Method Article

Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57851

⸱

July 3rd, 2018

 ,  , 
1Center for Molecular and Cellular Bioengineering, TU Dresden, 2Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich at the University Hospital Carl Gustav Carus of TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalność komórek beta jest ważna dla homeostazy glukozy we krwi, która jest oceniana w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą genetycznie zakodowanego reportera dla napływu wapnia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki beta trzustki reagują na rosnące stężenie glukozy we krwi poprzez wydzielanie hormonu insuliny. Dysfunkcja komórek beta prowadzi do hiperglikemii i poważnych, zagrażających życiu konsekwencji. Zrozumienie, w jaki sposób komórki beta działają w warunkach fizjologicznych oraz jakie czynniki genetyczne i środowiskowe mogą powodować ich dysfunkcję, może prowadzić do lepszych opcji leczenia pacjentów z cukrzycą. Zdolność do pomiaru poziomu wapnia w komórkach beta służy jako ważny wskaźnik funkcji komórek beta, ponieważ napływ jonów wapnia wyzwala uwalnianie insuliny. W tym miejscu opisujemy protokół monitorowania stymulowanego glukozą napływu wapnia do komórek beta danio pręgowanego za pomocą GCaMP6s, genetycznie kodowanego czujnika wapnia. Metoda umożliwia monitorowanie wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia z rozdzielczością pojedynczej komórki w wysepkach zamontowanych ex vivo. Odpowiedź na glukozę komórek beta w obrębie tej samej wyspy trzustkowej może być uchwycona jednocześnie przy różnych stężeniach glukozy, co sugeruje obecność funkcjonalnej heterogeniczności wśród komórek beta danio pręgowanego. Co więcej, technika ta zapewnia wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną, co ujawnia oscylacyjny charakter napływu wapnia po stymulacji glukozą. Nasze podejście otwiera drzwi do wykorzystania danio pręgowanego jako modelu do badania wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na funkcjonowanie i dysfunkcję komórek beta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz poziom glukozy we krwi utrzymuje się w wąskim zakresie, w dużej mierze dzięki funkcji endokrynologicznej trzustki. Hormonalną rolę trzustki pełnią wysepki Langerhansa, które zawierają komórki wydzielające hormony. Komórki beta wydzielające insulinę są odpowiedzialne za obniżenie poziomu glukozy we krwi po posiłku zawierającym węglowodany. Niewystarczające wydzielanie insuliny przez komórki beta może skutkować cukrzycą1, która charakteryzuje się utrzymującym się wysokim poziomem glukozy we krwi. Cukrzyca typu 1 i typu 2, która obecnie dotyka ponad 400 milionów ludzi na całym świecie, prowadzi do zachorowalności i śmiertelności2. Badając czynniki molekularne i środowiskowe, które przyczyniają się do dysfunkcji komórek beta, lepiej zrozumiemy, w jaki sposób zaczyna się i postępuje cukrzyca typu 2. Ponadto zdolność do różnicowania ludzkich komórek macierzystych w funkcjonalne komórki beta in vitro może stanowić źródło nowych komórek beta do terapii wymiany komórek w cukrzycy typu 1. W tym celu ważne jest zbadanie funkcji i dojrzewania komórek beta w modelowych organizmach genetycznych, aby uzyskać wiedzę niezbędną do wytwarzania funkcjonalnych komórek beta w naczyniu.

Funkcjonalność komórek beta może być monitorowana na poziomie całych wysp trzustkowych, określając ilościowo całkowitą ilość insuliny wydzielanej w odpowiedzi na stymulację glukozą. To kumulatywne podejście bada wysepkę jako pojedynczą grupę komórek bez różnicowania indywidualnych właściwości komórki. Jednak analiza odpowiedzi glukozy poszczególnych komórek beta ujawniła różnorodność właściwości funkcjonalnych komórek beta i obecność heterogeniczności3. Aby ocenić funkcję poszczególnych komórek beta, możliwe jest monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowych, które prowadzą do wydzielania insuliny4. Wydzielanie insuliny poprzedzone jest wejściem glukozy do komórek beta. Glukoza, która dostaje się do komórek beta, jest szybko metabolizowana do ATP. Wyższe wewnątrzkomórkowe stężenia ATP zmniejszają otwarte prawdopodobieństwo wrażliwych na ATP kanałów jonowych potasu, prowadzących do depolaryzacji komórek beta. Depolaryzacja otwiera wrażliwe na napięcie kanały jonowe wapnia i zwiększa wewnątrzkomórkowy wapń. Z kolei wapń wyzwala egzocytozę insuliny, która jest uwalniana w krążeniu i obniża poziom glukozy poprzez promowanie wykorzystania glukozy5,6,7.

