próbki muszą być pobierane, myte, ważone i zamrażane w sposób, który szybko wygasza reakcje metaboliczne. Ponadto tusza muchowa jest odporna na standardowe protokoły homogenizacji i wymaga młyna perełkowego, aby zapewnić optymalną ekstrakcję metabolitów. Wreszcie, próbki analizowane przez GC-MS muszą zostać poddane derywatyzacji chemicznej przed wykryciem12. Podczas gdy wcześniej opublikowane metody opisują wszystkie te kroki3,13,14, nadal potrzebny jest protokół wizualny, który pozwoliłby początkującemu użytkownikowi na powtarzalne generowanie danych wysokiej jakości. Tutaj pokazujemy, jak przygotować próbki larw Drosophila do analizy metabolomicznej opartej na GC-MS. Protokół ten pozwala użytkownikowi na powtarzalny pomiar wielu małych metabolitów polarnych, które składają się na centralny metabolizm węgla.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kolekcja jaj

  1. Zbierz dorosłe samce i dziewicze samice o pożądanych genotypach. Zwierzęta te należy indywidualnie starzeć w fiolce z karmą ze standardową pożywką Bloomington przez 3-5 dni.
  2. Ustaw odpowiednie krycia, przenosząc 50 dziewiczych samic i 25 samców do nowej fiolki z pokarmem.
    UWAGA: Dla każdego genotypu należy założyć co najmniej sześć niezależnych kojarzeń. Z każdego krycia pobiera się tylko jedną próbkę (tj. sześć próbek pobranych z sześciu niezależnych krzyżówek).
  3. Przygotuj czapki do składania jaj z melasy.
    1. Zmieszać 115 ml melasy i 29 g agaru z 700 mlH2Ow kolbie o pojemności 2 litrów.
    2. Zagotuj mieszaninę melasy i agaru na gorącym talerzu.
    3. Schłodzić do temperatury 70 °C.
    4. Dodać 25 ml mieszaniny kwasów (20 ml 85% kwasu fosforowego i 209 ml kwasu propionowego w 1 lH2O; Przechowywać w brązowej butelce) i 10 ml 10% estru metylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego w 95% etanolu.
    5. Wlej agar z melasą zarówno do pokrywki, jak i dolnej części naczynia do hodowli tkankowych o wymiarach 35 x 10 mm2.
      UWAGA: Przed wlaniem płytek agarowych z melasą upewnij się, że pokrywki i/lub podstawa płytki 35 x 10 mm2 ściśle przylegają do ust butelki bulionowej Drosophila (opisanej w kroku 1.6). W zależności od marki użytych płyt podstawa może nie nadawać się do użytku.
  4. Przygotuj świeżą pastę drożdżową, dodając wodę destylowaną do aktywnych suchych drożdży (5 g drożdży/7 ml wody), aż mieszanina stanie się pastą, którą można łatwo rozprowadzić na twardej powierzchni (tj. konsystencja masła orzechowego).
  5. Rozprowadź około 1,5 g pasty drożdżowej na powierzchni kapsla do składania jaj z melasy.
  6. Zrób cztery otwory wentylacyjne po przeciwnych stronach plastikowej butelki bulionowej Drosophila o pojemności 6 uncji za pomocą igły 22 G.
