Artykuł metodologiczny

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57848

⸱

11 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół do zasiewania rzadkiej populacji komórek za pomocą końcówek pipet do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia wyższej efektywności enkapsulacji komórek w kropelkach.

Streszczenie

Wśród różnych projektów platform mikroprzepływowych często używanych do analizy komórkowej, mikrofluidyka kropelkowa dostarcza solidnego narzędzia do izolowania i analizowania komórek na poziomie pojedynczej komórki, eliminując wpływ czynników zewnętrznych na mikrośrodowisko komórkowe. Enkapsulacja komórek w kropelkach jest podyktowana rozkładem Poissona jako funkcją liczby komórek obecnych w każdej kropli i średniej liczby komórek na objętość kropli. Komórki pierwotne, zwłaszcza komórki odpornościowe lub próbki kliniczne mogą być rzadkie, a bezstratna enkapsulacja komórek pozostaje wyzwaniem. W tym artykule przedstawiamy nową metodologię, która wykorzystuje końcówki pipet do ładowania komórek do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych bez znacznej utraty komórek. W przypadku różnych typów komórek wykazujemy wydajną enkapsulację komórek w kropelkach, która ściśle odpowiada wydajności enkapsulacji przewidywanej przez rozkład Poissona. Nasza metoda zapewnia bezstratne ładowanie komórek na platformy mikroprzepływowe i może być łatwo dostosowana do dalszej analizy pojedynczych komórek, np. w celu dekodowania interakcji komórkowych między różnymi typami komórek.

Wprowadzenie

W ostatnich latach gwałtownie wzrosło wykorzystanie mikrofluidyki jako solidnej i wszechstronnej platformy do analizy komórkowej na poziomie pojedynczej komórki1. Platformy te zapewniają wysokoprzepustowe badania przesiewowe pojedynczych komórek i cząsteczek biologicznych z wysoką precyzją i czułością przy użyciu bardzo małej objętości próbki2,3,4. Wśród różnych typów konstrukcji mikroprzepływowych, platformy oparte na kropelkach umożliwiają wysokoprzepustową analizę pojedynczych komórek poprzez izolowanie ich w kropelce fazy wodnej otoczonej niemieszającą się fazą, która umożliwia precyzyjną i dokładną kontrolę nad mikrośrodowiskiem komórkowym5,6. Mikrofluidyka oparta na kropelkach zapewnia elastyczność izolowania pojedynczych lub wielu komórek, zarówno w kropelkach wodnych, jak i hydrożelowych, i jest cenna w badaniu złożonych zachowań komórkowych, takich jak wydzielanie białek lub interakcje komórkowe7,8,9. Na sygnalizację i przesłuch między komórkami odpornościowymi mogą wpływać interakcje z innymi komórkami w mikrośrodowisku10. Izolacja pojedynczych komórek w kropelkach zapewnia efektywne laboratorium analityczne wolne od zakłóceń, wolne od wpływu zewnętrznych czynników środowiskowych, co zapewnia bardziej wydajne i dokładne wyniki11,12. Modyfikacja konstrukcji platformy kropelkowo-mikroprzepływowej z wieloma wlotami umożliwia enkapsulację wielu typów komórek w celu badania interakcji komórkowych poprzez parowanie komórek12,13.

Proces enkapsulacji komórek w kropelkach jest losowy, a szybkość enkapsulacji komórek można statystycznie określić za pomocą wzoru na rozkład Poissona14,15. Tę szybkość enkapsulacji można oszacować, biorąc pod uwagę średnią szybkość docierania komórek do połączenia kropel i zakładając, że przybycie każdej komórki jest niezależne od nadejścia innych komórek16. Nawet jeśli nie można zagwarantować niezależnego przybycia komórek, w przypadku słabo rozmieszczonych komórek można rozważyć założenie niezależności i prawdopodobieństwo wystąpienia kropli zawierającej jedną lub więcej komórek można przewidzieć jako funkcję liczby komórek obecnych w każdej kropli i średniej liczby komórek w kropli16, 17. Ponieważ to oszacowanie enkapsulacji komórkowej w kropelkach zależy od liczby komórek obecnych w każdej kropli, można zasugerować, że zwiększenie stężenia komórek na wlocie zwiększy średnią liczbę komórek obecnych w każdej kropli16. Dlatego, aby zapewnić hermetyzację pojedynczej komórki, należy zmniejszyć stężenie komórek, ale często prowadzi to do dużej liczby pustych kropel18.

Utrata komórek podczas ładowania przez przyłączanie, sedymentację i/lub zbijanie się w strzykawce, rurki lub urządzeniu produkcyjnym jest częstym wadą odpowiedzialną za odchylenie rzeczywistych wartości enkapsulacji od przewidywanych wartości enkapsulacji19. Problem ten staje się jeszcze bardziej wyolbrzymiony podczas wysiewu rzadkich komórek odpornościowych lub próbek klinicznych, ponieważ są one już rzadkie w populacji, a enkapsulacja tylko kilku komórek, znacznie niższa niż oczekiwano, nie dostarcza wystarczających danych do analizy eksperymentalnej. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) to rzadki podzbiór komórek odpornościowych, który stanowi tylko około 0,2 - 0,6 procent całej populacji białych krwinek20. Komórki te wydzielają ogromne ilości interferonów typu I po aktywacji i tym samym odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych21. Badając zachowanie komórkowe tak rzadkich komórek w kropelkach, konieczne jest zapobieganie utracie komórek podczas wysiewu komórek i enkapsulacji22. Istnieje kilka rozwiązań związanych z projektem, które zapewniły hermetyzację pojedynczych komórek w kropelkach przy użyciu metod aktywnej enkapsulacji, które wykorzystują różne siły fizyczne, takie jak siły akustyczne lub elektryczne, do generowania kropel zawierających pojedyncze komórki23,24. Metody te mają jednak swoje własne ograniczenia w zakresie produkcji kropel16.