Do zbadania funkcji komórek beta zastosowano kilka strategii, w tym monitorowanie potencjału błony8, bezpośrednią wizualizację egzocytozy pęcherzyków insuliny9, oraz ilościowe określenie wewnątrzkomórkowego napływu Ca2+ jako wskaźnik reakcji na glukozę10. Wśród nich obrazowanie wewnątrzkomórkowego Ca2 + ma tę zaletę, że zwiększa skalę analizy do wielu pojedynczych komórek w obrębie tej samej wysepki11,12, co pozwala na bezpośrednie porównanie reakcji na glukozę między poszczególnymi komórkami beta. Wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ można monitorować za pomocą barwników fluorescencyjnych wrażliwych na wapń13 lub genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECIs)14. Podczas gdy barwniki wskaźnikowe wapnia nie mają swoistości dla typu komórkowego, GECI mogą być wyrażane w określonym typie komórki przez określone promotory. Ponadto nowa generacja GECI, takich jak GCaMP6, zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu wraz z szybszą dynamiką czasową15. W tym miejscu opisujemy użyteczność nowej generacji GECI, w szczególności GCaMP6s, do wizualizacji wapnia w komórkach beta w rozdzielczości pojedynczej komórki. Stosujemy tę metodę do pierwotnej wysepki danio pręgowanego jako naszego wybranego modelu. Podczas rozwoju embrionalnego komórki beta w pierwotnej wyspie trzustkowej pochodzą z grzbietowych i brzusznych zawiązków trzustki16. Pierwotna wysepka znajduje się w stereotypowym położeniu anatomicznym w trzustce danio pręgowanego, co umożliwia jej łatwą identyfikację i izolację. Komórki beta w pierwotnej wyspie trzustkowej są niezbędne do regulacji poziomu glukozy, ponieważ ich ablacja genetyczna prowadzi do hiperglikemii17,18. Co więcej, te komórki beta stają się wrażliwe na glukozę podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego19. Protokół ten można również zastosować do obrazowania wtórnych wysp trzustkowych, które tworzą się w stadiach postembrionalnych. Protokół pozwala na obrazowanie komórek beta ex vivo, na późniejszych etapach rozwoju i przy określonych stężeniach glukozy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Ustawę o Dobrostanie Zwierząt i za zgodą Landesdirektion Sachsen, Niemcy (AZ 24–9168.11-1/2013-14, T12/2016).

1. Przygotowanie

UWAGA: Ten protokół służy do obrazowania ex vivo pierwotnej wysepki danio pręgowanego z podwójnej transgenicznej Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)19 danio pręgowany. W tej linii transgenicznej promotor insuliny (ins) napędza specyficzną dla komórek beta ekspresję dwóch transgenów: nls-Renilla-mKO2, który oznacza jądro komórek beta monomeryczną fluorescencją pomarańczy Kusabira 2 (mKO2); i GCaMP6s15, który emituje zieloną fluorescencję w odpowiedzi na wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Specyficzna dla komórek beta ekspresja GCaMP6s umożliwia badanie reakcji komórek beta na glukozę bez zakłóceń spowodowanych zmianami wapnia w otaczających typach komórek.