  7. Przenieś nowo pokryte muchy z fiolki z pokarmem do butelek z kulturą.
    UWAGA: Muchy mogą być przenoszone za pomocą CO2 jako tymczasowego środka znieczulającego lub przez trzymanie górnej części fiolki w ustach butelki i ostre stukanie dnem butelki o blat stołu.
  8. Szybko umieść na powierzchni nakrętkę do składania jaj melasy z pastą drożdżową w otworze butelki bulionowej Drosophila. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby zamocować nakrętkę do składania jaj na miejscu.
    UWAGA: Jeśli muchy zostały znieczulone przed transferem, butelkę należy umieścić poziomo na blacie, aż wszystkie muchy wyzdrowieją. Gdy muchy będą całkowicie mobilne, umieść butelkę w inkubatorze z nakrętką do składania jaj melasy na dnie kultury.
  9. Wymieniaj nakrętkę do składania jaj melasy co najmniej raz dziennie przez pierwsze dwa dni, odwracając butelkę bulionową, stukając dnem butelki o blat, zdejmując starą nakrętkę jaja i natychmiast umieszczając nową nakrętkę do wylotu butelki. Wyrzuć starą nasadkę do składania jaj.
    UWAGA: Ten krok zapewnia, że samice nie trzymają swoich jaj i pozwala na zebranie zsynchronizowanych populacji.
  10. Umieść nową nakrętkę do składania jaj w butelce bulionowej po 3 dniu, wymień po 2 godzinach i wyrzuć. Zdejmij i załóż drugą nasadkę do składania jaj po czterech godzinach. Oznacz spód tej nasadki do składania jaj datą, godziną i genotypem.
    UWAGA: Jaja zebrane w tym 4-godzinnym oknie zostaną wykorzystane do analizy. Ten krok synchronizacji ma kluczowe znaczenie dla analizy określonych etapów rozwoju. Jaja można zbierać w ten sposób przez kilka dni.
  11. Włóż nasadki do składania jaj do płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm2 i umieść w inkubatorze w żądanej temperaturze i wilgotności.
  12. Codziennie sprawdzaj czapki do składania jaj pod kątem problemów z głodem, gęstością zaludnienia lub zanieczyszczeniem.
    UWAGA: Larwy muszą mieć dostęp do odpowiedniego pokarmu, aby zapewnić ciągły rozwój. W razie potrzeby świeżą pastę drożdżową można rozprowadzić na wszystkich czapkach do składania jaj, które zostaną użyte w eksperymencie. Ponadto, jeśli zagęszczenie populacji larw jest zbyt duże, larwy zaczną wędrować poza płytkę hodowlaną. Próbki te nie powinny być wykorzystywane do analizy metabolomicznej, ponieważ duża gęstość zaludnienia i pośrednie napady głodu doświadczane podczas wędrówki spowodują niespójne dane. Zalecana jest gęstość ~80–100 larw środkowego drugiego stadium (L2) na płytkę lub 40–50 larw środkowego trzeciego stadium (L3) na płytkę. Próbki, które są widocznie zanieczyszczone bakteriami lub grzybami, należy wyrzucić.