W tym badaniu opracowaliśmy solidną i prostą metodę, która pozwala obejść niedociągnięcia tradycyjnych metod ładowania pojedynczych lub wielu komórek do urządzeń mikroprzepływowych. Nasza metoda, zainspirowana przez Rho i wsp., wykorzystuje końcówki pipet o różnych rozmiarach do wysiewania małych objętości rzadkich komórek odpornościowych do kropelkowych platform mikroprzepływowych bez znacznej utraty próbki i daje wyniki, które są spójne z przewidywaniami teoretycznymi25. Metodologia ta może być łatwo i z powodzeniem zaadaptowana do wielu zastosowań obejmujących mikrofluidykę na bazie kropelek i stosowana do szerokiej gamy typów komórek, a nawet mikrocząstek.

Protokół

1. Produkcja urządzeń z 3 wlotami polidimetylosiloksanu (PDMS)

  1. Odmierz 40 g bazy PDMS w kubku miksera kondycjonującego i ostrożnie dodaj 4 g utwardzacza PDMS do odczynnika bazowego w kubku, używając zakraplacza.
  2. Umieść filiżankę w uchwycie miksera kondycjonującego i zmierz całkowitą wagę filiżanki za pomocą uchwytu. Ustaw odpowiednio wartość ciężaru wyważenia wirówki na mieszalniku kondycjonującym.
  3. Mieszać bazę i utwardzacz w mieszalniku kondycjonującym z prędkością 2 000 obr./min przez 2 min, a następnie odpieniać przy 2 000 obr./min przez 2 min.
  4. Przygotuj aluminiową łódkę o średnicy mniej więcej tej samej wielkości, co płytka krzemowa o średnicy 100 mm. Umieść wafel krzemowy, wyprodukowany w procesie formowania repliki, w aluminiowej łodzi i umieść ten zestaw na szalce Petriego (średnica = 120 mm, wysokość = 20 mm).
    UWAGA: Rozmiar płytki Petriego zależy od wielkości płytki krzemowej.
  5. Wyjmij kubek z uchwytu i ostrożnie wlej wstępnie utwardzoną mieszaninę PDMS (zawartość kubka) na wafel silikonowy.
  6. Umieścić szalkę Petriego, zawierającą płytkę krzemową ze wstępnie utwardzoną mieszaniną PDMS, w eksykatorze na około 20 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
  7. Wyjmij szalkę Petriego po 20 minutach i sprawdź, czy nie pozostały pęcherzyki powietrza, które można usunąć.
  8. Umieścić szalkę Petriego w piekarniku nastawionym na 65 °C na co najmniej 3 godziny.
  9. Po 3 godzinach wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i ostrożnie obierz utwardzony PDMS z wafla silikonowego.
  10. Urządzenia PDMS należy ciąć wzdłuż linii cięcia za pomocą noża lub skalpela. Przebij otwory na wlotach i wylotach każdego urządzenia za pomocą dziurkacza 1.2 mm. Wyczyść każde urządzenie PDMS taśmą klejącą, aby usunąć kurz lub resztki PDMS.
    1. Opcjonalnie przedmuchać azotem, aby usunąć resztki kawałków PDMS.
  11. Przygotować szkiełka podstawowe, czyszcząc je wodą z mydłem, a następnie izopropanolem i osuszyć azotem.
  12. Połącz czyste urządzenie PDMS z czystym szkiełkiem podstawowym w asherze plazmowym, aby zamknąć przewody przepływu. Użyj następujących ustawień: Moc: 50 W, Czas: 45 s, Czas opóźnienia odpowietrzania: 2 s, Gaz procesowy: Gaz 1 (Powietrze), Odpowietrznik: Oba zawory, Ograniczony czas odpowietrzania: 60 s, Czas odkręcania pompy: 10 s, Czas podtrzymania odpowietrznika: 0 s, Czas odcięcia gazu: 1 s, Pompowanie turbo włączone: 0. Odłącz wszystkie inne przewody gazowe.
    UWAGA: Ustawienia używane dla ashera plazmowego mogą się różnić w zależności od marki używanej ashera plazmowego.
  13. Przygotować roztwór silanu, dodając 50 μl silanu (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) do 950 μl oleju fluorowanego.
    UWAGA: Silan jest toksyczny. Proszę pracować pod wyciągiem.
  14. Przygotowany roztwór silanu narysuj w strzykawce, która jest podłączona do rurki teflonowej.
  15. Zasolić urządzenie, przepłukując przygotowany roztwór silanu przez wylot urządzenia.
  16. Umieść urządzenie w piekarniku nastawionym na 65 °C na 30 minut.
  17. Wyjmij zasolone urządzenie z piekarnika i wypłucz nadmiar silanu z urządzenia olejem fluorowanym.
  18. Umieść urządzenie z powrotem w piekarniku nastawionym na 65 °C na co najmniej 1 godzinę, aby zakończyć proces klejenia.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu.