  1. Przygotować świeży bulion fibrynogenu (10 mg/ml), rozpuszczając 10 mg fibrynogenu bydlęcego w 1 ml roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego Ca2+/Mg2+ w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Energicznie wirować, aż proszek fibrynogenu całkowicie się rozpuści. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej jeszcze przez co najmniej 15 minut.
    UWAGA: Wywar można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2–3 godziny. Wyrzuć bulion, jeśli roztwór zacznie polimeryzować i stanie się lepki.
  2. Przygotować roztwór roboczy fibrynogenu (3,3 mg/ml), trzykrotnie rozcieńczając zapas fibrynogenu w HBSS. Na przykład wymieszaj 300 μl fibrynogenu z 600 μl HBSS, aby przygotować 900 μl roztworu roboczego fibrynogenu.
  3. Przygotować roztwór trombiny (10 j./ml), rozpuszczając 10 jednostek trombiny w 1 ml HBSS lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Roztwór ten można przygotować wcześniej, podzielić na porcje po 50 μl i zamrozić w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotuj 200 mM roztworu D-glukozy, rozpuszczając 1,8 g D-glukozy w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
  5. Przygotować 300 mM roztwór KCl, rozpuszczając 1,1 g KCl w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
  6. Zaopatrz się w naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm do montażu wysepek.
  7. Do wypreparowania i zamontowania wysepki należy użyć mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w lampę fluorescencyjną i kostkę z czerwonym filtrem (TRITC: wzbudzenie: 532–554 nm, emisja: 570–613 nm; lub Texas-Red: wzbudzenie: 540–580 nm, emisja: 592–667 nm).
  8. Do obrazowania napływu wapnia do komórek beta należy użyć odwróconego mikroskopu konfokalnego (Zeiss LSM 780 lub podobnego) z obiektywem pneumatycznym 20X (0,8 NA) i wyposażonego w uchwyt na płytki ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
  9. Przygotować roztwór sulfonianu metanu trikainy (MS222) o stężeniu 200 mg/l do eutanazji danio pręgowanego.
  10. Zaopatrz się w szalki Petriego o średnicy 90 mm do rozbioru danio pręgowanego.

2. Pierwotna wysepka pręgowanego - sekcja i montaż

  1. Poddaj rybę eutanazji za pomocą przedłużonej inkubacji w MS222. W tym celu delikatnie wyjmij rybę ze zbiornika za pomocą sieci rybackiej i inkubuj ją na szalce Petriego zawierającej roztwór MS222, aż zwierzę nie wykaże żadnych ruchów operkularnych (skrzeli); Zazwyczaj zajmuje to 5 minut. Przenieść rybę na szalkę Petriego zawierającą roztwór HBSS z Ca2+/Mg2+.
  2. Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w lampę fluorescencyjną i czerwoną kostkę filtra przeanalizuj skórę pokrywającą prawą stronę brzucha zwierzęcia, aby wyizolować trzustkę.
    1. W tym celu przetnij skórę danio pręgowanego od ust do płetwy odbytowej za pomocą ostrych kleszczy. Oderwij przeciętą skórę, aby odsłonić brzuch; To cięcie odsłania narządy wewnętrzne. Wykorzystując czerwoną fluorescencję ekspresji mKO2 w komórkach beta, ustal położenie wysp trzustkowych za pomocą badania wzrokowego pod mikroskopem. W razie potrzeby usuń płaty wątroby, ponieważ mogą one zakryć wyspę, utrudniając jej znalezienie.
      UWAGA: Pierwotna wysepka znajduje się w pobliżu przedniej części brzucha, zwykle po prawej stronie.
  3. Oczyść pierwotną wyspę trzustkową, ostrożnie usuwając otaczające tkanki, takie jak wątroba i adipocyty. Podejmij środki ostrożności, aby nie zranić ani nie szturchnąć wysepki; Po oczyszczeniu otaczającej tkanki poszczególne komórki na powierzchni wyspy stają się rozpoznawalne.
  4. Odpipetować kroplę 30 μl HBSS na środek naczynia ze szklanym dnem. Przenieś rozciętą wysepkę do tej kropli.
  5. Ostrożnie przemyć wysepkę raz HBSS i raz 30 μl roztworu roboczego fibrynogenu (3,3 mg/ml). Upewnij się, że nie wysuszasz wysepki podczas etapów mycia, ponieważ niezastosowanie się do tego powoduje śmierć komórki.
  6. Powoli i delikatnie dodać 10 μl roztworu trombiny (10 j./ml). Pozostaw wysepkę i naczynie nietknięte na 15–20 minut. Zauważ, że kropla fibrynogenu-trombiny stanie się w tym momencie lepka i lekko nieprzezroczysta.

