Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57853

⸱

31 sierpnia 2018

1Department of Marine Biology and Ecology, University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

Streszczenie

Koralowce są ważnymi bezkręgowcami oceanicznymi, które są kluczowe dla ogólnego zdrowia oceanów, jak również dla zdrowia ludzi. Jednak ze względu na wpływ człowieka, taki jak wzrost temperatury oceanów i zakwaszenie oceanów, koralowce są coraz bardziej zagrożone. Aby sprostać tym wyzwaniom, postępy w biologii komórkowej i molekularnej okazały się kluczowe dla diagnozowania stanu zdrowia koralowców. Modyfikacja niektórych technik powszechnie stosowanych w medycynie ludzkiej może znacznie poprawić zdolność naukowców do leczenia i ratowania koralowców. Aby temu zaradzić, protokół hybrydyzacji in situ, stosowany głównie w medycynie ludzkiej i ewolucyjnej biologii rozwoju, został dostosowany do stosowania u dorosłych koralowców w warunkach stresu.

Celem tej metody jest wizualizacja przestrzennej ekspresji sondy RNA w tkance dorosłego koralowca, która została zanurzona w parafinie i pocięta na szkiełka podstawowe. Metoda ta koncentruje się na usunięciu parafiny i ponownym uwodnieniu próbki, wstępnej obróbce próbki w celu zapewnienia przepuszczalności próbki, inkubacji przed hybrydyzacją, hybrydyzacji sondy RNA i wizualizacji sondy RNA. Jest to potężna metoda w przypadku wykorzystania organizmów niemodelowych do odkrycia, gdzie ulegają ekspresji określone geny, a protokół można łatwo dostosować do innych organizmów niemodelowych. Metoda ta jest jednak ograniczona, ponieważ jest przede wszystkim jakościowa, ponieważ intensywność wyrażania może się różnić w zależności od ilości czasu użytego podczas etapu wizualizacji i stężenia sondy. Ponadto wymagana jest cierpliwość, ponieważ ten protokół może zająć do 5 dni (a w wielu przypadkach dłużej) w zależności od używanej sondy. Wreszcie, powszechne jest niespecyficzne barwienie tła, ale to ograniczenie można przezwyciężyć.

Wprowadzenie

Koralowce są kluczowymi budowniczymi ekosystemów i ważnymi dla różnorodności biologicznej w oceanach i zdrowiu ludzi1,2,3. Są zagrożone ze względu na zmiany klimatyczne i inne antropogeniczne czynniki stresogenne, a wiele gatunków koralowców uważa się za krytycznie zagrożone. W związku z tym istnieje znaczne zapotrzebowanie na narzędzia komórkowe i molekularne do diagnozowania koralowców w stresie. Ponadto niewiele wiadomo na temat tego, gdzie geny ulegają ekspresji w tkance dorosłego koralowca, a zatem niewiele wiadomo o funkcjach tych genów. Aby rozwiązać ten problem, dostosowaliśmy protokół hybrydyzacji in situ (ISH), powszechnie stosowany w medycynie ludzkiej i ewolucyjnej biologii rozwoju, do stosowania na próbkach tkanek zatopionych w parafinie dorosłych koralowców. Ta technika jest najskuteczniejsza, gdy jest stosowana na dorosłych koralowcach, które przeszły stresujące wydarzenie, takie jak narażenie na stres cieplny. Jednak technika ta może być stosowana w szerokim zakresie tkanek i etapów życia koralowców i nie ogranicza się tylko do koralowców narażonych na stres cieplny4,6,7. Ponadto technika ta może być stosowana na tkankach lub komórkach dowolnego metazoanu, o ile dostępne są informacje o sekwencji cDNA.

Celem tej metody jest wizualizacja sond RNA w tkance dorosłego koralowca, która została zakonserwowana i zatopiona w parafinie i pocięta na szkiełka. Ta metoda jest potężnym narzędziem diagnostycznym, które pozwala na wizualizację kwasów nukleinowych w tkance dorosłego koralowca. Początkowo metoda ta została opracowana do diagnostyki medycznej i od tego czasu stała się popularnym narzędziem w dziedzinach takich jak biologia rozwojowa i ewolucyjna biologia rozwojowa8,9,10. ISH jest również metodą krytyczną, szczególnie w systemach niemodelowych, gdy dostępne są dane dotyczące sekwencji genomicznych i transkryptomicznych, ale przestrzenne wzorce ekspresji genów są nieznane. W przypadku prac diagnostycznych w systemach niemodelowych technika ta jest skuteczna, ponieważ może wskazać, które komórki i tkanki wyrażają interesujący nas gen i może prowadzić do bardziej ukierunkowanych podejść terapeutycznych8,9,10,11,12. Wreszcie, ta technika jest jakościowa i skuteczniejsza w połączeniu z ilościowymi danymi dotyczącymi ekspresji genów11.