2. Bezstratna enkapsulacja komórek

  1. Pobieranie komórek
    1. Ponownie zawiesić limfocyty T Jurkat w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w stężeniach 1,0x106 komórek/ml, 2,0x106 komórek/ml, 4,0x106 komórek/ml i 8,0x106 komórek/ml; pDC w pożywkach hodowlanych wolnych od surowicy krwiotwórczej (np. X-VIVO 15) w stężeniach 1,3x106 komórek/ml, 3,0x106 komórek/ml i 13,0x106 komórek/ml; Komórki A549 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) w stężeniu 1,0x106 komórek/ml.
      UWAGA: Rodzaj komórek i koncentracja komórek mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Na podstawie eksperymentu można również przeprowadzić znakowanie komórek.
  2. Ładowanie końcówką do wytwarzania kropel wodnych
    1. Przygotować olej fluorowany z 3% biokompatybilną mieszaniną środków powierzchniowo czynnych, dodając 3 ml środka powierzchniowo czynnego do 2 ml oleju fluorowanego.
      UWAGA: Stężenie środka powierzchniowo czynnego dodawanego do oleju fluorowanego decyduje o stabilności emulsji dla różnych okresów inkubacji. Stężenie środka powierzchniowo czynnego różni się w zależności od pożywki użytej dla określonych typów komórek.
    2. Narysuj mieszaninę fazy olejowej do strzykawki (1 ml). Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki i podłączyć ją do rurki teflonowej o odpowiedniej długości.
    3. Przygotować strzykawkę z próbką, pobierając do niej biokompatybilny olej mineralny. Usunąć pęcherzyki powietrza i podłączyć strzykawkę do rurki teflonowej o odpowiedniej długości.
    4. Przebić zatyczkę PDMS o średnicy 5 mm z utwardzonej płyty PDMS.
      UWAGA: Utwardzoną płytę PDMS można przygotować, wykonując kroki od 1.1 do 1.9. Użyj zwykłej płytki krzemowej zamiast sfabrykowanej płytki krzemowej.
    5. Przebij kolejny otwór w środku wtyczki za pomocą dziurkacza 1 mm.
    6. Włóż zatyczkę do końcówki pipety o pojemności 200 μl, od większego końca, tak aby ściśle przylegała.
      UWAGA: Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać większą objętość próbki i większe komórki. Do końcówek do pipet o pojemności 1 000 μl można stosować zatyczki o średnicy od 5 mm do 7 mm. Za pomocą korka o średnicy 5 mm można zassać próbkę o objętości około 400 μl do końcówki pipety. W przypadku zastosowania zatyczki o większej średnicy (7 mm) można zassać większą objętość próbki (około 900 μl).
    7. Włożyć rurkę, która jest podłączona do strzykawki, do zatyczki PDMS, która została włożona do końcówki pipety. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby napełnić podłączoną końcówkę pipety olejem mineralnym. Wypchnij całe resztki powietrza z końcówki pipety.
    8. Opuścić końcówkę pipety, połączoną ze strzykawką, w roztworze próbki i zassać około 150 μl próbki do końcówki.
    9. Powtórzyć kroki od 2.2.4 do 2.2.8 w celu przygotowania drugiej strzykawki z próbką.
    10. Ostrożnie umieścić wszystkie trzy przygotowane strzykawki na pompie strzykawkowej.
    11. Włożyć obie końcówki pipet, zawierające próbkę, do dwóch wewnętrznych wlotów chipa PDMS. Włóż rurkę zawierającą mieszaninę fazy olejowej do zewnętrznego wlotu.
    12. Ustawić wartość natężenia przepływu na pompie strzykawkowej w następujący sposób: roztwór fazy ciągłej: 600 μL/h, próbki komórek: 100 μL/h każda. Wprowadź i ustaw wymiary strzykawki.
      UWAGA: Ustawienia średnicy będą się różnić w zależności od typu strzykawki.
    13. Uruchomić pompę, aby przepłukać roztwór próbki przez wewnętrzne kanały urządzenia, a fazę olejową przez zewnętrzny kanał urządzenia.
    14. Podłącz rurkę o odpowiedniej długości do wylotu, aby rozpocząć zbieranie kropel, gdy tworzenie się kropel jest stabilne. Czas zbierania różni się w zależności od eksperymentu.
    15. Zbieraj kropelki w probówce z zamkiem. Dodać 200 μl pożywki RPMI (bez surowicy) na zebrane kropelki i inkubować próbkę.
      UWAGA: Czas inkubacji zebranych kropelek różni się w zależności od eksperymentu. Kropelki są zbierane w probówce blokującej, gdy analiza lub izolacja oparta na cytometrii przepływowej jest wykonywana po odzyskaniu komórek z kropel przez rozbicie emulsji. Możliwe jest zebranie kropelek w szklanej komorze, jeśli eksperyment wymaga analizy mikroskopowej w kropelce.
  3. Rozbijanie emulsji i pobieranie komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej
    1. Przygotować 20% roztwór 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanolu (PFO) (v/v) w oleju fluorowanym, dodając 2 ml PFO w 10 ml oleju fluorowanego.
    2. Usunąć nadmiar oleju z dna probówki zbiorczej, zawierającej kropelki, za pomocą strzykawki.
    3. Dodać 100 μl 20% roztworu PFO do emulsji, aby rozbić emulsję i uwolnić zamknięte komórki do fazy wodnej. Dotknij i krótko wymieszaj. W tym momencie nie wiruj. Inkubować przez 1-2 min.
      UWAGA: Ilość dodanego PFO zależy od ilości wytworzonych kropel. Dodawaj dodatkowo PFO, aż warstwa oleju całkowicie się rozpuści. Należy pamiętać, że PFO jest toksyczny dla komórek, a zbyt wysokie stężenia PFO lub zbyt długa inkubacja w PFO mogą prowadzić do zwiększonej śmierci komórek.
    4. Krótko wiruj roztwór przy najniższej możliwej wartości rcf przez 30 sekund.
    5. Przygotuj 100 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionego 2% surowicą cielęcą płodu (FCS) (2 ml FCS w 98 ml PBS).
    6. Natychmiast po odwirowaniu odpipetować 550 μl frakcji wodnej i przenieść ją do nowej probówki zamykającej zawierającej 500 μl zimnego roztworu PBS uzupełnionego 2% FCS, jak przygotowano w kroku 2.3.5. Niech resztki oleju opadną na dno nowej rurki blokującej.
    7. Ostrożnie odessać 950 μl fazy wodnej zawierającej komórki z tej rurki blokującej, nie zasysając resztek oleju i przenieść roztwór do nowej rurki blokującej.
    8. Obracaj komórki w nowej rurze blokującej przez 10 minut.
    9. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl zimnego roztworu PBS uzupełnionego 2% FCS, jak przygotowano w kroku 2.3.5.
      UWAGA: W zależności od eksperymentu, ogniwa można również ponownie zawiesić w dowolnym innym odpowiednim roztworze, takim jak pożywka. Wybarwić komórki, na podstawie eksperymentu, do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Parowanie komórek