2. Pobieranie próbek larw

  1. Starzej larwy do pożądanego etapu. W przypadku zbierania larw L3 należy ponownie zsynchronizować próbki w momencie linienia L2–L3. Resynchronizacja jest zwykle osiągana przy użyciu wcześniej opisanej metody, która wykorzystuje przednie przetchlinki jako kamień milowy rozwoju15. Alternatywnie, larwy środkowego L3 można zsynchronizować za pomocą genu reporterowego sgs3 16.
    UWAGA: W związku z tym stwierdzamy, że larwy w połowie L2 (~60 godzin po złożeniu jaj) idealnie nadają się do większości analiz, ponieważ rozwój larw jest nadal stosunkowo synchroniczny na tym etapie, starannie pobrane próbki mają odpowiedni pokarm do rozwoju do tego punktu czasowego, a liczba zwierząt w próbce jest możliwa do opanowania (patrz poniżej). Dodatkowy etap synchronizacji jest konieczny dla larw L3, ponieważ liczne impulsy ekdyzonu, które występują podczas rozwoju L3, mają dramatyczny wpływ na metabolizm i generują artefakty w niezsynchronizowanych populacjach.
  2. Użyj igły do preparowania, aby delikatnie podnieść pastę drożdżową z agaru. Umieść drożdże na nowym kapsle z agaru z melasy.
    UWAGA: Większość larw zjada się na granicy faz między agarem z melasy a pastą drożdżową.
  3. Użyj małego pędzla, aby zebrać larwy z nowo odsłoniętej powierzchni agaru z melasy. Umieść larwy w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    UWAGA: Odpowiednie wielkości próbek dla każdego stadium rozwojowego są następujące: 50 larw w pierwszym stadium rozwojowym (L1); 25 larw środkowego L2; 20 wczesnych larw L3; 15 larw środkowego L3 lub późnego L3
    4. .
  4. Umyj i zamroź próbki (kroki od 2.3 do 2.8) w małych partiach (od czterech do sześciu próbek), jednocześnie pobierając duży zestaw próbek. Próbki należy zamrozić w ciągu 20 minut od umieszczenia larw w probówkach.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie probówek Eppendorf Flex Tubes 1,5 ml, ponieważ inne probówki mogą zakłócać przenoszenie próbki w kroku 3. Próbki należy pobrać do probówek do mikrofuge. Nie pobieraj próbek w rurkach z kulkami opisanymi w kroku 3.1. Kulki ceramiczne zatrzymują roztwór płuczący NaCl, co skutkuje niedokładnymi pomiarami masy i wprowadza zanieczyszczenia do próbki.
  5. Dodaj 1 ml lodowatego 0,9% NaCl do probówki, zamknij pokrywkę i obróć probówkę pionowo, aby dokładnie umyć larwy.
  6. Umieść rurkę z powrotem na lodzie na ~30 s. W tym czasie larwy opadną na dno probówki, ale drożdże pozostaną w zawiesinie. Gdy wszystkie larwy utworzą luźny osad, usuń roztwór NaCl za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  7. Powtórz kroki 2.4 i 2.5 dwa razy lub do momentu, gdy końcowy roztwór myjący będzie klarowny.
    Uwaga: Dodatkowe etapy mycia mogą być konieczne, jeśli pobrana próbka zawiera nadmierną ilość drożdży.
  8. Odwirować próbki o masie 2 000 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  9. Usunąć cały pozostały roztwór za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  10. Natychmiast zamrozić próbkę w ciekłym azocie.
    UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany. Próbki można przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze -80 °C.

3. Przenoszenie próbek do probówek z koralików

  1. Każda próbka larwalna musi zostać przeniesiona z probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml zawierających kulki ceramiczne o średnicy 1,4 mm. Przygotowując się do tego etapu przenoszenia, użyj markera odpornego na etanol, aby oznaczyć bok rurki z koralikami o pojemności 2 ml (oznaczenia na wieczku zostaną zniszczone podczas kroku 4.4).
  2. Wytaruj masę oznakowanej rurki z kulką za pomocą wagi analitycznej zdolnej do dokładnego pomiaru 0,01 mg.
  3. Jeżeli próbki larw były przechowywane w temperaturze -80 °C, przed przeniesieniem należy umieścić probówki z próbkami w ciekłym azocie.
  4. Użyj długich kleszczyków, aby usunąć probówkę o pojemności 1.5 ml z ciekłym azotem Dewara.
  5. Zakładając rękawice nitrylowe, chwyć zamrożoną rurkę, odwróć i ostro uderz pokrywką rurki o blat, aby usunąć zamrożony granul. Natychmiast wlej granulkę do wstępnie wytarowanej probówki z koralikami o pojemności 2 ml. Jeśli osad nie zdoła się wysunąć, włóż probówkę z powrotem do ciekłego azotu i powtórz.
    UWAGA: Granulki larwalne nie wydostaną się ze wszystkich probówek do mikrofuge. W przypadku korzystania z probówki innej niż zalecana, przed pobraniem próbek do analizy należy ustalić, czy osady larwalne mogą zostać usunięte.
  6. Szybko zmierz łączną masę osadu larwalnego i rurki z kulką. Natychmiast umieścić probówkę z próbką w ciekłym azocie. Masa osadów larwalnych zostanie wykorzystana do normalizacji danych metabolomicznych.
    UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany. Próbki można przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze -80 °C.