Podejście opisane w tym artykule będzie interesujące dla badaczy, którzy już zaprojektowali sondę RNA znakowaną digoksygeniną (DIG) (zarówno sondę sensowną, jak i antysensowną) i są teraz gotowi do przeprowadzenia hybrydyzacji sond in situ z próbką. Aby wykonać tę metodę, dla każdej badanej sondy potrzebne będą dwa szeregowe odcinki tkanki koralowca parafinowego. Jedna sekcja będzie używana dla sondy czujnikowej, a druga dla sondy antysensownej. Sonda wykrywania będzie kontrolką wskazującą niespecyficzne powiązanie. Jeśli w sondzie zmysłowej obserwuje się barwienie, oznacza to, że sonda antysensowna nie jest specyficzna dla interesującego RNA. Sondy mogą być zaprojektowane dla każdego genu ulegającego ekspresji. W tym protokole wykorzystano kilka przykładów, które wcześniej stwierdzono jako ulegające ekspresji podczas stresu cieplnego u koralowców: homolog onkogenu wirusa kostniakomięsaka myszy FBJ (Fos-B), białko aktywujące (AP1) i receptor czynnika martwicy nowotworu 41 (TNFR 41)11. ISH przy użyciu sond RNA znakowanych DIG jest preferowany w porównaniu z sondami radioaktywnymi, ponieważ ich obsługa jest znacznie bezpieczniejsza10. Ponadto technika ta jest bardzo czuła i może być wykonywana na szerokim zakresie tkanek i zarodków poza dorosłymi koralowcami narażonymi na stres cieplny13,14,15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Usuwanie parafiny

Uwaga: Wykonaj następujące kroki pod wyciągiem.

  1. Odparafinować cienkowarstwowe szkiełka zatopione w parafinie ze 100% ksylenem pod pokrywą w szklanych słoikach Coplin przez 10 minut. Nie używaj plastikowych słoików Coplin, ponieważ ksylen topi plastik. Przed użyciem wysterylizuj słoiki Coplin w autoklawie.
  2. Przygotuj cztery sterylne szklane słoiki Coplin z następującymi elementami: 100% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i 60% etanolu. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz.
    1. Przełóż szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin ze 100% etanolem i moczyć je przez 10 minut. Po 10 minutach opróżnij szklany słoik Coplin i zastąp go nowym 100% etanolem. Ponownie namocz szkiełka przez 10 minut.
    2. Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 80% etanolem na 1 min.
    3. Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 70% etanolem na 1 min.
    4. Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 60% etanolem na 1 min.

2. Wstępna obróbka preparatów w celu przygotowania hybrydyzacji sondy RNA

  1. Wykonaj następujące prania w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Wykonuj mycie w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością. Do prania szkiełek należy używać sterylnych kopert do szkiełek z miejscem na maksymalnie pięć szkiełek.
  2. Przenieść szkiełka do sterylnego szkiełka pocztowego z 18 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Prać przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Wylej 1x PBS i natychmiast potraktuj tkankę na szkiełkach proteinazą K, aby umożliwić penetrację tkanki przez sondę. Dodać około 18 ml roztworu proteinazy K do szkiełka (patrz Tabela 1 dla stężenia roztworu roboczego). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Nie potrząsać.
    1. Podczas inkubacji szkiełek przygotuj bufor prehybrydyzacyjny (Prehybe Buffer). Umieść bufor Prehybe we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut, a następnie schładzaj w łaźni lodowej przez 5 minut. Receptura buforu Prehybe znajduje się w Tabeli 1.
    2. Zatrzymać trawienie reakcji proteinazy K poprzez wylanie roztworu proteinazy K i natychmiast dodać 18 ml 0,2% roztworu glicyny-PBS do szkiełka pocztowego. Pozostaw suwak w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    3. Wylej 0,2% roztwór glicyny-PBS i dodaj 18 ml 2x roztworu cytrynianu sodu (SSC) do każdego szkiełka pocztowego. Myć szkiełka w 2x SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając przy 100-150 obr./min.

3. Prehybrydyzacja preparatów w ramach przygotowań do hybrydyzacji sondą RNA

  1. Podczas mycia szkiełek za pomocą 2x SSC, zaopatrz się w nową sterylną kopertę do szkiełek i umieść około 18 ml buforu Prehybe w maszynie do przenoszenia. Umieść szkiełko w piecu do hybrydyzacji w temperaturze hybrydyzacji.
    UWAGA: Temperatura hybrydyzacji będzie zależeć od używanej sondy, ale zwykle waha się od 50-60 °C.
  2. Po zakończeniu mycia 2x SSC, wylej 2x SSC i umieść szkiełka w komorze do szkiełek w buforze Prehybe w piecu do hybrydyzacji na 1 godzinę.