  1. Pobieranie i barwienie komórek
    1. Policz limfocyty T Jurkat z kolby hodowlanej i odwiruj komórki z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut.
    2. Usuń supernatant i ponownie zawieś 1,0x106 komórek w 1 ml PBS, aby uzyskać stężenie 1,0x106 komórek/ml. Ilość dodanego PBS zależy od liczby komórek.
    3. Powtórzyć kroki 3.1.1-3.1.2 w celu przygotowania drugiej próbki limfocytów T Jurkat o tym samym stężeniu komórek.
    4. Przemyć obie próbki dwukrotnie 1 ml PBS przy 1 500 obr./min przez 5 minut.
    5. Ponownie zawiesić jedną próbkę komórkową barwnikiem 1,25 μM estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), a drugą próbkę komórkową barwnikiem 1,25 μM dalekiej czerwieni lub barwnikiem proliferacji komórek 1,25 μM przy stężeniu komórek 1,0x106 komórek/ml. Całkowity roztwór barwiący wynosi 1 ml na 1,0x106 komórek.
      UWAGA: Komórki mogą być znakowane różnymi barwnikami w zależności od filtrów dostępnych w cytometrze przepływowym lub w mikroskopie fluorescencyjnym.
    6. Inkubować próbki komórek z barwnikami przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Zatrzymaj reakcję barwienia, dodając 1 ml lodowatego FCS po 10 minutach.
    8. Przemyć próbki komórek dwukrotnie 1 ml PBS przy 1 500 obr./min przez 5 minut.
    9. Ponownie zawiesić próbki komórek w pożywce RPMI w stężeniu 10,0x106 komórek/ml dla każdego koloru.
  2. Ładowanie końcówką do produkcji kropelek hydrożelu agarozowego do parowania komórek
    Uwaga: W przypadku parowania komórek za pomocą kropelek hydrożelu agarozowego należy utrzymywać temperaturę systemu między 27 °C a 37 °C przez cały proces wytwarzania i zbierania kropel, aby zapobiec żelowaniu hydrożeli i zagwarantować żywotność komórek9.
    1. Rozpuścić agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania, podgrzewając ją do 75 °C w PBS o stężeniu 4% (w/v) i mieszać mieszaninę przez 20 minut.
    2. Wymieszać roztwór agarozy ze znakowanymi limfocytami T Jurkat, aby uzyskać stężenie agarozy 2% (w/v). Powtórz to dla drugiej próbki z inaczej oznakowanymi komórkami.
    3. Przygotować olej fluorowany z 2% mieszaniną środków powierzchniowo czynnych, dodając 20 ml środka powierzchniowo czynnego do 30 ml oleju fluorowanego (mieszanina fazy olejowej).
    4. Wykonaj kroki 2.2.2 - 2.2.14.
      UWAGA: Ze względu na lepki charakter agarozy o niskiej temperaturze topnienia i w celu zapewnienia stabilnej produkcji kropel, należy ustawić wartość natężeń przepływu na pompach strzykawkowych w następujący sposób: mieszanina fazy olejowej: 2 000 μL/h, próbki komórek: 200 μL/h. Wprowadź i ustaw wymiary strzykawki.
    5. Zebrać kropelki do probówki blokującej i inkubować kropelki w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
  3. Rozbijanie emulsji i pobieranie kulek agarozy do analizy FACS
    1. Po inkubacji kropel przez 60 minut, usunąć nadmiar oleju z rurki blokującej, zawierającej kropelki, za pomocą strzykawki.
    2. Dodać 200 μl PFO, aby usunąć interfazę oleju z kropel.
      UWAGA: Ilość PFO dodawanego do probówki zależy od ilości wytwarzanych kropel. Dodawaj dodatkowo PFO, aż warstwa oleju całkowicie się rozpuści.
    3. Zebrane kulki agarozy przemyć dwukrotnie 1 ml zimnego PBS, aby całkowicie usunąć olej przez odwirowanie z prędkością 1,500 obr./min przez 10 min.
    4. Analizuj zebrane kulki agarozy za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Możliwe jest również obserwowanie koralików pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy oparty na PDMS układ mikrofluidyczny z trzema wlotami o wysokości 25 mikronów (Rycina 1). W tej konfiguracji urządzenia zewnętrzny wlot służył do przepływu oleju z surfaktantem, a dwa wewnętrzne wloty do przepływu faz wodnych z zawiesinami komórek lub pożywkami. Po wygenerowaniu i zebraniu krople inkubowano przez kilka godzin poza układem przed przeprowadzeniem analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W okresie inkubacji składniki surowicy obecne w pożywkach mogą oddziaływać z surfaktantem, co może prowadzić do niestabilności i rozpadu kropel. Dlatego ważne jest dodanie zoptymalizowanego stężenia surfaktantu do oleju fluorowanego. Przetestowaliśmy stabilność monodyspersyjnych kropel zawierających bezsurowicze pożywki do hodowli komórek krwi uzupełnione 2% ludzką surowicą przy różnych stężeniach surfaktantu w oleju fluorowanym. Z Ryciny 2 wynika, że monodyspersyjne krople te pozostają wysoce stabilne do 24 godzin, gdy do fazy olejowej dodano co najmniej 3% surfaktantu. Podobne wyniki uzyskano w przypadku pożywek RPMI z dodatkiem i bez dodatku 10% FCS (dane niepokazane). Zatem stabilność kropel jest silnie uzależniona od optymalnych stężeń surfaktantu przy pracy z różnymi rodzajami pożywek hodowlanych i składnikami surowicy.