3. Obrazowanie na żywo ex vivo intensywności fluorescencji GCaMP na pierwotnych wysepkach danio pręgowanego

  1. Dodaj 200 μl HBSS na wierzch formy i ostrożnie umieść naczynie na uchwycie płytki mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu pneumatycznego 20X, 0,8 NA, do obrazowania konfokalnego. Zlokalizuj wysepkę za pomocą opcji jasnego pola.
  2. Używając filtra do czerwonej fluorescencji, aby zobaczyć fluorescencję jądrową mKO2 w komórkach beta, skup się na wysepce. Poszczególne jądra powinny być wyraźnie widoczne.
  3. Zlokalizuj wyraźną płaszczyznę obrazowania, ręcznie zmieniając płaszczyznę ogniskową mikroskopu konfokalnego tak, aby przesuwała się przez grubość wysepki wzdłuż jej osi z. Upewnij się, że płaszczyzna obrazowania zawiera wystarczającą liczbę (50-100) komórek beta do obrazowania, a jasność fluorescencji jądrowej mKO2 jest jednolita, szczególnie w środku wysepki.
  4. Ustaw sekwencyjną akwizycję dla fluorescencji GCaMP6s i mKO2, korzystając z następujących ustawień w "Smart Setup Menu": GCaMP6s, wzbudzenie: 488 nm, emisja: 500–555 nm, fałszywy kolor: zielony (Wybierz "GFP"); mKO2, wzbudzenie: 561 nm (mCherry), emisja: 570–630 nm, fałszywy kolor: czerwony (Wybierz "mCherry").
    UWAGA: Przy tym ustawieniu kanał czerwony będzie rejestrował położenie jąder komórek beta, podczas gdy kanał zielony będzie rejestrował intensywność fluorescencji GCaMP.
  5. W "Trybie akwizycji" ustaw rozdzielczość obrazu na 1,024 x 1,024 pikseli, prędkość na 10 i uśrednianie na 1. Zainicjuj nagrywanie ciągłe, wybierając opcję "Szeregi czasowe" i ustawiając "Czas trwania" na 500 cykli, z czasem akwizycji około 2 s na klatkę.
    UWAGA: Pierwsze 50 klatek szeregów czasowych odpowiada aktywności komórek beta przy stężeniu glukozy 5 mM. Jest to odpowiedź wyjściowa. Reagująca komórka beta z czasem będzie wykazywać narastanie i zanikanie intensywności zielonej fluorescencji. Zaobserwowaliśmy, że kilka (1-5%) komórek beta oscyluje przy 5 mM glukozy.
  6. Miej oko na cykl obrazowania. Po pierwszych 50 klatkach zwiększ stężenie glukozy w otaczającym roztworze do 10 mM bez przerywania zapisu.
    1. Nie zakłócając akwizycji obrazu, delikatnie odpipetować 5 μl 200 mM roztworu D-glukozy na wierzch żelu przytrzymującego wyspę trzustkową. Zdobądź 150 ramek przy 10 mM glukozy.
      UWAGA: Wzrost stężenia glukozy zwiększy liczbę komórek beta ulegających oscylacjom fluorescencyjnym GCaMP w kanale zielonym.
    2. Upewnij się, że jądra komórek pozostają stabilne podczas procesu. Jeśli wysepka mocno się trzęsie podczas akwizycji, a jądra oddalają się od płaszczyzny ogniskowej, wyrzuć próbkę (jeśli to konieczne).
    3. Odczekać wystarczająco długi okres czasu, aby umożliwić polimeryzację formy fibrynogenowo-trombinowej, aby zapewnić stabilność kolejnych próbek.
  7. Po 200 klatkach należy dodatkowo zwiększyć stężenie roztworu do 20 mM, delikatnie pipetując 10 μl 200 mM roztworu D-glukozy. Zdobądź 150 klatek dla koncentracji 20 mM.
  8. Po 350 klatkach zdepolaryzuj wysepkę za pomocą 30 mM KCl. W tym celu dodać 20 μl roztworu podstawowego KCl o stężeniu 300 mM. Na tym etapie obserwuj, że oscylacje fluorescencji GCaMP6s zatrzymają się i utrwalą z dużą intensywnością; Komórki beta, które nie reagowały na glukozę, mogą również wykazywać wzrost intensywności zielonej fluorescencji po dodaniu KCL.

4. Kwantyfikacja śladu fluorescencji GCaMP dla poszczególnych komórek beta

UWAGA: Aby prześledzić i określić ilościowo reakcje poszczególnych komórek beta na różne poziomy glukozy, określ ilościowo intensywność fluorescencji GCaMP dla całego okresu obrazowania. Oznaczanie ilościowe przeprowadza się w rozdzielczości komórkowej. W tym celu należy użyć FIJI20 do wyodrębnienia wartości intensywności fluorescencji GCaMP z obrazów (kroki 4.1–4.6) oraz oprogramowania arkusza kalkulacyjnego lub R21 do przeprowadzenia analizy (kroki 4.8–4.9).