4. Pobieranie próbek

  1. Umieścić probówki z próbkami w chłodziarce stołowej o temperaturze -20 °C.
  2. Do każdej probówki dodać 0,8 ml wstępnie schłodzonego (-20 °C) 90% metanolu zawierającego 2 μg/ml kwasu bursztynowego-d4. Umieścić próbkę z powrotem w chłodziarce stołowej o temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Kwas bursztynowy-d4 służy jako wzorzec wewnętrzny. Stosować wyłącznie HPLC klasyH2Oi metanol. Ponieważ metanol i inne rozpuszczalniki organiczne są lotne i trudno je dokładnie zmierzyć za pomocą pipet wyporowych, zalecamy użycie pipet wyporowych na tym etapie i we wszystkich następnych.
  3. Ustawić kontrolę ujemną, dodając 0,8 ml wstępnie schłodzonego (-20 °C) 90% metanolu zawierającego 2 μg/ml kwasu bursztynowego-d4 do pustej probówki z kulkami.
  4. Homogenizować próbki przez 30 sekund z prędkością 6,45 m/s za pomocą homogenizatora z młynem perełkowym umieszczonego w pomieszczeniu kontroli temperatury o temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Brak szybkiej i całkowitej homogenizacji osadu larwalnego jest częstym źródłem zmienności w analizie metabolomicznej. Używaj wyłącznie homogenizatorów, które są w stanie zniszczyć zamrożone tkanki larwalne w ciągu 30 sekund.
  5. Umieścić probówki z homogenizowanymi próbkami z powrotem do chłodnicy stołowej o temperaturze -20 °C i inkubować je w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Odwirować probówki o masie 20 000 × g lub maksymalnej prędkości przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć powstały osad.
  7. Przenieść 600 μl supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Nie naruszaj osadu. Jeżeli osad zostanie usunięty podczas pipetowania supernatantu, należy umieścić cały supernatant z powrotem w probówce i powtórzyć krok 4.6.
  8. Umieścić probówki z próbkami w wirówce próżniowej. Upewnij się, że wszystkie probówki są otwarte przed zamknięciem wirówki. Suszyć próbki w temperaturze pokojowej, aż cały rozpuszczalnik zostanie usunięty (ten etap zwykle trwa ~16 godzin).
    UWAGA: W razie potrzeby protokół można wstrzymać na tym etapie. Wysuszoną próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Derywatyzacja chemiczna