Aby zademonstrować wydajność enkapsulacji naszej metody, najpierw dokonaliśmy zasiewu komórek za pomocą rurek podłączonych do strzykawek, co stanowi najbardziej konwencjonalne podejście do zasiewu komórek (Rycina 3A). Zebraliśmy komórki T Jurkat w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL oraz 4,0x106 cells/mL, uzyskując wydajność enkapsulacji niższą od wartości przewidywanych (Rycina 3B). Przy stężeniu 1,0x106 cells/mL odsetek kropli zawierających pojedynczą komórkę wynosił 2,5%, co nie uległo zwiększeniu nawet przy zastosowaniu wyższych stężeń komórek. Aby zwiększyć wydajność ładowania komórek, zmodyfikowaliśmy nasze poprzednie podejście i zamontowaliśmy rurkę o połowę krótszą do podwyższonego statywu, a następnie wprowadziliśmy zawiesinę komórkową do części przyłączonej do urządzenia PDMS (Rycina 4A). Stosując tę metodę, enkapsulowaliśmy komórki T Jurkat w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL i 4,0x106 cells/mL, a także rzadkie pDCs w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL i 12,0x106 cells/mL. Oczekiwaliśmy poprawy wskaźników enkapsulacji dzięki zapobieganiu sedymentacji komórek za pomocą tej metody. Jednak we wszystkich badanych stężeniach wyniki eksperymentalne były znacznie niższe od przewidywanych wartości rozkładu Poissona (Rycina 4B oraz Rycina 4C).

Stosując naszą metodę ładowania przez końcówkę, zoptymalizowaliśmy szybkość enkapsulacji komórek w celu uzyskania wyników doświadczalnych zgodnych z wartościami przewidywanymi statystycznie (Rycina 5A). Dla różnych stężeń limfocytów T Jurkat uzyskana wydajność enkapsulacji odpowiadała naszym obliczonym wartościom przy wszystkich stężeniach (Rycina 5B). Co istotne, nawet w przypadku komórek adherentnych, takich jak komórki nowotworowe A549, które mają tendencję do agregowania się, zaobserwowaliśmy nieznacznie wyższą wydajność enkapsulacji przy stężeniu komórkowym 1,0x106 cells/mL (Rycina 5C). Oceniliśmy również skuteczność naszego systemu w enkapsulacji trudniej dostępnych i rzadkich pDC przy różnych stężeniach komórek: 1,0x106 cells/mL, 3,0x106 cells/mL oraz 13,0x106 cells/mL (Rycina 5D). Aby umożliwić ładowanie potencjalnie większych objętości przekraczających 200 µL, np. podczas pracy z liniami komórkowymi lub bardziej licznymi pierwotnymi komórkami odpornościowymi, zbadaliśmy również wydajność enkapsulacji komórek przy użyciu końcówek 1000 µL (niebieskich). Wykazaliśmy, że końcówki 1000 µL zapewniają podobną wydajność enkapsulacji w porównaniu z końcówkami 200 µL (żółtymi) (Rycina 5E).