4. Hybrydyzacja sondy RNA

  1. Podczas gdy szkiełka inkubują się z buforem Prehybe w piecu do hybrydyzacji, przygotuj roztwór sondy hybrydyzacyjnej.
    1. Rozcieńczyć każdą sondę w buforze hybrydyzacyjnym (0,5 μl sondy z 24,5 μl buforu hybrydyzacyjnego).
      UWAGA: Przepis na bufor hybrydyzacyjny znajduje się w tabeli 1. Przykład przygotowania i stężeń sondy można znaleźć w Traylor-Knowles i wsp.11.
    2. Umieść rozcieńczoną sondę na bloku grzewczym o temperaturze 86-90 °C na 12 minut, a następnie schłodzić przez 1 minutę na lodzie.
  2. Wyjmij szkiełko z pieca do hybrydyzacji i pojedynczo wyjmij szkiełka z pudełka do przenoszenia za pomocą sterylnej pęsety. Połóż szkiełka płasko na ręczniku papierowym i ostrożnie zetrzyj nadmiar buforu Prehybe wokół próbek tkanek. Należy uważać, aby nie dotykać próbek i pracować szybko, aby zapobiec wysuszeniu próbek tkanek.
  3. Owiń tkankę za pomocą wstrzykiwacza PAP. Nanieść pipetą 25 μl rozcieńczonego roztworu sondy i przykryć próbkę plastikowym szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Umieścić próbki w szkiełkowej komorze wilgotnościowej z 4x SSC + 50% roztworem formamidu na dnie komory.
    2. Po dodaniu sond do wszystkich szkiełek, umieścić komorę wilgotnościową szkiełka w piecu do hybrydyzacji na co najmniej 24 godziny w temperaturze hybrydyzacji 50-60 °C. Czas inkubacji może się różnić w zależności od stężenia sondy, ale powinien wynosić co najmniej 24 godziny.
  4. Po całonocnej inkubacji z rozcieńczonymi sondami wyjmij szkiełkową komorę wilgotnościową z pieca do hybrydyzacji.
    1. Usuń szkiełka nakrywkowe z każdego z szkiełek, uważając, aby nie przesunąć tkanki. W pipecie o pojemności 1000 μl dodaj 1000 μl roztworu 2x SSC i delikatnie zmyj szkiełko.
    2. Umieścić szkiełko w sterylnym pudełku pocztowym z 18 ml 2x roztworu SSC na 5 minut w temperaturze pokojowej. Wylej roztwór i zastąp go 18 ml świeżego 2x SSC. Powtórzyć inkubację ponownie przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    3. Wylej 2x roztwór SSC. Dodaj 18 ml 1x roztworu SSC i myj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wylej 1x roztwór SSC i zastąp go 18 ml świeżego roztworu 1x SSC. Powtarzać inkubację przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    4. Wylej 1x SSC. Dodać 18 ml 0,5x SSC i prać przez 10 minut w temperaturze 42 °C bez wstrząsania. Wylej 0,5x SSC i zastąp go 18 ml świeżego 0,5x SSC. Prać ponownie przez 10 minut w temperaturze 42 °C bez wstrząsania.

5. Wizualizacja sondy RNA

UWAGA: Do wizualizacji sondy, podczas procesu rozwoju zostanie użyty fioletowy BM. Jednak przed tym krokiem wymagane jest kilka prań, aby przygotować próbki do barwienia.