  1. Jeżeli wysuszone próbki były przechowywane w temperaturze -80 °C, nieotwarte probówki z próbkami umieścić w wirówce próżniowej i suszyć przez 30 minut. Ten krok należy wykonać przed otwarciem probówki z próbką.
    UWAGA: Ten krok usuwa kondensację, która zbiera się na zewnątrz rurki do mikrofugi po wyjęciu z zamrażarki. Ta część protokołu jest niezwykle wrażliwa naH2Oi należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, aby wszystkie odczynniki były jak najbardziej suche.
  2. Przygotować roztwór 40 mg/ml chlorowodorku metoksyloaminy (MOX) w bezwodnej pirydynie. Stosować wyłącznie bezwodną pirydynę. Przechowywać MOX i pirydynę w eksykatorze i codziennie przygotowywać roztwór MOX.
    UWAGA: MOX i pirydyna są toksyczne. Przygotuj ten roztwór w dygestorium.
    1. Użyj opalarki, aby wysuszyć szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml.
    2. Wprowadzić igłę strzykawki do butelki z bezwodną pirydyną. Usunąć 1 ml pirydyny i dodać do probówki do mikrofuge zawierającej 40 mg MOX.
    3. Przepłukać butelkę bezwodnej pirydyny argonem. Zamknąć butelkę i wrócić do eksykatora.
    4. Rozpuścić MOX w pirydynie, inkubując probówkę w mieszalniku termicznym w temperaturze 35 °C przez 10 minut przy prędkości 600 obr./min.
  3. Do wysuszonej próbki dodać 40 μl 40 mg/ml MOX w bezwodnym roztworze pirydyny.
  4. Wirować przez 10 s i krótko odwirować (10 000 x g przez 20 s).
  5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę przy 600 obr./min w mieszalniku termicznym.
  6. Wirować przy 20 000 × g lub maksymalnej prędkości przez 5 minut, aby usunąć cząstki.
  7. Przenieść 25 μl supernatantu do fiolki z automatycznym samplerem z 250 μl dezaktywowaną szklaną wkładką mikroobjętościową.
  8. Dodać 40 μl N-metylo-N-trimetylosililotrifluoracetamidu (MSTFA) zawierającego 1% TMCS.
    UWAGA: MSTFA jest toksyczny. Wykonaj tę czynność pod wyciągiem.
    UWAGA: Jeśli jest to możliwe, ten krok można wykonać za pomocą automatycznego podajnika próbek Gerstel.
  9. Nałożyć nakrętkę na fiolkę automatycznego podajnika próbek i zamknąć za pomocą zaciskarki.
  10. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (250 obr./min).
  11. Przygotować roztwór wzorca estru metylowego kwasów tłuszczowych (FAMES), jak opisano wcześniej3. Dodać 3 μl FAMES do fiolki automatycznego podajnika próbek za pomocą automatycznego podajnika próbek bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: FAME służą do kalibracji przesunięcia czasu retencji i sprawdzania działania urządzenia. Jeśli żaden automatyczny podajnik próbek nie jest dostępny, FAME można dodać w kroku 5.8.

6. Wykrywanie GC-MS

UWAGA: W większości przypadków użytkownik przeprowadzi ten krok z pomocą głównego urządzenia do spektroskopii mas. Protokół ten jest przeznaczony do stosowania z 30-metrową kolumną GC z 5-metrową kolumną ochronną.

  1. Losowo określ kolejność próbek.
  2. Przygotuj GC-MS.
    1. Ustaw natężenie przepływu helu w gazie nośnym na 1 ml/min.
    2. Ustawić temperaturę na wlocie na 250 °C.
    3. Zaprogramuj GC tak, aby wykonywał następujący gradient temperatury:
      1. Temperatura początkowa do 95 °C z podtrzymaniem 1 min.
      2. Zwiększyć temperaturę do 110 °C z prędkością 40 °C/min z utrzymaniem trwającym 2 minuty.
      3. Zwiększenie do 250 °C przez rampę 5°C/min.
      4. Zwiększyć do 330 °C z szybkością 25 °C/min z końcowym zatrzymaniem trwającym 4 minuty.
    4. Ustaw opóźnienie rozpuszczalnika na 3,5 min.
      UWAGA: Czas można zmienić zgodnie z systemem GC-MS. Celem tego kroku jest zapobieżenie uszkodzeniu detektora przez MSTFA i MOX.
  3. Wstrzyknąć 1 μl derywatyzowanej próbki do GC-MS (stosunek podziału 10:1).
    UWAGA: Wstrzyknąć 2 μl próbki, jeśli intensywność pików jest zbyt niska. Kolejność wstrzykiwania próbek powinna być losowa.
  4. Uruchom spektrometr mas w trybie pełnego skanowania w zakresie mas 50–500 m/z.