  1. Otwórz plik obrazu na FIDŻI za pomocą "LSM Toolbox". W tym celu wybierz "Wtyczka | Zestaw narzędzi LSM | Pokaż przybornik LSM". W "LSM Toolbox" kliknij "Otwórz LSM" i wybierz plik obrazu.
    Uwaga: W przypadku formatów, które nie są obsługiwane przez "LSM Toolbox", najpierw przekonwertuj je na tiff w celu analizy.
  2. Wyodrębnij odpowiedzi komórek za pomocą narzędzia do analizy obszaru zainteresowania (ROI) na FIDŻI. Otwórz "Menedżera ROI" w menu "Analizuj" w sekcji "Narzędzia". Ręcznie narysuj ROI za pomocą "narzędzia do zaznaczania wielokątów" znajdującego się na pasku narzędzi.
  3. Narysuj ROI w czerwonym kanale, w którym widoczne są jądra komórek beta. Wybierz ROI tak, aby obejmował obszar większy niż jądro komórki, aby uwzględnić część cytoplazmy komórki. Upewnij się, że pozycja ROI jest spójna między ramkami i dostosuj pozycję, jeśli to konieczne.
  4. Dodaj wybrane ROI do "Menedżera ROI", klikając przycisk "Dodaj [t]". Wybierz i dodaj wiele ROI do ROI, aby uzyskać dane z wielu komórek.
  5. Następnie z menu "Analizuj" wybierz "Ustaw pomiary". Wybierz "Gęstość zintegrowana", aby określić ekstrakcję całkowitej intensywności fluorescencji w obszarze.
  6. Przejdź do zielonego kanału zawierającego fluorescencję GCaMP i wybierz "Multi Measure" w "Menedżerze ROI".
    UWAGA: Zapewni to pomiary intensywności dla komórek w całym szeregu czasowym.
  7. W przypadku, gdy pozycja ROI musi zostać dostosowana ze względu na ruch wysepki, ręcznie skompiluj pomiary intensywności w różnych ramkach. Skopiuj wartości i wklej je do osobnego arkusza kalkulacyjnego.
  8. Uzyskaj znaczniki czasu ramek obrazu z "LSM Toolbox". Korzystanie z opcji "Zastosuj stemple | Stosowanie stempli t | Nazwa pliku | Zrzut do pliku tekstowego", aby uzyskać znaczniki czasu. Zapisz znaczniki czasu za pomocą opcji "Zapisz jako" lub skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego.
  9. Po skompilowaniu wartości intensywności dla wszystkich komórek wykonuj analizę pojedynczo lub automatycznie (np. przy użyciu formuł programu Excel lub R).
  10. Przeanalizuj poszczególne komórki w dwóch krokach.
    1. W pierwszym kroku oblicz intensywność fluorescencji powyżej linii podstawowej. W tym celu należy obliczyć bazową intensywność fluorescencji (F0) jako średnią intensywności fluorescencji dla pierwszych 50 klatek (5 mM glukozy). Następnie odejmij linię bazową (F0) od całego szeregu czasowego (F – F0).
      UWAGA: Kilka komórek może wykazywać wyraźne oscylacje GCaMP pod wpływem podstawowej glukozy, które zwykle utrzymują się po stymulacji wyższymi stężeniami. Dla takich komórek możliwe jest oszacowanie F0 tylko poprzez przyjęcie średniej intensywności początkowych ramek, w których komórki wykazały spadek fluorescencji.
    2. W drugim etapie analizy należy uzyskać końcową intensywność fluorescencji GCaMP poprzez normalizację intensywności fluorescencji.
      UWAGA: Ma to na celu usunięcie różnic między wysepkami od różnych zwierząt. Poszczególne wysepki wykazują różne poziomy emisji fluorescencji po stymulacji glukozą.
    3. Normalizuj intensywność fluorescencji, dzieląc ją przez najwyższą wartość intensywności. W tym celu należy obliczyć intensywność piku (Fmax – F0) i podzielić odjęte wartości wyjściowe przez intensywność piku, aby uzyskać końcową intensywność fluorescencji GCaMP (F – F0)/(Fmax – F0).
  11. Wyrzuć komórki, które nie wykazują zmiany intensywności po stymulacji KCl, ponieważ mogą być niezdrowe lub uszkodzone.
  12. Do przeprowadzenia analizy (kroki 4.9–4.10) w języku R należy użyć skryptu języka R (plotcelltrace. R) dostarczone wraz z niniejszym rękopisem.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, przeanalizowano reakcje glukozowe komórek beta na wysepce od zebrygowanego po 45 dniach od zapłodnienia (dpf). W tym celu pierwotna wysepka została wycięta ze zwierzęcia poddanego eutanazji i umieszczona w pleśni fibrynogenowo-trombinowej w naczyniu ze szklanym dnem. Wysepkę zanurzono w HBSS zawierającym 5 mM glukozy. Stężenie glukozy zwiększano stopniowo do 10 mM i 20 mM. Rejestrowano reakcje komórek beta na rosnące stężenie glukozy. Na koniec komórki beta zdepolaryzowano za pomocą 30 mM KCl (Rysunek 1). Depolaryzacja za pomocą KCl indukuje wnikanie wapnia do zdrowych komórek beta.