W zależności od konstrukcji chipa i badanego problemu badawczego, nasza technika ładowania końcówką może być stosowana do wprowadzania komórek albo przez jeden wlot, w celu badania heterogeniczności komórkowej, albo przez wiele wlotów równolegle, w celu rozszyfrowania oddziaływań komórkowych. Porównaliśmy ładowanie komórek T Jurkat (przy stężeniu 10,0x106 cells/mL) z jednego wlotu z ładowaniem dwóch różnie oznakowanych populacji komórek T Jurkat (przy łącznym stężeniu 10,0 x106 cells/mL) z dwóch wlotów (Rycina 6A i Rycina 6B). Podczas enkapsulacji krople generowano przy użyciu agarozy o ultraniskiej temperaturze żelowania, a po wytworzeniu poddano je żelowaniu w celu utworzenia kulek hydrożelu agarozowego, co umożliwiło późniejszą analizę via mikroskopia i cytometria przepływowa (Rycina 6C i Rycina 6D). Analiza mikroskopowa wykazała, że parowanie komórek osiągnięto przy różnych kombinacjach, co wskazuje na wysokoprzepustowe parowanie komórek (Rycina 6C). Ponadto analiza tej samej populacji kulek hydrożelowych za pomocą cytometrii przepływowej wykazała, że kulki bez komórek można oddzielić od kulek z komórkami na podstawie wyraźnego wzorca rozproszenia przedniego (FSC, wielkość) i bocznego (SSC, ziarnistość) (Rycina 6D). Gating populacji kulek bez komórek potwierdził brak enkapsulacji komórek poprzez brak sygnałów fluorescencyjnych. Dodatkowo gating populacji kulek z komórkami ujawnił istnienie wielu subpopulacji, co wskazuje na enkapsulację różnie oznakowanych komórek T Jurkat. Nasze wyniki demonstrują, że na podstawie analizy mikroskopowej i cytometrycznej można osiągnąć efektywne parowanie komórek, a wydajność enkapsulacji była nieco wyższa w porównaniu do przewidywań rozkładu Poissona (Rycina 6E).

Schemat układu mikrofluidycznego do generowania kropel; przepływ oleju, medium i komórek; zaznaczone rozmiary kanałów i filtrów.
Rysunek 1. Mikrofluidyczne urządzenie do generowania kropel oparte na PDMS z trzema wlotami i jednym wylotem. Urządzenie składa się z trzech wlotów służących odpowiednio do wprowadzenia ciągłej fazy olejowej, pożywki do hodowli komórek oraz zawiesiny komórek. Wygenerowane krople są zbierane na wylocie. Próbki przepływają laminarnie do złącza skupiającego przepływ, gdzie zostają zamknięte w kropelkach. Na wlotach struktury filtrujące zatrzymują duże cząstki, takie jak agregaty białek lub komórek. Średnica szczelin w strukturze filtra jest zaznaczona niebieskimi liniami. Średnica kanałów przy dyszy produkcyjnej jest zaznaczona czerwonymi liniami. Wysokość kanałów na całym chipie wynosiła 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza powierzchni kropli w czasie; wykresy porównują stężenia surfaktantu w badaniu mikrofluidyki.
Rycina 2. Stabilność kropli w ciągu 24 godzin. Wykresy przedstawiają powierzchnię kropli zawierających bezsurowicze podłoże hodowlane dla komórek krwiotwórczych + 2% surowicy ludzkiej w czasie dla trzech różnych stężeń surfaktantu A) 0.5% B) 3% C) 5%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego z chipem PDMS oraz wykresem stężenia komórek w funkcji liczby kropli.
Rysunek 3. Metoda załadunku komórek z wykorzystaniem rurek. Komórki Jurkat-T są ładowane do urządzenia w różnych stężeniach przy użyciu strzykawki połączonej z rurkami. A) Ilustracja przedstawia układ doświadczalny. B) Wydajność enkapsulacji komórek określona za pomocą mikroskopii świetlnej. Kropki: wartości wyznaczone doświadczalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces enkapsulacji komórek, mikrofluidyczny układ PDMS, analiza wykresu kropel, wpływ stężenia komórek.
Rycina 4. Enkapsulacja różnych typów komórek przy różnych stężeniach z wykorzystaniem metody załadunku przez pionową rurkę. W celu określenia wydajności enkapsulacji komórek przeprowadzono enkapsulację limfocytów T Jurkat oraz pDC (o różnych stężeniach). A) Ilustracja przedstawia układ eksperymentalny dla metody załadunku przez pionową rurkę. B) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji limfocytów T Jurkat. C) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji pDC. Kropki: wartości określone eksperymentalnie; Linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Układ urządzenia mikrofluidycznego i wykres generowania kropel; analiza stężenia komórek; system PDMS.
Rycina 5. Metoda ładowania przez końcówkę w celu enkapsulacji różnych typów komórek. A) Schematyczne przedstawienie techniki ładowania przez końcówkę. B) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji komórek Jurkat. C) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji komórek A549. D) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji pDCs. E) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji limfocytów T Jurkat przy użyciu końcówek do pipet 200 µL (żółte) i końcówek do pipet 1 000 µL (niebieskie). Kropki: wartości wyznaczone eksperymentalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikrofluidyki kropelkowej; schemat, wykres, mikroskopia; rozkład Poissona, liczenie komórek.
Rycina 6. Parowanie komórek w kropelkach. A) Schematyczne przedstawienie metody ładowania przez końcówkę w celu parowania różnych komórek z 2 wlotów w kropelkach. B) Wykres przedstawia enkapsulację komórek T Jurkat z wykorzystaniem jednego wlotu lub dwóch wlotów równolegle. Stężenie komórek dla jednej końcówki wynosi 2.0x106 cells/mL, a stężenie komórek dla dwóch końcówek wynosi dla obu 1.0x106 cells/mL. Kropki: wartości określone eksperymentalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. C) Nałożone obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kulek hydrożelowych i znakowanych komórek T Jurkat. D) Wykres przedstawia analizę cytometryczną komórek sparowanych w hydrożelowych kuleczkach agarozowych. Wykres pokazuje zarówno rozproszenie przednie (forward scatter), jak i boczne (sideward scatter). E) Porównanie liczby komórek w hydrożelowych kuleczkach agarozowych wykrytych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Słupki: wartość średnia; wąsy: błąd standardowy średniej, n ≥ 4. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym protokole zademonstrowaliśmy wydajną i prostą technikę ładowania i hermetyzowania komórek w kropelkach w celu wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek oraz wykonywania kontrolowanego parowania komórek w badaniach interakcji komórkowych. Ponadto porównaliśmy kilka konwencjonalnych podejść do ogniw obciążnikowych z urządzeniami mikroprzepływowymi i wykazaliśmy, że nasze podejście do ładowania końcówek jest bardziej wydajną techniką w porównaniu z innymi metodami.