  1. Przemyć szkiełka 18 ml alkalicznego buforu fosfatazy (bufor AP) bez MgCl2 przez 1 minutę. Wylać bufor AP bez MgCl2 i dodać 18 ml 1x buforu blokującego Boehringera-Mannheima rozcieńczonego buforem kwasu maleinowego. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej w szkiełku pocztowym, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Zastosowany bufor blokujący Boehringer-Mannheim i bufor kwasu maleinowego zostały wstępnie przygotowane i zakupione w zestawie buforowym DIG Wash and Block (dostępnym w sprzedaży).
    1. Alternatywnie można przeprowadzić inkubację przez noc w temperaturze 4 °C. Dłuższy okres blokowania zmniejszy pojawianie się niespecyficznego wiązania.
  2. Przygotować 20 ml rozcieńczonych fragmentów DIG anty-digoksygeniny-AP Fab (przeciwciało anty-DIG = 2 μl przeciwciała anty-DIG + 20 ml 1x bufor blokujący Boehringera-Mannheima). To wystarczy do użycia w 1 plastikowej skrzynce pocztowej. Więcej tego rozwiązania należy przygotować, jeśli ma być użyty więcej niż jeden folder do przenoszenia slajdów.
  3. Dodać przeciwciało anty-DIG do nowego sterylnego szkiełka pocztowego i przenieść szkiełka do koperty z roztworem przeciwciała anty-DIG. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, delikatnie wstrząsając.
  4. Po inkubacji wylać przeciwciało anty-DIG i umyć szkiełka w skrzynce do szkiełek 18 ml buforu AP bez MgCl2 przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
  5. Wylej AP-Buffer bez MgCl2 i dodaj 18 ml AP-Buffer. Myć przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Po 5 minutowej inkubacji odlać AP-Buffer, zastąpić go 18 ml świeżego AP-Buffera i myć przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
  6. W ciemności wylej bufor AP i dodaj 18 ml fioletowego BM do koperty do slajdów. Inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności, sprawdzając rozwój fioletowego koloru co 1/2 godziny. Czas reakcji na wizualizację będzie się różnić w zależności od opracowywanej sondy.
    UWAGA: Zamiast fioletowej wizualizacji BM, roztwór rozwojowy można wykonać przy użyciu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanu (BCIP) i niebieskiego tetrazolu nitro (NBT). Instrukcje znajdują się w Tabeli 1.
  7. Zatrzymaj wywoływanie koloru, przenosząc szkiełka do nowego sterylnego szkiełka pocztowego z 18 ml buforu Tris-EDTA (TE) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
  8. Odlej bufor TE i dodaj 18 ml wody wolnej od RNaz do szkiełka i myj przez 1 minutę w ciemności.
  9. Wyjmij szkiełka z wody i wysusz je wokół krawędzi tkanki. Dodaj podłoże mocujące glicerolu i umieść szkiełka nakrywkowe. Przechowuj preparaty w temperaturze 4 °C, aż zdjęcia będą gotowe do zrobienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wykonaniu niniejszego protokołu zostanie zidentyfikowane miejsce ekspresji badanej sondy RNA w komórkach i tkankach. Reprezentatywne wyniki dla tego protokołu dotyczą AP-1, FosB i TNFR41. Wyniki te, opublikowane wcześniej przez Traylor-Knowles et al.11, pokazują przestrzenną ekspresję sond RNA w dorosłych koralowcach poddanych stresowi cieplnemu. Na Ryc. 1 przedstawiono dwa przykłady różnych typów barwienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda opisana w tym protokole została zmodyfikowana w stosunku do wcześniejszych prac w medycznych i ewolucyjnych badaniach rozwojowych 8,9,10,12,17. Protokół ten koncentruje się na niuansach hybrydyzacji in situ z sondą antysensowną RNA znakowaną DIG na dorosłych koralowcach, które zostały zakonserwowane i osadzone w parafinie. Metodę tę można łatw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez nagrodę nr. OCE-1323652 w ramach stypendium podoktorskiego National Science Foundation Ocean Science i nagrody nr 1012629 z Burroughs Wellcome Fund Postdoctoral Enrichment Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór DenhardtaAffymetrix70468 50 ML
Bioworld Bufor fosfatazy alkalicznejFisher50-198-724
Koperty do slajdówFisher12-587-17B
Bufor fosfatazy alkalicznej BioworldFisher50-198-724
50 ml Probówki FalconFisher14-959-49A
UltraPure Roztwór DNA plemników łososiaInvitrogen15632-011
PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) pH 7,4InvitrogenAM9625
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz, 10 x 500 mlInvitrogen10977-023
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz, 10 x 500 mlInvitrogen10977-023
UltraPure Roztwór DNA plemników łososiaInvitrogen15632-011
Slide White Apex Superior AdhesiveLeica Biosystems3800080
roztwór PBS, pH 7,4Life Technologies10010072
Proteinaza K, klasa molekularna, 2 mlNew England BiolabsP8107S
Super Pap Pen Liquid BlockerPromega22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fragmenty FabRoche11093274910
BM Purple, 100 mlRoche11442074001
DIG Zestaw do mycia i blokowaniaRoche11585762001
NBT/BCIPRoche11681451001
roztwór formaldehydu, rozmiar 500 mlSigma-Aldrich252549-500ML
Bufor SSC o stężeniu 20XSigma-AldrichS6639-1L
Bezwodnik octowySigma-Aldrich320102-100ML
FormamidSigma-Aldrich47670-250ML-F
TrietanoloaminaSigma-Aldrich90279-100ML
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3149-10KU
Ksyleny, AR (ACS), do stosowaniahistologicznegoVWRMK866806
EtanolVWREM-EX0276-4S
Bufor TE
VWR97005-252, 97005-254
Wytrząsarka oscylacyjnaVWR89032-088
Piec hybrydyzacyjny VWR PAV6232

Bibliografia

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933(2003).
  2. Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742(2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59(2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
  8. In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900(2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15(2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24(2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3(2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka koralowcasonda RNAekspresja genówodparafinowanie ksylenemrehydratacja etanolemtraktowanie proteinazą Kbufor do hybrydyzacjiprzemywanie buforem AP
In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.