Korzystając z FIJI i oprogramowania do analizy danych, intensywność fluorescencji GCaMP6s poszczególnych komórek beta jest ekstrahowana i normalizowana (Rysunek 2). Jak widać po śladowej intensywności fluorescencji, poszczególne komórki beta wykazują oscylacje fluorescencji GCaMP6s po stymulacji glukozy, które zatrzymują się po stymulacji KCl. Technika ta zapewnia komórkową rozdzielczość reakcji komórki beta na glukozę i wgląd w ich funkcjonalność.

figure-results-1
Rycina 1: Obrazowanie na żywo ex vivo napływu wapnia przy użyciu GCaMP6s w komórkach beta danio pręgowanego. Główna wysepka z Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); Danio pręgowanego Tg(ins:GCaMP6s) (45 dpf) umieszczono w pleśni fibrynogenowo-trombinowej i inkubowano z 5 mM (podstawowym) glukozą. Komórki beta zostały oznaczone czerwonym markerem jądrowym, podczas gdy fluorescencja GCaMP6s jest obecna w zielonym kanale. Wysepka była stymulowana rampą glukozową składającą się z sekwencyjnej inkubacji z 10 mM i 20 mM D-glukozy i depolaryzowana przez dodanie 30 mM KCl. Groty strzałek oznaczają poszczególne komórki beta, których aktywność była analizowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Znormalizowany ślad intensywności fluorescencji GCaMP6s dla poszczególnych komórek beta. Znormalizowany ślad intensywności fluorescencji GCaMP6s dla komórek beta oznaczonych grotami strzałek w Rysunek 1. Oś X oznacza czas w sekundach. U góry słupki przedstawiają stężenie glukozy i KCl w pożywce HBSS. Oś Y oznacza znormalizowaną intensywność fluorescencji w szeregach czasowych. W tym celu intensywność wyjściową (F0) oblicza się jako średnią intensywność podczas inkubacji w 5 mM glukozy. Jest to odejmowane od całych danych szeregów czasowych (F - F0). Intensywność powyżej linii podstawowej jest normalizowana przez maksymalną intensywność wyświetlaną przez komórkę (F - F0)/(Fmax- F0). Znormalizowany ślad pokazuje oscylacyjną odpowiedź komórek beta na glukozę, która stabilizuje się, gdy komórki są depolaryzowane za pomocą 30 mM KCl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy technikę ilościowego oznaczania reakcji komórek beta na glukozę w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jest to możliwe dzięki monitorowaniu wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia GCaMP6s. Aktywność komórek beta jest wychwytywana ex vivo poprzez zamontowanie wysepki w formie fibrynogenowo-trombinowej. Krytycznym krokiem protokołu jest stabilność formy. Należy zapewnić odpowiedni czas, aby fibrynogen rozpuścił się w roztworze HBSS. Bez tego forma nie polimeryzuje wystarczająco, aby zapewnić stabilność podczas sesji obrazowania. Wysepka zamontowana w pleśni fibrynogenowo-trombinowej i zanurzona w pożywce do hodowli komórkowej może zachować żywotność przez co najmniej tydzień (dane nie pokazane). Alternatywy dla pleśni fibrynogenowo-trombinowej, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia, mogą być wykorzystane do zamontowania wysepki22. Kolejnym krytycznym parametrem jest rozwarstwienie wysepki. Na tym etapie tkanka otaczająca wyspę musi zostać usunięta bez uszkadzania lub szturchania wysepki. Umiejętna sekcja przychodzi wraz z praktyką.