7. Analiza danych

  1. Analizuj dane metabolomiczne przy użyciu podejścia ukierunkowanego lub nieukierunkowanego. Analiza ukierunkowana koncentruje się na pomiarze obfitości zdefiniowanego zestawu metabolitów, takich jak pomiary mleczanu, które opisujemy poniżej. W przeciwieństwie do tego, analiza nieukierunkowana wykorzystuje bezstronne podejście do identyfikacji dowolnej cechy metabolicznej, która ulega znaczącym zmianom między dwoma zestawami próbek.
    UWAGA: Nasze laboratorium korzysta przede wszystkim z bezpłatnych programów MetAlign17 i MetaboAnalyst18,19 do analizy danych. Ponieważ odpowiedni opis zarówno etapów kontroli jakości, normalizacji, jak i przetwarzania danych wykracza poza zakres tego manuskryptu, odsyłamy użytkownika do bardziej szczegółowych protokołów, które są poświęcone przetwarzaniu danych20,21,22. Ponadto schemat blokowy opisujący kroki wymagane do tej analizy można znaleźć w innym miejscu8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mutanty dehydrogenazy mleczanowej (dLDH), pozbawione aktywności dLDH4, oraz genetycznie dopasowane kontrole zostały pobrane w stadium larw mid-L2 i przetworzone zgodnie z opisanym powyżej protokołem. W porównaniu z kontrolami, larwy mutantów wykazują istotne zmiany w poziomach mleczanu, pirogronianu i L-2-hydroksyglutaranu4. Widma pozyskano za pomocą systemu Agilent GC6890-5973i MS. Przykład widma GC-MS wygenerowanego zgodnie z nasz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metabolomika daje niezrównaną możliwość zbadania reakcji metabolicznych, które składają się na metabolizm pośredni. Czułość tej technologii sprawia jednak, że dane są podatne na tło genetyczne, sygnały rozwojowe i różne stresy środowiskowe, w tym temperaturę, wilgotność, gęstość zaludnienia i dostępność składników odżywczych. W związku z tym wysokiej jakości i powtarzalna analiza metabolomiczna wymaga, aby próbki były pobierane w ściśle kontrolowanych warunkach. Chociaż kilka recenzji podkreśla ten punkt

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania dla członków Indiana University Mass Spectroscopy Facility oraz University of Utah Metabolomics Core Facility za pomoc w optymalizacji tego protokołu. J.M.T. jest wspierany przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R35GM119557.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niesiarkowana melasa z czarnego paskaGood Food, INC
Drosophila Agar Type IIGenesee Scientific66-103
PirydynaEMD MiliporePX2012-7
Hydrocholoride metoksyaminy (MOX)MP Biomedicals, LLC155405
MSTFA z 1% trimetylochlorosilanemSigma69478
Fleischmann' s Aktywne suche drożdżeAB Mauri Food Inc2192
6 uncji butelka bulionowa DrosophilaGenesee Scientific32-130
Mieszanka do homogenizacji tkanek miękkich (probówki 2 ml) Omni InternationalSKU:19-627
Wkładka do fiolki, 250 i mikro; L szkło dezaktywowane z nóżkami polimerowymiAgilent5181-8872
Kwas bursztynowy-2,2,3,3-d4Sigma293075
SpeedVacThermo SC210A
kwas o-fosforowyFisher ScientificA242-1
Kwas propionowySigmaP5561
ester metylowy kwasu p-hydroksybenzoesowegoGenesee Scientific20-258
Bead RuptorOmni InternationalSKU:19-040E
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012
Wytrząsarka MultiTherm z blokiem 24 X 12 mmBenchmark ScientificH5000
MetanolSigma34860
Probówka wirówkowa 1,5 mlEppendorf22364111
Falcon 35 X 10 mm Naczynie do hodowli tkankowychCorning Incorporated353001
Kolumna GCPhenomexZB-5MSi

Bibliografia

  1. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
  2. Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
  3. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  4. Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
  5. Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
  6. Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
  7. Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
  8. Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
  9. Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
  10. Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
  11. Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
  12. Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
  13. Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
  14. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  15. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
  16. Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
  17. Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  18. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  19. Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
  20. Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
  21. Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
  22. Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
  23. Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metabolomika GC-MSekstrakcja metabolitówderywatyzacja chemicznahomogenizacja w młynku kulkowymwirowanie próżniowederywatyzacja metoksylaminąsilylowanie MSTFAprzygotowanie fiolek do autosampleraanaliza głównych składowych
Przygotowanie próbek larw Drosophila do metabolomiki opartej na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.