Badanie próbek klinicznych lub rzadkich typów komórek, których liczba jest rzadka w mikrofluidyce kropelkowej, wiąże się z pewnymi nieodłącznymi wyzwaniami. Jak również wykazaliśmy, komórki mają tendencję do osadzania się w strzykawkach i na powierzchni rurki, uniemożliwiając w ten sposób enkapsulację komórkową w celu dostosowania się do przewidywanych wartości. Aby uniknąć tego problemu, niektóre grupy używają mieszadeł w strzykawkach. Jednak w przypadku stosowania rzadkich i ograniczonych populacji komórek, całkowita objętość komórek jest również ograniczona, co ogranicza użycie dużych strzykawek i mieszadełek. Co więcej, zastąpiliśmy również częściej używane rurki rurkami pokrytymi teflonem, aby zapobiec przyczepianiu się komórek, ale ta metoda nie poprawiła wyników, a jeśli rurka jest zbyt długa, problem przyczepiania się komórek pogarsza się (dane nie pokazane). Alternatywnie zastosowaliśmy pionowe ładowanie rurki, w którym komórki były ładowane do rurki, a nie do strzykawki, aby zapobiec utracie komórek w dużych objętościach strzykawek. Za pomocą tej techniki można załadować komórki o małej objętości próbki, np. pDC, które są rzadkie i ograniczone. Ponadto próbka z rurki jest ładowana do urządzenia pionowo, aby zapobiec sedymentacji komórek. Rurka używana do wysiewu komórek ma niewielkie wymiary i można ją porównać do mikrokanałów. Przepływ w rurze jest napędzany ciśnieniem i podąża za parabolicznym profilem prędkości26. Oznacza to, że maksymalna prędkość przepływu znajduje się w środku rurki, a minimalna prędkość znajduje się na krawędziach rurki27. Podczas przepłukiwania populacji komórek przez rurkę, gradient prędkości powoduje, że komórki są popychane w kierunku krawędzi, na których się osiadają, ponieważ prędkość na granicy jest bliska zeru. Sedymentacja lub osiadanie komórek w rurkach zmniejsza w ten sposób skuteczność enkapsulacji, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, w których dane eksperymentalne nie zgadzały się z przewidywanym modelem.

Innym powszechnie stosowanym rozwiązaniem stosowanym przez naukowców, pracujących z mikrofluidyką kropelkową, jest zwiększenie gęstości pożywki do hodowli komórkowej poprzez dodanie odczynników dopasowujących gęstość, takich jak jodinaksol, aby zapobiec sedymentacji komórek w strzykawkach19. Jednak odczynniki dopasowujące gęstość mogą wpływać na zachowanie komórek i niekorzystnie wpływać na wydzielanie cytokin przez komórki (dane nie pokazane)28.

Mimo że kilka małych i dużych modyfikacji konwencjonalnych technik ładowania komórek wykazało nieznaczną poprawę wydajności enkapsulacji, uzyskane wyniki eksperymentalne nadal nie zgadzały się z obliczeniami teoretycznymi. Jednak dzięki podejściu do ładowania końcówek mogliśmy przezwyciężyć ograniczenia poprzednich metod i skuteczność enkapsulacji regulowaną przez statystyki Poissona. Technika ta jest korzystna nie tylko do ładowania komórek zawiesinowych, ale może być również stosowana do ładowania komórek przylegających, takich jak pierwotne keratynocyty i A549, do chipów mikroprzepływowych. W przypadku stosowania licznych linii komórkowych, na przykład A549, K562 itp., Można użyć większej objętości próbki. W związku z tym, w zależności od objętości próbki, można również stosować końcówki do pipet o różnych rozmiarach, a tę prostą technikę można dostosować zarówno do enkapsulacji jednokomórkowej, jak i wielokomórkowej.

Podczas gdy niskie stężenie komórek jest wymagane, aby zapewnić zamknięcie pojedynczych komórek w kropelkach, pożądane są wyższe stężenia komórek, aby zwiększyć średnią liczbę komórek zamkniętych w każdej kropli w badaniach związanych z parowaniem komórek. Istnieje kilka opisanych wcześniej metod łączenia komórek odpornościowych w pary na chipach mikroprzepływowych lub mikrofabrykowanych nanodołkach 29,30,31. W mikrofluidyce kropelkowej statystyka Poissona mówi, że parowanie komórek 1:1 dla dwóch różnych typów komórek można osiągnąć przy optymalnych stężeniach komórek. Opierając się na przewidywaniach Poissona, istnieje również prawdopodobieństwo, że kropelki mogą zawierać inne kombinacje. Podczas gdy parowanie komórek 1:1 może być pożądane do badania interakcji komórkowych na poziomie pojedynczej komórki i skutkuje lepszym zrozumieniem komórek, parowanie wielu komórek ma również poważne zalety. Pozwala zrozumieć wpływ wielu komórek jednego typu komórek na drugi typ komórek. Wzajemne oddziaływanie między różnymi komórkami odpornościowymi pomaga wygenerować skuteczną odpowiedź immunologiczną przeciwko wielu infekcjom i patogenom, a także zwiększa wytrzymałość naszego układu odpornościowego32. W związku z tym komunikacja komórkowa może być badana z dużą precyzją w różnych kontekstach, np. 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1 itp. Pozwoliło to lepiej zrozumieć, w jaki sposób pojedyncze komórki lub pary komórek kontrolują indukcję odpowiedzi immunologicznej. Jest to szczególnie interesujące dla badania na przykład zdolności komórek NK lub cytotoksycznych limfocytów T do seryjnego zabijania odpowiednich komórek docelowych.