Ograniczeniem protokołu obrazowania jest ograniczenie do jednej płaszczyzny konfokalnej wysepki. Ma to na celu uchwycenie dynamiki napływu wapnia w obrębie poszczególnych komórek beta. Stos Z na całej grubości wysepki prowadzi do niskich prędkości obrazowania i utraty sygnału oscylacyjnego z pojedynczych komórek. Ograniczenie to można poprawić, stosując szybsze metody obrazowania konfokalnego, takie jak mikroskopia wirującego dysku, aby umożliwić uchwycenie dynamiki wapnia w trzech wymiarach. Kolejną granicą byłoby obrazowanie wapnia in vivo 12. Przezroczysty charakter zarodka danio pręgowanego lub wykorzystanie bezpigmentowych szczepów dorosłych ryb danio pręgowanego23 może w przyszłości otworzyć możliwość obrazowania in vivo .

Obrazowanie aktywności komórek beta w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej umożliwia badanie niejednorodności funkcjonalnej między poszczególnymi komórkami beta. Takie podejście może pomóc rzucić światło na istnienie subpopulacji komórek beta. Ostatnio wiele badań wykazało istnienie subpopulacji w nominalnie jednorodnych komórkach beta 24,25,26. Obrazowanie ex vivo można połączyć z reporterami genetycznymi w celu scharakteryzowania reakcji subpopulacji na glukozę. Ponadto połączenie konfiguracji obrazowania ze stymulacją farmakologiczną może pozwolić na badania przesiewowe związków, które mogą poprawić funkcjonalność komórek beta.

Podsumowując, przedstawiona tutaj technika pozwala na ilościowe określenie i porównanie odpowiedzi glukozy dla poszczególnych komórek beta. Zapewnia bezpośrednie okno na funkcjonalność komórek beta, ważny parametr w rozwoju cukrzycy.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Ninov za komentarze do manuskryptu, członkom Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie (CRTD) za pomoc techniczną. N.N. jest wspierany przez DFG-CRTD, Cluster of Excellence na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie, Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) oraz Niemieckie Centrum Badań nad Cukrzycą (DZD).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transgeniczna linia danio pręgowanego: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)Na prośbę autorów
Mikroskop stereoskopowyZEISS495015-0001-000SteREO Discovery.V8
ŚwietlówkaZEISS423013-9010-000Oświetlacz HXP 120 V
Czerwony Filtr KostkaZEISS000000-1114-462 Zestaw filtrów 45 HQ TexasRed
Mikroskop konfokalnyZEISSLSM 780
Fibrynogen bydlęcySigmaF8630
HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa)ThermoFisher14025092
TrombinSigmaT4648
D-GlucoseSigmaG8270
KClSigmaP9333
35 mm średnica naczyń ze szklanym dnemThermoFisher150680
tricaine metan sulfonateSigmaE10521 
Fine ClepsFine Science Tools11445-12
FIJI, przy użyciu ImageJ Wersja: 2.0.0-rc-43/1.50ehttps://fiji.sc/
R, wersja 3.2.4https://www.r-project.org/
RStudiohttps://www.rstudio.com/
plotcelltrace. RNiestandardowy skrypt dostarczony z manuskryptem

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).">Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
  2. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).">Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
  3. Heterogeneity in pancreatic beta-cell population. Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).">Pipeleers, D. G. Heterogeneity in pancreatic beta-cell population. Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).
  4. Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).">MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).
  5. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).">Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).
  6. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).">Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
  7. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).">Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
  8. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).">Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
  9. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).">Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
  10. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).">Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
  11. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044(2015).">Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044(2015).
  12. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).">Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  13. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).">Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
  14. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).">Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  15. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).">Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).">Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  17. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).">Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  18. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).">Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  19. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664(2017).">Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664(2017).
  20. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676(2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676(2012).
  21. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).">R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  22. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).">Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
  23. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).">White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  24. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).">Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756(2016).">Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756(2016).
  26. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).">Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Beta Cell FunctionCalcium ImagingZebrafish IsletsSingle Cell ResolutionGlucose ResponsivenessGCaMP6 FluorescenceConfocal MicroscopyIntracellular Calcium DynamicsIslet Live ImagingGenetic Manipulation

Related Articles