Jak wspomniano, w przypadku wielokrotnej enkapsulacji komórek w kropelkach pożądane są wyższe stężenia komórek. Jednak podczas ładowania komórek z jednego wlotu w celu enkapsulacji komórek, wyższe stężenia próbki komórek mogą powodować agregację komórek na wlocie. Skutkuje to niższymi wskaźnikami enkapsulacji i większymi odchyleniami od wartości teoretycznych. Aby uniknąć tego problemu, ogniwa można również ładować z dwóch oddzielnych wlotów. Teoretycznie możliwe byłoby opracowanie innych urządzeń mikroprzepływowych z wieloma wlotami, aby osiągnąć jeszcze wyższe poziomy enkapsulacji komórek, gdy uzasadniona jest średnia na x komórek. W tym badaniu zbadaliśmy skuteczność enkapsulacji limfocytów T Jurkat po załadowaniu zarówno z jednego wlotu, jak i dwóch wlotów przy użyciu tego samego całkowitego stężenia i uzyskaliśmy podobną skuteczność enkapsulacji. Ta modyfikacja pozwala naukowcom sparować różne typy komórek na chipie.

Chociaż ta metoda pomaga w ładowaniu komórek do urządzeń mikroprzepływowych bez znacznej utraty komórek, istnieją pewne środki ostrożności, o których należy pamiętać. Podczas napełniania strzykawek olejem mineralnym i zasysania próbki komórek do końcówek pipet należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, a cały system powinien być wolny od powietrza. Należy również pamiętać, że olej mineralny nie powinien mieszać się z próbką. Końcówki pipet, zawierające próbki, powinny być mocno włożone we wloty urządzenia mikroprzepływowego, z zachowaniem najwyższych środków ostrożności, aby zapobiec wyciekom i dalszemu wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza. Podsumowując, ładowanie końcówek jest prostą, ale solidną techniką, która pozwala na wysokoprzepustową analizę zachowania komórek poprzez enkapsulację komórek bez znacznych strat komórek w opłacalny sposób. W przypadku stosowania z optymalnymi stężeniami próbki na wlocie, to podejście polegające na ładowaniu komórek końcówkami do pipet jest bardzo elastyczne i może być dostosowane do różnych typów komórek, zwłaszcza do rzadkich pierwotnych komórek odpornościowych, w celu uzyskania wyższej skuteczności enkapsulacji, zbliżonej do przewidywanych modeli.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Politechnice w Eindhoven za hojne wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanol Sigma-Aldrich171468-5G
1H,1H,2H,2H-PerfluorooktyltrietoksysilanFluorochem/UKS13150Silan (toksyczny)
Agaroza (bardzo niska temperatura żelowania)Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD  Wegwerpspuiten met Luer-Lok-puntenFisher Scientific10630694Strzykawka
biopsji 1,2 mmHarris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670eBioscience65-0840-85
CellTrace CFSEInvitrogenC34554
CellTrace Far Red CellInvitrogenC34564
Probówki EppendorfEppendrofProbówki Safe-Lok 1 ml i 2 ml
Szkiełko szkiełkoweSigma AldrichCLS294775X38-72EACorning, gładkie L i razy; W 75  mm i razy; 38  mm
Pompy HarvardAparatura HarvardaC-400750; C-400727Pompy strzykawkowe
HFE-7500 3M Novec Płyn inżynieryjnyFluorochem/UK51243Olej fluorowany
Dziurkacz do biopsji Kai 5 mmAmstel Medical1980130
Luer stubInstechlabs/USALS20SKróciec Luer, 20ga (różowy) x 0,5 cala (12 mm), niesterylny
Olej mineralny (lekki)Sigma AldrichM8410-1L
Fosforan buforowana sól fizjologicznaSigma-AldrichP4417-50TABTabletki
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500)Sphere Fluidics020317-09Surfaktant
Plasma AsherEmitechK1050X Pył plazmowy
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Silikonowa baza elastomerowa 184Sylgard9355218PDMS
Środek utwardzający z elastomeru silikonowego Sylgard9355218Utwardzacz 
Łącznik cewnika ze stali nierdzewnejInstechlab/USASC20/1520ga x 15mm, niesterylny
rurki teflonowe TFE RurkaSigma-Aldrich58696-U  L i razy; O.D. & czasy; ID 50 stóp i razy; 1/16 cala &czasy; 0,031 cala
Thinky mikser ARE-250EX-4025FMieszanka kondycjonująca
do Probówki PTFE

Bibliografia

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740(2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732(2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43(2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881(2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110(2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317(2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898(2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139(2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42(2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175(2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroprzep ywy kropelkoweenkapsulacja kom rekadowanie ko c wk pipetyrozk ad Poissonacytometria przep ywowaanaliza mikroskopowakoraliki hydro elowerozbijanie emulsjipompa strzykawkowadreny teflonowe
Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.